An important element of metabolic regulation of cardiac and skeletal muscle energetics is the interaction of mitochondria with cytoskeleton. Mitochondria are in charge of supplying the cells with energy, adjusting its functional activity under conditions of stress or other aspects of life. Mitochondria display a tissue-specific distribution. In adult rat cardiomyocytes, mitochondria are arranged regularly in a longitudinal lattice at the level of A band between the myofibrils and located within the limits of the sarcomeres. In interaction with cytoskeleton, sarcomeres and sarcoplasmic reticulum they form the functional complexes, the intracellular energetic units (ICEUs). The ICEUs have specialized pathways of energy transfer and metabolic feedback regulation between mitochondria and ATPases, mediated by CK and AK. The central structure of ICEUs is the mitochondrial interactosome (MI) containing ATP Synthasome, respiratory chain, mitochondrial creatine kinase and VDAC, regulated by tubulins. The main role of MI is the regulation of respiration and the intracellular energy fluxes via phosophotransfer networks. The regulation of ICEUs is associated with structural proteins. The association of mitochondria with several cytoskeletal proteins described by several groups has brought to light the importance of structure-function relationship in the metabolic regulation of adult rat cardiomyocytes. To purvey a better understanding of these findings, the present work investigated the mechanism of energy fluxes control and the role of structure-function relationship in the metabolic regulation of adult rat cardiomyocytes. To show these complex associations in adult cardiac cells several proteins were visualized by confocal microscopy: α-actinin and β-tubulin isotypes. For the first time, it was showed the existence of the specific distribution of β-tubulin isotypes in adult cardiac cells. Respiratory measurements were performed to study the role of tubulins in the regulation of oxygen consumption. These results together confirmed the crucial role of cytoskeletal proteins -i.e. tubulins, α-actinin, plectin, desmin, and others- for the normal shape of cardiac cells as well as mitochondrial arrangement and regulation. In addition, in vivo - in situ mitochondrial dynamics were studied by the transfection of GFP-α-actinin, finding that fusion phenomenon does not occur as often as it is believed in healthy adult cardiac cells.

Notre étude est consacrée à la caractérisation des mécanismes d'adaptation métabolique des neutrophiles au cours de l'inflammation et plus particulièrement au cours de leur recrutement dans les voies aériennes des patients atteints de mucoviscidose (cystic fibrosis ou CF en anglais). Dans la mucoviscidose, nous avons précédemment décrit que les neutrophiles présents dans la lumière du poumon sont viables et soumis à une reprogrammation, notamment via l'activation de la voie anabolique mTOR. Ce travail est fondé sur les propriétés spécifiques de ligands solubles dérivés des domaines liant le récepteur (RBD, pour Receptor-Binding Domain) des glycoprotéines d'enveloppes rétrovirales permettant leur utilisation pour la détection de transporteurs métaboliques à la surface des cellules. Dans un premier temps, nous avons validé l'utilisation de ce nouveau groupe de marqueurs pour identifier et caractériser le phénotype métabolique des leucocytes CF obtenus à partir d'échantillons de différents compartiments (sang et expectorât pulmonaire). Dans un deuxième temps, l'étude de l'expression de ces transporteurs métaboliques sur les neutrophiles sanguins de patients atteints de CF ou de polyarthrite rhumatoïde et de sujets contrôles, a permis la distinction de phénotypes métaboliques au niveau systémique selon différents états inflammatoires. Ensuite, nous avons comparé l'expression des transporteurs métaboliques entre les neutrophiles sanguins et pulmonaires de patients CF et révélé une adaptation métabolique de ces cellules lors de leur recrutement vers les poumons. Enfin, les neutrophiles présents dans les voies aériennes des patients CF présentent une modulation de leur activité transcriptionnelle. De façon surprenante, nos travaux démontrent que malgré leur reprogrammation, les neutrophiles recrutés vers les poumons CF sont fonctionnellement compétents, ajoutant ainsi un nouvel angle d'approche dans l'étude des neutrophiles au cours de l'inflammation, notamment dans le cas de la pathologie pulmonaire liée à la mucoviscidose. / The present study focuses on adaptive metabolic steps adopted by neutrophils during inflammation, particularly during their recruitment into the cystic fibrosis (CF) airways. In CF, we previously described that airway neutrophils are alive and undergo reprogramming, featuring notably the activation of the anabolic mTOR pathway. The present work is based on specific properties of soluble ligands derived from the receptor-binding domains (RBD) of retroviral glycoprotein envelopes, which can be used for the detection of metabolite transporters at the cell surface. First, we validated the use of this new set of markers for the identification and characterization of the metabolic phenotype of CF leukocytes obtained from distinct compartments (blood and sputum). Second, by studying the metabolite transporter expression on blood neutrophils from CF or rheumatoid arthritis patients and control subjects, we distinguished metabolic phenotypes characteristic of specific inflammatory states. Then, we compared metabolite transporter expression between CF blood and airway neutrophils and showed that neutrophils undergo significant metabolic adaptation upon recruitment into the lungs. Finally, we demonstrated that CF airway neutrophils display significant transcriptional modulation and that despite their metabolic reprogramming, they remain functionally competent, thus adding an additional angle of approach to neutrophil studies with regard to inflammation, notably during CF airway disease.

La chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse simple quadripolaire (GC-qMS) est la technique la plus utilisée dans l’exploration des acides organiques urinaires dans le cadre du diagnostic des aciduries organiques (AO). Cependant, après analyse par GC-MS de plus de 1000 échantillons d'urines recueillis auprès d'enfants atteints de troubles neurologiques, moins de 0,5% d'entre eux ont reçu un diagnostic positif. Ceci témoigne de l’urgence de rechercher de nouveaux biomarqueurs dans le domaine des troubles neurologiques associés à des erreurs innées du métabolisme (EIM).L'objectif principal de cette thèse a été de développer une nouvelle méthode d’analyse des échantillons urinaires par chromatographie bidimensionnelle couplée à la spectrométrie de masse (GCxGC-qMS) et d'évaluer son apport dans le profilage métabolique de ces échantillons. Par ailleurs, dans le cadre du diagnostic des AO, dans un objectif de simplification de la procédure de préparation de l’échantillon, nous avons évalué une autre approche d’analyse directe en temps réel couplée à la spectrométrie de masse « DART-MS » des acides organiques urinaires. La première étape de notre travail a été de développer un protocole de préparation de l’échantillon compatible avec une méthode de séparation bidimensionnelle. Puis, grâce à l’étude systématique des différentes conditions de séparation, nous avons développé une méthode par CGxCG-qMS parfaitement adaptée à la séparation des composés extraits.Après validation analytique, la méthode proposée a été ensuite évaluée par le profilage des composés organiques présents dans des échantillons urinaires prélevés chez des volontaires sains. Par rapport aux profils obtenus par une méthode par GC-qMS classique, optimisée, les profils chromatographiques obtenus par la méthode proposée présentent une sensibilité et une résolution nettement plus élevées. Ceci se traduit par la détection en GCxGC-qMS de nombreux composés supplémentaires, jusqu’à 92, selon les échantillons. Parmi les composés supplémentaires détectés et caractérisés, certains sont d’un intérêt diagnostic reconnu.Malgré les difficultés liées à l’étape de préparation de l’échantillon et au traitement des données, l’ensemble des résultats obtenus par la méthode proposée sur de nombreux échantillons urinaires a confirmé les potentialités et la nécessité d’utiliser la chromatographie bidimensionnelle dans le domaine de la découverte de candidats biomarqueurs. Il s’agit maintenant de poursuivre l’identification des composés supplémentaires détectés dans les échantillons urinaires étudiés et d’appliquer la méthode proposée à un plus grand nombre d’échantillons témoins et pathologiques afin d’essayer d’identifier des candidats biomarqueurs.Enfin, les essais préliminaires par la technique DART-MS, effectués dans un laboratoire de la Direction des Applications Militaires (DAM) du CEA, ont été axés sur la détection d’un panel d’acides organiques représentatifs des différentes anomalies rencontrées lors des AO. Malgré les effets de suppression ionique qui restent à éliminer, les résultats obtenus montrent que cette approche mérite d’être approfondie. / Among inherited metabolic diseases, organic acidemia (OA) or organic aciduria is characterized by urinary excretion of abnormal amounts or types of organic acids. OA is mostly associated with genetic conditions resulting in a specific step of amino acid catabolism dysfunction. Such alterations can produce disease states that range from mild to lethal neurological involvement. Gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) remains the most used analytical technique for detecting specific urinary organic metabolites related to OA. However, after analyzing more than 1,000 urine samples collected from children with neurological disorders, by this technique less than 0.5% of them were positive. Thus, the discovery of new biomarker candidates for other metabolic diseases is urgently needed. The main objective of this thesis was to evaluate a new method using two-dimensional gas chromatography coupled to mass spectrometry (GCxGC-MS) for the both qualitative and quantitative metabolic profiling of children’s urine. As compared to GC-MS, GCxGC-MS shows great resolution power and high peak capacity. For this purpose, we first developed a GCxGC-MS method with an appropriate sample preparation protocol for urinary organic acids profiling. Applied to urine samples of healthy children and children with neurological disorders, the proposed method showed high sensitivity and peak capacity thus opening new possibilities for the characterization of new biomarker candidates. For instance, by this technique, we were able to detect in urines samples more than ninety additional compounds, which are not detected by a conventional GC-MS method. However, taken together the obtained results show that while the GCxGC technique has unmatched power to separate compounds in a complex mixture, the sample preparation protocol remains a limiting step for the precise quantification of the detected compounds. On another hand, in order to reduce the sample preparation step, we evaluated the direct analysis in real time (DART) method for the urinary organic acids screening. The obtained results are very promising.

Els mitocondris són orgànuls citoplasmàtics que tenen un paper fonamental en múltiples processos biològics com l’oxidació de substrats i la producció d’ATP, la senyalització cel•lular, l’apoptosi, el control del cicle cel•lular i l’homeòstasi del calci. Els mitocondris són orgànuls dinàmics, que pateixen canvis de morfologia regulats per processos de fusió i de fissió. Existeix un equilibri entre ambdós processos que és indispensable per a la correcta funció mitocondrial. Les proteïnes que participen directament en la fusió mitocondrial en mamífers són les mitofusines (Mfn1 i Mfn2), localitzades a la membrana mitocondrial externa i OPA1, situada a la membrana mitocondrial interna. Diferents estudis han demostrat que la proteïna Mfn2, a més de promoure la fusió dels mitocondris, també està implicada en la interacció entre els mitocondris i el reticle endoplasmàtic i que participa en la regulació del cicle cel•lular i del metabolisme mitocondrial. Per altra banda, l’expressió de Mfn2 es troba disminuïda en múscul esquelètic en situacions de resistència a la insulina, com l’obesitat o la diabetis de tipus 2, que a la vegada es caracteritzen per una alterada activitat mitocondrial. En base a aquestes observacions, l’objectiu principal de la present tesi doctoral ha estat estudiar els efectes de la modulació de l’expressió de Mfn2 sobre el metabolisme i la bioenergètica mitocondrial en múscul esquelètic. Amb aquest propòsit hem expressat una forma truncada de Mfn2 (hMfn2Δ614-757) o bé hem reprimit l’expressió de Mfn2 endògena en el model cel•lular C2C12 i en múscul esquelètic de ratolí. Per dur a terme aquest objectiu hem generat 3 models de ratolí diferents: el model d’expressió transitòria de la forma hMfn2Δ614-757; el model de repressió transitòria de Mfn2 i el ratolí knockdown de Mfn2. Els dos primers models han estat generats mitjançant la tècnica de l’electrotransferència d’ADN en múscul esquelètic. La sobreexpressió de la forma hMfn2Δ614-757 en cèl•lules C2C12 diferenciades incrementa el consum d’oxigen mitocondrial en situació basal i també en desacoblar la cadena de transport d’electrons de la síntesi d’ATP, suggerint una major capacitat respiratòria dels miotubs que expressen la hMfn2Δ614-757. En múscul esquelètic de ratolí, l’expressió d’aquesta forma de Mfn2 causa una estimulació de la taxa d’oxidació de glucosa així com un increment de la Respiratory Control Ratio (RCR). La inducció del metabolisme mitocondrial observada en sobreexpressar la forma hMfn2Δ614-757 no és deguda a un augment de la massa mitocondrial, sinó a un increment en l’expressió i l’activitat d’alguns dels complexes de la cadena respiratòria mitocondrial. La repressió de Mfn2 en miotubs C2C12 produeix un increment en la respiració no associada a la producció d’ATP o proton leak i una disminució en el potencial de membrana mitocondrial. Aquests resultats indiquen que la repressió de Mfn2 provoca el desacoblament de la cadena de transport d’electrons i la síntesi d’ATP, suggerint una disminució de l’eficiència de la fosforilació oxidativa. Els músculs dels ratolins knockdown de Mfn2 presenten una reducció de la taxa d’oxidació de glucosa i de la Respiratory Control Ratio. A més, la repressió de Mfn2 disminueix l’activitat del complex IV de la cadena respiratòria. En conjunt aquests resultats suggereixen que la disminució de l’expressió de Mfn2 origina una disfunció del sistema de transport electrònic mitocondrial. També cal remarcar que els ratolins knockdown de Mfn2 presenten una major susceptibilitat a desenvolupar resistència a la insulina en resposta a l’envelliment o a una dieta rica en greixos. La disfunció mitocondrial i l’augment en la producció d’espècies reactives d’oxigen (ROS) observats en el múscul esquelètic d’aquests ratolins podrien explicar aquesta major susceptibilitat. / Mitochondria are cellular organelles that play a fundamental role in many cellular functions, such as substrates oxidation, ATP production, apoptosis and calcium economy. Mitochondria are dynamic organelles that can fuse and divide; the balance between both processes is crucial for a correct mitochondrial function. The most relevant proteins described to date involved in the regulation of mitochondrial fusion are mitofusins 1 and 2 (Mfn1 and Mfn2, respectively) and OPA1. Substantial data indicates that Mfn2 is also a key regulator of cell cycle and mitochondrial metabolism. On the other hand, Mfn2 expression is reduced in skeletal muscle of obese subjects and type 2 diabetic patients, situations characterized by altered mitochondrial activity. Based on these observations, the main objective of this thesis was the study of the metabolic role of Mfn2 in skeletal muscle. We have studied the metabolic effects caused by the manipulation of Mfn2 expression in mice skeletal muscle in vivo. By means of DNA electrotransfer technologies, we have expressed a truncated Mfn2 mutant in skeletal muscle and we have also repressed endogenous Mfn2 expression with microRNAs. We have also generated a skeletal muscle Mfn2 knockout mouse model (Mfn2 KO). The expression of truncated Mfn2 mutant in tibialis stimulated glucose oxidation and increased the Respiratory Control Ratio (RCR). It also increased the expression of subunits Cox4 of OXPHOS complex IV and Atp5a1 of complex V. We observed these metabolic effects in absence of changes in mitochondrial content. The repression of Mfn2 in mice skeletal muscle caused a marked reduction in the expression of subunit Cox4 of OXPHOS complex IV, accompanied with a 20% of decrease in COX activity. In this case we neither observed differences in mitochondrial content. Skeletal muscle from Mfn2 KO mice showed a decrease in glucose oxidation and in the RCR. In addition, Mfn2 KO mice showed a higher susceptibility to develop insulin resistance in response to aging or a high fat diet. Mitochondrial dysfunction and the increased ROS production observed in skeletal muscle of these mice could explain this higher susceptibility.

La presencia de glucógeno en las neuronas ha sido motivo de controversia durante las pasadas décadas. Sin embargo, está aceptado que las neuronas expresan la maquinaria necesaria para sintetizar glucógeno, pero no para degradarlo. La presencia de la glucógeno sintasa (GS) en las neuronas es un misterio y no existe ningún estudio que analice cuál es su función fisiológica en este tipo neuronal. Recientemente se ha establecido un paralelismo entre la GS neuronal y el caballo de Troya, ya que múltiples estudios han demostrado que una hiper-activación de la GS y la consecuente acumulación de glucógeno desencadenan la entrada en apoptosis. A pesar de ello, la neurona gasta energía para su transcripción y traducción, lo que hace pensar que su presencia en la neurona es importante para su correcto funcionamiento. Los objetivos de esta tesis doctoral son los siguientes: 1. Caracterización del metabolismo de glucógeno y de su presencia en neuronas. 2. Estudio de la maquinaria de degradación de glucógeno en neuronas y su regulación en hipoxia 3. Análisis de la síntesis de glucógeno en neuronas expuestas a hipoxia. 4. Evaluación de la función biológica de la GS en neuronas bajo condiciones de hipoxia. Los resultados de esta tesis revelan que las neuronas tienen una síntesis de glucógeno activa, y, además, lo acumulan en condiciones basales. Además, poseen la maquinaria necesaria para la degradación de glucógeno y degradan sus propias reservas en condiciones de hipoxia. La capacidad neuronal de degradación de glucógeno está presente en una situación in vivo, ya que las neuronas del modelo Drosophila melanogaster movilizan sus reservas en condiciones de hipoxia, y las neuronas de Purkinje en el ratón lo hacen tras una anoxia post-mortem prolongada. La maquinaria de degradación del polisacárido, desconocida hasta el momento, está mediada por la expresión de la glucógeno fosforilasa (GP). Las neuronas expresan la isoforma cerebral del enzima, pero no la muscular, como en el caso de los astrocitos. Esta isoforma está presente tanto en neuronas en cultivo como en neuronas procedentes de cortes de cerebro de ratón adulto. La hipoxia causa la defosforilación y activación de la GS. La GS sintetiza glucógeno activamente, aunque los niveles netos del polisacárido disminuyen en hipoxia. Por tanto, está teniendo lugar un ciclo aparentemente fútil en donde la síntesis y degradación se encuentran activas. Finalmente se ha demostrado que el metabolismo del glucógeno forma parte de la maquinaria de protección que activa la neurona para resistir a la hipoxia. En consecuencia, las neuronas que carecen la GS tienen una mortalidad más elevada que aquellas que sí que expresan el enzima. En el modelo de la mosca, el metabolismo del glucógeno neuronal también juega un papel en la tolerancia a la hipoxia y moscas con niveles reducidos de GS específicamente en la neurona muestran un empeoramiento en la respuesta tras un período de bajo oxígeno. En conclusión, esta tesis presenta evidencias de que las neuronas poseen un metabolismo activo de glucógeno que, además, juega un papel clave en la tolerancia de estas células a condiciones de hipoxia. / The presence of glycogen in neurons has been a matter of debate for the past decades. However, it is accepted that neurons express the necessary machinery to synthesize glycogen, but not for degrading it. The presence of Glycogen Synthase (GS) in neurons is a mystery and there is no study which approaches its physiological function in this cellular type. Recently a parallelism has been drawn between GS and the Trojan horse, since several studies have shown that an over-activation of GS and an accumulation of glycogen cause apoptosis in the neurons. Nevertheless, neurons waste energy for transcribing and synthesizing the protein, which suggests that its presence might be important for the normal functioning of the neurons. The aims of the thesis are the follows 1) Characterization of glycogen metabolism and its presence in neurons 2) Study of the glycogen degradation machinery in neurons and its regulation in hypoxia 3) Analysis of the synthesis of glycogen in neurons exposed to hypoxia 4) Evaluation of the biological function of GS in neurons under hypoxia conditions The results of this thesis reveal that there is an active glycogen synthesis under normal conditions. In addition, they express the necessary machinery to degrade the polysaccharide and degrade it under hypoxia conditions. The neuronal capacity of glycogen degradation is present in the in vivo situation, both in neurons from Drosophila melanogaster and from mice. The glycogen degradation machinery is mediated through the expression of glycogen phosphorylase (GP). Neurons express the brain isoform of the enzyme, but not the muscle, as astrocytes do. This isoform is present in neuronal cultures, as well as in neurons from adult mice brain slices. Hypoxia causes the dephosphorylation and activation of GS. GS actively synthesizes glycogen, although the global glycogen levels diminished in hypoxia. Indeed, an apparent futile cycle is taking place under hypoxia, where both synthesis and degradation are activated. Finally, we have demonstrated that glycogen metabolism is part of the protection machinery the neuron activates for tolerating the hypoxia conditions. Consequently, neurons without GS have a higher mortality rate that these who actively express the enzyme. In Drosophila melanogaster, flies with reduced GS levels specifically in neurons have an impaired phenotype in their reponse to hypoxic conditions. In conclusion, this thesis presents evidences that show neurons have an active glycogen metabolism which plays a key role in the neuronal response to hypoxia.

Las células tumorales presentan alteraciones metabólicas. Una de las diferencias con las células no transformadas es que los tumores usan más glucosa incluso en condiciones de normoxia, lo que se utiliza actualmente para visualizar tumores mediante la técnica de PET. Ultimamente se están desarrollando terapias basadas en estas particularidades metabólicas de las células tumorales, que las hacen más sensibles a inhibición del metabolismo glicolítico. Aquí estudiamos la muerte producida por la falta de glucosa en sarcomas y otros tipos tumorales. La privación de glucosa induce apoptosis o necrosis dependiendo de la línea celular. Mostramos cómo la privación de glucosa induce actividad caspasa en células deficientes de Bax/Bak, mientras que en las líneas de rabdomiosarcoma induce necrosis. Además la caspasa-8 está implicada en la muerte por ausencia de glucosa en estas células deficientes en Bax/Bak y también en células humanas HeLa. Investigamos el uso de 2-deoxiglucosa como inductor de muerte celular frente a líneas de rabdomiosarcoma alveolar y embrional. La 2-deoxiglucosa promueve muerte celular en líneas de rabdomiosarcoma alveolar. También induce diferenciación acompañada por una bajada de PAX3/FOXO1a, una proteína surgida de la translocación cromosómica en las células de rabdomiosarcoma alveolar y crítica en el desarrollo oncogénico de las mismas. Caracterizamos la muerte celular apoptótica inducida por 2-deoxiglucosa en líneas de sarcoma, in vitro. Estudiamos las moléculas de las rutas de apoptosis que determinan la sensibilidad de estas células a la 2-deoxiglucosa, con especial interés en las proteínas de la familia del oncogén Bcl-2. La muerte celular inducida por el tratamiento está asociada a la activación de Bax y Bak. Observamos que la sobre-expresión de proteínas anti-apoptóticas de la familia Bcl-2 como Bcl-xL y de Mcl-1 previene la apoptosis, indicando que la muerte sucede a través de la ruta mitocondrial. Enseñamos que la bajada de Mcl-1 y la subida de Noxa son críticos en la muerte por 2-DG. Además, la 2-DG promueve estrés reticular acompañado de la inducción de ATF4 y chaperonas. Al bajar los niveles de ATF4, protegemos a las células de la muerte inducida por 2-DG y prevenimos la pérdida de Mcl-1. Incubamos células en presencia de manosa, que revierte el estrés inducido por la 2-DG y previnimos la muerte sin subir los niveles de ATP. Así, el estrés energético causado por la 2-DG no es la principal causa de muerte celular. También la 2-DG promueve la fosforilación de eIF2α, un inductor de ATF4, y la inactivación de mTOR. Nuestros resultados sugieren que el uso de inhibidores glicolíticos como la 2-DG pueden ser efectivos en el tratamiento de los rabdomiosarcoma alveolares y que Noxa podría ser un marcador pronóstico de la eficiencia de estas drogas. Por otro lado, caracterizamos las respuestas a la falta de glucosa y 2-DG, en particular la respuesta autofágica que puede determinar que las células mueran o no en respuesta a la falta de nutrientes. Observamos que las células están sensibilizadas al tratamiento con 2-DG tras el uso de cloroquina. Sin embargo, la presencia de cloroquina no afecta a la privación de glucosa. Intentamos clarificar si la falta de glucosa está induciendo macroautofagia. El flujo de LC3 por western blot nos indica que no hay más macroautofagia ni en células DKO ni en las Rh4 en ausencia de glucosa. Por microscopía confocal y analizando células HeLa y Rh4, tampoco vemos mayores acúmulos de GFP-LC3 tras la retirada de glucosa comparando con tratamientos clásicos de inducción de autofagía como la retirada de aminoácidos o con rapamicina. Estos datos sugieren que la combinación de 2-DG con inhibidores de la autofagia podría ser útil en el tratamiento contra rabdomiosarcomas y que la falta de glucosa no induce autofagia. / Characterization of cell death induced by inhibition of glucose metabolism Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft-tissue tumor of childhood characterized by high malignancy, local invasiveness and a marked predisposition to metastasize. Recently, a number of therapies targeting tumor cell metabolism are being developed, since oncogenic changes make tumors more sensitive to inhibition of glycolytic metabolism. We observed that the glycolytic inhibitor 2-deoxyglucose (2-DG) can efficiently promote cell death in p53-deficient alveolar rhabdomyosarcoma (the rhabdomyosarcoma subtype with poorer prognosis), but not in embryonal rhabdomyosarcoma. Differential expression of HIF-1 could not explain the different sensitivity of tumor subtypes. 2-deoxyglucose induced nuclear chromatin condensation, cleavage of caspase substrates and DNA degradation which was inhibited by caspase inhibitors. Cell death triggered by 2-DG was associated with its ability to activate Bax and Bak and was prevented by overexpression of the anti-apoptotic Bcl-2 homologs Bcl-xL and Mcl-1. Conversely, siRNA against Bcl-xL or Mcl-1 accelerated death. 2-DG promoted downregulation of the anti-apoptotic protein Mcl-1 and accumulation of two BH3-only proteins, Noxa and Bim. siRNA against these proteins indicated that Noxa mediates 2-DG-induced cell death. Addition of different carbon/energy sources indicated that apoptosis is not associated with loss of ATP but rather with endoplasmic reticulum stress and the eIF2-alpha-ATF4 pathway. 2-DG promoted Mcl-1 loss, probably due to general inhibition of translation, since both eIF2-alpha phosphorylation and inactivation of the mTOR pathway were observed. All these events (ER stress, energetic stress and inhibition of the mTOR pathway) are known to induce autophagy. Indeed, 2-DG induces autophagy, and inhibition of autophagy at different levels sensitizes cells to 2-DG. Together, our findings suggest that glycolysis inhibitors such as 2-DG may be effective in treating alveolar rhabdomyosarcoma.

Introducció: La nicotina causa una estimulació simpàtica per mitjà de mecanismes centrals i perifèrics. Els mecanismes mediats pel SNC inclouen l'activació dels quimioreceptors perifèrics, particularment els quimioreceptors carotidis i dels cossos aòrtics, i efectes directes sobre el tronc de l'encèfal i la medul·la espinal. Aquesta resposta simpaticomimètica a la nicotina, amb l'activació dels quimioreceptors, produeix per via reflexa vasoconstricció, taquicàrdia i elevació de la pressió arterial. Els mecanismes perifèrics inclouen l'alliberament de catecolamines des de la medul·la suprarenal i les terminacions nervioses vasculars. Aquesta descàrrega adrenèrgica que s'inicia amb el fumar pot afectar la resposta de l'organisme durant l'esforç.Objectiu: La finalitat de l'estudi és la de conèixer les respostes fisiològiques i subjectives en el curs de l'exercici físic fins a l'extenuació, en els individus en funció del seu hàbit tabàquic i, si existeixen diferències entre els mateixos fumadors actius i en situació d'abstinència tabàquica.Material i mètode: S'han estudiat 38 subjectes d'edats compreses entre 18 i 48 anys (mitjana de 32,7). La distribució en funció de l'hàbit tabàquic ha estat: 25 fumadors (F)(17 homes i 8 dones)i 13 no fumadors (NF)(8 homes i 5 dones). L'estudi ha constat de dues parts: 1ª. Comparació del comportament dels F i NF al llarg d'una prova d'esforç (PE) amb anàlisi dels gasos espirats mitjançant cicloergòmetre. La temperatura cutània (TC) s'ha registrat de forma contínua i simultània amb dos sensors tèrmics, un a la regió dorsal i l'altre a la cuixa, sobre el quadríceps. També s'han determinat parametres bioquímics i hematològics. 2ª. Repetició de la PE, comparant els fumadors en situació de fumador actiu i en abstinència tabàquica. L'abstinència tabàquica s'ha detectat i confirmat mitjançant la determinació dels nivells de COHb en sang venosa abans de la PE.Resultats i conclusions: En el nostre estudi, hem comprovat que l'hàbit tabàquic, com a efecte crònic, no modifica de forma significativa la capacitat màxima de treball durant l'esforç en els individus sans i amb edats compreses entre els 18 i 48 anys, independentment del gènere i del grau d'activitat física. Però encara que el consum de cigarretes en individus acostumats a fumar no restringeix significativament el seu rendiment físic, sí que es modifica, de forma notable, la seva resposta fisiològica durant l'activitat física de lleugera i moderada intensitat. Aquesta es manifesta amb un increment significatiu en la despesa metabòlica i l'oxidació d'hidrats de carboni com a substrat energètic, un increment en la resposta cardiocirculatòria i pulmonar (en menor grau), i una deficient resposta termoreguladora al llarg de l'esforç. El fumar cigarretes, al ritme habitual i sense evitar el seu consum les hores prèvies a l'activitat física, pot afectar de forma significativa els mecanismes implicats en la termoregulació i provocar una resposta hemodinàmica alterada durant l'exercici. L'associació de tabac i activitat física d'alta intensitat pot fer augmentar la temperatura central al pertorbar els mecanismes de pèrdua de calor mitjançant la redistribució del flux vascular cutani. A més, durant exercicis perllongats com els exercicis de resistència, i en ambients calorosos, el consum de cigarretes pot actuar com a factor limitant en el rendiment esportiu, i incrementar el risc d'hipertèrmia. En canvi, el consum de tabac disminueix de forma significativa la percepció de l'esforç durant l'activitat física d'alta intensitat en els fumadors actius.

En les gestants que inicien l’embaràs amb baix estat en cobalamina (Cbl), l’empitjorament de l’estat en Cbl al llarg de l’embaràs, s’acosta a una deficiència funcional (augment plasmàtic en àcid metilmalònic (MMA) i homocisteïna (tHcy)). L’ús regular de suplements amb 2 μg de cianocobalamina, es relaciona amb Cbl, holotranscobalamina (HoloTC) i HoloTC/Cbl plasmàtics més elevats, durant tot l’embaràs i al cordó. Els genotips MTRR 524TT, TCII 776CG i 776GG, s’associen amb una reducció d’HoloTC en adults. En les gestants amb baix estat en Cbl a principis d’embaràs, els genotips MTRR 524TT i MTRR 66GG s’associen amb major MMA i tHcy respectivament. El genotip TCII 776GG es relaciona amb 3 vegades més risc de creixement intrauterí retardat. En adults amb baix estat en Cbl i elevat en folats s’observa una relació positiva entre folats i tHcy. Iniciar l’embaràs amb baix estat en Cbl i elevat en folats, s’associa amb MMA més elevat. / The worse cobalamin (Cbl) status during pregnancy is close to functional deficiency (increased plasma methylmalonic acid (MMA) and homocysteine (tHcy)) in pregnant women who start pregnancy with low Cbl status. Regular use of supplements containing 2 µg of cyanocobalamin is associated with higher plasma Cbl, HoloTC and HoloTC/Cbl throughout pregnancy and in cord. The MTRR 524TT, TCII 776CG and 776GG genotypes, in adults are associated with a reduction of holotranscobalamin (HoloTC). In pregnant women with low cobalamin status in early pregnancy, MTRR 524TT and 66GG genotypes are associated with increased MMA and tHcy, respectively. TCII 776GG genotype is associated with triple risk of intrauterine growth retardation. In adults with low cobalamin and high folate status, there is a positive relation between folate and tHcy. Furthermore the beginning of pregnancy with low cobalamin and high folate status is associated with higher plasma MMA.

El principal objectiu d'aquest treball ha estat estudiar la producció de metabòlits amb activitat antibiòtica per soques de l'espècie Pseudomonas fluorescens de la col·lecció EPS, i també avaluar la seva potencialitat com a agents de biocontrol. Es va disposar també de diverses soques de P. fluorescens, cedides per altres investigadors, que van utilitzar-se com a referència perquè algunes són actives en control biològic i produeixen metabòlits secundaris d'interès en el biocontrol de malalties de plantes.La present memòria s'estructura en cinc capítols, que són, introducció al control biològic, descripció de l'etapa de selecció de soques i cerca dels metabòlits produïts, estudi de la producció d'HCN per la soca EPS288, estudi de la producció de l'antibiòtic 2,4-diacetilfloroglucinol (DAPG), i finalment, el darrer capítol, on s'ha estudiat la producció de DAPG sobre material vegetal i la capacitat de colonitzar arrels per diverses soques d'interès.En l'etapa de prospecció, va demostrar-se que un 37% del total de les soques de la col·lecció EPS produïen HCN, totes de l'espècie P. fluorescens, i un 90% d'aquestes provenien de les arrels de plantes. Es va confirmar la producció dels metabòlits secundaris 2,4-diacetilfloroglucinol, àcid fenazina-1-carboxílic, i pirrolnitrina, per diverses soques de la col·lecció EPS seleccionades mitjançant tècniques moleculars. Així, de la col·lecció EPS, les soques EPS317 i EPS808 produeixen DAPG, la EPS263 àcid fenazina-1-carboxílic i pirrolnitrina i, EPS894, EPS895, EPS945 produeixen àcid fenazina-1-carboxílic. La producció d'HCN es va estudiar més exhaustivament en la soca EPS288, seleccionada per la seva activitat antifúngica i candidata a agent de biocontrol contra Stemphylium vesicarium, causant de la estemfiliosi de la perera, i contra Penicillium expansum, causant de la podridura blava en conservació de fruita a postcollita. Per aquest estudi, es va dissenyar i validar un sistema per recollir l'HCN a partir de cultius en medi líquid. S'ha demostrat que la temperatura d'incubació, la concentració cel·lular de sembra i la composició del medi de cultiu afectaven a la producció d'HCN. Els medis complexos i la glicina n'afavorien la síntesi i la font de carboni no afectava. La soca EPS288 va produir més HCN que P. fluorescens CHA0, soca de referència productora d'HCN i descrita com a activa en processos de biocontrol de fongs fitopatògens. En l'estudi de la producció de DAPG, les soques de la col·lecció EPS i de referència, es van comparar en diversos medis de cultiu estudiant l'efecte de la complexitat i consistència del medi, i l'addició de ferro o de glucosa. Va demostrar-se que la producció de DAPG depèn principalment de la soca i de les característiques del medi de cultiu. La glucosa estimula la producció, mentre que el ferro pràcticament no afecta, i en general, el medi sòlid i complex estimula la producció de DAPG. Tanmateix, aquests efectes varien en alguna de les soques assajades donant lloc a comportaments singulars. En el seguiment del creixement amb un sistema automàtic es va comprovar que la velocitat específica de creixement i la concentració cel·lular assolida al final del cultiu, estaven condicionades per la composició del medi de cultiu. En les proves d'antagonisme vers fitopatògens que foren seleccionats com a indicadors, va observar-se que tant l'antagonisme in vitro com la inhibició d'infeccions sobre material vegetal estaven parcialment relacionades amb la producció dels metabòlits secundaris estudiats. La promoció del creixement de portaempelts per aquestes soques depenia de la soca i de l'hoste, però no es pogué establir una relació causa-efecte amb el metabòlits produïts. També es va comprovar que algunes de les soques podien sobreviure en ferides de pomes i de peres, on produïren DAPG.Mutants resistents a rifampicina de diverses soques de la col·lecció EPS i de referència es van inocular en llavors de pomera i de tomatera que es van sembrar i incubar en condicions controlades. Es va fer el seguiment de la població bacteriana total i resistent a rifampicina present a les arrels durant 72 dies. Totes les soques van colonitzar les arrels de les plantes, mantenint una elevada població durant 37 dies, cap d'elles va estimular el creixement ni mostrar efectes fitotòxics, no afectant tampoc signicativament a la població bacteriana espontània de les arrels. La soca EPS808, una de les seleccionades pel treball, va aconseguir uns nivells de producció de DAPG, una velocitat de creixement i una supervivència relativa a les arrels similar a altres soques de referència descrites com a bons agents de biocontrol. En conseqüència, se la considera una candidata a agent de biocontrol que hauria de ser objecte de futurs estudis d'eficàcia. / El principal objetivo de este trabajo ha sido estudiar la producción de metabolitos con actividad antibiótica por cepas de la especie Pseudomonas fluorescens de la colección EPS, y también evaluar su potencialidad como agentes de biocontrol. Se dispuso de varias cepas de P. fluorescens, cedidas por otros investigadores, que se utilizaron como referencia ya que algunas de estas son activas en el control biológico, y producen metabolitos secundarios de interés para el biocontrol de enfermedades de plantas.La presente memoria se estructura en cinco capítulos, revisión bibliográfica del control biológico, descripción de la etapa de selección de cepas y de los metabolitos producidos, estudio de la producción de HCN por la cepa EPS288, estudio de la producción de 2,4-diacetilfloroglucinol(DAPG), y finalmente, el último capítulo, donde se ha estudiado la producción de DAPG sobre material vegetal y la capacidad de colonizar las raíces de diversas plantas. En la etapa de prospección se demostró que el 37% del total de las cepas de la colección EPS producían HCN, todas ellas de la especie P. fluorescens, de las cuales el 90% había sido aislada de las raíces de plantas. Se confirmó la producción de los metabolitos secundarios 2,4-diacetilfloroglucinol, ácido fenazina-1-carboxílico y pirrolnitrina, por diversas cepas de la colección EPS seleccionadas mediante técnicas moleculares. De la colección EPS las cepas EPS317 y EPS808 producen DAPG, la EPS263 ácido fenazina-1-carboxílico y pirrolnitrina y las cepas EPS894, EPS895 y EPS945 producen ácido fenazina-1-carboxílico. La producción de HCN se estudió en detalle por la cepa EPS288, esta había sido seleccionada por su actividad antifúngica y es candidata a agente de biocontrol contra Stemphylium vesicarium, causante de la estemfiliosis del peral, y contra Penicillium expansum, causante de la enfermedad del moho azul en la conservación de la fruta en poscosecha. Para este estudio se diseñó y se validó un sistema para la recogida del HCN que se desprende de cultivos en medio líquido. La temperatura de incubación, la concentración en la siembra y la composición del medio de cultivo afectaban a la producción de HCN. Los medios de cultivo complejos y la glicina estimulaban su síntesis, mientras que la fuente de carbono no afectaba. La cepa EPS288 produjo más HCN que la P. fluorescens CHA0, cepa de referencia productora de HCN y descrita como activa en procesos de control biológico de hongos fitopatógenos.En el estudio de la producción de DAPG, las cepas de la colección EPS y de referencia, se compararon en diferentes medios de cultivo estudiando el efecto de la complejidad y la consistencia del medio de cultivo, y de la adición de hierro o de glucosa. Se demostró que la producción de DAPG depende principalmente de la cepa y de la composición del medio de cultivo. La glucosa estimula la producción, mientras que el hierro casi no tiene efecto. Sin embargo, estos efectos varían en alguna de las cepas ensayadas dando lugar a comportamientos singulares.El seguimiento del crecimiento mediante un sistema automático permitió verificar que la velocidad específica de crecimiento y la concentración celular en la fase estacionaria estaban condicionadas por la composición del medio de cultivo. En las pruebas de antagonismo frente a hongos fitopatógenos seleccionados como indicadores, se observó que el antagonismo in vitro y la inhibición de infecciones sobre material vegetal correlacionaban parcialmente con la producción de los metabolitos secundarios estudiados. La promoción del crecimiento de portainjertos con esas cepas era función del huésped y de la cepa. Se comprobó que algunas de las cepas sobrevivían en heridas de manzanas y de peras dónde sintetizaban DAPG. Mutantes resistentes a rifampicina de diversas cepas de la colección EPS y de referencia se inocularon en semillas de manzano y de tomate las cuales se sembraron e incubaron en ambiente controlado. La población bacteriana en las raíces de las plantas se monitorizó durante un periodo de 72 días. Todas las cepas colonizaron las raíces de las plantas manteniendo una elevada población durante, al menos, 37 días. Ninguna de la cepas estimuló el crecimiento ni mostró fitotoxicidad, y no afectaron significativamente a la población bacteriana espontánea de las raíces.La cepa EPS808, una de las seleccionadas para el presente trabajo, demostró una producción de DAPG, velocidad específica de crecimiento y una supervivencia relativa en las raíces, similares a otras cepas de referencia descritas como buenos agentes de biocontrol. Por lo tanto, se considera a esta cepa como una candidata a agente de biocontrol, que tendría que ser objeto de futuros estudios de eficacia. / The main objective of this work is to study the production of biologically active secondary metabolites produced by Pseudomonas fluorescens strains from EPS collection. Moreover, their potential as biocontrol agents was also evaluated. We used P. fluorescens strains, provided by foreign scientists, that were utilised as a reference because these strains are active as biocontrol agents and produce secondary metabolites involved in biological control. The present work is divided into five chapters which deal with an introduction to biological control, the selection of strains, the detection and identification of metabolites produced by these bacteria, the study of HCN production by EPS288 strain, the study of 2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG) production, and finally, the DAPG production based on fruits and plants, and root colonisation by selected strains.It was shown that 37% of isolates in EPS collection produced cyanide, all were P. fluorescens, and 90% of them were isolated at roots of different plants. The secondary metabolites 2,4-diacetilphloroglucinol (DAPG), phenazine-1-carboxilic acid (PCA) and pyrrolnitrin were identified and its production by some EPS collection strains, selected with molecular techniques, was demonstrated. The strains EPS317 and EPS808 produce DAPG, EPS263 produces phenazine-1-carboxilic acid and pyrrolnitrin, and the strains EPS894, EPS895, EPS945 produce phenazine-1-carboxilic acid.The production of cyanide acid by P. fluorescens EPS288 was studied more exhaustively. This strain was selected as a biocontrol agent due to its antifungal activity against Stemphylium vesicarium, that causes brown spot on pear, and Penicillium expansum, that causes the blue mould of fruits during postharvest. A device to collect cyanide produced by bacteria from broth cultures was set up and validated. The incubation temperature, the initial cell density and the composition of growth media clearly affected HCN production by EPS288 strain. Complex media and glycine stimulated HCN production, however, it was not affected by carbon source in defined growth media. The EPS288 strain produced more cyanide in Castric growth media than P. fluorescens CHA0, a reference strain employed in biological control of fungal pathogens. The reference strains and those from EPS collection which produced DAPG were compared considering the factors complexity and consistence of growth media. The effect of iron and glucose addition were also evaluated. The strain and growth media characteristics were the predominant factors in the DAPG production. Glucose increased DAPG production, while iron addition had no considerable effect, and as general rule, solid and complex media stimulated DAPG production. However these effects are variable depending on the strain. The monitoring of bacterial growth and DAPG production with an automated absorbance reader showed that the growth rate and cellular yield were affected by growth media.In antagonism tests against selected fungal pathogens, the in vitro inhibition and inhibition of infections over organic material were, in part, correlated with secondary metabolite production. The rootstock growth promotion caused by some of these strains was dependent on the strain and the host, but a cause-effect relationship with antibiotics produced could not be clearly established. Some strains were able to colonise and produce DAPG in wounds on apples and pears. Rifampicine resistant spontaneous mutants of the reference and of EPS collection strains were isolated and inoculated on apple and tomato seeds, which were sown and grown under a controlled conditions. The evolution of inoculated strains and the whole bacterial population at the roots were monitored during 72 days. All selected strains efficiently colonised plant roots at high levels for at least 37 days, and nor phytotoxic either plant growth promotion was observed by any strain. Moreover, they did not significantly affected the spontaneous bacterial population at roots.The EPS808 strain exhibited a 2,4-diacetilphloroglucinol production level, a specific growth rate and a relative root population as high as the reference strains that are referenced to be good biocontrol agents. Thus we conclude that this strain can be considered as a candidate for biological control agent, but further efficacy studies are required.

La spectroscopie par résonance magnétique permet de manière non invasive, de caractériser et suivre l'évolution du métabolisme cérébral in vivo chez l’Homme. Néanmoins, de nombreux biais empêchent l’obtention d’une caractérisation métabolique cérébrale complète, un prérequis essentiel pour mieux comprendre une pathologie diffuse comme la Sclérose en Plaques (SEP).Mon premier projet a donc consisté à transposer une technique de spectroscopie rapide en 3 dimensions, acquise dans deux orientations spatiales. Cette comparaison a mis en évidence des diminutions de métabolites reliés à la viabilité et à l’activité neuronale, dans des régions fonctionnelles motrices et cognitives, mais également une activité gliale accrue dans les lésions de substance blanche mais aussi en dehors. La deuxième étude a visée à caractériser d'un point de vue métabolique, les accumulations cérébrales de sodium observées chez les patients atteints de SEP par IRM du 23Na. Nous avons pu mettre en évidence des corrélations significatives entre les accumulations de sodium et les diminutions de NAA mettant en lumière un lien fort entre ces accumulations et les phénomènes de souffrance neuronale.Enfin, le dernier projet a eu pour but d'améliorer la résolution spatiale de l'imagerie spectroscopique du proton en tirant partie des avantages d'un imageur clinique 7 Tesla. Après avoir corrigé différents problèmes comme les inhomogénéités B0 et B1 ainsi que l’artefact de déplacement chimique, nous avons obtenu le profil du NAA, de la Choline et de la Créatine pour 4 gros noyaux thalamiques. De plus, l’analyse statistique a mis en évidence des différences métabolique entre les noyaux Thalamiques. / Magnetic Resonance Spectroscopy (MRS) allows to characterize, in vivo and non-invasively, the cerebral metabolism in Human. Nevertheless, use MRS in clinical routine is marginal and it is impossible to obtain whole brain metabolic topography, mandatory step in order to understand diffuse pathology like Multiple Sclerosis (MS).First of all, we aimed to transpose a fast 3D-MRSI sequence acquired in two different orientations. We observed significant decrease in metabolites linked with neuronal health and activity, in important motor and cognitive areas, and also increase in glial activation, inside white matter T2 lesions but also outside in normal appearing white and grey matter.Secondly, we aimed to characterize the metabolic counterpart of cerebral sodium accumulations observed, using 23Na MRI, in MS patients. We observed significant correlations between sodium accumulations and decrease in NAA highlighting a strong link between sodium accumulations and neuronal suffering.Finally, we attempted to improve spatial resolution of proton MR spectroscopy using 7 Tesla scanner. We also addressed ultra-high field artifacts like B0 and B1 inhomogeneities as well as chemical shift displacement error. We obtained metabolic profiles of NAA, Choline and Creatine for 4 big thalamic nuclei. Moreover, statistical analysis evidencing metabolic differences between nuclei in same hemisphere but also for some nuclei left/right differences.