La inflamació s’ha considerat tradicionalment com un mecanisme de defensa, molt lligat a la supervivència de l’espècie, per la seva capacitat de combatre les infeccions o restaurar el dany produït. No obstant, un estat d’inflamació crònic produeix un efecte totalment contrari, que s’associa a un mal funcionament de teixits i òrgans. L’objectiu d’aquest treball és l’estudi de la proteïna quimioatraient de monòcits-1 (MCP-1), una proteïna descrita per la seva funció en l’atracció de monòcits a la lesió arterioscleròtica, i que pot tenir un paper rellevant en el metabolisme. Els resultats mostren que MCP-1 està implicada en el control del metabolisme dels lípids i de la glucosa, i que l’expressió hepàtica de MCP-1 està sobre-expressada per la dieta i que contribueix al desenvolupament i progressió de l’esteatosi hepàtica en el model LDLr-/-. Precisament, l’últim treball demostra que l’estudi dels canvis metabolòmics en el teixit hepàtic ens pot ajudar a entendre aquesta patologia / Inflammation has been traditionally regarded as a defense mechanism, closely linked to the survival of the species for their ability to fight infections or restore the damage. However, a state of chronic inflammation produced a completely opposite effect, which is associated with tissue and organ malfunction. The aim of this work is the study of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), a protein described by its role in attracting monocytes to atherosclerotic lesions, which may also play an important role in metabolism. The results show that MCP-1 is involved in the control of lipids and glucose metabolism. Hepatic MCP-1 is over-expressed by diet and contributes to the development and progression of fatty liver disease (NASH) in LDLr-/- model. Indeed, the latest study shows that metabolomic changes in the liver can help us to understand the NASH progression.

La GK és clau en la regulació del metabolisme glucídic tant per la seva funció al pàncrees en què determina la secreció d’insulina, com per la seva funció al fetge on controla les vies d’utilització i d’emmagatzematge de glucosa. Per aquest motiu és una bona diana per a la teràpia de la diabetis, i diverses companyies farmacèutiques estan desenvolupant activadors sintètics de la GK (GKA) pel tractament de la diabetis de tipus 2. Els estudis de GKAs existents avaluen l’activació de la GK a nivell sistèmic i no es coneixen els seus efectes específis sobre la GK al fetge. Per indagar-los, com que no disposàvem d’un GKA específic per a la GK del fetge, ens vam proposar la sobrexpressió d’una forma de GK amb una mutació activadora (GK-A456V) que confereix característiques cinètiques a l’enzim idèntiques a les obtingudes amb els GKAs. L’introduírem al fetge perivenós mitjançant transfecció gènica hidrodinàmica (perquè és la zona on s’expressa majoritàriament l’enzim salvatge en condicions fisiològiques). Un dels controls emprats en l’estudi fou la sobrexpressió de la GK salvatge també a la zona perivenosa, que ens permetria comparar els resultats d’aquesta sobrexpressió local de la GK amb la sobrexpressió no zonal descrita a la bibliografia. Per una banda, avaluàrem els efectes de la sobrexpressió i de l’activació de la GK hepàtica en el context d’un animal sa a llarg termini, per determinar si hi havia risc de resistència a insulina (com s’esdevé en alguns models de sobrexpressió no zonal de GK al fetge). Tant l’activació com la sobrexpressió de GK al fetge perivenós a curt termini comportaren una disminució de la glicèmia i de la insulinèmia. No obstant, en avaluar-ho a llarg termini, la sobrexpressió de GK generà un fenotip de resistència a insulina exclusivament al fetge. En canvi, la GK-A456V comportà un fenotip amb un perfil metabòlic similar als animals controls, sense alteracions dels nivells de glúcids i lípids (sèrics i hepàtics). Al fetge, malgrat que no provocava canvis en el metabolisme glucídic i lipídic, l’activació de la GK va promoure la desregulació per GKRP i la inducció de la glucosa-6-fosfatasa. Per altra banda, la presència de la GK activada al fetge resultà en una activació del catabolisme al teixit adipós. Per altra banda, vam emprar un model de diabetis de tipus 1 per determinar els efectes de la GK-A456V sobre el fenotip diabètic independentment de la insulina, amb la finalitat de valorar l’activació de la GK hepàtica com a tractament alternatiu als GKAs sistèmics. La sobrexpressió perivenosa de GK, tot i que comportà un increment del metabolisme de glucosa al fetge (increment del glicogen hepàtic, de ub-PFK-2, de L-PK, c-myc) i una disminució de la gluconeogènesi (reducció dels nivells de PEPCK), va provocar dislipidèmia com a resultat de la disminució de la β-oxidació d’àcids grassos (reducció dels nivells de Cpt-1) i una inducció de la lipogènesi hepàtica (augment de FAS, ACC, ChREBP). Altres models de sobrexpressió de GK, descrits a la literatura, que no tenien en compte el concepte de zonació hepàtica, també presentaven alteracions en el metabolisme lipídic. En canvi, l’activació de la GK comportà una rellevant disminució de la hiperglicèmia diabètica tot i tenir un lleu efecte sobre l’activació del metabolisme de glucosa i sobre la inhibició de la gluconeogènesi. Sobretot és interessant que la millora de la hiperglicèmia diabètica no va acompanyada d’alteracions del metabolisme lipídic. En conjunt, aquest treball suggereix que l’activació de la GK exclusivament al fetge és una estratègia terapèutica millor per a la diabetis que la sobrexpressió de la GK. / Synthetic glucokinase activators have been used in the context of type 2 diabetes therapy, mainly for their insulin secretagogue activity. However, the impact of these drugs on liver GK has not been studied in vivo. Since GK activators and activating GK mutations confer identical kinetic properties to GK, we hypothesize that hepatic overexpression of a mutated form of GK, GKA456V, described in a patient with Persistent Hyperinsulinemic Hypoglycemia of Infancy (PHHI), shall mimic the liver-specific effects of GK-activating drugs. GKA456V was overexpressed in the liver of streptozotocin diabetic mice and also in healthy mice. Metabolite profiling in serum and liver extracts, together with key components of glucose and lipid homeostasis, were analyzed and compared to GK wild-type transfected animals. Cell compartmentalization of mutant and wild-type GK was also examined in vivo. In the type 1 diabetic mice, GKA456V overexpression markedly reduced blood glucose in the absence of dislipidemia, in contrast to wild-type GK-overexpressing mice. Enhanced glucose utilization did not correlate with glycogen synthesis or lactate production. PEPCK mRNA was not affected, whereas the mRNA for the catalytic subunit of glucose-6-phosphatase was upregulated ~4-fold in the liver of GKA456V treated animals. Moreover, GKA456V was not translocated to the nucleus after a short fast, confirming that this activating mutation disrupted GKRP regulation. In healthy mice, the overexpression of hepatic GK resulted in insulin resistance. Otherwise, GKA456V overepxressing animals were not insulin resistant. They showed increased mRNA and protein content of the catalytic subunit of glucose-6-phosphatase in the liver, and an idnuction of catabolism in their adipose tissue. Our results validate liver specific GK activation as a strategy for diabetes therapy and provide new insights into the complex GK regulatory network.

A la primera part de l'estudi s'avaluen els defectes metabòlics de secreció i sensibilitat ala insulina presents en una població d'alt risc per desenvolupar diabetis mellitus tipus 2com són els familiars dels pacients diabètics. A la segona part de l'estudi es realitza unassaig clínic doble cec controlat amb placebo amb un dels fàrmacs utilitzats per laprevenció de la diabetis tipus 2 com és la metformina a pacients amb tolerància alteradaa la glucosa. S'analitzen els seus efectes metabòlics i antiinflamatoris.S'estudia la sensibilitat a la insulina i la secreció amb el mètode HOMA i CIGMA javalidats per aquests estudis tant a la primera part com la segona part de l'estudi. Ladeterminació dels paràmetres inflamatoris es realitzaren amb mètodes d'enzimimmunoassaig d'alta sensitivitat. L'anàlisi estadística de les dades de l'assaig es realitzaamb el model general lineal d'anàlisis de la variància per a mesures repetides.Els familiars dels pacients diabètics manifesten defectes de la sensibilitat i la secreciód'insulina. La metformina a etapes prediabètiques millora la hiperglucèmia i lasensibilitat a la insulina. Millora el perfil bioquímic hepàtic i és probable que tingui propietats antiinflamatòries al augmentar les concentracions de la proteïna bactericida incrementadora de la permeabilitat (BPI). / "Study of insulin resistance in first-degree relatives of type 2 diabetic patients andthe effects of metformin"First part of the study analyzes the metabolic defects of insulin secretion and action in ahigh risk population, the first degree relatives of type 2 diabetic patients. On the secondpart of the study we performed a randomized double blind study with metformin versusplacebo in impaired glucose tolerant patients. We analyzed the metabolic and antinflammatory effects.We studied insulin sensitivity and secretion with HOMA and CIGMA tests in both studies. Inflammatory determinations were performed with high sensitivity immunoassay. Statistical analysis were done with general lineal model of variance for repeated measurements.First degree relatives manifest insulin secretion and sensitivity defects. Metformin improves hyperglycaemia an insulin resistance. It also improves hepatic biochemicaltests and it could have antinflammatory properties due to the increase in bactericidal increasing permeability protein (BPI)levels.

Zéaralénone (Zen) est un métabolite secondaire de type polykétide biosynthétisé par différentes espèces de Fusarium (Fusarium graminearum, F. culmorum, F. equiseti, et F. crookwellense). Il s'agit d'un oestrogène non-stéroïdien (ou mycoestrogène) souvent nommé phytoestrogène. La Zen est un contaminant de cultures de céréales dans le monde entier (Bennett et Klich, 2003). Elle résiste à la plupart des traitements qui ont lieu au cours de la fabrication des denrées alimentaires. En dépit de sa structure non-stéroïdienes, le zen est capable de se lier aux récepteurs des oestrogènes et provoque des altérations morphologiques et fonctionnelles des organes de reproductions. Elle interagit non seulement avec les deux types de récepteurs aux oestrogènes (Celius et al., 1999; Shier et al., 2001; Yu et al., 2004; Takemura et al., 2007), mais aussi avec les substrats dans un certain nombre d'insuffisance des enzymes hépatiques. La Zen est bien absorbée et est capable d'atteindre des cibles intracellulaires. La disparité importante des effets de la Zen entre les différentes espèces animales pourrait en partie due à la différence entre leur profil des enzymes hépatiques (Gaumy et al., 2001; Cavret et Lecoeur, 2006). Le métabolisme de la Zen est complexe, il est dominé par des réactions de conjugaison (considérées comme des voies de détoxication) et des réactions de réduction qui correspondent à l'activation biologique (Gaumy et al., 2001). Nos principaux objectifs étaient l'élucidation des effets des aliments contaminés (en particulier avec le zéaralénone) sur les enzymes de détoxication (en particulier CYP P450) et la compréhension des effets de la zéaralénone sur les différentes espèces. Dans la littérature l'effet de la Zen sur l'expression et sur l'activité des enzymes de détoxication est limité à des expériences in vitro, à notre connaissance aucune recherche in vivo n'a encore été publiée. En vue d'établir les effets in vivo de la zéaralénone sur les enzymes de détoxication nous avons effectué plusieurs expériences: tout d'abord sur le rat, qui est un modèle animal classique pour les études biologiques et sur lequel on trouve une large documentation sur les effets des xénobiotiques et en particulier sur les effets de la Zen, et ensuite sur le poulet, l'une des espèces considérée comme la plus résistante et «habituée» à la présence de la Zéaralénone. Des approches complémentaires ont été utilisées pour déterminer les effets de la zéaralénone sur les enzymes de détoxication: a) Le développement d'outils d'analyses pour des études de la pharmacocinétique des mycotoxines; b) la détermination in vivo des effets de la zéaralénone sur l'expression des enzymes de détoxication et de son devenir dans l'organisme animal c) du mécanisme moléculaire in vitro de la zéaralénone - les effets directs sur les enzymes de détoxification hépatique d) la spécificité des espèces et l'évaluation des risques humains. D'importants effets stimulants sur l'expression d'ARNm de la P-gp ont été observés in vivo chez le rat traitait avec Zéaralénone, ce qui suggère que la P-glycoprotéine pourrait être impliqué dans la voie de détoxication de la zéaralénone. L'implication de la P-glycoprotéine dans le transport de la Zen a été déterminé dans des lignées cellulaires Caco2 par Videmann et al., en 2008. La présence de zéaralénone induit des réponses métaboliques précoces et rapides, en particulier pour le CYP2C7, il pourrait jouer un rôle important dans la voie de détoxication de la Zen chez le rat. Une influence des traitements par la Zéaralénone sur l'expression des RNAm et sur l'activité des isoformes de P450, CYP2B2 et 3A a également été réalisée. CYP2C7 et CYP3A1 sont respectivement les homologues chez le rat des formes CYP2C8 et CYP3A4 humaine (Nelson, 1999), ces cytochromes sont impliqués dans la formation d'un nouveau métabolite le 8-hydroxy Zen. In vivo l'apparition de ce métabolite (le 8-hydroxy Zen) a également été démontrée. Le devenir dans le rat et le poulet de la Zéaralénone a été évalué en utilisant les nouvelles méthodes développées: HPLC-DAD et LC-MS (en utilisant comme étalon interne Zen 13C enrichi). Chez le rat, la zéaralénone est rapidement éliminée. Elle est retrouvée dans les urines, pendant les 6 premières heures après l'administration : environ 60% (47,8 ± 14,3 mg) du montant total de la zéaralénone urinaire éliminé (79,8 ± 23,9 mg) et la Zen et ses métabolites éliminés par l'urine sont d'environ 4% de la zéaralénone administrés. Dans les échantillons de muscle de poulet les niveaux d'α-Zol (13,42 mg / kg) sont plus élevés que le niveau JEFCA accepté (2 mg / kg). Ces volailles sont donc impropres à la consommation. A l'échelle mondiale l'évaluation des risques de l'exposition de l'homme à la zéaralénone, en prenant en compte les habitudes alimentaires, a été réalisée et il en résulte un important et constant risque pour la santé humaine. Aussi la nécessité d'apporter des modifications au règlement concernant la teneur maximale acceptable de la zéaralénone dans les céréales a était surligniez, et nous considérons comme acceptable la valeur 5 μg/kg.

Le maintien de l'homéostasie rédox des thiols, dépendant du pouvoir réducteur du<br />NADPH, est un processus vital pour la cellule faisant intervenir deux voies supposées<br />distinctes : 1) thiorédoxine réductase/thiorédoxines et 2) glutathion<br />réductase/glutathion/glutarédoxines. En dépit de leur importance, on connaît mal la spécificité<br />des glutarédoxines et des thiorédoxines [1]. C'est particulièrement vrai chez les organismes<br />photosynthétiques, dont le métabolisme rédox, dépendant de la photosynthèse, est essentiel à<br />la biosphère (production d'oxygène, assimilation du carbone et de l'azote inorganiques<br />nécessaires à la production de biomasse pour la chaîne alimentaire). La photosynthèse,<br />comme la respiration, produit des molécules oxydantes (les espèces activées de l'oxygène) qui<br />perturbent, entre autres, l'homéostasie rédox des thiols.<br />Dans le cas des glutarédoxines, il a été montré, chez les organismes hétérotrophes, que ces<br />enzymes utilisent le pouvoir réducteur du glutathion (re-réduit par le NADPH via la<br />glutathion réductase) pour contrôler l'état rédox des thiols des résidus cystéines (Cys) des<br />protéines (réduire les ponts disulfure inter- ou intra-moléculaires). Les glutarédoxines se<br />répartissent en deux grandes familles, selon la composition de leur centre rédox actif : les<br />glutarédoxines à dithiol (possédant un site actif de type CysXXCys) et les glutarédoxines à<br />monothiol (avec un site actif de type CysXXSer).<br />Au cours de ma thèse, j'ai analysé, in vitro et in vivo, les glutarédoxines avec un organisme<br />photosynthétique modèle: la cyanobactérie unicellulaire Synechocystis PCC6803<br />(Synechocystis), qui possède un petit génome (3,57 Mb) entièrement séquencé et<br />génétiquement manipulable avec les vecteurs plasmidiques développés au laboratoire.<br />Synechocystis possède 3 glutarédoxines (Grx): deux à dithiol (Grx1 et Grx2) et une à<br />monothiol (Grx3). Dans un premier temps, j'ai inactivé les 3 gènes correspondants,<br />indépendamment ou non. Tous les mutants correspondants (simples, doubles et triple) sont<br />parfaitement viables, dans les conditions standard de croissance. Par contre, leur tolérance aux<br />stress diffère de celle de la souche sauvage. Le mutant Dgrx1 est sensible au mercure (HgCl2)<br />et à l'uranium ((CH3COO)2UO2). Le mutant Dgrx2 est sensible au peroxyde d'hydrogène<br />(H2O2), au cadmium (CdSO4) et au sélénate (NaSeO4). Le mutant Dgrx3 est sensible au bleu<br />de méthylène. Le triple mutant Dgrx1Dgrx2Dgrx3 est sensible à chacun des toxiques<br />précédemment cités, et aussi, de façon spécifique par rapport aux autres mutants, à un excès<br />(x25) de zinc (ZnCl2). Ces résultats indiquent que les Grx possèdent une certaine sélectivité,<br />qui s'exerce vraisemblablement au travers d'interactions spécifiques.<br />11<br />Pour rechercher des partenaires protéiques des Grx, j'ai utilisé un système bactérien de<br />"double hybride", basé sur 2 plasmides dans lesquels on peut cloner, indépendamment, les<br />gènes codant pour les protéines "appâts" (chacun des trois gènes grx) et les protéines "proies"<br />(les partenaires possibles des Grxs). Pour identifier ces dernières, nous avons cloné,<br />indépendamment, une cinquantaine des gènes impliqués dans métabolisme rédox, sans se<br />limiter au contrôle de l'homéostasie rédox des thiols. Les 1000 tests d'interaction réalisés<br />nous ont permis d'identifier 10 interactions totalement nouvelles impliquant des Grx. Ensuite,<br />j'ai analysé les interactions (1) Grx1-MerA (MerA est la réductase du mercure) et (2)<br />thiorédoxine réductase-Grx1-Grx2, par une approche multidisciplinaire: (i) mutagenèses<br />dirigées, tests double hybride et études in vivo; (ii) approche biochimique (GST Pulldown); et<br />(iii) tests d'activité in vitro.<br />J'ai montré que l'activité de réduction du mercure de MerA est inhibée, de façon réversible,<br />par la glutathionylation (fixation d'une molécule de glutathion) d'une cystéine (Cys78) de son<br />site actif. Grx1 réactive MerA en catalysant la réaction de déglutathionylation du site actif de<br />MerA. Outre la tolérance de Synechocystis au mercure (HgCl2), j'ai montré que Grx1 et MerA<br />interviennent également dans la résistance à l'uranium (CH3COO)2UO2.<br />Parallèlement, j'ai analysé les interactions thiorédoxine réductase-Grx1-Grx2. J'ai montré que<br />la thiorédoxine réductase est capable de réduire Grx1, qui peut à son tour réduire Grx2. Cette<br />voie rédox originale compense l'absence de glutathion réductase chez Synechocystis. J'ai<br />également montré que cette "nouvelle" voie rédox est capable de réduire le sélénate. Ces<br />résultats in vitro sont confortés par certains de mes résultats qui suggèrent que Synechocystis<br />répond au sélénate par la formation d'un hétérodimère Grx1-Grx2.<br />Les deux "nouvelles" voies rédox caractérisées au cours de ma thèse sont particulièrement<br />intéressantes car elles permettent de relier deux processus rédox, homéostasie rédox des thiols<br />et détoxication des métaux lourds par réduction, qui n'étaient jusqu'ici pas considérés comme<br />étant étroitement imbriqués.

No sabem quin nom serà emprat en la posteritat per a caracteritzar la nostra era però amb tota seguretat se la podria nomenar l'Era química, tal és el nombre de molècules sintetitzades per l'home que impregnen l'ambient que ens envolta en la nostra vida diària. Per això el nostre concepte de civilització moderna és inconcebible sense un entorn químic superimpost a l'entorn natural. Si la vida humana és millor gràcies a les nostres creacions químiques, o bé serà destruïda per elles, avui més que mai és una qüestió sense resposta (E. Pellegrino, 1976). Amb aquestes declaracions de Pellegrino, es posa de relleu que el propi home és capaç de provocar, a vegades inconscientment, canvis importants en el Medi Am bient, que alteren les repercussions que podríem conside rar "naturals"i els beneficis perseguits es converteixen moltes vegades en perjudicis. Entre ells, l'anomenada "contaminació ambiental" és la causa de trastorns sobre la nostra salut i origen de noves malalties. En aquesta Tesi s'estudien els efectes sobre l'organisme humà d'alguns d'aquestos agents contaminants, els nomenats electrofílics, que es troben abundantment repartits a l'atmosfera de les àrees industrials i urbanes, en molts ambients laborals, i sobre tot al fum del tabac. Aquestos compostos electrofílics són capaços, una vegada ingressats al nostre organisme, de formar enllaços covalents amb les cèl·lules i provocar en elles lesions irreversibles com a mutagènesi i carcinogènesi. Per agreujar més la situació, l'home disposa de sistemes enzimàtics capaços d'augmentar la toxicitat d'alguna d'aquestes substàncies, o inclus de convertir en tòxiques algunes que d'antuvi no ho eren.Sortosament el nostre organisme compta amb diferents mètodes de defensa contra aquestes agressions, entre els que s'hi troben els sistemes de metabolització que permeten eliminar aquestes substàncies el més ràpidament possible. Els compostos electrofílies segueixen majoritàriament la via metabòlica de la conjugació amb el glutation (GSH), mitjançant l'acció de les Glutation S-Transferasa (GST), la qual cosa priva la toxicitat d'aquests agents i facilita la seva excreció. Així doncs, aquest sistema Glutation-Glutation S-Transferasa té un paper clarament detoxificador i pro tector davant d'aquests compostos. El producte final d'aquesta conjugació és un tioèter inactiu, que s'elimina fàcilment per l'orina. Els tioèters seran, per tant, un reflex del grau d'exposició de l'organisme als compostos electrofílics però, a més, ens permetran diferenciar, a igualtat d'ex posició, la millor o pitjor capacitat de detoxificació de cada individu. De tot això es dedueix que, per a valorar la importància d'un contaminant, no és suficient quantificar la seva concentració ambiental, que és el que podríem nomenar "grau de contaminació externa", sinó que s'han de tenir en compte també les interaccions amb els sistemes biològics (metabolització) que poden modificar el compost inicial. D'aquestes interaccions s'obté el que coneixem com a "grau de contaminació interna" o real, que serà molt variable per a cada individu, i no necessàriament coincidirà amb la contaminació externa. Es per tot això que adquireixen tant de valor els no menats indicadors biològics, com a expressió molt fiable de la nomenada Exposició Interna. Els tioèters urinaris han de considerar-se com a indicadors biològics i incluir-se en els plans de monitorització de Salut Pública, com de fet ja passa a d'altres països. En primer lloc, caldrà una coordinació de les funcions de tots els professionals, com són: químics, fisiòlegs, farmacèutics, farmacòlegs, etc., sobrepassant inclus els límits de competències tradicionalment impostes. Existeixen diferents nivells d'actuació i distintes tasques per a tots, i només petits conflictes territorials i jurisdiccionals poden entorpir la bona coordinació d'aquests especialistes en el gran paper que els té reservat la Salut Pública. El farmacòleg, a part de la funció clàssica de descobrir i desenvolupar nous productes, ha de tenir també un paper preponderant en el control d'agents químics em prats en la ramaderia, agricultura i indústria. Ha de dependre d'ells també l'ensenyar i portar a terme treballs d'investigació bàsica, que permetin després, establir sistemes de vigilància i informació, a fi de què la utilització dels agents químics sigui racional. Per tant, allà on existeixi un problema d'interacció d'agents químics amb la vida, la presència del farmacòleg es fa indispensable i adquireix una gran significació social. (E. Pellegrino, 1976).

Al observar la existencia de pocos trabajos realizados en gallinas ("Gallus domesticus") sobre el contenido y distribución de hierro, así como sobre el metabolismo y requerimientos de este metal, orientamos nuestro estudio hacia la observación de posibles variaciones de los siguientes elementos: 1º) Contenido y distribución del hierro en función de la edad, en función del sexo y en el momento de la puesta en los principales órganos y tejidos del animal: hígado, bazo, riñones, corazón; músculo esquelético; intestino delgado: duodeno, yeyuno e íleon; plumas; líquido de perfusión (sangre más CINa 0.9%); carcasa.2º) Contenido en hierro ferritínico en hígado y bazo en función de la edad, en función del sexo y en el momento de la puesta.3º) Balance metabólico en función de la edad, en función del sexo y en el momento de la puesta. 4º) Distribución del hierro y balance metabólico en función del contenido en hierro en las dietas a las 13 semanas: machos y hembras, a las 24 semanas (hembras en estado de puesta). 5º) Determinación del contenido en hierro ferritínico en hígado y bazo en función del contenido en hierro en las dietas, a las 13 semanas: machos y hembras, a las 24 semanas (hembras en estado de puesta). Las experiencias se llevaron a cabo con gallinas pertenecientes a la raza Shaver, genéticamente selecciona-da como ponedora, a las siguientes edades: 4, 8, 13 y 18 semanas, machos y hembras, y gallinas en puesta (24 semanas). Escogimos (en los apartados 4º y 5º) las dos edades citadas, ya que a las 13 semanas son animales aún no adultos sexualmente, y en el segundo caso, sabemos que la puesta modifica el metabolismo del hierro.El número de animales por cada edad y sexo fue de nueve.

Amb l'objectiu d'identificar gens potencialment involucrats en la fisiopatologia de la diabetis mellitus de tipus 2 i l'obesitat es va realitzar al nostre laboratori un experiment d'hibridació sostractiva amb músculs de rates Zucker ZDF obeses i diabètiques i rates. Un dels gens identificats en aquest estudi no havia estat descrit anteriorment; se'l va anomenar DOR, de l'anglès "Diabetes and Obesity Regulated gene". La manca absoluta d'informació prèvia a la literatura sobre DOR fa que la finalitat general d'aquesta tesi sigui identificar i caracteritzar la seva funció a nivell cel·lular. Per aquest motiu primerament es va analitzar la seqüència de la proteïna en busca de senyals o dominis que poguessin aportar informació sobre la seva funció. Diversos indicis indicaven que DOR podia ser una proteïna implicada en la regulació de la transcripció. Concretament, la presència d'una putativa caixa LxxLL, típica de coactivadors de receptors nuclears, indicaven que DOR podia ser un coactivador. Experiments amb vectors reporter van confirmar que la proteïna DOR exerceix de coactivador dels receptors nuclears TR&#945;, PPAR&#947;, GR&#945;, ER&#945; i VDR&#945;. Posteriorment es va realitzar una fusió de la proteïna DOR amb el domini d'unió a DNA del factor de transcripció de llevat Gal4 (Gal4 DBD). D'aquesta manera es va demostrar que DOR té un domini d'activació de la transcripció, ja que aquesta proteïna de fusió és capaç d'activar l'expressió d'un reporter de Gal4. A més, través de fusions amb el Gal4 DBD de fragments de la proteïna DOR, es va poder mapar en quina regió de la proteïna es localitza aquest domini d'activació de la transcripció. La cerca a bases de dades va detectar diverses proteïnes de diferents espècies amb homologia amb DOR, que podien ser, per tant, ortòlegs de la proteïna. La fusió d'aquests possibles ortòlegs amb el Gal4 DBD també era capaç d'activar l'expressió del reporter de Gal4. En cèl·lules C2C12 en que s'havia reduït l'expressió de DOR per l'acció d'un siRNA específic, la capacitat dels receptors nuclears TR&#945; i PPAR&#947; d'activar l'expressió dels seus reporters es veia disminuïda, cosa que indica que la presència de DOR és important per a l'acció d'aquests receptors nuclears. Tot i contenir una putativa caixa LxxLL vam poder comprovar que aquesta no és el principal domini d'interacció de DOR amb els receptors nuclears, ja que la mutació de la caixa no aboleix la capacitat de DOR de coactivar aquests receptors. La caixa, en canvi, és important per al domini d'activació de la transcripció de DOR, ja que la versió mutada de la proteïna és menys potent a l'hora de coactivar els diferents receptors nuclears. Vam analitzar també la localització intracel·lular de la proteïna. Mitjançant estudis amb proteïnes de fusió de DOR amb la proteïna fluorescent GFP, així com amb estudis d'immunolocalització, vam poder comprovar que DOR es localitza al nucli, cosa que és coherent amb la seva funció com a coactivador. Tot i això en determinades condicions DOR es pot localitzar al citosol. En aquest sentit vam poder determinar a DOR les regions responsables de la seva localització nuclear i de la sortida del nucli de la proteïna que té lloc en determinades condicions. Per últim vam analitzar el paper de possibles modificacions post-traduccionals en l'activitat i la localització de DOR. A través de la mutació de llocs putatius de fosforilació per diferents cinases vam deduir que tant l'activitat com la vida mitja de DOR es veu afectada per fosforilacions per aquestes cinases. A més vam comprovar que DOR també es regula per modificacions en lisines, ja que la mutació de lisines de la proteïna també afecta a la seva localització i a la seva vida mitja. / To initially identify genes responsible for the alterations associated to diabetes, we screened genes differentially expressed in Zucker diabetic (ZDF) rats and non-diabetic lean rats by PCR-select cDNA subtraction. One of the genes differentially expressed had not been described before. We named it DOR for "Diabetes and Obesity Regulated gene". The study of the protein sequence suggested that DOR could be a nuclear protein that may participate in transcriptional regulation. To assess whether DRCoA regulates nuclear hormone receptor activity we performed reporter vector assays with several nuclear receptors. Our results confirmed that DOR is able to coactivate the nuclear receptors TR&#945;, PPAR&#947;, GR&#945;, ER&#945; i VDR&#945;. We also constructed a fusion protein of DOR with the DNA binding domain of the yeast transcription factor Gal4 (Gal4 DBD). This allowed us to demonstrate that DOR has a transcription activation domain, as this fusion protein is able to activate the expression of a reporter vector for Gal4. The fusion of several fragments of the protein with the Gal4 DBD served us to delimitate the region of DOR responsible for the activation of the transcription. We also analyzed the cellular distribution of the protein. As could be expected, DOR localizes to the nucleus of the cells, although in certain conditions is localized in the cytoplasm. We determined the regions of the protein responsible for this nuclear localization, as well as the signals responsible for the exit of the protein to the cytoplasm in certain conditions. Lastly we analyzed the role of post-translational modifications in the activity, stability and localization of the protein.

La lipoproteïna lipasa (LPL) és un enzim amb un paper central en el metabolisme lipídic que, sotmès a una regulació específica de teixit, modula la distribució dels triacilglicerols circulants entre els diferents teixits de l'organisme. En el nostre grup s'han estudiat els canvis d'activitat LPL associats a una situació d'estrès. En aquest treball descrivim inicialment que l'estrès agut per immobilització en rata provoca un ràpid descens (5 minuts) de l'activitat LPL del teixit adipós blanc retroperitoneal concomitant amb un augment de l'activitat LPL a plasma. Aquesta resposta suggereix que l'alliberament de l'enzim a la sang podria constituir un mecanisme de regulació de l'activitat LPL a teixits, no descrit anteriorment. A més a més, l'augment paral·lel dels nivells de nitrat a plasma durant la immobilització i resultats previs del nostre grup suggereixen que l'òxid nítric podria participar en aquest procés d'alliberament.En aquest context, vàrem recórrer a l'ús d'eines proteòmiques amb l'objectiu d'estudiar una possible modificació post-traduccional de l'LPL produïda per l'òxid nítric o per espècies reactives del nitrogen. L'aplicació d'aquestes eines ens ha portat a demostrar: (i) la inespecificitat de l'anticòs P66, un anticòs policlonal anti-LPL emprat en estudis anteriors, (ii) l'existència d'isoformes de punt isoelèctric (pI) de l'LPL de rata i (iii) la nitració in vivo en tres residus de tirosina de l'LPL de rata en resposta a l'administració de lipopolisacàrid, que podria constituir un nou mecanisme de regulació de l'activitat LPL tissular.El descobriment de l'existència d'isoformes de pI de l'LPL, obre les portes a estudis més exhaustius dirigits a la identificació de les diferències moleculars entre les isoformes i a explorar les seves possibles implicacions funcionals. / Lipoprotein lipase (LPL) is an enzyme that plays a key role in lipid metabolism. LPL is under tissue-specific regulation and modulates the distribution of circulating triacylglycerols between the tissues of the organism. Our research group has studied the changes in LPL activity associated with stress. The present work reports that acute stress by immobilization induces a fast (5 minutes) down-regulation of retroperitoneal white adipose tissue LPL activity and a simultaneous increase in plasma LPL activity. This response suggests that the release of this enzyme from the endothelium to the bloodstream may constitute a fast mechanism of tissue LPL activity regulation that has not previously been studied.In this context, we used proteomic tools to study a potential post-translational modification in LPL induced by nitric oxide or by reactive nitrogen species. The use of such tools has allowed us to demonstrate: (i) the non-specificity of P66 antibody, a polyclonal antibody used in previous studies; (ii) the existence of isoelectric point (pI) isoforms of rat LPL; and (iii) the in vivo nitration of three tyrosine residues in rat LPL in response to lipopolysaccharide administration, which could be a new mechanism of tissue LPL activity regulation.The discovery of LPL pI isoforms opens the door to further studies aimed at identifying the molecular differences between the isoforms and at exploring their potential functional implications.

Les aminoacil-ARNt sintetases (aaRS) són els enzims encarregats d'aminoacilar els ARN de transferència (ARNt) per tal que puguin ser utilitzats pels ribosomes en el procés de síntesi proteica. La síntesi de les proteïnes codificades en el genoma mitocondrial i constitutives dels complexos de la cadena respiratòria i la fosforilació oxidativa requereixen una maquinària traduccional pròpia de l'orgànul. Per tant, mutacions en els elements que constitueixen l'aparell de traducció genètica mitocondrial poden desencadenar patologies greus en humans. Existeixen malalties mitocondriales humanes causades per mutacions en l'ADN mitocondrial que afecten específicament els ARNt i ARNr i, a més, s'han descrit mutacions en proteïnes mitocondrials codificades en el genoma nuclear, entre les quals es troben mutacions en aaRS mitocondrials. La complexitat de les patologies mitocondrials, degudes a defectes en la síntesi proteica en l'orgànul, justifica la generació de models animals que permetin caracteritzar els efectes de deficiències d'aminoacilació mitocondrial, i el desenvolupament d'estratègies terapèutiques. En base a aquest objectiu, al llarg de la present tesi doctoral hem generat un model de patologia mitocondrial en Drosophila melanogaster amb el propòsit de caracteritzar els efectes d'una deficiència de traducció en l'orgànul com a conseqüència de la manipulació de la seril-ARNt sintetasa mitocondrial (DmSRS2). Els animals sotmesos al silenciament de l'expressió de la DmSRS2, mitjançant l'ARN d'interferència, mostren un descens en els nivells d'ARNtSer mitocondrials aminoacilats. La depleció de la DmSRS2, de manera generalitzada, compromet significativament la viabilitat de l'organisme i, de manera restringida en determinats òrgans i teixits, impedeix el correcte desenvolupament d'aquests. A més, el descens en els nivells de DmSRS2 provoca defectes en la morfologia, en la biogènesi i en la funció mitocondrials, que reprodueixen algunes de les característiques pròpies de malalties mitocondrials humanes. Cal afegir que en el context d'aquest projecte hem descobert una nova proteïna d'insecte homòloga a la seril-ARNt sintetasa mitocondrial (SLIMP), la caracterització de la qual s'ha convertit en un objectiu més d'aquesta tesi doctoral. La llarga història evolutiva de les aaRS explica l'àmplia varietat de funcions associades amb elles, i de proteïnes homòlogues, independents del paper convencional que desenvolupen en la traducció genètica. SLIMP representa una d'aquestes proteïnes, que probablement va sorgir de la duplicació d'una SRS mitocondrial a la base de l'evolució dels metazous, i s'ha mantingut en tots els insectes, en una espècie d'aràcnid i en una d'eriçó de mar. Tot i que SLIMP no desenvolupa una funció com aaRS, reté algunes de les característiques típiques de les SRS mitocondrials, com ho són la conformació dimèrica i la capacitat d'unir específicament els ARNtSer mitocondrials. SLIMP té un paper essencial en D. melanogaster atès que la reducció constitutiva i ubiqua de la seva expressió disminueix la viabilitat, i la depleció restringida en teixits concrets afecta el desenvolupament d'aquests. Proposem que la funció de SLIMP pot estar relacionada amb el metabolisme mitocondrial, ja que la seva depleció produeix greus anormalitats estructurals en l'orgànul, un increment en la biogènesi i una reducció de la capacitat respiratòria mitocondrial. Addicionalment, una dieta enriquida en molècules antioxidants produeix un efecte pal·liatiu en la viabilitat de les mosques sotmeses al silenciament global de SLIMP. / Aminoacyl-tRNA synthetases (aaRS) aminoacylate transfer RNAs (tRNAs) for their use by the ribosome during protein synthesis. The synthesis of mitochondrially encoded proteins is performed by a translation apparatus specific for the organelle, and mutations in elements that constitute this apparatus can trigger severe pathologies in humans. Mutations in the mitochondrial DNA that specifically affect tRNA and rRNA, as well as mutations in nuclear encoded mitochondrial proteins, for instance, those affecting mitochondrial aaRS, are related to disease. The complexity of mitochondrial diseases caused by defects in protein synthesis justifies the generation of animal models which permit the characterization of the pathogenic mechanisms and the development of therapeutic strategies. In the present doctoral thesis we use Drosophila melanogaster to construct a model of a mitochondrial disease caused by a deficiency in mitochondrial translation, by means of RNAi-mediated silencing of mitochondrial seryl-tRNA synthetase (DmSRS2). Silencing of DmSRS2 causes a decrease in mitochondrial seryl-tRNASer levels. Global DmSRS2 depletion compromises viability, and when restricted to particular organs, it prevents their proper development. Moreover, DmSRS2 reduction affects mitochondrial morphology, biogenesis, and function.Within the context of this project we discovered a new insect protein, called SLIMP, homologous to mitochondrial seryl-tRNA synthetase, whose characterization became an additional objective of this thesis. Owing to their long evolutionary history, aaRS and their homologues can perform a wide variety of non-canonical functions. SLIMP is likely the result of a duplication of a mitochondrial SRS gene that occurred early in the evolution of metazoans and was maintained in insects. SLIMP is a dimeric protein and is able to bind mitochondrial tRNASer, properties it has retained from the ancestral mitochondrial SRSs. Although SLIMP does not function as an aaRS, it carries out an essential role in D. melanogaster mitochondria, as its depletion by RNAi decreases the viability of the organism and affects mitochondrial structure, biogenesis, and respiratory capacity.