La glicogen sintasa (GS) és un enzim cabdal en el metabolisme de carbohidrats, catalitzant l’addició d’un residu glicosil a l’extrem no reductor d’una cadena de glicogen preexistent. Les GSs eucariotes són enzims altament regulats, tant per al•losterisme com per fosforilació. Gràcies a diferents estructures de GSs resoltes en els darrers anys ja es té una idea aproximada el mecanisme enzimàtic de la reacció, així com els llocs d’unió de la molècula donadora del grup glicosil UDP-glucosa. Tot i que experimentalment es coneix la gran afinitat entre la GS i el glicogen, l’acceptor en la reacció catalítica, se sap poc de la interacció d’ambdós. En el nostre laboratori es va identificar un lloc d’unió a carbohidrats a la superfície de la GS de l’arqueó Pyrococcus abyssi (PaGS) gràcies a la resolució de l’estructura cristal•logràfica d’aquest enzim unit a una molècula de maltohexaosa. En aquesta tesi es demostra que aquest lloc d’unió a carbohidrats de PaGS es tracta d’un lloc d’unió a glicogen funcional ja que, quan el modifiquem per mutagènesi, l’enzim perd la seva capacitat d’unió al glicogen. Aquesta pèrdua d’afinitat té un impacte directe sobre l’eficiència catalítica de PaGS a l’hora d’utilitzar glicogen com a substrat. Per alineament de seqüències deduïm una possible conservació d’aquest lloc d’unió en la glicogen sintasa muscular humana (HMGS). La mutació d’aquest domini de la HMGS resulta en una disminució de l’afinitat per glicogen de l’enzim, un canvi en la seva localització subcel•lular i un clar impacte en la capacitat de l’enzim per acumular glicogen in vivo. D’aquesta manera identifiquem fins a cinc residus aminoacídics, tots allunyats del centre actiu, la mutació dels quals disminueix l’afinitat de l’enzim pel glicogen i que formarien, per tant, part d’un nou lloc d’unió a glicogen no catalític en la HMGS, que es mostra com un element regulador crític responsable de l’eficiència catalítica de l’enzim in vivo. Una vegada establerta la importància del domini d’unió a glicogen en HMGS, mesurem l’afinitat de la isoforma hepàtica de la glicogen sintasa humana (HLGS) pel glicogen. Tot i que ambdues isoformes de la GS humana tenen una alta identitat en la seva seqüència d’aminoàcids, els resultats mostren que HLGS té una menor afinitat pel glicogen. No hem pogut identificar els residus responsables d’aquest canvi d’afinitat. Al nostre laboratori es va descriure per primera vegada com la HMGS transloca al nucli cel•lular quan exhaureix els seus reservoris de glicogen. Els mutants de HMGS que no s’uneixen al glicogen també transloquen al nucli cel•lular, confirmant el glicogen com a únic factor de retenció citoplasmàtic de HMGS. Finalment, en aquesta tesi també s’intenta deduir si la localització nuclear de HMGS té algun paper biològic. Hem aconseguit identificar tres proteïnes que col•localitzen al nucli cel•lular amb HMGS, i que tenen en comú la seva capacitat d’unió a ARN. Hem observat com la incubació amb l’inhibidor de la transcripción actinomicina D de cèl•lules amb HMGS nuclear fa que l’enzim transloqui a la perifèria nucleolar, comportament descrit per moltes altres proteïnes que uneixen ARN. Finalment, un assaig in vitro d’unió entre HMGS i ARN apunta a la possible interacció entre ambdós. Totes aquestes evidències recolzen una possible funció nuclear per a la HMGS. / Thesis title: “Determinants of glycogen binding and translocation of glycogen synthase”. Author: Carlos Martínez Pons. ABSTRACT Glycogen is a glucose polymer synthesized by the cell to store large amounts of glucose and is subsequently mobilized when energy demand increases. The importance of glycogen is reflected in its conservation among archaea, bacteria and eukarya. The glycogen granule is considered as a finely regulated organelle, with most of its proteins locating at the granule thanks to a direct interaction with glycogen through a carbohydrate-binding site. But it still remains unclear if these sites have other implications on protein regulation and catalytic performance. In this thesis we structurally identify a functional non-catalytic glycogenbinding site on a key enzyme of glycogen metabolism. When we mutate this carbohydrate-binding site we observe an alteration of the subcellular distribution of the enzyme and, moreover, a dramatic decrease of its catalytic performance, showing that the glycogen-binding site is not only used to remain bound at the glycogen granule, but that it is necessary for the proper functioning of the enzyme.

D'un grup de pacients que presentin la mateixa malaltia, fins i tot en cas que en tots ells es pogués comprovar que la intensiat del procés és la mateixa, no tots responen amb igual intensitat a un fàrmac administrat a la mateixa dosi, per la mateixa via i amb el mateix interval d'administració. Tenir en compte la variabilitat de resposta quan s'admimstra un fàrmac és un del prerequisits de l'ús racional de medicaments. Amb l'augment del nombre de fàrmacs emprats en terapèutica s'ha enregistrat un increment en la incidència de reaccions adverses. Per tal de disnnnuir-les al mínim i aconseguir una resposta terapèutica òptima cal conèixer quins són els factors que influeixen en la relació dosi/resposta i individualitzar la dosi quan això sigui possible. L'important desenvolupament de les tècnlques de determinació dels nivells plasmàtics de fàrmacs ha permès saber que els processos farmacocinètics constitueixen la principal font de variabilitat intenndividual en la resposta als medicaments, i entre aquests el més important des d'un punt de vista quantitatiu és el metabolisme. Les causes més importants de variabilitat en la capacitat de metabolisme dels xenobiòtics són els factors ambientals i els genètics. Fa uns 30 anys que es coneix que la capacitat d'acetilació està sotmesa a polimorfisme genètic, més recentment s'han descrit polimorfismes de metabolisme d'altres vies, generalment hidroxilatives. En aquest sentit el present treball es composa de tres apartats:1) Determinació de la capaciat de metabolisme de la Isoniazida (fenotip acetilador) en una mostra de 126 individus sans. La distribució de freqüències de la relació entre el fàrmac i el seu principal metabòlit en orina, es comporta de forma bimodal, diferenciant-se una subpoblació d'individus amb una baixa formació de metabòlit (acetiladors lents) que representa un 65,1 de la mostra estudiada. El 34,9 restant està format per individus amb una major capacitat de metabolisme (acetiladors ràpids). No sembla existir cap influència de factors com Tedat, sexe, consum de tabac, cafè i alcohol en e1 fenotip acetilador.2) Determinació de la capacitat de metabolisme de la debrlsoquina (fenotip hidroxilador) en una mostra de 156 voluntaris sans. La distribució de freqüències de la relació entre aquest fàrmac i el seu principal metabòlit és de tipus bimodal. Un 4,5 del individus estudiats metabolitzen de forma defectuosa la debrisoquina (hidroxiladors pobres) i un 95,5 ho fan de forma normal (hidroxiladors extensos). Tampoc existeix cap influència de l'edat, sexe, i hàbits tòxics en la manifestació d'aquest fenotip.3) L'acció neurotòxica d'alguns xenobiòtic sembla ser un dels factors etiopatogènics de la malaltia de Parkinson. Els individus amb una baixa capacitat metabòlica (detoxificant) podrien tenir un major risc de patir parklnsonisme o malaltia de Parkinson . Alguns fàrmacs (neurolèptics) i substàncies ambientals (MPTP) que poden produir parkinsonisme es metabolitzen per via hidroxilativa. En base a aquesta hipòtesi es va determinar el fenotip hidroxilador de la debrisoquina en una mostra de 54 pacients diagnosticats de Parkinson, amb la finalitat d'estudiar si en aquest tipus de pacients hi ha una major incidència de metabolitzadors pobres. No s'han detectat diferèncles entre els percentatges d'hidroxiladors pobres de les dues mostres analitzades (individus sans 4,5, parkinsomans 3,7), el que demostra que no sembla existir relació entre la capacitat de metabolitzar la debrisoquina i la malaltia de Parkinson. / Not all patients in a group suffering from the same illness respond in the same degree to a drug administered in the same dose, by the same route and the same interval even when the intensity of the process were proven to be the same. Taking into account the variability of response when administering a drug is one of the prerequisites for a rational use of drugs. With the increase in the number of drugs prescribed in therapeutics, an increase in the incidence of adverse drug reactions has been recorded. In order to reduce such reactions and achieve an optimal therapeutic response , the factors that influence the dose/response ratio have to be known and the dose has to be individualized whenever possible. The dramatic development of techniques for the determination of plasmatic levels of drugs has revealed that pharmacokinetic processes are the main cause of interindividual variability in response to drugs and that metabolism is quantitatively the most important of these processes. The main cause of variability in the capacity to metabolize xenobiotics are the environmental and the genetic factors. The capacity to acetytate has been known to be subject to genetic polymorphism for about 30 years. More recently, metabolic polymorphisms of other pathways, usually hydroxylative, have been described. This research deals with acetylator and hydroxylator phenotypes. It is composed of tree parts:
1) Determination of the rate of metabolism of isoniazid (acetilator phenotype) in a sample of 126 healthy individuals. The frequency distribution of the urinary drug/metabolite ratio reveals a bimodal pattern: 65.1 of the sample population shown a low formation of the metabolite (slow acetilators), while the remaining 34.9 have a higher capacity to metabolize (fast acetilators). Factors such as age, sex and tobacco, cofee or alcohol intake do not seem to influence this phenotype.2) Determination of the rate of metabolism of debrisoquine (hydroxylator phenotype) in a sample of 156 healthy volunteers. The frequency distribution of the urinary drug/metabolite ratio again showns a bimodal pattern: 4.5 of the sample population are defective metabolizers of debrisoquine (poor hydroxylators), while 95.5 are normal metabolizers (extensive hydroxylators). Age ,sex and toxic habits do not seem to influence the manifestation of this phenotype, either.3) The neurotoxic action of some xenobiotics appears to be one of the aetiopathogenic factors causing the appearance of Parkinson's disease. Individuals with a low metabolic rate migth be more exposed to developing Parkinsonism or Parkinson's disease. Some neuroleptic drugs and some environmental substances (MPTP) which may produce Parkinsonism are metabolized by hydroxylation. According to this hypothesis, the hydroxylator phenotype of debrisoquine was determined in a sample of 54 patients with diagnosed Parkinson's disease in order to ascertain if a higher incidence of poor metabolizers is found among this kind of patients. No significant difference in the percentage of poor hydroxylators has been recorded between the two analyzed sample populations (4.5 in healthy individuals, 3.7 in Parkinson patients), which proves that no relationship seems to exist between the capacity to metabolize debrisoquine and Parkinson's disease.

In eukaryotes, L-carnitine is involved in energy metabolism, where it facilitates b-oxidation of fatty acids. Carnitine acyltransferases catalyze the reversible conversion of acyl-CoA and carnitine to acylcarnitine and free CoA. There are three carnitine acyltransferase families, which differ in their acyl-chain length selectivity: carnitine palmitoyltransferases (CPTs) catalyze long-chain fatty acids, carnitine octanoyltransferase (COT) prefers medium-chain fatty acids, and carnitine acetyltransferase (CrAT) uses short-chain acyl-CoAs. In this study, we attempted to identify the amino acid residues responsible for acyl-CoA specificity in the acyltransferase family through structure-based mutagenesis studies. We identified an amino acid (Met564 in rat CrAT) that is critical to fatty acyl chain-length specificity. A CrAT protein carrying the M564G mutation behaved as if its natural substrates were medium-chain acyl-CoAs, similar to COT. In the reverse case, mutation of the orthologous glycine (Gly553) to methionine in COT decreased activity towards its natural substrates, medium-chain acyl-CoAs, and increased activity towards short-chain acyl-CoAs. A second putative amino acid involved in acyl-CoA specificity was identified (Asp356 in rat CrAT), and the double CrAT mutant D356A/M564G behaved as a pseudo-CPT in terms of substrate specificity. Three-dimensional models revealed a deeper hydrophobic cavity for the binding of acyl groups in both CrAT mutants in the same position as the shallow cavity in the wt enzyme. Furthermore, we studied the effect of C75-CoA, a potent and competitive inhibitor of CPT I, on CrAT activity. C75-CoA occupies the same pocket in CPT I as palmitoyl-CoA, suggesting an inhibitory mechanism based on mutual exclusion. To determine whether this inhibitor would fit in the open hydrophobic pocket formed in CrAT mutants M564G and D356A/M564G, we carried out competitive inhibition assays. Our experiments showed that while C75-CoA is a potent inhibitor of CrAT mutants M564G and D356A/M564G, it has no effect on wt CrAT. Choline acetyltransferase (ChAT) catalyzes a similar reaction to CrAT, with the difference that in ChAT the acetyl group from acetyl-CoA is transferred to choline instead of carnitine. Cronin (1998) successfully redesigned ChAT to use carnitine instead of its natural substrate choline. In the present study, our aim was to achieve the opposite, that is, to redesign rat CrAT specificity from carnitine to choline. We prepared a mutant CrAT that incorporates four amino acid substitutions, and the resulting mutant shifted the catalytic discrimination between L-carnitine and choline in favour of the latter substrate. The food industry is interested in the production of esters for use as flavouring compounds; for example, esters are responsible for the fruity character of fermented alcoholic beverages such as beer and wine. Esters are produced in an enzyme-catalyzed reaction between a higher alcohol and an acyl-CoA molecule. Since CrAT is responsible for the modulation of the acyl-CoA/CoA ratio, we hypothesized that overexpression of this enzyme could modify ester production in yeast. Therefore, we overexpressed CrAT in yeast and analysed its effect on ester production during alcoholic fermentation. Compared with control cells, overexpression of CrAT caused a significant reduction in the production of some esters, including the important flavour components ethyl acetate and 3-methyl-butyl acetate.In conclusion, the amino acid substitutions in rat CrAT and COT in this study reveal several residues that are involved in substrate recognition and provide insight into the molecular requirements for their correct positioning in order to achieve efficient catalysis. These results not only help us to understand the structure-function relationship within the acyltransferase family, but may also facilitate studies on obesity, non-insulin dependent diabetes, and patients with defective â-oxidation. Moreover, our results open the possibility of biotechnological applications of the enzymes of the carnitine acyltransferase family in the wine industry.

Durante la regeneración hepática el contenido de fructosa 2,6-bisfosfato, Fru-2,6-P(2) disminuyó rápidamente (1 h) manteniéndose los niveles bajos durante las primeras 24 h. A partir de este tiempo, los niveles tendieron a recuperarse sin alcanzar los valores control a los 7 días. El contenido de glucógeno mostró un perfil similar siendo la disminución inicial menos rápida (mínimo a las 6 h) y restableciéndose el contenido a los 7 días. Los bajos niveles de Fru-2,6-P(2) después de una hepatectomía parcial correlacionan con el incremento de la gluconeogénesis y la disminución de la glucolisis descritos. Posiblemente la causa de la rápida disminución del contenido de Fru-2,6-P(2) después de una hepatectomía parcial sea la fosforilación del enzima por la proteína quinasa dependiente de cAMP como así lo sugiere la rápida disminución de la actividad PFK-2 activa (que representa la actividad quinasa de la forma no fosforilada del enzima bifuncional 6-fosfofmcto 2-quinasa/fructosa 2,6-bisfosfatasa, PFK-2/FB/Pasa-2) y del cociente de actividades PFK-2 activa/total (reflejo del grado de fosforilación del enzima bifuncional). Otros factores como la disminución del contenido de hexosas 6-fosfato y el aumento de citrato y fosfoenolpiruvato podrían también contribuir al mantenimiento de estos bajos niveles.Durante el proceso regenerativo aparece una forma del enzima bifuncional diferente a la del enzima de hígado adulto como lo indica su comportamiento cinético frente al glicerol 3-fosfato y a la incubación con la proteína quinasa dependiente de cAMP. El diferente reconocimiento de esta forma enzimática con anticuerpos específicos de la PFK-2/FBPasa-2 de hígado y con anticuerpos contra toda la proteína sugiere que tiene su extremo amino modificado. Durante todo el proceso proliferativo el ARNm que se expresa es específico de hígado por lo que la modificación del extremo amino no es debida a un alternativo "splicing" del gen sino a alguna modificación post-transcripcional aún no descrita para este enzima.Los niveles de ARNm del enzima bifuncional disminuyeron rápidamente después de una hepatectomía parcial con un mínimo a las 6 h y aumentando después de este tiempo con un máximo a las 48-60 h, y tendiendo a normalizarse después de este tiempo. Estos niveles de ARNm estuvieron regulados a nivel transcripcional, no correlacionando las variaciones del contenido de ARNm con variaciones en el contenido del enzima. La velocidad de degradación del ARNm del enzima bifuncional no se modificó durante las primeras horas después de una hepatectomía parcial sugiriendo un papel mis importante de la regulación transcripcional durante esta fase.Los niveles de ARNm de los enzimas considerados reguladores de la glucolisis/gluconeogénesis: glucoquinasa (GK), piruvato quinasa (L-PK), fructosa 1,6-bisfosfatasa (FBPasa-1) y fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) fueron analizados por "Northern blot". En general, durante la fase pre-replicativa (0-12 h) se observa una disminución del contenido de ARNnl de los enzimas glucolíticos y aumento del de PEPCK. Esta correlación se rompe durante la fase replicativa (>12 h) donde se aprecia la recuperación del mensajero de GK (24 h), junto con elevados niveles de PFK-2FBPasa-2 y PEPCK. El contenido del mensajero de la LPK se recuperó a los 7 días, mientras que los niveles de FBPasa-1 no se modificaron significativamente durante todo el proceso regenerativo. El contenido de ARNm de estos enzimas también fue analizado en los animales laparotomizados y, aunque mostraron algunas modificaciones, éstas fueron mucho menos pronunciadas que en los animales hepatectomizados, normalizándose alrededor de las 24 h.La administración de glucagón intraperitonealmente (1 mg/kg) produjo sobre el sistema de la Fru-2,6-P(2) (metabolito, enzima, mensajero) una situación similar a la detectada durante las primeras horas después de una hepatectomía parcial. Así se observó una disminución del contenido de Fru-2,6-P2 en paralelo a la fosforilación del enzima. La actividad PFK-2 total y el contenido de ARNm también disminuyeron. Los niveles de ARNm estuvieron regulados a nivel transcripcional observándose una disminución de la velocidad de transcripción del gen en paralelo al contenido del ARNm. Sorprendentemente, la estabilidad del ARNm del enzima bifuncional aumentó en presencia de glucagón sugiriendo que quizás las vidas medias de losARNm estimadas mediante este procedimiento "in vitro" no reflejen las vidas medias reales "in vivo". Esta estabilización de los niveles de ARNm en presencia de glucagón también ocurrió para la L-PK y la PEPCK. La estabilización de los ARNm se modificó en presencia de cicloheximida, un inhibidor de la síntesis de proteínas, sugiriendo todos estos datos que en la estabilización de estos ARNm están involucradas proteínas con un recambio rápido y reguladas por un proceso dependiente de cAMP. / Glycogen and fmclose 2,6-bisphosphate levels in rat liver decreased quickiy after partial hepateciomy. After 7 days the glycogen level was normalyzed and fructose 2.6-bisphosphate concentration still remained low. The active (non-phosphorylaied) fonn of 6-phosphofructo-2-kinase/fructose 2,6-bisphosphatase (PFK-2/FBPase-2) varied in parallel with fructose 2.6- bisphosphate levels. The mRNA of PFK-2/FBPase-2 expressed during the hepatic regeneration is the adult liver form. The kinetic and immunological differences found for PFK-2/FBPase-2 during liver regeneration could reflect some as yet unidentified post-translational change.The mRNA levels of glucokinase (GK), L-pyruvate kinase (L-PK), PFK-2EBPase-2, fructose 1,6-bisphosphatase (FBPase-1) and phosphoenolpyurvate carboxykinase (PEFCK) were analyzed during liver regenerartion. The mRNA levels of glycolytic enzymes (GK, PFK-2/FBPase-2 and L-PK) decreased rapidly after partial hepatectomy. GK mRNA increased at 16-24 h, returning to normal values after his time. After six hours the PFK-2/FBPase-2 mRNA increased to a maximum at 48 hours, and returned to normal levels by 96 hours. L-pyruvate kinase mRNA recovered control levels al 168 h. In contrast, phosphoenolpyruvate carboxykinase mRNA increased rapidly after liver resection and remained high during the regenerative process. However, the levels of fructose 1,6-bisphosphatase mRNA, another gluconeogenic enzyme, were not modified significantly. These results correlate with reported rates and enzyme levels of increased gluconeogenesis after partial hepatectomy. The effect of stress on the mRNA levels was also studied. All enzymes showed variations in their mRNA levels following the surgical stress. The differences were more pronounced in regenerating than in sham animals, being practically normalized at 24 h. The rate of gene transcription of PEFCK, PFK-2/FBPase-2 and albumin was measured during liver regeneration. The transcription rate of albumin did not change whereas that of PEPCK was increased >12-fold at 6 hours and remained high during the regenerative process. The rate of gene transcription of PFK-2FBPase-2 decreased by 50 % at 6 hours and increased thereafter with a maximum at 72 hours, and then returned to control values at 96 hours. These results correlate with the mRNA levels and demonstrate that gene inscription of PEFCK and PFK-2FBPase-2 is specifically regulated, and that this regulation is in part responsible for the alterations in hepatic metabolism seen in regenerating liver.The administration of glucagon reproduced in fructose 2.6-bisphosphate system (meitabolite, protein, mRNA) a similar situation that we have described during the first hours after partial hepatectomy.

Flavonoids, and more specifically, red wine procyanidins, have many beneficial effectsagainst pathologies such as cardiovascular heart disease and related illnesses. Althoughadipose tissue has a central role in some of these pathologies, including obesity and diabetes,there is a lack of information about the effects of procyanidins on this tissue. This thesisaddresses this question. The effects of a grape seed procyanidin extract (GSPE) on the lipidand glucose metabolism of adipocytes were evaluated by taking the 3T3-L1 cell line as amodel of study. Results show that the GSPE has insulinomimetic effects, stimulating glucoseuptake, glycogen synthesis and trigliceride synthesis. To achieve this, the GSPE shares someof the mechanisms and intracellular mediators of the insulin-signalling pathways (such asGLUT-4 translocation, PI3K and p38 MAPK) but it must also use other, complementary,mechanisms. These results suggest that procyanidins have beneficial effects on diabetesand/or insulin resistance. This is partially proven by in vivo studies that show that GSPE hasantihyperglycemic properties on streptozotozin-induced diabetic rats. Also analyzed in thisthesis are the molecular mechanisms used by GSPE to explain the already described lipolyticeffects. Protein kinase A and PPARã are shown to be involved in these effects. Some ofthese results opened up another line of study into the effects of GSPE on the differentiationprocess of the 3T3-L1. These studies showed that procyanidins alter the differentiation ofpreadipocytes when added at the induction of differentiation. Since an increase in thenumber of adipocytes has a negative effect on obesity, this is a promising characteristic ofGSPE that should be taken into account when its possible antiobesity properties are studied. / Als flavonoides, i més concretament a les procianidines del vi negre, se'ls han atribuït moltespropietats beneficioses contra diverses patologies, com les malalties cardiovasculars i altrespatologies relacionades. Tot i que el teixit adipós juga un paper important en algunesd'aquestes patologies, com la obesitat i la diabetis, la informació referent l'acció de lesprocianidines en aquest teixit és escassa. Aquesta tesis estudia els efectes de les procianidinesderivades de pinyol de raïm (GSPE) en l'adipòcit, i per a dur-ho a terme es pren com amodel d'estudi la línia cel.lular 3T3-L1. Per una banda es descriuen els efectes del GSPE enel metabolisme de lípids i glúcids de la cèl.lula adiposa. El GSPE fa un paperinsulinomimètic: estimula la captació de glucosa, la síntesi de glicògen i la síntesi de triacilglicerols. L'anàlisi dels mecanismes moleculars per exercir aquests efectes mostra que GSPEen part comparteix mecanismes i vies de senyalització propis de la insulina (translocació deGLUT-4, PI3K, p38 MAPK); tanmateix, s'observa que GSPE ha d'usar també altresmecanismes complementaris. Aquests resultats suggereixen que GSPE pot tenir efectespositius en situacions de diabetis i/o resistència a insulina, donat que a més a més, els estudisin vivo mostren que GSPE és antihiperglicèmic en condicions de diabetis induïda perestreptozotocina. En aquesta tesis també s'analitzen els mecanismes moleculars queexplicarien els efectes lipolítics de les procianidines descrits en estudis previs, i s'ha trobatque la proteina kinasa A i PPARã hi estan involucrats. Part d'aquests resultats han obert unaaltra via d'estudi sobre els efectes de la GSPE en el procés de diferenciació de la cèl.lulaadiposa on s'ha observat que el tractament amb procianidines a l'inici de la diferenciaciódificulta aquesta transformació. Donat que l'augment del nombre d'adipòcits afectanegativament la obesitat, aquest efecte de les procianidines és una característicaprometedora que caldrà tenir en compte en l'estudi del seu possible paper antiobesitat.

La citrulline est un acide aminé dont les propriétés anaboliques n’ont été mises en évidence que très récemment. Ces propriétés pourraient relever en particulier de son rôle de précurseur direct de l’arginine. L’arginine est un acide aminé central du métabolisme des mammifères, notamment comme précurseur de nombreuses molécules exerçant des fonctions physiologiques essentielles, en particulier les polyamines, que ce soit les polyamines « classiques » putrescine, spermidine et spermine, dérivés de décarboxylation de l’ornithine impliquées entre autres dans la prolifération cellulaire, ou l’agmatine, dérivé de la décarboxylation de l’arginine. Toutefois, les interactions métaboliques entre citrulline et polyamines restent encore peu connues. Le but de ce travail a été d’explorer le lien métabolique entre citrulline et polyamines, selon deux démarches distinctes.La première a été d’évaluer l’influence d’une complémentation prolongée (3 mois) en citrulline sur le métabolisme tissulaire des polyamines « classiques » chez le rat âgé. La citrulline n’affecte que de manière modérée le métabolisme des polyamines, principalement en corrigeant les altérations liées au vieillissement.La seconde, par analogie avec la putrescine et l’agmatine, a exploré l’implication du dérivé décarboxylé de la citrulline, la N-carbamoyl-putrescine (NCP) dans le métabolisme des mammifères après avoir mis au point une technique de dosage de celle-ci dans les milieux biologiques. Nous n’avons pas pu mettre en évidence la présence de NCP dans des tissus de rats ayant reçu de la citrulline par voie orale ou par voie parentérale suggèrant soit une absence de synthèse soit un métabolisme extrêmement rapide de la NCP. Par ailleurs, la NCP administrée par voie orale à des doses de 5 et 50 mg/kg/j ne semble pas induire de toxicité ni d’effets biologiques majeurs mais la démonstration de son absorption digestive reste à faire. Cependant, la NCP exerce quelques effets modérés sur le métabolisme des acides aminés et des polyamines, l’évaluation de doses plus élevées ou l’administration par voie parentérale permettrait de confirmer ces observations. / The anabolic properties of the amino acid citrulline have only been recently demonstrated. These properties may result at least in part from its role as an arginine precursor. Arginine plays a central role in mammalian amino acid metabolism, notably as the precusor of many molecules involved in essential physiological functions, such as polyamines either “classical” ones, namely putrescine, spermidine, and spermine, derived from ornithine decarboxylation and notably involved in cell proliferation, or more recently-discovered molecules such as agmatine, the decarboxylation derivative of arginine. Metabolic interactions between citrulline and polyamines are still mostly unknown.The aim of this work was to explore the metabolic link between citrulline and polyamines using two different strategies.First, the influence of a long term citrulline supplementation on tissue “classical” polyamine metabolism in aged rats has been evaluated. Polyamine metabolism is only moderately affected by citrulline supplementation, mostly correcting aging-related alterations.Second, by analogy with putrescine and agmatine, the involvement of the decarboxylated derivative of citrulline, N-carbamoyl putrescine (NCP), in mammalian metabolism was investigated after having developped an HPLC assay for the determination of NCP in biological media. We have not been able to demonstrate the presence of NCP in tissues of rats having received citrulline orally or parenterally suggesting either a lack of synthesis or an extremely rapid metabolism of NCP. In addition, oral administration of NCP 5 or 50 mg/kg/d did not appear to induce toxicity or major biological effects but the demonstration of its gastrointestinal absorption remains to be done. However, NCP has some moderate effects on amino acid and polyamine metabolism. The evaluation of higher doses of NCP or of its parenteral administration is required to confirm these observations.

Au cours de ma thèse, j'ai eu plusieurs projets différents portant sur l'importance de l’homéostasie énergétique chez Drosophila melanogaster. L'homéostasie énergétique est le maintien constant des réserves énergétiques de la cellule. Mon projet principal de thèse porte sur le lien entre le métabolisme et la croissance dépendante des voies mTOR (mechanistic Target-Of-Rapamycin) chez Drosophila melanogaster. Il existe deux voies mTOR très conservées au cours de l’évolution : la voie mTORC1 et la voie mTORC2. Les voies mTOR sont des voies de signalisation qui activent à la fois la croissance et le métabolisme. Cependant les effets de l’activation des voies mTOR sur le métabolisme invivo sont encore à l’étude. De plus, on ne sait pas si l’activation du métabolisme est nécessaire à la croissance dépendante des voies mTOR. J’ai montré que l’activation des voies mTOR in vivo diminue le stockage des réserves énergétiques (tréhalose,glycogène) lors d'une alimentation sucrée.L'activation de la voie mTORC1 diminue aussi le stockage des triglycérides en milieu sucré. En utilisant des outils génétiques, j’ai également montré que la croissance dépendante de la voie mTORC2 dépend au niveau autonome cellulaire de la synthèse d’acides gras, de l’activité pyruvate déshydrogénase et de l’activité lactate déshydrogénase. De plus, la croissance induite par mTORC2 est inhibée par le sucre alimentaire. La croissance induite par l’activation de la voie mTORC1 ne dépend ni du métabolisme du glucose, ni de celui des acides gras.Mais elle diminue si on combine une inhibition de la synthèse des acides gras avec un ajout de sucres alimentaires. J’ai également contribué à deux autres projets au cours de ma thèse : un qui étudie l’importance de l’homéostasie énergétique dans le déclenchement de l’autophagie, et un autre qui étudie l’importance du métabolisme des acides gras dans la physiologie de l’intestin. / The main topic of my PhD is theimportance of energy homeostasis in Drosophilamelanogaster. Energy homeostasis is a biologicalprocess that holds energy stores at a steady state. Mymain PhD topic investigates the importance ofmetabolic homeostasis during growth in Drosophilamelanogaster. I focused on growth induced by themTOR (mechanistic Target-Of-Rapamycin)pathways. There are two mTOR pathways : themTORC1 and mTORC2 pathway. They are veryconserved throughout evolution. The mTORpathways are signaling pathways that activate bothgrowth and metabolism. Howevever the effects ofmTOR activation on metabolism in vivo is still underinvestigation. Moreover, it is not known ifmetabolism activation is necessary to sustain mTORdependent growth. I showed that the activationof the mTOR pathways in vivo decreases energystorage (trehalose, glycogen) during a dietsupplemented with sugar. Moreover, the activation ofthe mTORC1 pathway decreases triglyceride storageduring this diet. Using genetic tools, I also showedthat mTORC2-dependent growth on the autonomouscellular level depends on fatty acid synthesis,pyruvate dehydrogenase and lactate dehydrogenase.Moreover, mTORC2-dependent growth is inhibitedby dietary sugar. mTORC1-dependent growth is notsensitive to glucose or fatty acid metabolism alone.However, mTORC1-dependent growth decreaseswhen fatty acid synthesis inhibition is combined withan increase in dietary sugar. I also contributed to twoother projects : one investigating the effect of energyhomeostasis on autophagy onset and an otherinvestigating the effect of fatty acid metabolism ongut physiology.

Exposure of yeast to increases in extracellular osmolarity activates the stress-activated Hog1 MAP kinase, which is essential for cell survival upon osmotic stress. Activation of the Hog1 MAPK results in cell growth arrest, suggesting a possible role of the MAP kinase in the control of the cell cycle. Our results have shown that Hog1 activation resulted in accumulation of cells in the G1/S and G2/M transitions. At G1, Hog1 regulates the cell cycle progression by a dual mechanism that involves downregulation of G1 cyclin expression and direct targeting of the CDK-inhibitor protein Sic1. The MAPK interacts with Sic1, and phosphorylates a single residue of Sic1, which, in combination with the downregulation of cyclin expression, results in Sic1 stabilization and inhibition of cell cycle progression. Consistently, sic1_ cells, or cells containing a SIC1 allele mutated in the Hog1 phosphorylation site, are unable to arrest at G1 phase after Hog1 activation, and become sensitive to osmostress. Together, our data indicate that Sic1 is the molecular target for Hog1 that is required to modulate cell cycle progression in response to stress at G1. On the other hand, activation of the Hog1 MAPK also results in an increase of cells in the G2 phase. Arrested cells displayed down regulation of the Clb2-Cdc28 kinase activity and consequently enlarged buds, defects in spindle formation and orientation. These effects were prevented by deletion of the SWE1 gene. Thus, swe1Ä cells failed to arrest at G2, which resulted in a premature entry into mitosis and mislocalization of nuclei. Consistently, swe1Ä cells were osmosensitive. Swe1 degradation was reduced in response to activation of Hog1. Swe1 accumulation is mediated by the activity of the complex Hsl1-Hsl7. Hog1 phosphorylates a single residue at the regulatory domain of Hsl1, which leads to the mislocalization of Hsl7 from the bud neck, and consequent Swe1 accumulation. In addition, Hog1 downregulates G2 cyclin expression, reinforcing the inhibition of cell cycle progression at G2/M. These results indicate that Hog1 imposes a delay in critical phases of cell cycle progression necessary for proper cellular adaptation to new extracellular conditions.

La 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA, éxtasis) es una anfetamina sustituida de consumo frecuente y abusivo. La enzima principal que participa en el metabolismo de fase I de la MDMA, la isoforma 2D6 (CYP2D6) del citocromo P450, resulta también inhibida por la MDMA. Además, ésta es a la vez metabolizada por otras isoformas de CYP, por ejemplo la CYP1A2. La contribución de esta enzima y los posibles cambios en su actividad tras una administración de MDMA nunca han sido estudiados in-vivo. En consecuencia, se realizó un ensayo clínico donde los marcadores, dextrometorfano y cafeína se administraron tras una dosis oral de MDMA. En base a la farmacocinética de ambos marcadores se evaluaron posibles cambios en la actividad de las enzimas. En base al ratio metabólico urinario de dextrometorfano i dextrorfano (MR) se calculó la vida-media de degradación de CYP2D6. Tras una dosis de MDMA, el Cmax i AUC del dextrometorfano aumentó aproximadamente 10 veces con la correspondiente disminución en los parámetros farmacocineticos de dextrorfano. Se aumentó el MR casi 100 veces después de una dosis de MDMA, con un 67% de los sujetos superando la antimoda de 0.3 para la asignación del fenotipo de metabolizador lento de CYP2D6. La actividad de CYP2D6 se recuperó después de 10 días con una vida media de degradación de CYP2D6 de 46.6 h. La farmacocinética de la cafeína y sus metabolitos no fue afectada por la MDMA. Se debería avisar los consumidores de MDMA de las consecuencias de tal inhibición. A pesar de que hay muchas evidencias en animales sugiriendo que el MDMA es una neurotoxina serotonergica, todavía hay mucho debate sobre cuál es la causa de estos cambios cerebrales a largo plazo. La investigación apunta a la producción excesiva de especies reactivos de oxigeno (ROS) en el cerebro después de la administración de MDMA. La MDMA induce hipertermia, la liberación excesiva de dopamina cerebral y lleva a la desregulación energética del metabolismo. Conjuntamente, el metabolismo de MDMA produce un catecol reactivo, cuyos productos causan neurotoxicidad serotonergica en ratas. Cualquiera de los factores anteriores podrían ser la causa de la excesiva producción de ROS y los consecuentes cambios serotonergicos. A tenor de estas hipótesis, se investigó si diferentes temperaturas corporales afectarían el metabolismo de MDMA. Se administró MDMA a ratas a tres temperaturas ambientales distintas con el fin de prevenir o exacerbar la hipertermia inducida por MDMA. Se determinaron las concentraciones plasmáticas de MDMA y sus metabolitos principales durante las 6 h posteriores a la administración de la droga. Después de siete días, se sacrificaron los animales y se determinaron las cantidades de índoles cerebral. La administración de MDMA a 15ºC bloqueó la respuesta hipertermica y la disminución a largo plazo de 5-HT encontrada en ratas administradas a 21.5 ºC. A 15ºC, las concentraciones plasmáticas de MDMA aumentaron significativamente mientras que las concentraciones de sus metabolitos disminuyeron en comparación con ratas administradas a 21.5ºC. En contraste, la hipertermia y las deficiencias de indoles fueron exacerbadas en ratas tratadas a 30ºC. Se observó que las concentraciones plasmáticas de metabolitos de MDMA aumentaron significativamente en estos animales. La depleción a largo plazo de 5-HT no estuvo potenciada por la perfusión intrastriatal de MDMA después de una dosis sistémica de MDMA. Además, la interferencia del metabolismo de MDMA con la administración del inhibidor de catecol-o-metiltransferasa, entacapona, potenció la neurotoxicidad de MDMA, indicando que los metabolitos que son sustratos para este enzima podrían contribuir a la neurotoxicidad. Estos resultados tienen implicaciones tanto con el papel de la temperatura en el mecanismo del desarrollo de la neurotoxicidad del MDMA como en el abuso en humanos donde la hipertermia esta asociado con casos de toxicidad aguda. Se ha sugerido también que la causa de la depleción de 5-HT por MDMA es debido a un aumento de niveles de tirosina en el cerebro, cuyo hidroxilación no enzimática conduce a la formación de radicales libres derivados de la dopamina. En consecuencia, se propuso que el metabolismo de MDMA en compuestos pro-oxidantes fuera el paso limitante del proceso. En una serie de experimentos se encontraron niveles más altos de hipertermia aguda, concentraciones plasmáticas de tirosina, MDMA y sus metabolitos después de una dosis toxica de MDMA (15 mg/kg i.p.) versus una dosis no-toxica (7.5 mg/kg i.p.). La administración de una dosis no-toxica de MDMA (7.5 mg/kg i.p.) en conjunto con L-tirosina (0.2 mmol/kg i.p.) produció un aumento similar de niveles de tirosina en el suero con los niveles encontrados tras una dosis toxica de MDMA, sin embargo, los niveles de 5-HT cerebral permanecieron en niveles normales. Una dosis no-toxica de MDMA en combinación con una dosis alta de tirosina (0.5 mmol/kg i.p.) causó depleciones a largo plazo en ratas administradas a 21.5ºC pero no a 15ºC, condiciones conocidas por disminuir el metabolismo de MDMA. Al mismo tiempo, la perfusión estriatal de MDMA en combinación con tirosina (0.5 mmol/kg i.p.) en ratas hipertermicas no causaron depleciones de 5-HT. En contraste, se observaron reducciones significativas en 5-HT cerebral tras la administración de una dosis no-toxica de MDMA en ratas en condiciones de hipertermia en combinación con entacapona o acivisina, compuestos capaces de interferir con el metabolismo de MDMA o aumentar la disponibilidad de sus metabolitos en el cerebro, respectivamente. En conjunto estos datos indican que a pesar de que la tirosina y la hipertermia pueden contribuir a la neurotoxicidad inducida por la MDMA, el metabolismo de la droga parece ser el paso limitante.

Le marché mondial des fruits représente des centaines de milliards d’euro par an et l’amélioration de la qualité organoleptique et nutritionnelle des fruits est l’un des principaux objectifs de ces dernières années. Le métabolisme primaire est une cible toute trouvée pour tenter de répondre à ces exigences. En effet c’est lui qui va fournir les briques nécessaires à la croissance et au développement, mais également les composés qui confèrent les valeurs gustatives tels que les sucres et les acides organiques. C’est pourquoi la compréhension de son fonctionnement au cours du développement des fruits est nécessaire. Pour cela le métabolisme primaire a été étudié chez huit espèces de fruits charnus qui diffèrent en termes de durée de développement, de taille de fruit, de famille botanique, de qualité gustative (sucrosité, acidité…), et sujettes ou non à une crise respiratoire au début de la maturation. Des données physiologiques et biochimiques ont été collectées tout au long du développement du fruit, de l’anthèse à la maturité physiologique. La modélisation de la croissance des fruits a permis de standardiser les stades de développement et ainsi d’améliorer la comparaison entre espèces. La composition de la biomasse a ensuite été caractérisée qualitativement et quantitativement par des approches analytiques ciblées et non ciblées mettant en évidence les similitudes et les différences de composition et d’évolution au cours du développement. Des modèles linéaires généralisés combinant la composition et les données de croissance ont été utilisés pour comparer différentes phases de développement du fruit et une analyse discriminante par régression des moindres carrés partiels (PLS-DA) a permis de séparer les fruits climactériques des non climactériques. Dans les deux cas, les composés des parois cellulaires, les protéines et les lipides interviennent dans la différentiation des groupes. Enfin, une étude détaillée du métabolome et de l’activome du fruit a été réalisée chez trois espèces de Solanacées. Elle montre qu’au sein d’une même famille botanique la régulation diffère au cours du développement, notamment au niveau du métabolisme des sucres et de la glycolyse. Ces travaux revisitent le caractère climactérique des fruits, le positionnant bien en amont du déclenchement de la crise respiratoire, et, plus généralement, permettent de mieux comprendre le métabolisme primaire au cours du développement du fruit. / The world fruit market represents hundreds of billions of euros per year and improving the organoleptic and nutritional quality of fruit has been one of the main objectives in recent years. Primary metabolism is a target that can be used to try and meet these requirements. Indeed, it provides the bricks necessary for growth and development but also the compounds that contribute to taste such as sugars and organic acids. Therefore, it is necessary to understand how it operates during fruit development. For this purpose, primary metabolism has been studied in eight species of fleshy fruits that differ in terms of development duration, fruit size, botanical family, taste quality (sweetness, acidity, etc.), and are subject or not to a respiratory crisis at the initiation of ripening. Physiological and biochemical data have been collected throughout the fruit development from anthesis to physiological maturity. Fruit growth modelling allowed standardizing the stages of development and thus improved comparison between species. The composition of biomass was then characterized qualitatively and quantitatively by targeted and non-targeted analytical approaches highlighting similarities and differences in composition and changes during development. Generalized linear models combining composition and growth data were used to compare different phases of fruit development and a discriminant partial least square regression analysis (PLS-DA) was used to separate climacteric and non-climacteric fruits. In both cases, cell wall compounds, proteins and lipids were involved in group differentiation. Finally, a detailed study of the fruit metabolome and activome was performed in three species of Solanaceae. It revealed that within the same botanical family, regulation differs during development, particularly for sugar metabolism and glycolysis. This work revisits the climacteric character of fruits, positioning it long before the onset of the respiratory crisis, and, more generally, provides a better understanding of primary metabolism during fruit development.