A produção de proteínas recombinantes, principalmente para uso farmacêutico, tem sido intensamente estudada, juntamente com suas propriedades físico-químicas, o que possibilita uma melhor escolha da técnica de purificação, e assim, evitar perdas no rendimento e custos elevados. A glicocerebrosidase (GCR) é uma enzima lisossomal, e sua deficiência ocasiona um distúrbio autossômico recessivo denominado doença de Gaucher. Atualmente o tratamento para essa patologia é por meio da Terapia de Reposição Enzimática (TRE), a qual tem sido realizada com grande êxito. Tendo em vista fornecer dados que possam auxiliar na redução do número de etapas cromatográficas no processo de downstream, este trabalho teve como objetivo, a purificação da GCR expressa por células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), em meio livre de soro fetal bovino (SFB). Para se alcançar tais resultados, realizou-se o cultivo das células CHO-GCR em meio quimicamente definido livre de SFB (CHO-S-SFM II). Foram realizadas três técnicas cromatográficas (troca iônica, interação hidrofóbica e afinidade), com base em suas propriedades físico-químicas. E para o ensaio da atividade enzimática, foi utilizado o substrato fluorogênico 4-Methylumbeliferyl β-D-glucopyranoside (4MU-G). As células CHO-GCR cultivadas em meio CHO-S-SFM II, apresentando viabilidade maior que 95%, e produção da GCR ativa, durante todo o período de cultivo. Os protocolos aplicados para a purificação da GCR, não apresentaram resultados significativos. Com o volume não retido após cromatografia por interação hidrofóbica, se estimou os valores de KM 2,13 e VMAX 0,0295 UFR/h para as constantes cinéticas da GCR. A diálise no processo de purificação mostrou ser uma etapa necessária para a atividade enzimática da GCR. No cultivo das células CHO-GCR para a formação do banco de trabalho, nos meios RPMI 1640 e α-MEM, ambos com a adição de 10% SFB, não houve diferença significativa no crescimento entre eles, e apresentaram 100% de viabilidade durante todo o período de cultivo. Porém, ao analisar de forma isolada a fase exponencial de cada curva, notou-se que às células cultivadas no meio RPMI 1640, apresentaram taxa de crescimento superior, às cultivadas em meio α-MEM. Concluiu-se que a expressão da GCR em meio livre de SFB, proporciona amostras menos complexas, em relação aos meios de cultura que necessitam de suplementação com SFB, o que pode reduzir o número de etapas cromatográficas, melhorando o rendimento e a redução da perda da atividade da GCR. O meio basal RPMI 1640 com a adição de SFB foi uma alternativa satisfatória para o cultivo das células CHO-GCR. Este estudo forneceu dados que podem contribuir para a melhoria do processo de purificação da GCR. Novas pesquisas podem ser desenvolvidas a fim de melhorar o processo de purificação da GCR. / The production of recombinant proteins, mainly for pharmaceutical use, has been intensively studied along with its physico-chemical properties, which allows a better choice of the purification technique, and thus avoid losses in yield and high costs. Glucocerebrosidase (GCR) is a lysosomal enzyme, and its deficiency causes an autosomal recessive disorder called Gaucher\'s disease. Currently the treatment for this pathology is through Enzymatic Replacement Therapy (ERT), which has been successfully performed. In order to provide data that may help reducing the number of chromatographic steps in the downstream process, this work aimed to purify GCR expressed by Chinese Hamster Ovary (CHO) cells in fetal bovine serum free (FBS). To achieve such results, the CHO-GCR cells were cultured in chemically defined Serum-free medium (CHO-S-SFM II). Three chromatographic techniques (ion exchange, hydrophobic interaction and affinity) were performed, based on their physicochemical properties. And for the enzymatic activity assay, the fluorogenic substrate 4-Methylumbeliferyl β-D-glucopyranoside (4MU-G) was used. CHO-GCR cells cultured in CHO-S-SFM II medium, presenting viability greater than 95% and GCR production active, throughout the culture period. The protocols applied for GCR purification did not present significant results. With the volume not retained after chromatography by hydrophobic interaction, KM values of 2.13 and VMAX 0.0295 UFR/h were estimated for GCR kinetic constants. Dialysis in the purification process was shown to be a step necessary for the enzymatic activity of GCR. In the culture of the CHO-GCR cells for the formation of the working bank, in the media RPMI 1640 and α-MEM, both with the addition of 10% FBS, there was no significant growth difference between them, and they showed 100% viability during all the growing period. However, when analyzing in isolation, the exponential phase of each curve, it was observed that the cells grown in RPMI 1640 medium showed higher growth rates, tham grown in α-MEM medium. It was concluded that the expression of GCR in serum-free medium provides less complex samples, relative to the culture media requiring FBS supplementation, which may reduce the number of chromatographic steps, improving yield and loss reduction of GCR activity. The basal medium RPMI 1640 with the addition of FBS was a satisfactory alternative for culturing the CHO-GCR cells. This study provided data that may contribute to the improvement of the GCR purification process. New research can be developed to improve the GCR purification process.

Com o intuito de gerar subsídios para melhoria do processo de produção de Metarhizium anisopliae, o presente estudo teve como principais objetivos, determinar os efeitos de inibidores de proteinases de soja no crescimento vegetativo, esporulação e virulência do fungo e comparar a produção, viabilidade e virulência dos conídios produzidos em diferentes tipos de arroz e aditivos. A adição de 5 g.L-1 de inibidores de proteinases semi-purificados de soja ou 0,5 g.L-1 de inibidor purificado do tipo Kunitz no meio de cultura ME resultou em grande aumento na esporulação (de duas a 75 vezes) sem afetar a viabilidade dos conídios de quatro isolados (ESALQ-1037, IBCB348, E9, F20) de M. anisopliae. A presença destes inibidores de proteinases também alterou a morfologia dos conídios produzidos em ME. Os mecanismos responsáveis por estas alterações fisiológicas não foram determinados, mas provavelmente estejam associados à ação anti-nutricional, diminuindo a absorção protéica e estimulando a esporulação. Os conídios produzidos no meio com adição de 0,5 g.L-1 de inibidor de proteinase do tipo Kunitz ou com 2,5 g.L-1 de albumina de soro bovino e no meio BDA apresentaram virulência superior aos conídios produzido no meio ME sem inibidores. Quando o inibidor de proteinase do tipo Kunitz foi adicionado à suspensão de conídios do fungo antes da pulverização de lagartas de Diatraea saccharalis, a eficiência de controle foi 35,1%, inferior ao apresentado pelos demais tratamentos sem a presença deste inibidor. Nos estudos para determinação dos melhores tipos de arroz para produção de M. anisopliae, tentou-se correlacionar à produção de conídios com características destes substratos como valor nutricional, teor de resíduos de agrotóxicos e densidade de microorganismos. O arroz parboilizado foi responsável pela maior produção de conídios (4,38 x 109 conídios.g-1). Este tipo de arroz apresentou teor de proteína bruta menor do que a maioria dos arrozes e o maior teor de umidade (41,3% após a autoclavagem). Além disto, os grãos após autoclavagem ficaram menos gelatinosos e mais soltos, o que facilita o processo de produção do fungo. Enquanto que os arrozes dos tipos brancos polidos, canjicão e integral ficaram pegajosos e formaram grumos, o que provavelmente deve acarretar em menor superfície de desenvolvimento para o fungo. O segundo melhor arroz, o canjicão, com produção de 3,42 x 109 conídios.g-1, teve a maior quantidade de fungos contaminantes nos grãos crus. Quantidades intermediárias de conídios foram produzidas pelos arrozes branco polido irrigado, de terras altas e orgânico. O integral foi o que resultou na menor quantidade de conídios (1,53 x 109 conídios.g-1), sendo o mais rico em minerais, proteína bruta e extrato etéreo. Nenhum dos aditivos (farelo de soja, grãos de soja partidos, extrato de soja, peptona de soja, inibidores de proteinases de soja semipurificados e purificado do tipo Kunitz, polpa cítrica e levedura) resultou em aumento na produção de conídios em comparação com o arroz parboilizado sem aditivos. Os conídios produzidos em todos os arrozes e aditivos apresentam viabilidade superior a 99%. As vantagens da utilização do arroz parboilizado levando-se em consideração custo, facilidade de manuseio e produtividade são discutidas. / In order to optimize the production process of Metarhizium anisopliae, the present study aimed to determine the effects of soybean proteinase inhibitors on growth, sporulation and virulence of the fungus and to compare yield, viability and virulence of M. anisopliae conidia produced in different types of rice and additives. The addition of 5 g.L-1 of semi-purified soybean proteinase inhibitor or 0.5 g.L-1 of Kunitz-type inhibitor purified on the culture medium ME resulted in large increases in sporulation (two to 75 times) without affecting the viability of conidia of four M. anisopliae isolates (ESALQ-1037, IBCB348, E9, F20). The presence of proteinase inhibitors altered morphology of conidia produced in ME. Mechanisms responsible for these physiological changes in the fungus have not been determined, but it is probably associated to an anti-nutritional action, reducing the absorption of protein and stimulating sporulation. Spores produced in the medium with the addition of 0.5 g.L-1 Kunitz-type inhibitor purified or 2.5 g.L-1 of bovine serum albumin (BSA) and PDA medium showed higher virulence of conidia produced in ME without inhibitors. When the Kunitz-type inhibitor was added to conidial suspension of the fungus before spraying larvae of Diatraea saccharalis, control efficiency was 35.1% lower than that presented in other inhibitor-free treatments. In the studies aiming to determine the best types of rice for production of M. anisopliae, we tried to correlate production of conidia with characteristics of these substrates such as nutritional content, pesticide residues and density of microorganisms. The parboiled rice was responsible for greater production of conidia (4.38 x 109 conidia.g-1). This type of rice showed crude protein content lower than most rice and the highest moisture content (41.3% after autoclaving). Besides that, grains became less gelatinous and loose after autoclaving, and these feature favored fungus production. While types of polished white, brown rice and course (broken) rice grain were sticky and formed clumps, providing a smaller area for fungus development. The second best rice, course rice grain, with production of 3.42 x 109 conidia.g-1, had the highest amount of fungal contaminants in raw grains. Intermediate amounts of conidia were produced by white irrigated polished rice, upland rice and organic rice. The brown rice was the kind that resulted in fewer conidia (1.53 x 109 conidia.g-1), being the richest in minerals, protein and lipids. None of the additives (soybean meal, soybean parties, soy extract, soy peptone, semi-purified soybean proteinase inhibitor, Kunitz-type inhibitor purified, citrus pulp and yeast) resulted in increased production of conidia compared to parboiled rice without additives. Conidia produced in all types of rice and additives presented viability greater than 99%. The advantages of the use of parboiled rice taking into consideration the cost, easy handling and productivity are discussed.

A produção de proteínas recombinantes, principalmente para uso farmacêutico, tem sido intensamente estudada, juntamente com suas propriedades físico-químicas, o que possibilita uma melhor escolha da técnica de purificação, e assim, evitar perdas no rendimento e custos elevados. A glicocerebrosidase (GCR) é uma enzima lisossomal, e sua deficiência ocasiona um distúrbio autossômico recessivo denominado doença de Gaucher. Atualmente o tratamento para essa patologia é por meio da Terapia de Reposição Enzimática (TRE), a qual tem sido realizada com grande êxito. Tendo em vista fornecer dados que possam auxiliar na redução do número de etapas cromatográficas no processo de downstream, este trabalho teve como objetivo, a purificação da GCR expressa por células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), em meio livre de soro fetal bovino (SFB). Para se alcançar tais resultados, realizou-se o cultivo das células CHO-GCR em meio quimicamente definido livre de SFB (CHO-S-SFM II). Foram realizadas três técnicas cromatográficas (troca iônica, interação hidrofóbica e afinidade), com base em suas propriedades físico-químicas. E para o ensaio da atividade enzimática, foi utilizado o substrato fluorogênico 4-Methylumbeliferyl β-D-glucopyranoside (4MU-G). As células CHO-GCR cultivadas em meio CHO-S-SFM II, apresentando viabilidade maior que 95%, e produção da GCR ativa, durante todo o período de cultivo. Os protocolos aplicados para a purificação da GCR, não apresentaram resultados significativos. Com o volume não retido após cromatografia por interação hidrofóbica, se estimou os valores de KM 2,13 e VMAX 0,0295 UFR/h para as constantes cinéticas da GCR. A diálise no processo de purificação mostrou ser uma etapa necessária para a atividade enzimática da GCR. No cultivo das células CHO-GCR para a formação do banco de trabalho, nos meios RPMI 1640 e α-MEM, ambos com a adição de 10% SFB, não houve diferença significativa no crescimento entre eles, e apresentaram 100% de viabilidade durante todo o período de cultivo. Porém, ao analisar de forma isolada a fase exponencial de cada curva, notou-se que às células cultivadas no meio RPMI 1640, apresentaram taxa de crescimento superior, às cultivadas em meio α-MEM. Concluiu-se que a expressão da GCR em meio livre de SFB, proporciona amostras menos complexas, em relação aos meios de cultura que necessitam de suplementação com SFB, o que pode reduzir o número de etapas cromatográficas, melhorando o rendimento e a redução da perda da atividade da GCR. O meio basal RPMI 1640 com a adição de SFB foi uma alternativa satisfatória para o cultivo das células CHO-GCR. Este estudo forneceu dados que podem contribuir para a melhoria do processo de purificação da GCR. Novas pesquisas podem ser desenvolvidas a fim de melhorar o processo de purificação da GCR. / The production of recombinant proteins, mainly for pharmaceutical use, has been intensively studied along with its physico-chemical properties, which allows a better choice of the purification technique, and thus avoid losses in yield and high costs. Glucocerebrosidase (GCR) is a lysosomal enzyme, and its deficiency causes an autosomal recessive disorder called Gaucher\'s disease. Currently the treatment for this pathology is through Enzymatic Replacement Therapy (ERT), which has been successfully performed. In order to provide data that may help reducing the number of chromatographic steps in the downstream process, this work aimed to purify GCR expressed by Chinese Hamster Ovary (CHO) cells in fetal bovine serum free (FBS). To achieve such results, the CHO-GCR cells were cultured in chemically defined Serum-free medium (CHO-S-SFM II). Three chromatographic techniques (ion exchange, hydrophobic interaction and affinity) were performed, based on their physicochemical properties. And for the enzymatic activity assay, the fluorogenic substrate 4-Methylumbeliferyl β-D-glucopyranoside (4MU-G) was used. CHO-GCR cells cultured in CHO-S-SFM II medium, presenting viability greater than 95% and GCR production active, throughout the culture period. The protocols applied for GCR purification did not present significant results. With the volume not retained after chromatography by hydrophobic interaction, KM values of 2.13 and VMAX 0.0295 UFR/h were estimated for GCR kinetic constants. Dialysis in the purification process was shown to be a step necessary for the enzymatic activity of GCR. In the culture of the CHO-GCR cells for the formation of the working bank, in the media RPMI 1640 and α-MEM, both with the addition of 10% FBS, there was no significant growth difference between them, and they showed 100% viability during all the growing period. However, when analyzing in isolation, the exponential phase of each curve, it was observed that the cells grown in RPMI 1640 medium showed higher growth rates, tham grown in α-MEM medium. It was concluded that the expression of GCR in serum-free medium provides less complex samples, relative to the culture media requiring FBS supplementation, which may reduce the number of chromatographic steps, improving yield and loss reduction of GCR activity. The basal medium RPMI 1640 with the addition of FBS was a satisfactory alternative for culturing the CHO-GCR cells. This study provided data that may contribute to the improvement of the GCR purification process. New research can be developed to improve the GCR purification process.

In Brazil, the discussion about the change in the energy matrix is gaining a bigger dimension. In this context appear the interest in studying plant species such as physic nut (Jatropha curcas L.), because it is an oilseed crop that has major socio economic potential for the biodiesel production. This way, arises the need to produce large quantity of seedlings selected from superior mother plants. The aim of this study was to evaluate the influence of growth regulators on in vitro establishment and callus induction in physic nut (Jatropha curcas L.). Leaf segments of selected mother plants of accession JCUFS-012 of the active germplasm bank of the UFS were used as explant source. The plants were grown in a greenhouse with white screen. In this work we evaluated the effect of sodium hypochlorite concentrations, time of immersion of explants types and concentrations of the plant regulators BAP, IBA, NAA, 2,4-D, IAA and kinetin on in vitro establishment, callus induction and anatomy of the tissues during organogenesis of physic nut. For in vitro establishment and regeneration we recommend the use of 0.5% of sodium hypochlorite for 5 minutes for the disinfestation of leaf explants of physic nut. Explants from leaf number 3 (the third leaf from the apex to the base, 9.4 cm wide and 10.0 cm length), are the most effective for callus induction. The use of MS medium supplemented with BAP (0.5-1.0 mg L-1) and IBA (0.5 mg.L-1) is essential for induction of compact callus in physic nut. Histological analysis showed formation of developed adventitious buds, with cambium connection with the callus tissues, evidencing indirect organogenesis. / No Brasil a discussão a respeito da mudança na matriz energética vem ganhando uma maior dimensão, neste cenário surge o interesse em estudar espécies vegetais, tais como o pinhão-manso (Jatropha curcas L.) por ser uma oleaginosa que apresenta importante potencial sócio econômico para a produção do biodiesel. Sendo assim surge a necessidade de produção de grande quantidade de mudas selecionadas a partir de matrizes superiores. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência de reguladores de crescimento no estabelecimento in vitro e indução de calos em pinhão-manso (Jatropha curcas L.). Foram utilizados como fonte de explantes segmentos foliares de plantas matrizes provenientes do acesso JCUFS-012 do banco ativo de germoplasma da UFS, cultivadas em estufa agrícola com tela clarite. No presente trabalho avaliou-se o efeito de concentrações de hipoclorito de sódio e tempo de imersão, tipos de explantes e concentrações dos fitorreguladores BAP, AIB, ANA, 2,4-D, AIA e cinetina, no estabelecimento in vitro, na indução de calos em pinhão-manso e a anatomia dos tecidos durante o processo de calogênese. Para o estabelecimento e regeneração in vitro, recomenda-se o uso da concentração de 0,5% de hipoclorito de sódio por 5 minutos para a desinfestação de explantes foliares de pinhãomanso. Explantes provenientes de folhas 3 (terceira folha no sentido ápice para a base, com 9,4cm de largura e 10,0 cm de comprimento), são mais eficientes para a indução de calos. E o uso do meio MS suplementado com BAP (0,5-1,0 mg.L-1) e AIB (0,5mg.L-1) é essencial na indução de calos compactos em pinhão-manso. A análise histológica mostrou a formação de brotos adventícios desenvolvidos, apresentando conexão cambial com os tecidos dos calos, evidenciando a organogênese indireta.

Made available in DSpace on 2016-12-23T14:37:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao.pdf: 478233 bytes, checksum: 59f53a87f76279d2bcf9fe36ad7f2a18 (MD5) Previous issue date: 2006-02-23 / Experiments were accomplished in establishment and multiplication medium with the objective of evaluating the micropropagation of the papaya tree (Carica papaya L.) Hybrid 'Tainung 01', generation F1, being used apical sections and apical sections of lateral buds of juvenile plants, cultivated in greenhouse. In the MS establishment medium, being used apical sections, different combinations of growth regulators were tested NAA (0.093; 0.931 and 1.862 mg L-1) and kinetin (5.38; 10.76 and 21.52 mg L-1) for identification of the best relationship for the survival, reactivity and callus mass. With the use of 0.093 mg L-1 of NAA combined with 5.38 mg L-1 of kinetin was obtained the best rosette of leaves formation with 100% of cultures reactivate, indicating there to be adaptation of the explants in vitro, besides to smallest callus formation, could be proven with the good reaction of these explants in MS multiplication medium with NAA to 0.093 mg L-1 and BAP to 0.45 mg L-1 during five subculture, with rate of constant multiplication of 5.288:1. In a second stage, with the use of apical sections of lateral buds, the adenine sulfate was evaluated in the multiplication medium. For the preparation of the establishment medium the best combination of the growth regulators was used NAA and kinetin obtained previously, while for the multiplication medium NAA was used to 0.093 mg L-1 and BAP to 0.45 mg L-1, and different levels of adenine sulfate (0; 30; 60; 90 and 120 mg L-1), associated with removal or not of the leaves of the rosette of leaves formed in the establishment medium. The tufts of shoots were subculture every 30 days in smaller tuft and, at the end of the fourth subculture they were made the evaluations of the fresh mass of the aerial part, number of capable shoots (&#8805; 5 mm) and no capable (< 5 mm) to the promoting root formation, and the visual aspect of the tufts of shoots. The best answers for the number of capable shoots to the promoting root formation (&#8805; 5 mm) they were found with the presence of the leaves, for the treatments 0, 30, 60 and 90 mg L-1 of adenine sulfate. It is recommended to use 30 mg L-1 of adenine sulfate in the multiplication medium for the quality and homogeneity of the produced aerial parts, with prolonged shoots and long petiole, with good pattern for subsequent promoting root formation. / Foram realizados experimentos em meio de estabelecimento e de multiplicação com o objetivo de avaliar a micropropagação do mamoeiro (Carica papaya L.) Híbrido Tainung 01 , geração F1, utilizando-se segmentos apicais e segmentos apicais de brotações laterais provenientes das plantas juvenis cultivadas em casa de vegetação. No meio de estabelecimento MS, utilizando-se segmentos apicais, foram testadas diferentes combinações dos reguladores de crescimento ANA (0,093; 0,931 e 1,862 mg L-1) e Cinetina (5,38; 10,76 e 21,52 mg L-1) para identificação da melhor relação para a sobrevivência, a reatividade e a massa de calo. Com a utilização de 0,093 mg L-1 de ANA combinado com 5,38 mg L-1 de Cinetina, obteve-se a melhor formação de roseta foliar com 100% de culturas reativas, indicando haver adaptação dos explantes in vitro, além da menor formação de calo, podendo ser comprovado com a boa reação destes explantes em meio de multiplicação MS com ANA a 0,093 mg L-1 e BAP a 0,45 mg L-1, durante cinco subcultivos, com taxa de multiplicação constante de 5,288:1. Numa segunda etapa, com a utilização de segmentos apicais de brotações laterais, avaliou-se a multiplicação em meio MS com diferentes níveis de sulfato de adenina. Para o preparo do meio de estabelecimento, utilizou-se a melhor combinação dos reguladores de crescimento ANA e Cinetina obtidos anteriormente, enquanto que para o meio de multiplicação, usou-se ANA a 0,093 mg L-1, BAP a 0,45 mg L-1 e diferentes níveis de sulfato de adenina (0; 30; 60; 90 e 120 mg L-1), associados com remoção ou não das folhas da roseta foliar formada no meio de estabelecimento. Os tufos de ramos foram subcultivados a cada 30 dias em tufos menores, e ao final do quarto subcultivo, foram feitas as avaliações da massa fresca da parte aérea, número de ramos aptos (&#8805; 5 mm) e não aptos (< 5 mm) ao enraizamento e o aspecto visual dos tufos de ramos. As melhores respostas para o número de ramos aptos ao enraizamento (&#8805; 5 mm) foram encontradas com a presença das folhas para os tratamentos 0, 30, 60 e 90 mg L-1 de sulfato de adenina. Recomenda-se utilizar 30 mg L-1 de sulfato de adenina no meio de multiplicação pela qualidade e homogeneidade das partes aéreas produzidas, com ramos alongados e pecíolos longos, com bom padrão para posterior enraizamento.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:22:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Thais_Cappellaro.pdf: 4211704 bytes, checksum: d61c0d95003eba8753dc50509ea70b01 (MD5) Previous issue date: 2010-03-26 / The olive tree (Olea europaea L.) is a member of the Oleaceae family which includes about 35 species of the genera Olea. All native and cultivated olive trees belong to the Olea europaea species. Researches with olive trees have recently been restarted in Brazil, and that is why there are little informations about this crop in this country. For this reason, it is important to develop studies about bloom period and pollen viability on olive cultivars such as Arbequina and Koroneiki. The objectives for this study were: to define the blooming period; to compare methods for pollen viability evaluation; to evaluate the effects of boric acid added to the medium on pollen germination; and to evaluate the viability of 12 months cold stored pollen, for these two cultivars. The data of bloom period for the two cultivars were obtained from 5 year-old trees grown in an orchard located in Bagé-RS, through observations made during the blooming period in the years of 2008 and 2009. Pollen viability of these two cultivars, were evaluated through three experiments in a laboratory. The first experiment were compared three methods of pollen viability evaluation: colorimetric method; in vitro germination; and in vivo germination. The variable was the pollen viability expressed as percentage (colorimetric, identified only by staining of pollen in vitro and in vivo, the percentage of pollen germinated). The second experiment were compared the effects on pollen germination of boric acid concentrations (0; 25; 50; 75; 100; or 125 mg.L-1) added to the germination medium containing agar 1% plus sucrose 15%. In a third experiment, pollens of both cultivars placed inside desiccators containing silica-gel and kept at -16°C for 12 months, were evaluated on their germination viability. It was observed that: In 2008, both cultivars started bloom on October 16th, and end of blooming on November 11th, while in 2009 the starting of bloom was on October 20th and the end of blooming on November 3rd for both cultivars. Therefore the blooming period was shorter in 2009 (21 days) as compared to that of 2008 (27 days); the colorimetric method make possible to identify highest percentages of viable pollen grains, however this method may overestimate pollen viability; the addition of boric acid to the media do not affect pollen germination; and pollen of both cultivars decreased their viability when stored in desiccators at -16°C during 12 months. / A oliveira (Olea europaea L.) pertence à família Oleaceae, a qual é composta por cerca de 35 espécies do gênero Olea. Todas as oliveiras cultivadas e as silvestres são da espécie europaea. No Brasil, há pouca pesquisa em realização, a qual foi praticamente interrompida nos últimos 30 anos. Somente nesta última década, a pesquisa com oliveiras foi reiniciada. Portanto, as informações técnicas obtidas em condições nacionais são quase inexistentes. Assim, é importante a realização de pesquisas para obtenção de conhecimentos quanto aos principais aspectos técnicos que abrangem sistemas de produção. O presente trabalho teve como objetivos determinar o período de floração e a viabilidade do pólen das cultivares de oliveira Arbequina e Koroneiki , em Bagé/RS, nos anos de 2008 e 2009. As avaliações do período de floração foram realizadas entre os meses de setembro a novembro. O delineamento foi inteiramente casualizado, sendo utilizado quatro repetições (planta). Em cada planta foram selecionados cerca de 200 rácimos florais por quadrante imaginário (Leste, Oeste, Norte e Sul), totalizando aproximadamente 800 rácimos/planta. Nos ramos e rácimos florais, identificou-se o estádio fenológico de cada estrutura vegetativa ou reprodutiva, utilizando a metodologia adaptada por Fernández- Escobar e Rallo (1981), na qual são definidos, resumidamente: a) repouso invernal (dormente); b) começo da brotação; c) formação dos rácimos florais; d) inchamento dos botões florais; e) diferenciação das corolas; f) início da floração; f1) plena floração; g) queda das pétalas; h) formação dos frutos. Para avaliar a viabilidade do pólen conduziram-se três experimentos em Laboratório, nos anos de 2008 e 2009. O primeiro experimento constou de diferentes testes de viabilidade do pólen (colorimétrico, germinação in vitro e germinação in vivo). A variável avaliada foi à viabilidade do pólen expressa em porcentagem (teste colorimétrico, identificada somente pela coloração do pólen; testes in vitro e in vivo, pela percentagem de pólen germinado). O segundo experimento foi composto de diferentes concentrações de ácido bórico (0, 25, 50, 75,100 e 125 mg.L-1) adicionadas a meios de culturas compostos por 1% de ágar e 15% de sacarose. A variável avaliada foi viabilidade do pólen caracterizada pela porcentagem de pólen germinado. O terceiro experimento comparou a viabilidade de polens armazenados durante 12 meses em dessecadores com sílica-gel com polens frescos (coletado e colocado para germinar após a deiscência das anteras). A variável avaliada foi viabilidade do pólen caracterizada pela ii porcentagem de pólen germinado. Segundo a metodologia utilizada, a floração das oliveiras Arbequina e Koroneiki , em 2008 e 2009, teve início nos dias 16 e 20 de outubro e término nos dias 11 e 09 de novembro. O período de floração para as duas cultivares, nos anos de 2008 e 2009 foi idêntico, sendo 27 e 15 dias, respectivamente. O método colorimétrico superestima o percentual de polens viáveis em oliveiras Arbequina e Koroneiki . O uso de ácido bórico no meio de cultura não influencia na germinação in vitro de pólen de cultivares de oliveira Arbequina e Koroneiki. Polens de oliveiras Arbequina e Koroneiki , armazenados a -16°C em dessecador com sílica-gel, durante doze meses, diminuem a porcentagem de viabilidade em ambas as cultivares. A oliveira (Olea europaea L.) pertence à família Oleaceae, a qual é composta por cerca de 35 espécies do gênero Olea. Todas as oliveiras cultivadas e as silvestres são da espécie europaea. No Brasil, há pouca pesquisa em realização, a qual foi praticamente interrompida nos últimos 30 anos. Somente nesta última década, a pesquisa com oliveiras foi reiniciada. Portanto, as informações técnicas obtidas em condições nacionais são quase inexistentes. Assim, é importante a realização de pesquisas para obtenção de conhecimentos quanto aos principais aspectos técnicos que abrangem sistemas de produção. O presente trabalho teve como objetivos determinar o período de floração e a viabilidade do pólen das cultivares de oliveira Arbequina e Koroneiki , em Bagé/RS, nos anos de 2008 e 2009. As avaliações do período de floração foram realizadas entre os meses de setembro a novembro. O delineamento foi inteiramente casualizado, sendo utilizado quatro repetições (planta). Em cada planta foram selecionados cerca de 200 rácimos florais por quadrante imaginário (Leste, Oeste, Norte e Sul), totalizando aproximadamente 800 rácimos/planta. Nos ramos e rácimos florais, identificou-se o estádio fenológico de cada estrutura vegetativa ou reprodutiva, utilizando a metodologia adaptada por Fernández- Escobar e Rallo (1981), na qual são definidos, resumidamente: a) repouso invernal (dormente); b) começo da brotação; c) formação dos rácimos florais; d) inchamento dos botões florais; e) diferenciação das corolas; f) início da floração; f1) plena floração; g) queda das pétalas; h) formação dos frutos. Para avaliar a viabilidade do pólen conduziram-se três experimentos em Laboratório, nos anos de 2008 e 2009. O primeiro experimento constou de diferentes testes de viabilidade do pólen (colorimétrico, germinação in vitro e germinação in vivo). A variável avaliada foi à viabilidade do pólen expressa em porcentagem (teste colorimétrico, identificada somente pela coloração do pólen; testes in vitro e in vivo, pela percentagem de pólen germinado). O segundo experimento foi composto de diferentes concentrações de ácido bórico (0, 25, 50, 75,100 e 125 mg.L-1) adicionadas a meios de culturas compostos por 1% de ágar e 15% de sacarose. A variável avaliada foi viabilidade do pólen caracterizada pela porcentagem de pólen germinado. O terceiro experimento comparou a viabilidade de polens armazenados durante 12 meses em dessecadores com sílica-gel com polens frescos (coletado e colocado para germinar após a deiscência das anteras). A variável avaliada foi viabilidade do pólen caracterizada pela ii porcentagem de pólen germinado. Segundo a metodologia utilizada, a floração das oliveiras Arbequina e Koroneiki , em 2008 e 2009, teve início nos dias 16 e 20 de outubro e término nos dias 11 e 09 de novembro. O período de floração para as duas cultivares, nos anos de 2008 e 2009 foi idêntico, sendo 27 e 15 dias, respectivamente. O método colorimétrico superestima o percentual de polens viáveis em oliveiras Arbequina e Koroneiki . O uso de ácido bórico no meio de cultura não influencia na germinação in vitro de pólen de cultivares de oliveira Arbequina e Koroneiki. Polens de oliveiras Arbequina e Koroneiki , armazenados a -16°C em dessecador com sílica-gel, durante doze meses, diminuem a porcentagem de viabilidade em ambas as cultivares.

The objectives of this work were to test different salt and sucrose concentrations in the in vitro medium and acclimatizing systems for production of strawberry stock plants. One experiment was conducted at the Breeding and Plant Propagation Laboratory and two experiments inside a screen house at the Department of Fitotecnia UFSM, from February to October, 2008. In the first experiment, sucrose 15; 30; 45 and 60g/L and salt ½; ¾ and 1 MS concentrations were compared, in a 3x4 factorial randomized experimental design, with five replications of five plantlets. Two evaluations were made, the first after plantlets were extracted from the in vitro medium and the second at the end of the acclimatizing period. In the first evaluation, the rate of survival, shoot height, number of roots, length of the bigger root and number of leaves of plantlets were determined. In the second evaluation, the same evaluations were done and also dry matter. In the second experiment, the effect of sucrose and salt concentrations on initial growth of stock plants was determined. Six plantlets of each in vitro medium of the previous experiment were used. The number of days from planting to the beginning of the stolon emission period, number of leaves and stolons, crown diameter and dry matter were determined 30 days after the acclimatizing period. In the third experiment, the acclimatizing systems made up by 128 cells polystyrene trays using organic substrate, polyethylene trays filled with sand and polyethylene trays filed with nutrient solution upon that plantlets floated were compared. The entirely randomized experimental design was used, with four replications of 10 plantlets. The rate of survival, shoot height, number of roots, length of the bigger root, number of leaves and shoot and root dry mass were determined. At the first evaluation of the first experiment, only number of leaves differed significantly, being higher in the 1 MS concentration. At the second evaluation, shoot height was higher in 1 MS, without difference from ¾ MS concentration. At the second experiment, the length of the bigger root was higher in ¾ MS, which did not differed from ½ MS. Dry mater and number of leaves of stock plants were higher by rooting plantlets in the 45 g/L sucrose and 1 MS salt concentrations. About acclimatizing systems, shoot height and number of leaves were higher in the 128 cells polystyrene trays using organic substrate while shoot and root dry matter were higher in the polyethylene trays filled with sand. It was concluded that for the clone Ivahé, the salt concentration may be reduced from 1 MS to ¾ MS and sucrose may be increased from 30 g/L to 45 g/L. About acclimatizing systems, the 128 cells polystyrene trays using organic substrate and the polyethylene trays filled with sand may be either used for acclimatizing plantlets of the Ivahé strawberry clone. / Este trabalho teve como objetivos testar diferentes concentrações de sais e de sacarose no meio de cultura e sistemas de aclimatização para a produção de mudas matrizes de morangueiro. Foi conduzido um experimento no Laboratório de Melhoramento e Propagação Vegetativa de Plantas e dois em abrigo telado, no Departamento de Fitotecnia da UFSM, entre fevereiro e novembro de 2008. No primeiro experimento, foram comparadas as concentrações de sacarose de 15, 30, 45 e 60g/L e de sais de ½, ¾ e 1 MS, em esquema fatorial 3x4 no delineamento inteiramente casualizado, com cinco repetições de cinco plântulas. Foram realizadas duas avaliações, uma na saída das plântulas do laboratório e outra após a aclimatização. Na primeira avaliação foi determinada a sobrevivência de plântulas, altura da parte aérea, número de raízes, comprimento da maior raiz e número de folhas. Na segunda avaliação essas determinações foram repetidas e foi também determinada a matéria seca de planta. No segundo experimento, foi determinado o efeito das concentrações de sais e sacarose no crescimento inicial das plantas matrizes. Foram utilizadas seis plântulas de cada concentração de meio empregadas no experimento anterior. Foi determinado o número de dias do transplante ao início do estolonamento, o número de folhas, número de estolões, diâmetro da coroa e matéria seca de plantas 30 dias após a aclimatização. No terceiro experimento, foram comparados os sistemas de aclimatização constituídos por bandejas alveoladas de poliestireno de 128 células com substrato orgânico, bandejas não alveoladas de polietileno com areia e bandejas não alveoladas com uma placa de poliestireno flutuante na solução nutritiva. O delineamento inteiramente casualizado foi empregado, com quatro repetições de 10 plântulas. Foi determinada a sobrevivência de plântulas, altura da parte aérea, número de raízes, comprimento da maior raiz, número de folhas e matéria seca de parte aérea e de raízes. No primeiro experimento, na primeira avaliação somente o número de folhas mostrou diferença significativa, sendo mais elevado na concentração 1 MS. Na segunda avaliação, a altura da parte aérea foi maior na concentração 1 MS, sem diferença de ¾ MS. No segundo experimento, o comprimento da maior raiz foi superior no tratamento ¾ MS, que não diferiu de ½ MS. A matéria seca e o número de folhas das plantas matrizes foram superiores quando as plântulas foram enraizadas na concentração de sacarose de 45gL e 1 MS de sais. Com relação aos sistemas de aclimatização, a altura da parte aérea e o número de folhas foram mais elevados no sistema de aclimatização em bandejas alveoladas com substrato, enquanto a matéria seca da parte aérea e das raízes foram superiores no sistema de bandejas não alveoladas com areia. Concluiu-se que para o clone Ivahé, a concentração de sais pode ser reduzida de 1 MS para ¾ MS e que a concentração de sacarose pode ser aumentada de 30 g/L para 45 g/L. Quanto aos sistemas de aclimatização, as bandejas alveoladas de poliestireno com substrato orgânico e as bandejas não alveoladas de polietileno com areia podem ser empregadas para aclimatizar plântulas do clone Ivahé.

A hemofilia A é uma doença ligada ao cromossomo X causada pela deficiência do fator VIII da coagulação sanguínea (FVIII). O tratamento disponível consiste na terapia de reposição da proteína do fator VIII derivada do plasma (FVIIIdp) ou recombinante (FVIIIr). Atualmente, dos 7 produtos recombinantes disponíveis no mercado, 6 são produzidos em linhagens celulares de roedores. A expressão dessa proteína em sistemas celulares não-humanos pode gerar uma molécula com perfil de modificações diferente do endógeno, podendo levar a reações imunogênicas e geração de inibidores anti-FVIIIr. Em função disso, novas estratégias de produção têm sido avaliadas, como a utilização de células hospedeiras mais eficientes no que diz respeito ao potencial de expressão da proteína de interesse. Dentre as linhagens de interesse, a linhagem hepática SK-HEP-1 tem se destacado por apresentar altos níveis de expressão do FVIIIr e potencial para o cultivo em suspensão em meios livres de soro fetal bovino (SFB). Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de FVIIIr na linhagem celular humana SK-Hep-1 comparando duas estratégias para o estabelecimento de processos de produção em condições livres de soro e em suspensão: Estratégia 1 - adaptação para tais condições da linhagem já modificada geneticamente e Estratégia 2 - modificação gênica para a expressão da proteína já em células previamente adaptadas à tais condições. Para a estratégia 1, foram geradas duas linhagens recombinantes produtoras de FVIIIr, SK-HEP-F8/Neo-E1 e SK-HEP-F8/GFP-E1 aderentes e em cultivos suplementados com SFB. Na caracterização da cinética e produção do FVIIIr as linhagens apresentaram taxas específicas máxima de crescimento (?max) de 0,064 e 0,0031h-1 produzindo 1,0 e 0,78UI/mL de FVIIIr, respectivamente. Diversos protocolos de adaptação foram empregados, entretanto, não foi possível obter sucesso na adaptação das linhagens recombinantes para condições livres de soro e em suspensão. Para a estratégia 2, as células SK-HEP-1 selvagens adaptadas ao meio de cultura livre de SFB SFMII apresentaram um valor de ?max de 0,0186h-1 e Xmax de 1,9x106cels/mL. Para as etapas de modificação gênica da linhagem selvagem foram utilizados os mesmos vetores lentivirais empregados para a geração das células recombinantes aderentes, pLVmpsvFVIII?B-Neo e pLVCMVFVIII?B-GFP. Para o primeiro, não foi possível gerar uma linhagem produtora do FVIIIr. Para o segundo, foi possível obter duas linhagens produtoras do FVIIIr com 0.14 e 0.12IU/mL de atividade pelo ensaio cromogênico. O presente trabalho mostrou que a linhagem humana Sk-Hep-1 é apropriada para a produção de altos níveis de FVIIIr. No entanto, maiores esforços devem ser voltados ao desenvolvimento de meios de cultura livres de soro específicos para a linhagem para possibilitar a produção eficiente do FVIIIr em suspensão em meios livre de soro. / Hemophilia A is a genetic X-linked disorder caused by the coagulation factor VIII (FVIII) deficiency. The current treatment is the replacement therapy with plasma derived FVIII (pdFVIII) or recombinant FVIII (rFVIII) products. Nowadays, of the seven products available in the market, six are produced in rodent expression systems, which can result in a rFVIII molecule with different post-translational modifications and may lead to immune responses to non-human epitopes. Therefore, new production strategies have been evaluated, as the use of more efficient hosts in terms of protein expression potential. Among potential cell lines, the hepatic SK-HEP-1 cell line features high levels of rFVIII production and potential for serum-free suspension culture. In face of the exposed above, the goal of this study was to evaluate rFVIII production in the SK-HEP-1 human cell line comparing two strategies for the establishment of production process in a suspension serum-free condition: strategy 1 - adaptation to these conditions of a genetic modified cell line; strategy 2 - genetic modification of an already adapted cell line to rFVIII protein expression. For strategy 1, two adherent rFVIII producer cell lines were established in serum containing medium, SK-HEP-F8/Neo-E1 e SK-HEP-F8/GFP-E1. Characterization of cell growth and rFVIII production showed a maximum specific growth rate (?max) of 0.064 and 0.00311h-1 with rFVIII production of 1.0 and 0.78UI/mL, respectively. Different adaptation protocols were used; however, it was not possible to adapt the recombinant cell lines to growth in suspension serum-free conditions. For strategy 2, the wildtype SK-HEP-1 cell line adapted growth in SFMII BSF medium, showed a ?max of 0.0186h-1 and a maximum cell concentration (Xmax) of 1.9x106cells/mL. For the genetic modification, it were employed the same lentiviral vectors used for the recombinant adherent cells generation, pLVmpsvFVIII?B-Neo and pLVCMVFVIII?B-GFP. For the first, no attempts were successful. For the second, it was possible to generate two rFVIII producer populations with 0.14 and 0.12IU/mL activity, measured by chromogenic assay. These results demonstrate that the SK-HEP-1 cell line is appropriate for the production of high levels of rFVIII. Nevertheless, efforts should be made in developing specific medium to support efficient rFVIII production in suspension and suspension serum-free conditions.

A hemofilia A é uma doença ligada ao cromossomo X causada pela deficiência do fator VIII da coagulação sanguínea (FVIII). O tratamento disponível consiste na terapia de reposição da proteína do fator VIII derivada do plasma (FVIIIdp) ou recombinante (FVIIIr). Atualmente, dos 7 produtos recombinantes disponíveis no mercado, 6 são produzidos em linhagens celulares de roedores. A expressão dessa proteína em sistemas celulares não-humanos pode gerar uma molécula com perfil de modificações diferente do endógeno, podendo levar a reações imunogênicas e geração de inibidores anti-FVIIIr. Em função disso, novas estratégias de produção têm sido avaliadas, como a utilização de células hospedeiras mais eficientes no que diz respeito ao potencial de expressão da proteína de interesse. Dentre as linhagens de interesse, a linhagem hepática SK-HEP-1 tem se destacado por apresentar altos níveis de expressão do FVIIIr e potencial para o cultivo em suspensão em meios livres de soro fetal bovino (SFB). Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de FVIIIr na linhagem celular humana SK-Hep-1 comparando duas estratégias para o estabelecimento de processos de produção em condições livres de soro e em suspensão: Estratégia 1 - adaptação para tais condições da linhagem já modificada geneticamente e Estratégia 2 - modificação gênica para a expressão da proteína já em células previamente adaptadas à tais condições. Para a estratégia 1, foram geradas duas linhagens recombinantes produtoras de FVIIIr, SK-HEP-F8/Neo-E1 e SK-HEP-F8/GFP-E1 aderentes e em cultivos suplementados com SFB. Na caracterização da cinética e produção do FVIIIr as linhagens apresentaram taxas específicas máxima de crescimento (?max) de 0,064 e 0,0031h-1 produzindo 1,0 e 0,78UI/mL de FVIIIr, respectivamente. Diversos protocolos de adaptação foram empregados, entretanto, não foi possível obter sucesso na adaptação das linhagens recombinantes para condições livres de soro e em suspensão. Para a estratégia 2, as células SK-HEP-1 selvagens adaptadas ao meio de cultura livre de SFB SFMII apresentaram um valor de ?max de 0,0186h-1 e Xmax de 1,9x106cels/mL. Para as etapas de modificação gênica da linhagem selvagem foram utilizados os mesmos vetores lentivirais empregados para a geração das células recombinantes aderentes, pLVmpsvFVIII?B-Neo e pLVCMVFVIII?B-GFP. Para o primeiro, não foi possível gerar uma linhagem produtora do FVIIIr. Para o segundo, foi possível obter duas linhagens produtoras do FVIIIr com 0.14 e 0.12IU/mL de atividade pelo ensaio cromogênico. O presente trabalho mostrou que a linhagem humana Sk-Hep-1 é apropriada para a produção de altos níveis de FVIIIr. No entanto, maiores esforços devem ser voltados ao desenvolvimento de meios de cultura livres de soro específicos para a linhagem para possibilitar a produção eficiente do FVIIIr em suspensão em meios livre de soro. / Hemophilia A is a genetic X-linked disorder caused by the coagulation factor VIII (FVIII) deficiency. The current treatment is the replacement therapy with plasma derived FVIII (pdFVIII) or recombinant FVIII (rFVIII) products. Nowadays, of the seven products available in the market, six are produced in rodent expression systems, which can result in a rFVIII molecule with different post-translational modifications and may lead to immune responses to non-human epitopes. Therefore, new production strategies have been evaluated, as the use of more efficient hosts in terms of protein expression potential. Among potential cell lines, the hepatic SK-HEP-1 cell line features high levels of rFVIII production and potential for serum-free suspension culture. In face of the exposed above, the goal of this study was to evaluate rFVIII production in the SK-HEP-1 human cell line comparing two strategies for the establishment of production process in a suspension serum-free condition: strategy 1 - adaptation to these conditions of a genetic modified cell line; strategy 2 - genetic modification of an already adapted cell line to rFVIII protein expression. For strategy 1, two adherent rFVIII producer cell lines were established in serum containing medium, SK-HEP-F8/Neo-E1 e SK-HEP-F8/GFP-E1. Characterization of cell growth and rFVIII production showed a maximum specific growth rate (?max) of 0.064 and 0.00311h-1 with rFVIII production of 1.0 and 0.78UI/mL, respectively. Different adaptation protocols were used; however, it was not possible to adapt the recombinant cell lines to growth in suspension serum-free conditions. For strategy 2, the wildtype SK-HEP-1 cell line adapted growth in SFMII BSF medium, showed a ?max of 0.0186h-1 and a maximum cell concentration (Xmax) of 1.9x106cells/mL. For the genetic modification, it were employed the same lentiviral vectors used for the recombinant adherent cells generation, pLVmpsvFVIII?B-Neo and pLVCMVFVIII?B-GFP. For the first, no attempts were successful. For the second, it was possible to generate two rFVIII producer populations with 0.14 and 0.12IU/mL activity, measured by chromogenic assay. These results demonstrate that the SK-HEP-1 cell line is appropriate for the production of high levels of rFVIII. Nevertheless, efforts should be made in developing specific medium to support efficient rFVIII production in suspension and suspension serum-free conditions.