Florações de cianobactérias tóxicas em corpos dágua doce usados como fonte para o consumo humano, recreação e irrigação são freqüentes nos dias de hoje devido à eutrofização destes ambientes. O monitoramento de linhagens tóxicas é importante para a prevenção dos efeitos adversos causados por suas toxinas na saúde de humanos e animais. Métodos rápidos e sensíveis para a detecção precoce das cianobactérias tóxicas em estações de tratamento de água e em programas de monitoramento de mananciais são de fundamental interesse para a prevenção desses efeitos. Atualmente, contagem de células, identificação de cianobactérias por microscopia óptica e análises químicas ou imunológicas das toxinas são usadas nos monitoramentos. Em anos recentes, métodos moleculares estão sendo desenvolvidos e propostos para o diagnóstico rápido e sensível da presença de cianobactérias tóxicas em diversos ambientes. Este estudo teve por objetivo implementar uma metodologia capaz de acessar e quantificar as cianobactérias do gênero Microcystis na Praia dos Namorados, no reservatório de Salto Grande, Americana, SP, local cujo uso recreacional é bastante intenso e florações de cianobactérias são freqüentemente observadas. Simultaneamente, buscou-se detectar o potencial de produção de microcistinas desses organismos. A técnica de PCR Quantitativa em Tempo Real (qPCR) foi empregada com essa finalidade e dois conjuntos de oligonucleotídeos LUX foram desenvolvidos tendo como alvo dois genes distintos. Seqüências de cpcBA-IGS do operon da ficocianina (PC) foram obtidas para sete linhagens de cianobactérias brasileiras, as quais foram alinhadas com outras seqüências existentes em banco de dados público, e permitiram o desenho dos iniciadores de qPCR QPCF/QPCR, capazes de amplificar fragmentos de 144 pb. Da mesma forma, outras 11 sequências inéditas foram obtidas para uma região do domínio da N-methyltransferase do gene da sintetase de microcistinas (mcyA) e permitiram o desenvolvimento dos iniciadores QmcyANMTF/ QmcyA-NMTR, capazes de amplificar fragmentos de 154 pb. Ambos os conjuntos foram marcados uma única vez com os fluoróforos FAM (QPCF/QPCR) ou JOE (QmcyA-NMTF/QmcyA-NMTR). Curvas de calibração para ambos os genes foram estabelecidas com regressão linear simples usando os valores de Ct (número de ciclos da qPCR em que a fluorescência atinge um limiar fixo pré-determinado) e concentrações conhecidas de DNA gênomico (em número de células equivalente) da Microcystis sp. NPLJ-4 (produtora de microcistina). As diluições utilizadas para o estabelecimento dessas curvas variaram de 1:10 a 1:10-5 e as concentrações de DNA foram correlacionadas com o respectivo número de células na amostra, obtido pela técnica de Utermöhl em laboratório certificado, como metodologia independente. Para PC e mcyA, as equações de regressão foram y = 43,977 - 1,8097Ln(x) (R2 = 0,99, p<0,05) e y = 42,932 - 1,8449Ln(x) (R2 = 0,99, p<0,05), respectivamente, sendo y = Ct com limiar de fluorescência fixo avaliado em 0,03 e x = quantidade de DNA na amostra em concentrações conhecidas (dada como log do número de células equivalente). Para ambos os genes analisados, o limite de detecção foi de 100 células por reação. Eficiências de 79 e 76% foram alcançadas nas amplificações para PC e mcyA, respectivamente. Posteriormente, essa metodologia foi aplicada a duas outras linhagens isoladas de Microcystis e em amostras ambientais de água, que foram coletadas sempre no mesmo ponto (Praia dos Namorados), em quatro períodos distintos (dez 06, abr 07, set 07 e nov 07). Genótipos PC (em número de células mL-1) foram quantificados pela técnica de qPCR em todas as amostras analisadas. Porém, genótipos mcy puderam ser determinados apenas em M. aeruginosa NPJB1 (0,5%) e na amostra referente à primeira coleta (2,7%). Os resultados de número de células em todas as análises feitas usando a técnica de Utermöhl foram superiores aos obtidos pela qPCR. A comparação entre as médias dos valores de quantificações gerados por Utermöhl e qPCR (PC) mostrou diferença significativa (Teste t de Student, p <0,05). Nas amostras ambientais, com exceção da primeira coleta, a presença de outros gêneros de cianobactérias cocóides, como Radiocystis e Sphaerocavum, foi observada, e suas distinções não foram possíveis nas observações microscópicas após a disrupção das colônias. Estudos adicionais realizados com a região cpcBA-IGS desses outros gêneros mostraram 96% de identidade com Microcystis, e seqüências IGS bastante similares. Assim, existe a possibilidade de que os iniciadores desenhados neste estudo estejam também amplificando esses dois gêneros de cianobactérias. Em adição, a contagem em microscópio pode ter superestimado os resultados, enquanto que a técnica de qPCR mostrou baixa eficiência de amplificação. O ensaio imunológico ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) identificou a produção de microcistinas dos tipos LR, RR ou YR em todas as amostras com concentrações maiores que 0,1 g L-1, com exceção da M. aeruginosa NPCD1 (não produtora de microcistinas). Os resultados obtidos neste estudo indicam que o número de células de Microcystis, estimado pela técnica de qPCR pode ser usado para o monitoramento ambiental na Praia dos Namorados, em atendimento à Portaria MS 518. Além disso, demonstram que é possível inferir a proporção de genótipos mcyA a partir da determinação de genótipos PC. Contudo, a validação dessa técnica requer maiores estudos, incluindo a utilização de mais gêneros de cianobactérias e análises de outros reservatórios brasileiros, para melhor avaliar sua confiabilidade para uso no monitoramento ambiental. Para fins de monitoramento em larga escala, a técnica de qPCR mostrou-se mais viável economicamente em relação à contagem de células por microscopia, devido a sua maior capacidade de processamento (18 amostras dia-1) / Toxic cyanobacterial blooms in freshwater bodies used as a source for human consumption, recreation and irrigation are frequent nowadays due to the eutrofication of these environments. The monitoring of toxic strains is important for the prevention of the side effects caused by their toxins in human and animal health. Rapid and sensitive methods for early detection of toxic cyanobacteria in water treatment stations and aquatic monitoring programs are essential for the prevention of these effects. Currently, cells counting, cyanobacterial identification using optical microscopy and chemical or immunological analyses of the toxins are applied for monitoring purposes. In recent years, molecular approaches are being developed and proposed for rapid and sensitive diagnosis of the presence of toxic cyanobacteria in several environments.This study aimed to implement a methodology capable of access and quantify Microcystis cyanobacterial genus at the Praia dos Namorados, in the Salto Grande reservoir, Americana, SP, where recreation is very intense and cyanobacterial blooms are frequently observed. Simultaneously, it was searched to detect the potential for microcystins production by these organisms. The Real Time Quantitative PCR (qPCR) technique was employed for these purpose and two sets of LUX primers were developed to target two distinct genes. Sequences of cpcBA-IGS of the phycocyanin operon (PC) were obtained for seven Brazilian cyanobacterial strains, which were aligned with other existing public database sequences, and allowed to design the qPCR QPCF/QPCR primers, able to amplify fragments of 144 bp. In the same way, 11 novel sequences were obtained from a region of the N-methyltransferase domain of the microcystin sinthetase gene (mcyA) and allowed the development of QmcyANMTF/ QmcyA-NMTR primers, able to amplify fragments of 154 bp. Both primer sets were labeled only once with FAM (QPCF/QPCR) or JOE (QmcyA-NMTF/QmcyA-NMTR) fluorophors. Standard curves for both genes were established with simple linear regression using the Ct values (the PCR cycle numbers at which the fluorescence reaches a predetermined threshold level) and known Microcystis sp. NPLJ-4 (microcystin producer) genomic DNA concentrations (in cell number equivalents). The dilutions used for the establishment of these curves ranged from 1:10 to 1:10-5 and the DNA concentrations were correlated with the respective cell numbers of the sample, obtained by Utermöhl technique in a certified laboratory, as an independent methodology. For PC and mcyA, the regression equations were y = 43.977 - 1.8097Ln(x) (R2 = 0.99, p<0,05) and y= 42.932 - 1.8449Ln(x) (R2 = 0.99, p<0,05), respectively, where y is the Ct at the set fluorescence threshold level (0.03) and x is the amount of known DNA concentrations in the sample (given as log cell number equivalents). For both analyzed genes, the detection limit was 100 cells per reaction. Efficiencies of 79 and 76% were achieved for PC and mcyA amplifications, respectively. Subsequently, this methodology was applied to two other isolated Microcystis strains and to environmental water samples, which were collected always in the same location (Praia dos Namorados), in four different periods (Dez 06, Apr 07, Set 07 and Nov 07). PC genotypes (in cell numbers mL-1) were quantified by the qPCR technique in all analyzed samples. However, mcy genotypes could be determined only in M. aeruginosa NPJB1 (0.5%) and in the first collected sample (2.7%). The results of cell numbers in all the analyses performed using Utermöhl technique were superior then those obtained by qPCR. The comparison between the average quantification values generated by Utermöhl and qPCR (PC) showed significant difference (Test t of Student, p<0,05). In the environmental samples, except for the first one collected, the presence of other cocoid cyanobacterial genera, such as Radiocystis and Sphaerocavum, was observed, and their distinctions were not possible by microscope observation after colonies disruption. Further studies carried out with the cpcBA-IGS region of these other genera showed 96% of identity with Microcystis, and very similar IGS sequences. Then, there is a possibility that the primers designed in this study are also amplifying these two cyanobacterial genera. In addition, microscopic cells counting may have overestimated the results, whereas qPCR technique showed low efficiency of amplification. The ELISA immunological assay (\"Enzyme-Linked Immunosorbent Assay\") identified the LR, RR or YR microcystins types in all samples analysed with concentrations higher than 0.1 mg L-1, with exception of M. aeruginosa NPCD1 (no microcystin producer). The results obtained in this study suggest that Microcystis cell numbers estimated by qPCR technique can be used for the environmental monitoring of the Praia dos Namorados, in attendance to the MS 518 regulation. Furthermore, they demonstrate that it is possible to infer the mcyA genotypes proportion from the PC genotypes determination. However, further studies are required for the validation of this technique, including the use of more cyanobacterial genera and other Brazilian reservoirs analyses, to better evaluate the reliability for its use in the environmental monitoring. For large scale monitoring, the qPCR technique is more economically viable when compared to the microscopic cells counting, due to its large processing capacity (18 samples day-1)

A cultura de cana-de-açúcar ocupa posição de destaque nos cenários nacional e internacional devido principalmente a produção de etanol como fonte de energia renovável e menos nociva ao ambiente. Entretanto um dos obstáculos à produtividade é a ocorrência de várias doenças dentre elas a escaldadura das folhas causada por Xanthomonas albilineans. Bactérias endofíticas e rizosféricas pertencentes ao gênero Burkholderia tem sido isoladas com alta frequência em diferentes culturas como, por exemplo, a cana-de-açúcar. Nas últimas décadas, estas bactérias têm recebido especial atenção devido ao seu potencial como promotoras de crescimento vegetal, como agentes de biorremediação, mas muito pouco é explorado quanto ao potencial biotecnológico dessas bactérias como agentes de biocontrole de doenças. Visto que essas bactérias vivem em um ambiente altamente competitivo e sujeito a flutuações ambientais, representam uma fonte altamente significativa de metabólitos secundários bioativos, como as bacteriocinas sintetizadas ribossomicamente e outros peptídeos não ribossomais. Portanto, os objetivos principais deste trabalho foram determinar a frequência de linhagens de Burkholderia spp. endofíticas e da rizosfera de cana-deaçúcar capazes de produzir bacteriocinas e outros metabólitos secundários e por meio de mutagênese aleatória por transposon, identificar genes associados a produção desses metabólitos. Os resultados de caracterização permitiram concluir que as bactérias endofíticas e rizosféricas pertencentes ao gênero Burkholderia avaliadas apresentaram grande potencial em produzir metabólitos com atividade antibacteriana in vitro; sendo capazes de controlar X. albilineans importante patógeno da cultura de cana-de-açúcar. Para uma das linhagens foi obtida uma biblioteca de mutantes, a qual foi parcialmente caracterizada quanto à alteração da atividade antibacteriana. Foram identificados doze mutantes que apresentaram perda da atividade antibacteriana. A análise das sequências flanqueadoras do transposon para os doze mutantes permitiu a identificação de genes associados a produção de bacteriocinas, a regulação da expressão gênica, a enzimas possivelmente associadas ao metabolismo secundário, ao metabolismo geral da célula e a proteínas hipotéticas. A identificação e clonagem de tais genes permitirão uma maior compreensão da produção desses compostos e futuras aplicações biotecnológicas. / The sugarcane crop has an important role in international and national scenery mainly because the ethanol production as a sustainable energy source and less harmful to the environment. However one of the obstacles to the productivity is the occurrence of several diseases among them leaf scald caused by Xanthomonas albilineans. Endophytic and rhizospheric bacteria that belong to the Burkholderia genus have been isolated in high frequency in different cultures, such as sugarcane. In the last decades, these bacteria have been receiving attention due their potential as plant growth promoters, bioremediation agents. However, the biotechnological potential of these bacteria as agents of diseases biocontrol is very poorly evaluated. Since these bacteria live in a highly competitive environment and subject to environmental fluctuations, they may represent a highly significant source of bioactive secondary metabolites, as ribosomal synthesized bacteriocins and other nonribosomal peptides. Therefore, the main aim of this work was to determine the frequency of bacteriocin and secondary metabolites production by endophytic and rhizospheric isolates of Burkholderia spp. from sugarcane. Also, the genes associated to synthesis of these metabolites were identified by random mutagenesis based on Tn5 transposon. The results showed that endophytic and rhizospheric Burkholderia spp. present in vitro potential to production of metabolites with antibacterial activity; being inhibited X. albilineans, an important pathogen of sugarcane crops. For one of the Burkholderia strain it was obtained a mutant library, which was partially characterized according to antibacterial activity. Twelve mutants that showed the loss of antibacterial activity were identified and further evaluated. Also, the analysis of the transposon flanking sequences for these mutants indicated that genes associated to the bacteriocin production, regulation of gene expression, enzymes possibly associated to the secondary metabolism, general metabolism of the cell and hypothetical proteins are related to loss of inhibition ability. The identification and cloning of such genes will allow a better understanding of the production of theses compounds and further biotechnological applications.

A agricultura moderna exige que as operações de manejo das plantas daninhas sejam economicamente viáveis, e principalmente seguras em termos de minimização da contaminação ambiental. A preocupação sobre a utilização intensiva de herbicidas sintéticos tem sido debatida constantemente, de tal forma que pesquisas têm sido desenvolvidas estrategicamente para a descoberta de novas moléculas herbicidas, baseadas em produtos naturais, para aplicação direta como agente de controle ou utilização indireta como aleloquímico. O solo é habitado por uma grande variedade de microrganismos, sendo que a maioria deles não foi estudada e identificada até o momento, conseqüentemente muitas pesquisas ainda podem ser desenvolvidas com o objetivo de explorar metabólitos secundários produzidos por estes microrganismos. Sendo assim, foi desenvolvida a presente pesquisa com o objetivo de testar e desenvolver uma fase inicial na seleção e descoberta de microrganismos do solo (actinomicetos) com potencial de produção de compostos fitoinibitórios. O método geral de seleção constituiu-se na coleta de amostras de solo de 0-20 cm de profundidade, a partir de áreas com diferentes sistemas de manejo e/ou vegetação. Estas amostras de solo foram então submetidas ao isolamento de actinomicetos (10 g de solo de cada amostra) através da diluição em série e plaqueamento em meio seletivo. Foram isoladas e cultivadas em meio líquido glicerina-caseína 103 colônias, sendo que, a solução de metabólitos acelular foi obtida por centrifugação e filtragem. A partir das soluções contendo os metabólitos foi conduzido um teste de germinação (screening primário) através de bioensaios de laboratório, utilizando como plantas teste pepino (Cucumis sativa) e sorgo (Sorghum bicolor). Com o objetivo de verificar a concentração do meio de cultura que exerceria o mínimo de efeito na germinação e crescimento/desenvolvimento das plântulas, foi realizado um teste de germinação com o meio de cultura sem os metabólitos microbiológicos, sendo avaliado através de análise de regressão dos resultados obtidos. O screening secundário foi realizado em condições de câmara-de-crescimento e consistiu na aplicação do meio de cultura acelular em condições de pré e pós-emergência das plantas de pepino e sorgo. Os screenings primário e secundário resultaram na seleção de sete microrganismos produtores de composto fitoinibitórios, estes utilizados para condução do experimento em condições de casa-de-vegetação, sendo aplicadas as soluções de metabólitos em condições de pré e pós-emergência das plantas de pepino, sorgo, picão-preto (Bidens pilosa) e capim colchão (Digitaria ciliaris). A conclusão principal desta pesquisa foi de que o método para seleção de isolados de actinomicetos, com potencial de produção de fitotoxicinas é adequado, e pode ser utilizado em um programa de descoberta de novos compostos com potencial herbicida, no entanto, os resultados obtidos não permitiram isolar actinomicetos com suficiente potencial fitoinibitório, para ser utilizado de forma direta em um programa de manejo de plantas daninhas na agricultura. / The modern agriculture requires that the weed management practices are economically feasible, and mainly safe for the minimization of the environmental contamination. The concern on the intensive use of synthetic herbicides has been debated constantly, in such way that researches have been developed strategically for the discovery of new herbicides molecules, based on natural products, either for direct application as control agent, or for indirect use as allelochemical. The soil is colonized by a great variety of microorganisms, however most of them were not studied and identified at the moment, consequently many researches still can be done, with the objective of exploring secondary metabolites produced by these microorganisms. Therefore, it was developed this research with the objective of testing and developing a initial process in the selection and discovery of soil microorganisms (actinomycetes) with potential of producing phytoinhibitory compounds. The general method used in the research consisted of soil sampling at 0-20 cm depth, from areas that had been cultivated with different cropping systems and/or vegetation. These soil samples were submitted to actinomycets isolation (10 g of soil per sample) through series dilution in selective medium. It was isolated and cultivated in liquid casein-glycerin medium 103 colonies, being the no cellular metabolite solution obtained by centrifugation and filtration. From the solutions containing the metabolites it was conducted a germination test (primary screening) through a laboratory bioassay with test plants of cucumber (Cucumis sativus) and sorghum (Sorghum bicolor). Objectifying to verify each of the cultivation medium concentrations that would cause the minimum effect on germination and growth/development of seedlings, it was also conducted a germination test with medium without the microbial metabolites, being evaluated through regression analysis results. The secondary screening was done in the growth chamber conditions, and consisted of application of no cellular medium in pre and post emergence conditions of the plants of sorghum and cucumber. The primary and secondary screening resulted in the selection of seven microorganisms producers of phytoinhibitory compounds, these used to conduct an experiment in the greenhouse, being sprayed the metabolic solutions in pre and post emergence conditions of cucumber, sorghum, Bidens pilosa and Digitaria ciliaris. The main conclusion of the research was that the method used for actinomycets selection and isolation, with potential of phytotoxins production is adequate and can be used in a new compounds discovery program with potential herbicide effects; however the results obtained did not allow isolating actinomycets with enough phytoinhibitory potential to be directly used in a program of weed management in agriculture.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The production of a bioherbicida for the biological control of weeds requires the development of a series of steps ranging from the selection of a suitable microbial strain for the production of product having herbicidal action until final formulation. Thus, this study aimed to select microorganisms from biological resources of the Pampa biome with potential for producing phytotoxins. Systematic samplings were performed with infectious symptoms in rice-growing areas and natural pastures of the Pampa biome. The first stage of the research was to select isolates with pathogenic potential inhibition test plants seedlings (Cucumis sativus L. var wisconsin.). The fungus that showed the best inhibitory effect was the VP51, identified through the use of molecular biology techniques, classified as Diaporthe sp. For optimization studies by means of submerged fermentation, industrial waste corn steep liquor were used (AMM) and sorghum (MAS), compared to synthetic medium. The means of submerged fermentation industry (AMM) showed better growth of fungal biomass and effect on test plant germination. In submerged fermentation bioreactor STR type, the rotation effect is significant, and the best results were obtained in tests with less rotation. In the pre-germination tests plants dormant and hard seeds were recorded, with a satisfactory result as biocontrol potential germination. / A produção de um bioherbicida para o controle biológico de plantas daninhas requer o desenvolvimento de uma série de etapas que vão desde a seleção de uma cepa microbiana apropriada para a produção do produto com ação herbicida até a sua formulação final. Nesse sentido, esse trabalho teve como objetivo selecionar micro-organismos a partir dos recursos biológicos do bioma Pampa com potencial na produção de fitotoxinas. Foram realizadas coletas sistemáticas de plantas com sintomas infecciosos em áreas de cultivo de arroz irrigado e pastagens naturais do bioma Pampa. A primeira etapa da pesquisa foi selecionar isolados fitopatogênicos com potencial de inibição de plântulas de plantas-teste (Cucumis sativus L. var wisconsin.). O fungo que apresentou o melhor efeito inibitório foi o VP51, identificado através do uso de técnicas de biologia molecular, classificado como Diaporthe sp. Para estudos de otimização do meio de fermentação submersa, foram utilizados resíduos industriais de água de maceração de milho (AMM) e de sorgo (MAS), comparando com o meio sintético. O meio de fermentação submersa em meio industrial (AMM) apresentou melhor crescimento de biomassa fúngica e efeito na germinação de plantas-teste. Na fermentação submersa em biorreator do tipo STR, o efeito da agitação foi significativo, sendo que os melhores resultados foram obtidos nos ensaios com menor agitação. Na germinação das plantas testes foram registradas sementes dormentes e duras, sendo um resultado satisfatório como potencial biocontrole da germinação.

As algas vermelhas, filo Rhodophyta, representam uma das maiores e mais antigas linhagens de organismos eucarióticos. Dentre as Rhodophyta, o gênero Laurencia J.V. Lamouroux (Ceramiales) é um dos mais completos do ponto de vista químico, pois consiste no maior produtor de metabólitos secundários e assim, destaca-se como uma fonte fascinante de novos produtos naturais, biologicamente ativos. Desta forma, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o potencial farmacológico dos extratos das espécies de Laurencia frente às atividades biológicas, assim como a análise da composição bioquímica e identificação de seus constituintes químicos. As espécies utilizadas foram L. aldingensis (LA), L. catarinensis (LC), L. dendroidea (LD), L.intricata (LI). Adicionalmente L. translúcida (LT), Palisada flagellifera (PF), P.perforata (PP) e uma variante pigmentar de LD (LDV) foram utilizadas para comparação. Para o desenvolvimento das atividades propostas foram utilizados extratos fracionados obtidos sucessivamente através dos solventes hexano (EH), clorofórmio (EC), metanol (EM), água (EA) e também extrato aquoso bruto (EAB). A análise de proteínas foi feita com os métodos de Bradford, Ácido bicinconínico (BCA) e absorção na luz UV a 280 nm. Destes, o método de Bradford mostrou-se o mais adequado Na dosagem de ficobilinas, a ficoeritrina se apresentou em maior quantidade em todas as espécies testadas em relação à ficocianina e aloficocianina. O ensaio para avaliação da atividade antimicrobiana usando vários patógenos foi feito por microdiluição em placa seguindo a NCCLS e as concentrações inibitórias mínimas (CIM) foram obtidas espectrofotometricamente. Em bactérias, LA-EH foi bactericida contra P. aeruginosa a uma concentração de 62,8 &mu;g.mL-1 e os extratos LA-EM e LC-EH tiveram uma ação bacteriostática forte contra S. pneumoniae nas concentrações de 51,1 e 85,1 &mu;g.mL-1, respectivamente. No ensaio antifúngico, LA-EH e LA-EC foram fungicidas contra C.parapsilosis a 49,0 e 57,8 &mu;g.mL-1, respectivamente. O ensaio antioxidante foi feito usando-se o método com DPPH, em que os EC apresentaram-se como os melhores extratos possuidores de moléculas capazes de doar prótons. Para o teste anticolinesterásico foi feito o ensaio qualitativo em CCD e ensaio quantitativo em microplaca pelo método de Ellman que puderam demonstrar a atividade inibidora da AChE sendo menor que 50 % , mesmo para concentrações de 600 &mu;g.mL-1. O perfil foi muito semelhante em todos os extratos testados no qual os EH e EC foram os mais ativos e os EM possivelmente deram um falso positivo, enquanto os extratos EA e EAB tiveram atividades baixas. No ensaio contra o fitopatógeno causador da antracnose no mamão, Colletotrichum gloesporioides, os resultados mostram que LC-EH e LD-EH são os mais ativos, com IC50 de 70 e 40 &mu;g.mL-1, respectivamente. Para o ensaio citotóxico contra células de mamíferos está sendo desenvolvido um modelo em que se utilizam células MES-SA e sua correspondente mutante (MES-SA/Dx5) multiresistente a drogas. O modelo proposto é bastante promissor e, do screening inicial sugere-se uma investigação mais detalhada em LD-EH e LT-EH cujos IC50 foram de 91 &mu;g.mL-1 e 16 &mu;g.mL-1, respectivamente, contra MES-SA. Uma investigação química de cada uma das frações dos extratos das espécies LA, LC, LD e LI foi realizada utilizando-se o CG-EM. Para identificação das substâncias foi utilizada a biblioteca do equipamento e literatura disponível através da comparação dos espectros de massas, tempo de retenção e Índice de Kovat´s. Os resultados obtidos neste estudo apresentaram potencial que justifica dar continuidade na busca de novas moléculas ou grupo de moléculas capazes de serem usadas em terapias sem a toxidez das substâncias sintetizadas quimicamente. / The Red Algae, phylum Rhodophyta, represent one of the largest and oldest lineages of eukaryotic organism. From the chemical standpoint, the Laurencia J.V. Lamouroux (Ceramiales) has been identified as one of the most complete and diverse genus within this specific group. The members of this genus have been identified, for instance, as the largest producers of secondary metabolites known to the Rhodophyta. Thus, it is not surprising that these specific species are currently under intense scrutiny with regard to their potential as new sources of natural products for medical and biotechnological applications. The primary aim of this study is to start a systematic investigation on the identification and characterization of novel Laurencia natural products showing desirable pharmacological and biomedical properties. The species used in this research are L. aldingensis (LA), L. catarinensis (LC), L. dendroidea(LD), L. intricate (LI). In addition, L. translucida (LT), Palisada flagellifera(PF), P.perforata (PP) and a pigment variant of LD (LDV) were included for comparison. Specifically, algal extracts were obtained through the sequential fractionation of dried algae samples with hexane (EH), chloroform (EC), methanol (EM), water (EA), and a single, crude, aqueous extracts (EAB). Protein content was performed using the Bradford, bicinchoninic acid assay (BCA) and the 280 nm uv quantification methods. The Bradford method was identified to be more appropriate for quantification. The analysis of phycobilins revealed that phycoerythrin was the major pigment in all species tested. Extracts were assayed for antimicrobial activity following the NCCLS microdilution tests and the minimum inhibitory concentration (MICs) obtained spectrophotometrically. Antimicrobial activity was explored using a variety of model biological targets (i.e. pathogens). To this end, microdilutions were used following the classical NCCLS and a minimal inhibitory concentration (MIC) protocol was performed on basis of electronic spectroscopy measurements. With respect to our findings on antibacterial activity, the LA-EH extract was bactericidal against the P. aeruginosa concentration of 62.8 &mu;g.mL-1 extracts and LA-EM and LC-EH had a strong bacteriostatic action against S. pneumoniae at concentrations of 51.1 and 85,1 &mu;g.mL-1, respectively. In the antifungal assay, LA-EH and LA-EC were fungicides against C. parapsilosis to 49.0 and 57.8 &mu;g.mL-1, respectively. The antioxidant assay was tested using the method with DPPH, in which the EC presented them as possessing the finest extracts of molecules capable of donating protons. And for the anticholinesterase test was done in the qualitative assay and quantitative assay on TLC plate by the Ellman method that could demonstrate the inhibitory activity of AChE less than 50 % for concentrations of 600 &mu;g.mL-1. The profile was similar for all extracts in which the EH and EC were the most active and possibly EM gave a false positive, while the EA and EAB extracts had very low activity. In the trial against the pathogen Colletotrichum Gloesporioides that causes papaya anthracnose the results show that LC-EH and LD-EH are the most active with IC50 of 70 and 40 &mu;g.mL-1, respectively. To perform the cytotoxicity assay against mammalian cells a model that is under development was proposed in which use cells MES-SA and its corresponding mutant (MES-SA/Dx5) multi-drug resistant. The proposed model is quite promising and the initial screening we propose a more detailed investigation of LD-EH and LT-EH whose IC50 were 91 &mu;g.mL-1 and 16 &mu;g.mL-1, respectively, against MES-SA cells. The LA, LC, LD and LI extract compounds were analyzed by GC-MS and the identification was performed using the library data and literature by comparing the mass spectra, retention time and index Kovat\'s. The study conducted here is likely to draw directions and help in the search for new molecules or group of molecules capable of being used in therapy without the toxicity of chemically synthesized compounds.

Os fungos endofíticos têm sido reconhecidos pela sua grande importância para as plantas hospedeiras, pois podem conferir proteção contra insetos herbívoros e patógenos, promover o crescimento vegetal, além de produzir metabólitos secundários com atividades biológicas diversas, entre outros. A cana-de-açúcar é uma cultura de grande importância social e econômica no Brasil, especialmente para o estado de São Paulo. Ultimamente esta cultura vem recebendo especial atenção devido ao crescente aumento da demanda de matéria prima, principalmente em função do acréscimo no consumo de etanol como biocombustível. Fungos do gênero Penicillium habitam os tecidos e a rizosfera de cana-de-açúcar, onde podem estabelecer associações mutualísticas com a planta e conferir diversos benefícios. Dentro deste contexto, estudos que avaliem a interação de Penicillium spp. com cana-de-açúcar são bastante promissores para geração de conhecimentos que auxiliem na otimização da agricultura. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivos a avaliação do potencial biotecnológico dos endofíticos de raiz e da rizosfera, do gênero Penicillium, pertencentes à comunidade fúngica de cana-de-açúcar, por meio de ensaios de antagonismo, produção de enzimas, solubilização de fosfato inorgânico e produção de ácido indol acético; assim como o estudo da interação de um isolado de P. pinophilum com cana-de-açúcar a partir do desenvolvimento de um sistema de transformação genética mediada pela bactéria Agrobacterium tumefaciens. Tanto a análise da atividade antimicrobiana como a produção de metabólitos apresentaram extensa variação fisiológica entre os isolados avaliados. Um isolado da espécie P. pinophilum (linhagem 44) foi escolhido para ser usado na transformação genética por mostrar-se superior estatisticamente em relação aos demais isolados nos ensaios anteriores. Para aumento da eficiência deste sistema de transformação foram avaliados diferentes parâmetros, dentre eles: tempo de co-cultivo (24 e 48 horas), concentração do indutor acetoseringona (200 M e 400 M) e tipos de membrana (papel filtro e náilon). O sistema de agrotransformação apresentou alta eficiência (482 transformantes por 107 conídios), gerando uma elevada quantidade de transformantes resistentes à higromicina B e expressando GFP. Dentre os parâmetros avaliados, a combinação que deu origem aos melhores resultados de transformação envolveu o co-cultivo por 48 horas sobre membrana de náilon, em meio de cultura contendo 200 M de acetoseringona. A interação fungo-planta foi avaliada a partir da inoculação de P. pinophilum linhagem selvagem e transformantes, em plântulas de cana-de-açúcar, seguida da análise por microscopia óptica de epifluorescência e reisolamento. Os resultados revelaram a natureza não patogênica desse fungo, uma vez que ele foi capaz de colonizar endofiticamente cana-de-açúcar e persistir nas raízes desta planta, sem levar ao desenvolvimento de qualquer sintoma de doença. Além disso, os ensaios de agrotransformação deram origem a uma biblioteca com mil e cem transformantes insercionais, o que constitui uma ferramenta importante para o estudo molecular do metabolismo secundário desse fungo endofítico e poderá contribuir para o entendimento da interação do complexo fungo-cana-de-açúcar, possibilitando no futuro a sua aplicação no melhoramento vegetal e exploração do seu potencial biotecnológico. / Endophytic fungi have been recognized for its great importance for the host plants, they may provide protection against herbivores and pathogens, promote plant growth, and produce secondary metabolites with biological activity, among other benefits. Sugarcane is a socially and economically important crop in Brazil, especially for the state of São Paulo. Lately, this culture has received special attention due to the growing demand for raw materials, mainly due to the increase in consumption of ethanol as a biofuel. Fungi Penicillium inhabit the tissues and rhizosphere of sugarcane, where they can establish mutualistic associations with the plant and provide several benefits. Within this context, studies evaluating the interaction of Penicillium spp. with sugar cane are very promising to generate knowledge in order to assist in the agriculture optimization. Thus, this study aimed to evaluate the biotechnological potential of endophytic Penicillium from root and rhizosphere, belonging to the fungal community of sugarcane, through tests of antagonism, enzyme production, solubilization of inorganic phosphate and indole acetic acid production, as well as studying the interaction of an isolate of P. pinophilum with sugarcane using the development of a system for genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens. Both the analysis of antimicrobial activity and the production of metabolites showed extensive physiological variation among isolates. An isolate of the species P. pinophilum (strain 44) was chosen to be used in genetic transformation for being statistically superior than the other strains in previous trials. Different parameters were evaluated to increase the efficiency of this transformation system, among them: co-culture time (24 and 48 hours), concentration of the inducer acetosyringone (200 µM and 400 µM) and types of membrane (filter paper and nylon). Agrotransformation system showed high efficiency, generating a high amount of hygromycin B resistant transformants that expressed GFP. Among the factors evaluated, the combination that showed the best results involved the transformation with a co-cultivation for 48 hours on a nylon membrane, in culture medium containing 200 µM of acetosyringone. The plant-fungus interaction was assessed from the inoculation of wild type and transformants P. pinophilum in seedlings of sugarcane followed by analysis by epifluorescence microscopy and reisolation. Results revealed the non-pathogenic nature of this fungus, since it was capable of endophytically colonize sugarcane and persisted in the roots of this plant, without developing any symptoms of illness. In addition, agrotransformation tests gave rise to a library with a thousand and one hundred insertional transformants, which is an important tool for molecular study of secondary metabolism of endophytic fungus, and may contribute to the comprehension of the complex interaction of fungus-sugarcane, allowing its future application in plant breeding and exploitation of their biotechnological potential.

Apesar dos diversos estudos sobre a presença de cianobactérias e a correlação entre fatores ambientais que influenciam ou desencadeiam florações, é ainda incipiente a informação sobre o controle fisiológico e bioquímico da produção de metabólitos secundários, cianotoxinas e compostos orgânicos voláteis (COVs) nestes organismos. Os COVs mais comumente encontrados em cianobactérias são a geosmina e o 2- metil-isoborneol, compostos que resistem ao tratamento convencional da água, causam mau cheiro e alteram seu gosto, além de bioacumular em peixes e moluscos. Estudos sobre possíveis sistemas de competição (alelopatia) entre linhagens de cianobactérias, ou entre elas e outros organismos, podem contribuir para elucidação do papel da produção de COVs por cianobactérias. Dessa forma, os objetivos deste projeto foram (i) prospectar a produção de COVs e seus efeitos na auto-regulação fisiológica em cianobactérias mantidas em laboratório; e (ii) desenvolver um método analítico, por microextração em fase sólida (SPME) e cromatografia em fase gasosa com detecção por espectrometria de massas (GC-MS), para a determinação destes compostos. Foram realizados ensaios para avaliar os perfis de produção dos COVs em duas linhagens de M. aeruginosa em diferentes fases de crescimento, sob diferentes intensidades luminosas (50, 150 e 250 ?&#181;mol.fótons.m-2.s-1) e também ao longo do ritmo circadiano, avaliando a influência dos períodos claro e escuro. Para avaliar efeitos alelopáticos, exsudatos de uma linhagem de M. aeruginosa produtora de microcistinas foram testados em culturas de outra linhagem de M. aeruginosa não produtora de toxinas por meio de técnicas tradicionais de cultivo com monitoramento do crescimento. Na análise da produção de COVs, por GC-MS, observou-se que se destacam, majoritariamente, os compostos &#945;-ciclocitral, &#946-ciclocitral e &#946;-ionona, sendo o &#946;-ciclocitral o mais abundante, em todas as condições testadas, para as ambas as linhagens estudadas. A linhagem não toxigênica, no entanto, apresentou produção mais elevada de todos os compostos identificados. Dentre as intensidades luminosas testadas, a intensidade de 250 &#181;mol.fótons.m-2s-1 foi a que apresentou a maior taxa de crescimento para a linhagem LTPNA 08 e relação negativa entre o aumento da irradiância e a produção de &#946;-ciclocitral. Foram identificadas, também, variações na produção dos compostos &#945;-ciclocitral, &#946;-ciclocitral e &#946;-ionona nas linhagens ao longo do ritmo circadiano, sendo as maiores concentrações encontradas no período escuro. Observou-se morte celular e redução na produção de COVs 24 horas após adição de exsudatos pertencentes à linhagem de M. aeruginosa toxigênica em cultivos da linhagem não-toxigênica. Sendo assim, pode-se inferir que a produção dos COVs pode sofrer alterações qualitativas e quantitativas dependendo do estímulo ambiental presente, tanto por interações bióticas (com outros organismos e ritmo circadiano), quanto por fatores abióticos (intensidade luminosa). / There are several studies on the presence of cyanobacteria and the correlation between environmental factors that may influence or trigger blooms. However, information concerning the physiological and biochemical control of the production of secondary metabolites, toxins and volatile organic compounds (VOC) by cyanobacteria is poorly understood. Geosmin and 2-methyl-isoborneolare are commonly found VOC in cyanobacteria, they resist to conventional water treatment and can cause bad smell and taste in the final water. In addition, VOC can bioaccumulate in fish and shellfish. Studies on possible competition systems (allelopathy) either among strains of cyanobacteria or among them and other organisms such as green microalgae, may help to elucidate the role of VOC production by cyanobacteria. Thus, the main objectives of this study are: (i) prospect the production of VOCs and their effects on physiological self-regulation in cyanocrobacteria kept in the laboratory; and (ii) to develop an analytical method, by solid phase microextraction (SPME) and gas chromatography with mass spectrometry detection (GC-MS), for the determination of these compounds. The assays were carried out to evaluate the production profiles of VOCs in two strains of M. aeruginosa at different growth stages under different light intensities (50, 150 and 250 &#181;mol.fótons.m-2.s-1) and also along of the circadian rhythm, evaluating the influence of light and dark periods. To assess allelopathic effects, exudates from a microcystin-producing strain of M. aeruginosa were tested on cultures of another non-toxin producing M. aeruginosa strain by traditional growth monitoring culture techniques. In the analysis of VOC production by GC-MS, it was observed that &#945;-cyclocyclal, &#946;-cyclocyclal and &#946;-ionone compounds were the most prominent, with &#946;-cyclocitral being the most abundant in all conditions tested, for both strains studied. The non-toxigenic lineage, however, showed higher production of all the identified compounds. Among the light intensities tested, the intensity of 250 &#181;mol.fótons.m-2s-1 was the one with the highest growth rate and positive relation between the irradiance increase and the &#946;-cyclocitral production. Variations in the production of the &#945;-cyclocyclal, &#946;-cyclocyclal and &#946;-ionone compounds were also identified in the lines along the circadian rhythm, being the highest concentrations found in the dark period. Cell death and reduction in VOC production were observed 24 hours after addition of exudates belonging to the toxigenic M. aeruginosa lineage in cultures of the non-toxigenic lineage. Thus, it can be inferred that the production of VOCs can undergo qualitative and quantitative changes depending on the environmental stimulus present, both by biotic interactions (with other organisms and circadian rhythm) and by abiotic factors (luminous intensity).

A espécie de cianobactéria Cylindrospermopsis raciborskii pertence a ordem Nostocales e tem a capacidade de realizar a fixação biológica do N2 atmosférico, sintetizar cianotoxinas e também de proliferar em águas doces formando florações de cianobactérias nocivas. A população de C. raciborskii encontrada no Brasil é conhecida por produzir derivados de saxitoxina (STX), enquanto cilindrospermopsinas (CYN), as quais são detectadas em isolados de outros países, não têm sido detectada em isolados brasileiros. Neste estudo, a produção de CYN por dois isolados brasileiros de C. raciborskii, CENA302 e CENA303, submetidos a diferentes condições nutricionais, foi avaliada usando o teste imunológico ELISA específico para detecção de CYN. Em seguida, genes evolvidos na biossíntese de CYN foram buscados no genoma dessas duas linhagens usando amplificações por PCR com iniciadores específicos e posterior sequenciamento Sanger, bem como sequenciamento genômico na plataforma HiScan SQ. Além disso, foram realizadas buscas nos dois genomas obtidos pela plataforma HiScan SQ de genes envolvidos com a síntese de algumas outras moléculas já descritas em cianobactérias, bem como aqueles relacionados com a fixação biológica de N2 e diferenciação do heterócito. Apesar da utilização de diferentes condições nutricionais, não foi detectada a produção de CYN no ensaio de ELISA em ambos os isolados de cianobactérias. No sequenciamento Sanger, dos nove genes sintetases de CYN buscados, quatro foram amplificados e sequenciados na linhagem C. raciborskii CENA302 e três na linhagem CENA303. Estas sequências de nucletídeos foram traduzidas em aminoácidos, e as funções das proteínas e os domínios preditos confirmaram a sua identidade como genes sintetase de CYN. O sequenciamento dos genomas completos das duas linhagens apresentou altos valores de qualidade de bases e elevada cobertura genômica. A busca por genes sintetase de CYN nos dois genomas foi realizada pelo mapeamento por referência das leituras, mostrando que algumas porções do agrupamento estavam contempladas no genoma, representando aproximadamente 10% do agrupamento de CYN. A anotação das regiões entre os genes descritos como flanqueadores do agrupamento CYN mostrou uma inversão gênica indicando a ocorrência de eventos que podem ter levado a perda ou dispersão no genoma deste agrupamento. Os genes anotados relacionados com fixação biológica de N2 e diferenciação do heterócito nas linhagens CENA302 e CENA303 apresentaram altas identidades com genes homólogos descritos em C. raciborskii. A ausência de alguns nucleotídeos no gene hetP envolvido na formação do heterócito possivelmente levou a perda de sua função na C. raciborskii CENA303, impedindo a diferenciação das células vegetativas em heterócitos, uma vez que não foi observado a presença dessa célula diferenciada em nenhuma das condições nutricionais avaliadas. Todos os genes de moléculas bioativas conhecidas de cianobactérias buscados pelo mapeamento por referência das leituras não foram encontrados nos genomas das linhagens C. raciborskii CENA302 e CENA303. Os resultados obtidos neste estudo revelaram a possibilidade de estar ocorrendo eventos evolutivos que estão causando a perda dos genes responsáveis pela síntese de CYN nos isolados brasileiros de C. raciborskii, demonstrando divergência alopátrica. / The cyanobacterial species Cylindrospermopsis raciborskii belongs to the order Nostocales and has the ability to perform biological nitrogen fixation, synthesize cyanotoxins and also to proliferate in freshwaters to form harmful cyanobacterial blooms. The C. raciborskii population from Brazil is known to produces saxitoxin derivatives (STX), while cylindrospermopsin (CYN), which is commonly detected in isolates from other countries, has thus far not been detected in Brazilian strains. In this study, the production of CYN by two Brazilian isolates of C. raciborskii CENA302 and CENA303, under different nutritional conditions, was evaluated using ELISA immunoassay specific for the detection of CYN. Then, genes involved in the biosynthesis of CYN were searched in the genome of these two strains using PCR amplification with specific primers and subsequent Sanger sequencing, as well as genomic sequencing on the platform HiScan SQ. Furthermore, searches were performed in the two genomes obtained by the platform HiScan SQ of genes involved in the synthesis of several other molecules already described in cyanobacteria, as well as those related to the biological N2 fixation and heterocyte differentiation. Despite the use of different nutritional conditions, no CYN production was detected by the ELISA assay for both cyanobacterial isolates. In the Sanger sequencing, of the nine CYN synthetase gene searched, four were amplified and sequenced in the C. raciborskii strain CENA302 and three in the strain CENA303. These nucleotide sequences were translated into amino acids, and the predicted protein functions and domains confirmed their identity as CYN synthetase genes. The complete genome sequencing of the two strains showed high values of bases quality and high genomic coverage. The search for CYN synthetase genes in the two genomes was performed by mapping reads to reference, showing that some portions of the cluster were contemplated in the genome, representing approximately 10% of CYN cluster. The annotation of regions between the genes described as flanking the CYN cluster showed a gene inversion indicating the occurrence of events that may have caused the loss or dispersion in the genome of this cluster. The annotated genes related to biological N2 fixation and heterocyte differentiation in the CENA302 and CENA303 strains showed high identities with homologous genes from other strains of C. raciborskii. The absence of a few nucleotides in the hetP gene involved in the heterocyte formation perhaps led to the loss of its function in the C. raciborskii CENA303, preventing the differentiation of vegetative cells into heterocyte, since it was not observed the presence of this differentiated cell in any of the nutritional conditions evaluated. All genes of known cyanobacterial molecules searched by mapping reads to reference were not found in the genomes of the C. raciborskii strains CENA302 and CENA303. The results of this study revealed the possibility of being occurring evolutionary events that are leading to loss of the genes responsible for the synthesis of CYN in the C. raciborskii Brazilian isolates, demonstrating allopatric divergence.

O gene de RNAr 16S tem sido amplamente utilizado na inferência filogenética de organismos procariotos, entretanto, sequências desse gene de cianobactérias isoladas de manguezais brasileiros são inexistentes. Neste estudo, 42 sequências inéditas do gene de RNAr 16S de cianobactérias isoladas de manguezais brasileiros foram geradas. Na análise BLAST as sequências apresentaram similaridades variando de 91 a 99% com outras sequências conhecidas de cianobactérias depositadas no GenBank. Na análise filogenética do gene de RNAr 16S várias sequências do gênero Chlorogloea ficaram agrupadas com sequências do gênero Synechococcus e algumas sequências de Nostoc ficaram mais próximas de sequências de Nodularia. As sequências de Leptolyngbya agruparam-se separadas das típicas de Leptolyngbya. Esses resultados corroboram com outros estudos, os quais mostraram que o filo Cyanobacteria necessita de revisão taxonômica. Na avaliação do potencial de produção de substâncias bioativas de 44 isolados de manguezais utilizando a técnica de PCR e dois conjuntos de oligonucleotídeos iniciadores degenerados específicos para sequências gênicas codificantes de peptídeo sintetase não ribossômica (NRPS) e policetídeo sintase (PKS) modular, 10 linhagens apresentaram resultado positivo para presença de NRPS e todos os isolados apresentaram resultado positivo para PKS. Na tentativa de atribuir função a esses genes e posteriormente explorar as potencialidades das linhagens, um produto da PCR de NRPS e 19 de PKS foram sequenciados, as sequências obtidas foram traduzidas para aminoácidos e utilizadas na construção de árvores filogenéticas. A análise filogenética da sequência de aminoácido do domínio de adenilação da NRPS indicou uma possível síntese de sideróforo pela linhagem Phormidium CENA135. Extratos extracelulares dessa linhagem analisados por Q-TOF/MS e RMN indicaram a produção de um sideróforo anfifílico com massa molecular e estrutura similar ao sideróforo synechobactina A. As sequências de aminoácidos do domínio da cetossintase de PKS das 19 linhagens mostraram relações filogenéticas com várias PKSs de linhagens conhecidas por produzirem substâncias, tais como sideróforo, algicida, microginina, oscilaginina B, hectoclorina e scytonemina. No teste da atividade antimicrobiana contra micro-organismos patogênicos dos extratos intra e extracelulares das 44 linhagens, 17 delas inibiram o crescimento de vários dos micro-organismos testados. Os extratos ativos foram analisados por Q-TOF/MS e 34 substâncias putativas conhecidas foram identificadas, tais como fungicidas, inibidores de proteases, antimaláricos e outras de funções desconhecidas. O teste imunológico ELISA específico para detecção da hepatotoxina microcistina (MC) apresentou resultado positivo para 16 das 23 linhagens testadas. Fragmentos de sequências do gene mcyA envolvido na síntese de MC foram amplificados por PCR em cinco linhagens (Synechococcus CENA136, Phormidium CENA135, Chlorogloea CENA142, Chlorogloea CENA146 e Nostoc CENA160), inclusive em dois gêneros sem registro de produção dessa toxina (Synechococcus e Chlorogloea). O teste ELISA específico para detecção da neurotoxina saxitoxina (SXT) apresentou resultado positivo para três linhagens. Entretanto, a análise em Q-TOF/MS e FT-ICR/MS de 15 linhagens, inclusive das que apresentaram resultado positivo no ELISA, não confirmaram a produção de saxitoxinas. / The 16S rRNA gene has been widely used in phylogenetic inference of prokaryotic organisms, however, sequences of this gene of cyanobacteria isolated from Brazilian mangroves are absent. In this study, 42 newly sequences of 16S rRNA gene of cyanobacteria isolated from Brazilian mangroves were generated. BLAST analysis of the sequences showed similarities ranging from 91-99% with other known cyanobacterial sequences deposited in GenBank. Phylogenetic analysis of several 16S rRNA sequences from the genus Chlorogloea were clustered with sequences from the genus Synechococcus and some sequences of Nostoc were closer to sequences of Nodularia. The Leptolyngbya sequences clustered separated from those of typical Leptolyngbya. These results corroborate with other studies which showed that the phylum Cyanobacteria need taxonomic revision. In assessing the potential of bioactive compounds production of 44 mangrove isolates using PCR technique and two sets of degenerated primers specific for gene sequences encoding non-ribosomal peptide synthetase (NRPS) and modular polyketide synthase (PKS), 10 strains showed positive results for the presence of NRPS and all isolates were positive for PKS. In an attempt to assign function to these genes and further explore the potential of the strains, a PCR product of NRPS and 19 PKS were sequenced and the sequences obtained were translated into amino acids and used to construct phylogenetic trees. Phylogenetic analysis of amino acid sequence of the NRPS adenylation domain indicated a possible synthesis of siderophore by the Phormidium strain CENA135. Extracellular extracts of this strain analyzed by Q-TOF/MS and NMR indicated the production of an amphiphilic siderophore with molecular mass and structure similar to the siderophore synechobactin A. The amino acid sequences of the PKS ketosynthase domain of 19 strains showed phylogenetic relationships with several PKSs of strains known to produce compounds such as siderophore, algicide, microginin, oscillaginin B, hectochlorin and scytonemin. In the antimicrobial activity test against pathogenic microorganisms of the intra- and extracellular extracts of 44 strains, 17 of them inhibited the growth of various microorganisms tested. The active extracts were analyzed by Q-TOF/MS and 34 putative known substances were identified such as fungicides, protease inhibitors, antimalarials, and others of unknown function. The immunological test ELISA specific for detection of the hepatotoxin microcystin (MC) was positive for 16 of the 23 strains tested. Sequence fragments mcyA gene involved in the synthesis of MC were amplified by PCR in five strains (Synechococcus CENA136, Phormidium CENA135, Chlorogloea CENA142, Chlorogloea CENA146 and Nostoc CENA160), including two genera with no record of production of this toxin (Synechococcus and Chlorogloea). Specific ELISA test for detection of the neurotoxin saxitoxin (SXT) showed positive results for three strains. However, analysis by Q-TOF/MS and FT-ICR/MS of 15 strains, including those that showed positive ELISA results, did not confirm the saxitoxin production.

O presente trabalho relata o estudo dos basidiomicetos Auricularia sp. e Aurantiopileus mayanensis. Extratos obtidos do corpo de frutificação dos basidiomicetos foram avaliados por CLAE-UV-ELSD-EM para análise do perfil químico e em ensaios de atividade biológica. O extrato do basidiomiceto Auricularia sp.apresentou atividade leishmanicida e tripanossomicida enquanto o extrato do A. mayanensis apresentou atividade antibacteriana, citotóxica e de inibição do proteassomo. Os extratos foram fracionados por processos cromatográficos. A partir do extrato do basidiomiceto Auricularia sp. foi isolado o éster metílico do ácido 7- (N-(hidroxifenilformamida) heptanoato de metila, composto inédito na literatura designado com o nome comum de éster metílico do ácido auriculárico. Também foram isolados quatro derivados dos ácidos anarcádicos e o ergosterol a partir do extrato do basidiomiceto A. mayanensis.Todos os compostos foram identificados por análises ou seus dados espectrométricos e espectroscópicos. / The present investigation reports the study of basidiomycetes Auricularia sp. and Aurantiopileus mayanensis. Extracts obtained from the fruiting bodies of basidiomycetes were analyzed by HPLC-UV-ELSD-MS and in biological activity assays. The extract of the basidiomycete Auricularia sp. presented leishmanicidal and trypanosomicidal activities while the extract of A. mayanensis presented antibacterial, cytotoxic and proteasome inhibition activities. Chromatographic techniques were applied to fractionate the extracts. Methyl 7-(N-(4-hydroxyphenyl) formamido) heptanoate was isolated from the extract of Auricularia sp., which was designated with the common name methyl ester of auricularic acid. Four derivatives of anarcadic acids and ergosterol were also isolated from the extract of the basidiomycete A. mayanensis. All compounds were identified by analyses of spectrometric and spectroscopic data.