A mastite é um sério problema em rebanhos leiteiros com consideráveis conseqüências econômicas. Embora alguns patógenos possam causar essa doença, Staphylococcus aureus é o mais importante agente etiológico em mastites bovinas e ovinas. O surgimento de linhagens resistentes a diferentes antibióticos e a presença de múltiplos fatores de virulência dificultam o tratamento das infecções causadas por essa espécie. Neste estudo, foram analisados 70 isolados de estafilococos coagulase positivos de origem animal: 52 provenientes de amostras de leite de bovinos portadores de mastite subclínica, do óstio dos tetos desses animais e de insufladores de três fazendas de exploração leiteira do Estado de São Paulo. Os outros 18 isolados foram provenientes de ovinos da região do agreste do Estado de PE, sendo 6 de casos de mastite clínica e 12 de casos de mastite subclínica. Por meio da eletroforese de campo pulsado (PFGE), pôde-se concluir que houve alta diversidade genética entre as linhagens de S. aureus isoladas das diferentes fontes analisadas das três fazendas do Estado de SP. No entanto, um perfil clonal comum foi identificado nas amostras de leite de duas dessas fazendas e, em uma terceira fazenda, houve a predominância de outro perfil clonal de S. aureus entre os isolados de leite bovino proveniente de animais portadores de mastite subclínica. Em relação às outras espécies coagulase positivas, todas originadas de óstios bovinos, foi possível determinar os perfis clonais dos isolados S. schleiferi spp coagulans e S. delphini e identificar a ocorrência de dois perfis distintos entre as linhagens de S. intermedius. Os isolados S. aureus provenientes de ovinos mostraram baixa diversidade genética com três perfis clonais comuns aos casos de mastite clínica e subclínica. Observou-se, em relação à combinação dos fatores de virulência de bovinos e ovinos, a ocorrência do gene cflA em 100% das amostras, o que indica o seu envolvimento no processo de colonização da glândula mamária, independente do hospedeiro. Dois clones bovinos destacaram-se por apresentar multiplicidade dos genes codificadores dos fatores de virulência. No entanto, houve pouca ocorrência dos genes relacionados ao processo toxigênico entre os isolados dessa espécie animal, ao contrário das cepas provenientes de ovinos. Em relação ao sistema regulador agr, o grupo II foi associado aos perfis clonais que apresentaram maior combinação dos genes codificadores dos fatores de virulência em isolados S. aureus provenientes de bovinos. Já o grupo III e agr negativos, aos isolados portadores de poucos desses genes. A presença do gene eta, pouco freqüente em linhagens animais, foi associada tanto com cepas bovinas agr negativas como do grupo II. Assim como nos isolados bovinos, o grupo II de agr, em ovinos, também foi relacionado com o perfil que apresentou maior combinação dos fatores de virulência, incluindo a associação dos genes sec e tst, mas também com perfis portadores de poucos genes de adesinas ou de nenhum gene para exotoxinas. O mesmo foi observado para o grupo I em linhagens ovinas. As cepas resistentes à oxacilina (BORSA), provenientes de isolados bovinos e de insufladores, apresentaram concentração inibitória mínima ≥1 - ≤ 16 µg/ml com múltipla resistência a outros antimicrobianos, mas foram negativas para o gene mecA, o que indica que sejam portadoras de outros mecanismos de resistência aos beta-lactâmicos, diferente da produção de PBP2a. / Mastitis is a serious problem in dairy herds with considerable economic consequences. Although some pathogens may cause this disease, Staphylococcus aureus is the most important etiologic agent in bovine and ovine mastitis. The appearance of antibiotic resistant strains and the presence of multiple factors of virulence, make the treatment of the infections caused by these species very difficult. In this study, we analyzed 70 isolates of coagulase positive Staphylococcus sp of animal origin: 52 from milk samples of subclinic mastitis, bovine teats and milking linners collected in three dairy farms from São Paulo State. The other 18 isolates were from the agreste region ovine in the State of Pernanbuco, with 6 strains from cases of clinic mastitis and 12 cases of subclinic mastitis. By pulsed-field electrophoresis (PFGE), we found high genetic diversity among S. aureus strains from different sources analyzed in the three farms from São Paulo State. However, a common S. aureus cloning profile was identified in the milk samples from two farms and, the third farm, presented a predominance of different profile from two previous farms. The six coagulase positive isolates from bovine teats were identified as S. schleiferi spp coagulans (1), S. delphini (1) and S. intermedius (4). This last specie presented two distinct profiles among strains. The ovine S. aureus strains showed a low genetic diversity presenting three common profiles in both clinic and subclinic mastitis. The cflA gene occurred in 100% of the bovine and ovine strains, showing its involvement in the process of colonization of the mammary glands independent of host species. Two bovine clones was notable for presenting multiplicity of virulence factors genes. However, there was a low occurrence of toxin encoding genes among bovine strains, unlike the ovine strains. The group II agr regulatory systems of S. aureus from bovine strains was associated to a wider combination of the virulent factors encoding genes. However, group III and negative agr was associated to few combination genes. Although the gene eta is, in general, less frequent in animal strains, in this study it was associated in both agr negative and group II agr bovine strains. In ovine, agr group II, as in the bovine isolates, it was also related to a wider combination of virulence factors, including the association of sec and tst genes. It was also found a few genes encoding adhesion and exotoxins in this group, occurring the same in agr group I in ovine strains. The borderline oxacillin-resistant Staphylococcus aureus (BORSA) strains isolated from bovine ostium, milk and milking apparatus line presented minimum inhibitory concentration ≥1 - ≤ 16 µg/ml with multiple resistance to other antimicrobial, but they were negative to the mecA gene, suggesting they are carrying other resistance mechanisms to beta-lactam antibiotics, different from the production of PBP2a.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:52Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-07-02Bitstream added on 2014-06-13T19:03:32Z : No. of bitstreams: 1 pardo_rb_dr_jabo.pdf: 1134204 bytes, checksum: f5af7219cd5d0c42c86945ad29a46afe (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os exames de palpação, inspeção e teste da caneca de fundo escuro, bem como o California Mastitis Test (CMT) foram realizados em 735 quartos mamários de búfalas leiteiras pesquisa de alterações clínicas e subclínicas nos quartos e em suas respectivas secreções. Independentemente dos resultados encontrados, foram coletadas amostras de leite para análises microbiológicas e de contagem de células somáticas (CCS). O isolamento microbiológico foi realizado em ágar sangue de ovino 5% e em ágar MacConkey, com 72 horas de incubação em aerobiose a 37oC. Foram procedidas, a cada 24 horas, leitura e identificação dos isolamentos. A ocorrência de quadros de mastite clínica foi representada por um único caso (0,14%) entre os 735 quartos mamários analisados, ocorrendo na fase inicial da lactação e envolvendo microrganismos de origem ambiental (Morganella morganii, Enterobacter aerogenes). Foram considerados quadros de mastite subclínica aqueles com resultados positivos ao CMT acompanhados de exame microbiológico positivo. A freqüência observada de quadros de mastite subclínica entre os 734 quartos mamários estudados foi de 20,03%, dos quais isolou-se principalmente microrganismos contagiosos. Os resultados negativos ao CMT predominaram durante todo o estudo (69,07%), independente da fase de lactação ou estação do ano consideradas, tendo sido observados resultados positivos do exame microbiológico em 57,58% das amostras CMT negativas. Foi elevada a freqüência de microrganismos classificados como contagiosos entre as amostras de leite analisadas, independente da estação do ano e da fase de lactação, entre os quais prevaleceu o Corynebacterium spp. (47,67%), entre os 579 microrganismos pertencentes a 19 gêneros bacterianos crescidos em cultura pura ou em associação. Considerando-se a falta de homogeneidade entre as variâncias, as contagens de células... / A total of 735 mammary quarters from buffalo cows were submitted to inspection, palpation, strip cup test and California Mastitis Test (CMT) in order to diagnose clinical and subclinical mastitis. Independent of the observed results, milk samples were collected from each mammary quarter to microbiological exams and automatic somatic cell counts (SSC). Milk samples were inoculated in 5% ovine blood agar and MacConkey agar and incubated for 72 hours under 37oC and aerobic condition. Growth observations and identifications were performed every 24 hours. One (0,14%) out of 735 mammary quarters studied presented clinical mastitis. It occurred in first stage of lactation (0 to 60th day post calving) and environmental microorganisms were isolated (Morganella morganii, Enterobacter aerogenes). Mammary quarters presenting positive results to CMT and microbiological exams were considered as subclinical mastitis cases and these represented 20,03% among 734 studied samples. CMT negative results were the most frequent observed during the study (69,07%), independent of lactation stage or season of the year considered. Among these CMT negative milk samples, 57,58% were positive in microbiological exams. There was a high occurrence of contagious microorganisms among the 579 identified bacteria from 19 different genus, isolated in pure or in association. Corynebacterium spp. was the most prevalent (47,67%), in every lactation stage or season of the year. Considering the absence of a normal distribution, somatic cell counts were submitted to a logarithmic transformation, log2(CCS/100)+3, originating the transformed somatic cell count (TSCC). There were statistically significant differences between TCCS means from milk samples with positive (2,23) and negative (1,71) results to CMT. Such differences were also observed in milk... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:52Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-02-03Bitstream added on 2014-06-13T20:04:30Z : No. of bitstreams: 1 nascifjr_ia_dr_jab.pdf: 487838 bytes, checksum: 48d0ed37c6795976c360a3bc66e7fd1d (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Com o objetivo de avaliar a eficácia do ácido lático frente ao iodo na anti-sepsia após a ordenha na prevenção da mastite bovina, foram estudados 668 quartos mamários de vacas holandesas em dois rebanhos leiteiros, sendo um experimental e outro comercial. Para tanto adotou-se o delineamento experimental tipo split-herd baseado na redução da ocorrência natural de novos casos de infecções intramamárias (recomendado pelo protocolo do National Mastistis Council). Os resultados obtidos evidenciaram que o ácido lático apresentou uma eficácia de 57,4% na redução do número de novos casos de IIM causados por Corynebacterium spp., Staphylococcus spp. e Streptococcus spp. entre as vacas estudadas no rebanho experimental. No rebanho comercial a eficácia foi de 42,9% entre os casos de IIM determinados por Staphylococcus spp., porém não mostrou eficácia entre os casos de IIM determinados por Corynebacterium spp. e Streptococcus spp.. Tanto o ácido lático quanto o iodo não interferiram nas taxas de cura espontânea, persistência de IIM e na ocorrência de casos clínicos de mastite entre as vacas estudadas nos rebanhos experimental e comercial. A utilização do ácido lático na anti-sepsia dos tetos de vacas após a ordenha, mostrou-se eficaz na redução do número de novos casos de IIM, desde que acompanhada por outras medidas de controle. / With the objective of evaluate the efficacy of a lactic acid against an iodine postmilking teat dip in preventing bovine mastitis, 668 mammary quarters from Holsteins cows in two dairy herds, one experimental and other commercial, were studied. The National Mastitis Council recommended protocol for determining efficacy of a postmilking barrier teat dip based on reduction of naturally occurring new intramammary infections was used, in a split-herd experimental design. Results demonstrated that lactic acid showed an efficacy of 57.4% in reducing new intramammary infections caused by Corynebacterium spp., Staphylococcus spp. and Streptococcus spp., among the experimental herd cows. In the commercial herd, the efficacy was 42.9%, but only in reducing the number of new cases of intramammary infections caused by Staphylococcus spp., and not for new cases of intramammary infections caused by Corynebacterium spp., and Streptococcus spp. Both, lactic acid and iodine didn't interfere in spontaneous cure, intramammary infections persistence and clinical mastitis rates in experimental and commercial herds. The use of a lactic acid teat dip antisepsis after each milking was effective in reducing new cases of IMI, as part of a mastitis control program.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:52Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003-02-13Bitstream added on 2014-06-13T21:05:08Z : No. of bitstreams: 1 zafalon_lf_dr_jabo.pdf: 215622 bytes, checksum: d6035416794c5235aa2dd22ef3e50373 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Estudou-se a influência da mastite subclínica bovina causada por Staphylococcus aureus sobre a qualidade e a quantidade do leite secretado por quartos tratados e não tratados e avaliou-se a relação custo/benefício do tratamento na lactação. Amostras de leite obtidas de vacas em duas fases de lactação, classificadas como Fase 1 e Fase 2, com animais até o final do segundo mês de lactação e do início do terceiro até o nono mês, respectivamente, foram submetidas a análises bacteriológicas, físico-químicas e citológicas. A mastite subclínica influenciou as variações (p<0,05) nas contagens de células somáticas, acidez titulável, densidade, extrato seco desengordurado, teor de cloretos e soroproteínas em ambas as fases estudadas. Após o tratamento, as diferenças entre os quartos mamários tratados e os quartos que serviram como controle diminuíram para todas as características estudadas, com exceção da produção de leite, proteína total, proteína verdadeira e soroproteínas nas duas fases, e do teor de gordura e da caseína, em uma das fases. As taxas de cura das Fases 1 e 2 foram de 79,0% e 83,3% e as taxas de recuperação espontânea de 21,4% e 3,7%, respectivamente. Não houve aumento das receitas com a produção de leite após o tratamento da mastite subclínica bovina causada por S. aureus durante a lactação. / The influence of bovine subclinical mastitis by Staphylococcus aureus upon milk quality and quantity of treated and untreated quarters and the treatment cost/benefit relation were studied. Bacteriologyc, physical-chemical and cellular analysis of milk samples from two stages of lactation, classified as Stage 1 and Stage 2, from animals until the second month of lactation and from animals of the third lactation month until the ninth lactation month, respectively, were performed. Subclinical mastitis influenced variations (p < 0.05) in the somatic cells count, titratable acidity, density, non fat solids, chloride levels and soroproteins in both lactation stages. After treatment, variations between treated mammary quarters and healthy quarters were reduced for all characteristics, except for milk production, total protein, true protein and soroproteins, in both stages, and for fat contents and casein in the Stage 1. The cure in the stages 1 and 2 were 79.0% and 83.3%, respectively. Spontaneous recovery rates were 21.4% and 3.7% for stages 1 and 2, respectively. There was no increase of the incomes with the milk production after bovine subclinical mastitis treatment by S.aureus in the lactation.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:52Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003-11-28Bitstream added on 2014-06-13T20:44:11Z : No. of bitstreams: 1 tonin_fb_dr_jabo.pdf: 116027 bytes, checksum: c4ccaa1b48fc25c63ad1990838911102 (MD5) / o presente estudo teve como objetivo verificar a prevalência da mastite caprina causada por Staphylococcus spp. em três rebanhos do Estado de São Paulo, bem como conhecer as características fenotípicas e genotípicas das cepas isoladas. Por outro lado, através dos testes de susceptibilidade a antimicrobianos e da PCR-ribotipagem, pretendeu-se, também, verificar a relação epidemiológica existente entre as cepas de Staphylococcus spp. isoladas em amostras de leite, óstio do teto, lesão em pele do teto e ordenhadeira, assim como de mãos, tonsilas e fossas nasais de ordenhadores. A prevalência da mastite subclínica foi de 12,0%, 10,7% e 26,6% nos rebanhos pertencentes às três propriedades estudadas, nos quais Staphylococcus coagulase negativa foi o principal agente envolvido na etiologia dos casos. O teste de susceptibilidade a antimicrobianos revelou que 100% das cepas foram sensíveis à gentamicina, a neomicina e ao cefoperazone e, ainda, que a resistência frente a ampicilina e penicilina foi observada em 25,2% das cepas. A análise molecular revelou estreita relação entre as cepas isoladas de amostras de leite e óstio de teto. Cepas isoladas dos insufladores da ordenhadeira, assim como as de fossas nasais dos ordenhadores, têm participação na epidemiologia das mastites em cabras. A PCR-ribotipagem permitiu avaliar a relação epidemiológica existente entre as cepas isoladas de forma mais eficiente que o teste de susceptibilidade a antimicrobianos. A compreensão dessas relações epidemiológicas é necessária para a implementação de medidas eficazes no controle e prevenção das mastites em cabras. / The present study aimed to investigate the prevalence of goat mastitis due to Staphylococcus spp. in three flocks from São Paulo State, as well as understand the phenotypic and genotypic characteristics of the strains isolated. Otherwise, epidemiological relationship between the strains isolated from milk, teat ends, skin lesions, milking units and milking personnel was investigated by the antimicrobial susceptibility and PCR-ribotyping. The prevalence of subclinical mastitis was 12,0%, 10,7% and 26,6% for the three flocks studied and coagulase negative Staphylococcus was the most prevalent agent isolated. Antimicrobial susceptibility test revealed 100% of sensibility to gentamicin, neomycin and cephoperazon and, in addition, the resistance to ampicillin and penicillin in 25,2% of the strains isolated. Molecular analysis showed close relationship between strains isolated from milk and teat ends. Strains isolated from milking units, as well as strains isolated from nasal swabs of the milking personnel, play an important role on goat mastitis epidemiology. PCR-ribotyping was more efficient than antimicrobial susceptibility test to evaluate the epidemiological relationship between the strains isolated. An understanding of these epidemiological relationships is necessary for the design of more effective mastitis control programs.

Orientador: Antonio Nader Filho / Banca: José Jurandir Fagliari / Banca: Paulo Francisco Domingues / Banca: Hélio Langoni / Banca: Vanerli Beloti / Resumo: Estudou-se a influência da mastite subclínica bovina causada por Staphylococcus aureus sobre a qualidade e a quantidade do leite secretado por quartos tratados e não tratados e avaliou-se a relação custo/benefício do tratamento na lactação. Amostras de leite obtidas de vacas em duas fases de lactação, classificadas como Fase 1 e Fase 2, com animais até o final do segundo mês de lactação e do início do terceiro até o nono mês, respectivamente, foram submetidas a análises bacteriológicas, físico-químicas e citológicas. A mastite subclínica influenciou as variações (p<0,05) nas contagens de células somáticas, acidez titulável, densidade, extrato seco desengordurado, teor de cloretos e soroproteínas em ambas as fases estudadas. Após o tratamento, as diferenças entre os quartos mamários tratados e os quartos que serviram como controle diminuíram para todas as características estudadas, com exceção da produção de leite, proteína total, proteína verdadeira e soroproteínas nas duas fases, e do teor de gordura e da caseína, em uma das fases. As taxas de cura das Fases 1 e 2 foram de 79,0% e 83,3% e as taxas de recuperação espontânea de 21,4% e 3,7%, respectivamente. Não houve aumento das receitas com a produção de leite após o tratamento da mastite subclínica bovina causada por S. aureus durante a lactação. / Abstract: The influence of bovine subclinical mastitis by Staphylococcus aureus upon milk quality and quantity of treated and untreated quarters and the treatment cost/benefit relation were studied. Bacteriologyc, physical-chemical and cellular analysis of milk samples from two stages of lactation, classified as Stage 1 and Stage 2, from animals until the second month of lactation and from animals of the third lactation month until the ninth lactation month, respectively, were performed. Subclinical mastitis influenced variations (p < 0.05) in the somatic cells count, titratable acidity, density, non fat solids, chloride levels and soroproteins in both lactation stages. After treatment, variations between treated mammary quarters and healthy quarters were reduced for all characteristics, except for milk production, total protein, true protein and soroproteins, in both stages, and for fat contents and casein in the Stage 1. The cure in the stages 1 and 2 were 79.0% and 83.3%, respectively. Spontaneous recovery rates were 21.4% and 3.7% for stages 1 and 2, respectively. There was no increase of the incomes with the milk production after bovine subclinical mastitis treatment by S.aureus in the lactation. / Doutor

Orientador: Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha / Resumo: A mastite é considerada um grande problema na pecuária leiteira e o uso frequente de antimicrobianos contribui para o aumento da pressão seletiva de micro-organismos resistentes aos principais fármacos. A Organização Mundial da Saúde Animal tem alertado para o risco da resistência antimicrobiana resultante do uso indevido de antimicrobianos no tratamento de animais doentes. O presente trabalho tem como objetivos identificar e caracterizar o perfil clonal, bem como os fatores de virulência e de resistência aos antimicrobianos em Staphylococcus spp. isolados do leite de bovinos com mastite subclínica de várias regiões do Brasil. As amostras foram concedidas pela Embrapa Gado de Leite, provenientes de 6 estados brasileiros, incluindo Paraná, Santa Catarina, Rio Grande do Sul, Minas Gerais, São Paulo e Pernambuco. Foram incluídas 181 amostras de Staphylococcus spp. no estudo. A identificação fenotípica revelou um total de 82 (45,3%) Staphylococcus aureus e 99 (54,7%) Staphylococcus coagulase negativa (CoNS). Destes, a espécie mais isolada foi S. chromogenes com 27 (14,9%) amostras, seguido de S. epidermidis com 26 (14,3%). Realizou-se a confirmação genotípica utilizando a técnica Internal Transcribed Spacer - PCR (ITS-PCR) de todas as amostras, demonstrando um total de 98% de concordância com o teste fenotípico. Quanto à determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM), S. aureus revelou 99% de sensibilidade à oxacilina, enquanto os CoNS apresentaram 32% de resistência à esse... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Mastitis is considered a major problem in dairy farming and the frequent use of antimicrobials contributes to increased selection pressure of resistant micro-organisms to the main drugs. The World Organisation for Animal Health are aimed at the protection of animal and human health against the risk of antimicrobial resistance resulting from the treatment of sick animals. This study aims to identify and characterize the clonal profile and the virulence as well as the virulence factors and the antimicrobial resistance to Staphylococcus spp. isolated from bovine milk with subclinical mastitis from several regions of Brazil. The samples were provided by Embrapa Gado de Leite (Embrapa Dairy Cattle), from 6 Brazilian states, including Paraná, Santa Catarina, Rio Grande do Sul, Minas Gerais, São Paulo and Pernambuco. A total of 181 samples of Staphylococcus spp. were included in the study. Phenotypic identification revealed a total of 82 (45.3%) Staphylococcus aureus and 99 (54.7%) Coagulase-Negative Staphylococci (CoNS) and, of these, the most isolated species was S. chromogenes with 27 (14.9%) samples, followed by S. epidermidis with 26 (14.3%). We realized the genotypic confirmation by using the technique Internal Transcribed Spacer - PCR (ITS-PCR) of all samples, demonstrating a total of 98% of concordance with the phenotypic test. As for the determination of Minimum Inhibitory Concentration (MIC), S. aureus showed 99% of susceptibility to oxacillin, while CoNS showed 32% resist... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Paulo Roberto Rodrigues Ramos / Resumo: A mastite é um processo inflamatório da glândula mamária, aguda ou crônica, freqüente em ruminantes, sendo consideráveis as perdas econômicas por tal patologia, por desencadear inúmeros problemas sanitários para a pecuária leiteira. Portanto, a análise do polimorfismo dessas proteínas constitui-se numa importante ferramenta para o melhoramento genético do rebanho leiteiro. Neste trabalho, foram analisadas possíveis associações entre o polimorfismo bioquímico das hemoglobinas, transferrinas, albuminas séricas e beta lactoglobulinas e freqüência de mastite em vacas da raça Holandês, num rebanho controlado, mantidas em ambiente tropical. Embora não tenha sido constatada diferença significativa entre as freqüências de polimorfismo bioquímico das proteínas entre as duas populações estudadas, propõe-se a realização de novos estudos na área de biologia genética para que os dados que forem obtidos poderão ser empregados na orientação de programas de manejo e de melhoramento com vistas à resistência a mastite. / Abstract: Mastitis is an inflammatory process of the mammary gland, sharp or chronic; frequent in ruminant, being considerable the economical losses for such pathology, for unchaining countless sanitary problems for the livestock milk pan. Therefore, the analysis of polymorphism of those proteins is constituted of an important tool for the flock milkman's genetic improvement. In this work, possible associations were analyzed among the biochemical polymorphism of the hemoglobins, transferrins, serum albumins and beta lactoglobulins and mastitis frequency in cows of the Dutch race, in a controlled flock, maintained in tropical atmosphere. Although it has not been verified significant differences among the frequencies of biochemical polymorphism of the proteins among the two studied populations, intends the accomplishment of new studies in the area of genetic biology so that the data that be obtained can be used in the orientation of handling programs and of improvement with views to the resistance the mastitis. / Mestre

Orientador: Vera Lucia Mores Rall / Coorientador: João Pessoa Araujo junior / Banca: Ary Fernandes Junior / Banca: Carlos Henrique Camargo / Banca: José Paes de Almeida Nogueira / Banca: Lina Casale Aragon-Alegro / Resumo: Staphylococcus sp é agente comum da mastite bovina, causando grandes perdas econômicas na pecuária brasileira. Esse micro-organismo possui fatores de virulência bastante conhecidos como a produção de hemolisinas, leucotoxinas e superantígenos como a toxina do síndrome do choque tóxico e enterotoxinas. Além disso, várias espécies de Staphylococcus podem adquirir genes de resistência aos antibióticos β lactâmicos. O objetivo do estudo foi caracterizar molecularmente isolados de Staphylococcus sp provenientes de leite de vacas com mastite clinica e subclínica de várias regiões do estado de São Paulo. Foram realizadas coletas de leite de vacas com mastite clinica e subclínica de diferentes fazendas no estado de São Paulo e realizados testes fenótipicos de resistência a antimicrobianos e de virulência (Toxina de Panton Valentine, sindrome do choque tóxico e toxinas esfoliativas), além de testes moleculares como Pulse Field Gel Eletrophoresis (PFGE), Multiloccus Sequence Typing (MLST) e Spa typing para comparação entre as cepas epidemiologicamente importantes e da tipagem do cromossomo cassette estafilocócico em cepas meticilina reistentes. As cepas resistentes a meticilina apresentaram amplo perfil de resistência e genes de resistência importantes e pouco relatados, sendo observados genes como fexA, lsaE, lnuB. Foram detectados dois novos spatyping (t10852 e t10856), bem como um novo alelo yqiL e um novo ST (2493). Os ECNs apresentaram resistências à maioria dos antibióticos estudados e foi observado a uma deleção no gene ermC, que codifica a resistência à eritromicina. / Abstract: Staphylococcus sp. is the common agent of bovine mastitis, causing big economic losses in Brazilian cattle. This micro-organism have virulence factors have been well known as the production of hemolysin, and leucotoxinas toxin superantigens such as toxic shock syndrome and enterotoxins. In addition, several Staphylococcus species can acquire antibiotic resistance genes β lactamics. The objective of the study is to characterize molecularly Staphylococcus sp. from milk of cows with subclinical mastitis in various regions of the state of São Paulo. Samples were coleted from milk of cows with subclinical and clinical mastitis from different farms in the state of São Paulo. Tests were performed phenotypic antimicrobial resistance and virulence (toxin Panton Valentine, toxic shock syndrome and exfoliative toxins), molecular tests as Eletrophoresis Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE), Multiloccus Sequence Typing (MLST) and spa typing for comparison between epidemiologically important strains, as well as the typing of strains in staphylococcal cassette chromosome methicillin reistentes. Methicillin-resistant strains showed broad resistance profile and resistance genes important and underreported were detected as fexA, lsaE, lnuB. Two new spatyping (t10852 and t10856) were detected as well as a new allele yqiL and a new ST (2493). The ECN showed resistance to most antibiotics and was observed the deletion in ermC gene encoding resistance to erythromycin. / Doutor

Submitted by CAMILA CHIODA DE ALMEIDA (milachioda@gmail.com) on 2018-08-03T16:19:20Z No. of bitstreams: 1 Camila_doutorado tese definitiva.pdf: 1977508 bytes, checksum: 8f88b2d3a8deefe001caf55b7c3ef036 (MD5) / Approved for entry into archive by Neli Silvia Pereira null (nelisps@fcav.unesp.br) on 2018-08-03T18:26:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 almeida_cc_dr_jabo.pdf: 1977508 bytes, checksum: 8f88b2d3a8deefe001caf55b7c3ef036 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-03T18:26:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 almeida_cc_dr_jabo.pdf: 1977508 bytes, checksum: 8f88b2d3a8deefe001caf55b7c3ef036 (MD5) Previous issue date: 2018-07-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Assim como nos bovinos, a búfala pode ter mastite, sendo o Staphylococcus aureus o principal causador desta enfermidade. No entanto, é possível que sua prevalência possa estar superestimada. Este estudo objetivou comparar métodos fenotípico e genotípico na identificação de S. aureus em amostras de leite bubalino e ambiente de ordenha bem como propor uma nova PCR quantitativa em tempo real para identificação do mesmo. Para isso, de um total de 408 amostras obtidas de leite de búfalo, ambiente de ordenha e mãos de ordenhadores, 32 cepas presuntivas de S. aureus foram identificadas com base em seu crescimento fenotípico característico em ágar Baird Parker, reações positivas de Gram e catalase, capacidade de coagular plasma de coelho, e resultado positivo no ensaio de PCR Sa442 específico para a espécies. No entanto, testes adicionais revelaram que destas 32 estirpes, apenas 10 isolados apresentaram resultado positivo na aglutinação em látex, incluindo um S. chromogenes e um S. agentis. A análise de MALDI-TOF MS revelou que oito das 32 cepas eram S. aureus, 19 S. chromogenes, três S. agnetis e uma S. xylosus. Todas as oito cepas identificadas como S. aureus pela análise de MALDI-TOF e confirmadas pelo sequenciamento do 16S rRNA foram positivas na PCR do gene cydB específico para S. aureus. Além disso, foi encontrada uma cepa positiva para o gene sea, nove para o gene cna, uma para o gene sei, duas para o gene sem, uma para o gene seg, seis para o gene seh, 15 para o gene eno 11 para o gene ebps duas para o gene fib e 14 para o gene fnbA. Das cepas Isoladas, apenas uma apresentou resistência a clindamicina, uma a vancomicina, uma para a rifampicina, nove para a penicilina, 15 para a eritromicina, duas para a ciprofloxacina e três para o cotrimoxazole. Resistência a dois antimicrobianos foi observado em oito cepas, a três antimicrobianos em uma cepa e a quatro antimicrobianos em uma cepa. Finalmente, sete das oito cepas de S. aureus foram positivas para a nova PCR em tempo real do gene coa, duas das 19 cepas S. cromogenes e a única cepa de S. xylosus também foram positivas. Em conjunto, nossos achados sugerem que S. agentis e S. chromogenes podem ser identificados erroneamente como S. aureus pelos testes de aglutinação em látex, PCR para Sa442 PCR e Staphyclin latex enquanto MALDI-TOF MS e um teste de PCR cydB específico para S. aureus podem identificar com precisão S. aureus de leite de búfala e amostras ambientais e que estas cepas podem apresentar genes que codificam enterotoxinas e resistência aos antimicrobianos. / Like cattle, buffalo may have mastitis, with Staphylococcus aureus being its main cause. However, it is possible that its prevalence may be overestimated. This study aimed to compare phenotypic and genotypic methods for S. aureus identification in samples of buffalo milk and milking environment as well as to propose a new quantitative real time PCR for its identification. For this, a total of 408 samples obtained from buffalo milk, milking environment and milkers hand, 32 presumed S. aureus strains were identified based on their characteristic phenotypic growth in Baird Parker agar, positive reactions of Gram and catalase, ability to coagulate rabbit plasma, and positive result in the species-specific Sa442 PCR assay. However, additional tests revealed that of these 32 strains, only 10 isolates tested positive for latex agglutination, including a S. chromogenes and a S. agentis. Analysis of MALDI-TOF MS revealed that eight of the 32 strains were S. aureus, 19 were S. chromogenes, three were S. agnetis and one was S. xylosus. All eight strains identified as S. aureus by MALDI-TOF analysis and confirmed by 16S rRNA sequencing were positive in S. aureus specific cydB gene PCR. In addition, a positive strain was found for the sea gene, nine for the cna gene, one for the sei gene, two for the sem, one for the seg gene, six for the seh gene, 15 for the eno 11 gene for the gene ebps two for the fib gene and 14 for the fnbA gene. Of the isolates, only one showed resistance to clindamycin, one to vancomycin, one to rifampicin, nine to penicillin, 15 to erythromycin, two to ciprofloxacin and three to cotrimoxazole. Resistance to two antimicrobials was observed in eight strains, three antimicrobials in one strain and four antimicrobials in one strain. Finally, seven of the eight strains of S. aureus were positive for the new real-time PCR of the coa gene, two of the 19 S. chromogenes strains and the only strain of S. xylosus were also positive. Taken together, our findings suggest that S. agentis and S. chromogenes can be misidentified as S. aureus by the agglutination assays of Sa442 PCR and Staphyclin latex while MALDI-TOF MS and a cydB PCR test specific for S. aureus can identify with accurate S. aureus of buffalo milk and environmental samples and that these strains may have enterotoxin genes and antimicrobial resistance genes in buffaloes.