La resistencia a la insulina es un estado patológico que se define como la incapacidad del organismo de responder normalmente a las acciones de la insulina. Este estado está ligado a la obesidad, al estilo sedentario de vida y es responsable en gran medida de la aparición de la diabetes de tipo 2. Aunque tradicionalmente el estudio de esta patología se había centrado en el metabolismo de carbohidratos, en las últimas décadas se ha producido un cambio hacia el estudio del metabolismo de ácidos grasos como principal promotor de esta enfermedad. De este modo, se ha demostrado una correlación entre la acumulación de lípidos en tejidos periféricos (hígado y músculo principalmente) y la aparición de resistencia a la insulina.El músculo es el responsable de la mayor parte del metabolismo de la glucosa en situaciones de estimulación por insulina. Esto confiere al músculo una vital importancia en el desarrollo de la resistencia a la insulina así como para el tratamiento de la diabetes de tipo 2. Numerosos estudios han descrito que la acumulación de especies derivadas de ácidos grasos en músculo, ya sea debido a un aporte excesivo de lípidos o a un fallo en su oxidación, conducen a una resistencia a la insulina. Estas especies derivadas de ácidos grasos actúan interfiriendo en la señalización de la insulina mediante la activación de una serie de proteínas, conduciendo a una desensibilización del músculo a las acciones de la insulina.En esta tesis se ha estudiado si un aumento en la oxidación de ácidos grasos en músculo es capaz de impedir la acumulación de sus derivados lipídicos y por lo tanto evitar la resistencia a la insulina ocasionada por ellos. Con este objetivo se han usado dos aproximaciones experimentales. En primer lugar, se ha evaluado el efecto de la sobreexpresión de la carnitina palmitoiltransferasa I (CPT I), que es la enzima responsable del control del transporte de ácidos grasos a la mitocondria, donde serán oxidados, y en segundo lugar, se ha estudiado el efecto del C75, un activador de la CPT I recientemente descrito. Además, también se ha estudiado el papel de otra proteína recientemente involucrada en el control de la oxidación de ácidos grasos en músculo, la FAT/CD36. Todo esto se ha llevado a cabo usando como modelo de estudio células de músculo esquelético de rata L6E9.Los resultados presentados en esta tesis demuestran que la sobreexpresión de CPT I ha resultado efectiva en el aumento de la oxidación de ácidos grasos, impidiendo su acumulación y por lo tanto protegiendo a la célula de la resistencia a la insulina. En cambio, se ha demostrado que el C75, a través de su activación a C75-CoA, se comporta como un inhibidor de la CPT I y por lo tanto de la oxidación de ácidos grasos en músculo esquelético. Por último, no se ha podido demostrar que FAT/CD36 juegue un papel importante en la oxidación de ácidos grasos en las condiciones de estudio utilizadas. Estos resultados confirman la importancia del metabolismo lipídico en la resistencia a la insulina en músculo y describen la CPT I como una posible diana farmacológica para el tratamiento de la resistencia a la insulina y la diabetes de tipo 2. Por otro lado describen una nueva acción del C75 sobre la actividad CPT I y sugieren la necesidad de realizar más estudios para esclarecer el papel de FAT/CD36 en la oxidación de ácidos grasos en músculo esquelético. / Skeletal muscle is responsible for 70-80% of whole-body insulin-stimulated glucose uptake and is therefore generally considered the most important site of insulin resistance. Insulin resistance in skeletal muscle plays a major role in the pathogenesis of type 2 diabetes although the mechanism responsible remains unclear. Intramuscular lipid accumulation is evident in a wide set of experimental models, including humans, rodents and muscle cells in culture. These observations have promoted the so-called lipotoxic model of skeletal muscle insulin resistance, which proposes that high plasma fatty-acid levels observed in the obese or insulin-resistant state lead to muscle lipid accumulation, which in turn causes a predisposition towards decreased insulin sensitivity and worsening of the disease.In this thesis we have tested the hypothesis that increases in fatty-acid oxidation should protect from fatty acid induced-insulin resistance by reducing lipid accumulation in the muscle cell. For this purpose we have used two experimental approaches: a) the overexpression of carnitine palmitoyltransferase I (CPT I), the rate-limiting enzyme in fatty acid import into mitochondria for oxidation, and b) study the effect of C75, a recently described CPT I agonist, in fatty-acid oxidation in muscle cells. Moreover we have studied the role of FAT/CD36, a protein recently described to be involved in beta-oxidation in muscle, in the rat skeletal muscle cultured cell line L6E9.Overexpression of LCPT I in L6E9 myotubes increased CPT I activity and palmitate oxidation, preventing lipid accumulation. As a result insulin sensitivity was completely restored. In contrast, C75 acted as an inhibitor of CPT I activity and palmitate oxidation, instead of an activator, both in muscle cells and in mice muscle in vivo. Finally, FAT/CD36 had not an important role in the control of fatty-acid oxidation in L6E9 myoutbes under our experimental conditions. These data confirm the importance of lipid metabolism in muscle insulin resistance and describe CPT I as a possible pharmacologic target for the treatment of insulin resistance and type 2 diabetes. Moreover, we describe a new role of C75 over CPT I activity and fatty-acid oxidation in skeletal muscle.

La obesidad y la diabetes tipo 2 son patologias en las cuales se ha demostrado una desregulación del metabolismo de ácidos grasos. Una acumulación de lípidos en otros tejidos distintos del tejido adiposo, entre los que sobresalen el músculo, páncreas e hígado conduce a la aparición de la resistencia a la insulina en el músculo, una secreción incontrolada de insulina en el páncreas y al desarollo de una esteatosis hepática. Estas enfermedades apuntan a la importancia del metabolismo de los ácidos grasos.Los ácidos grasos se oxidan mayoritariamente en mitocondrias y peroxisomas y este paso está facilitado por las carnitina acitransferasas. En esta tesis estudiaremos un miembro de esta familia, la carnitina palmitoiltransferasa 1 (CPT1). CPT1 es un enzima que facilita el transporte de ácidos grasos de cadena larga a la matriz mitocondrial, donde serán oxidados. Este proceso esta regulado por malonil-CoA, el inhibidor fisiológico de CPT1. El objetivo de este trabajo es identificar mediante análisis bioinformáticos y cinéticos la ubicación del malonil-CoA en las isoformas hepática y muscular de CPT1 (CPT1A y CPT1B). Con un buen modelo malonil-CoA/CPT1 se podrían diseñar fármacos para regular la β-oxidación de algunos ácidos grasos como palmitato y oleato, ya que sus niveles están estrechamente relacionados con patologías como la obesidad y la diabetes tipo 2.Aún no se ha resuelto el cristal de CPT1, posiblemente por ser una proteína integral de membrana. Por ello hemos recurrido a una aproximación bioinformática y análisis de "Docking" in silico, como método predictivo de las posibles interacciones de malonil-CoA con CPT1. El modelo 3D obtenido presenta dos sitios de unión de malonil-CoA, situados de forma opuesta en el canal catalítico, sitio A y sitio O. La validez de este modelo de "Docking" ha sido confirmada mediante estudio cinético de competición del inhibidor con los sustratos de CPT1A, carnitina y palmitoil-CoA y también mediante análisis de mutantes de CPT1A. Malonil-CoA es un inhibidor competitivo de CPT1 respecto al sustrato palmitoil-CoA y es un inhibidor mixto lineal de CPT1A respecto a la carnitina. Estos datos están de acuerdo con el modelo 3D propuesto de interacción de malonil-CoA, carnitina y palmitoil-CoA.En este trabajo proponemos por vez primera un modelo 3D de la isoforma muscular, CPT1B que ha resultado muy similar, como era de esperar, al de la isoforma hepática. Mediante estudios de mutagénesis dirigida hemos confirmado la ubicación de los residuos catalíticos y de un residuo implicado en la sensibilidad a malonil-CoA.Diversos estudios presentan al enzima CPT1 como potencial diana para el tratamiento de la obesidad y la diabetes tipo 2. También el enzima ácido graso sintasa (FAS) se ha propuesto como diana para el tratamiento de la obesidad. En este trabajo hemos demostrado que C75, una lactona ciclica de origen sintético, no solo actúa sobre FAS sino también sobre CPT1 y hemos aportado nueva información sobre el mecanismo de acción de esta molécula sobre la actividad CPT1 in vitro e in vivo. Los análisis por MALDI-TOF y HPLC-MS/MS y los estudios cinéticos y estructurales confirman que C75 es transformado in vitro e in vivo en su derivado CoA, el C75-CoA y bajo esta forma actúa como un inhibidor potente y reversible de CPT1. Además C75-CoA es un inhibidor competitivo respecto al sustrato palmitoil-CoA y es un inhibidor competitivo mixto respecto al sustrato carnitina. Los resultados del análisis de Docking de una molécula de C75-CoA en CPT1A confirman los resultados cinéticos obtenidos. Este estudio abre las puertas para el diseño de nuevos fármacos basados en la molécula de C75. / Carnitine palmitoyltransferase 1 (CPT1) is an ezyme that facilitates the transport of long chain fatty acids into the mitochondrial matrix for their oxidation. This process is regulated by malonyl-CoA, the physiological inhibitor of CPT1. The aim of this work is to identify by biocomputing and kinetic analyses the location of malonyl-CoA in the hepatic and muscular isoforms of CPT1 (CPT1A and CPT1B). The use of a good structural model of malonyl-CoA/CPT1 interaction might be useful for the design of drugs to control the regulation of β-oxidation of some fatty acids as palmitate and oleate, since their levels are closly linked whith pathologies such as obesity and diabetes type 2.Herein we propose a 3D model for CPT1 that presents two different binding sites for malonyl-CoA, situated in opposite sides in the catalytic channel, as shown by molecular Docking analisis. The validity of this Docking has been confirmed by competition kinetics studies of malonyl-CoA with both CPT1A substrates, carnitine and palmitoyl-CoA and also by analysis of specific CPT1A mutants. Malonil-CoA is a competitive inhibitor and a mixed linear inhibitor of CPT1 with regard to palmitoyl-CoA and carnitine respectively. These data are in accordance with the 3D model proposed for the interactions of these molecules with CPT1.Several studies reported that CPT1 is a potential target for the treatment of obesity and type 2 diabetes. Here we show that C75, a synthetic inhibitor of the fatty acid synthase (FAS) not only acts on this enzyme but also on CPT1. We have given new information about the mechanism of action of C75 on CPT1 activity in vitro and in vivo. MALDI-TOF and HPLC-MS/MS analyses and kinetic and structural studies confirm that C75 is transformed in vitro and in vivo in its CoA derivative, C75-CoA and under this form acts as a powerful and reversible inhibitor of CPT1. Also, C75-CoA is a competitive inhibitor and a competitive mixed inhibitor with regard to palmitoyl-CoA and carnitine respectively. The Docking analysis of C75-CoA in CPT1A confirm the kinetic results obtained. This study gives more informations for the design of new medicines based on the C75 molecule.

Yeast cells are exposed to a wide variety of environment stresses, among them changes in the osmotic conditions. An osmolar upshift leads to fast loose of intracellular water, so living cells have developed mechanisms to counteract this lost. In Saccharomyces cerevisiae changes in the osmotic conditions are sensed by the HOG pathway. The HOG pathway is a MAPK signalling pathway and the functional homolog of the stress activated MAPK JNK MAPK and p38 present in mammals. Because there is a high degree of conservation of these cascades, the HOG pathway is a good model to study osmotic adaptation processes.Recent reports have shown that the Hog1 MAPK can regulate several processes such as cell cycle control, metabolic adaptation or regulation of gene expression.At the beginning of this work, the mechanisms by which the Hog1 MAPK was controlling gene expression were unclear because transcription factors under the control of the MAPK were not well characterized. Our goal was the identification of new transcription factors under the control of the MAPK. Therefore, we designed a genetic screen and selected clones from a multicopy genomic library that were able to induce the expression of Hog1 dependent genes in non stress conditions. One of these clones was the SMP1 gene. Smp1 encodes for a MEF2-like transcription factor. Its overexpression induced the expression of osmoresponsive genes such as STL1, whereas smp1 cells were defective in their expression. smp1 cells showed reduced viability upon osmotic shock. Smp1-Hog1 interaction was checked by coprecipitation. Moreover, Smp1 was phosphorylated upon osmotic stress in a Hog1-dependent manner and in vitro phosphorylation experiments showed that Hog1 phosphorylated Smp1 at the C-terminal region. This phosphorylation was important for Smp1 osmoadaptation functions.Moreover Hog1 was implicated in cell adaptability to stationary phase through Smp1.On the other hand, microarrays studies showed that HXT1 hexose transporter was upregulated upon an osmotic shock in a Hog1 dependent manner. Expression of the HXT1 gene, which encodes a low affinity glucose transporter in Saccharomyces cerevisiae, is induced in response to glucose by the general glucose induction pathway, involving the Snf3/Rgt2 membrane glucose sensors, the SCF-Grr1 ubiquitination complex and the Rgt1 transcription factor. In addition to the glucose signalling pathway, we have found that, regulation of HXT1 expression also requires the HOG pathway. Deletion of components on both pathways results in impaired HXT1 expression. Genetic analyses identified Sko1 as the transcription factor under the control of Hog1 that was modulating HXT1 expression.Our studies here have shown that both Smp1 and Sko1 are transcription factors under the control of the MAPK.

Las especies reactivas del oxígeno (ROS), superóxido (O2o-), peróxido de hidrógeno (H2O2), y radical hidroxilo (OHo), se generan a partir de la reducción parcial del oxígeno molecular durante procesos metabólicos como la respiración o tras la exposición a ciertos agentes ambientales como las radiaciones UV. Estas ROS pueden reaccionar con biomoléculas como lípidos, proteínas y DNA e inactivar su función, por lo que las células han desarrollado actividades enzimáticas que se encargan de mantener niveles no-tóxicos de estos oxidantes. Se llama estrés oxidativo a la situación en la cual se produce un incremento en la concentración intracelular de ROS como consecuencia de un aumento en la generación o una disminución en la degradación de las mismas. En respuesta a estrés oxidativo, la célula activa rutas de señalización y factores de transcripción específicos que activan la expresión de proteínas antioxidantes encargadas de reestablecer los niveles redox intracelulares y de reparar los desperfectos causados por estos oxidantes. La levadura Schizosaccharomyces pombe es un organismo modelo ideal para el estudio de las respuestas a estrés oxidativo en las células eucariotas ya que posee sensores específicos a estrés oxidativo como el factor de transcripción Pap1 (pombe AP-1-like) y rutas de respuesta global a estrés, como las descritas en las células de mamífero, que son activadas por diferentes tipos de estrés. En el centro de esta ruta de respuesta global a estrés se encuentra la MAPK (Mitogen-activated protein kinase) Sty1. El factor de transcripción Pap1, de localización citoplasmática basal, se acumula en el núcleo en respuesta a estrés oxidativo. Este cambio de localización subcelular es debido a la inhibición del exporte nuclear dependiente de Crm1, aunque se desconocía el mecanismo molecular utilizado por este factor de transcripción para sensar y responder a oxidantes como H2O2 y dietilmaleto (DEM). Los resultados obtenidos indican que H2O2 oxida de forma reversible dos residuos de cisteína de Pap1 induciendo, seguramente, la formación de un puente disulfuro intramolecular, mientras que, DEM actúa como un agente alquilante que modifica de forma irreversible los residuos de cisteína del dominio C-terminal de Pap1. El gen que codifica para el factor de transcripción Pap1 fue aislado inicialmente como un gen que, en elevado número de copias, confería a las células un fenotipo de resistencia a ciertas drogas como estaurosporina. Esto es debido a que, tras acumularse en el núcleo en respuesta a estrés oxidativo, Pap1 activa la transcripción de genes implicados tanto en la respuesta antioxidante como en la resistencia a multidrogas. Todos aquellos genes que, al igual que pap1 fueron identificados por su implicación en la resistencia a multidrogas, codifican para proteínas que regulan la actividad del factor de transcripción Pap1. hba1 fue el único gen relacionado con resistencia a multidrogas, cuyo producto génico, una proteína con un dominio de unión a Ran (Ran-binding domain), Hba1, no había sido relacionado con la actividad de Pap1. Uno de los objetivos de mi trabajo experimental era el de determinar si Hba1 tenía un papel en la regulación de la actividad de Pap1. Nuestros resultados indican que la proteína Hba1, localizada en el nucleoplasma de la célula, participa en el exporte nuclear mediado por Crm1 de ciertas proteínas como el factor de transcripción Pap1 y la MAPK Sty1, aunque no de otras como la proteína PKI. Por ello, la pérdida de función de Hba1, por sobreexpresión o deleción del gen hba1, induce la localización nuclear constitutiva de Pap1 y Sty1 en ausencia de estrés. Esta localización nuclear de Pap1 es suficiente para la activación transcripcional de sus genes diana. Por lo tanto, el fenotipo de resistencia aumentada a multidrogas de las cepas en las que se ha perdido la actividad de la proteína Hba1, es debido a la acumulación de Pap1 en el núcleo en condiciones de no-estrés.

Resultats anteriors mostraven que rates amb obesitat nutricional ("dieta de cafeteria") tenien un perfil metabòlic d'estalvi de nitrogen, mentre que pel model d'obesitat genètica (Zucker (fa/fa)) es suggeria un malbaratament de nitrogen. Es mostra una reducció en la taxa de recanvi d'alanina per l'animal sencer en el model d'obesitat nutricional, i un increment en el model d'obesitat genètica. La fracció anabòlica de la taxa és la responsable d'aquestes alteracions, suggerint perturbacions en el metabolisme de proteïnes. S'estudiaren músculs individuals, escollits per a assolir un rang ampli de perfils fibril•lars. L'obesitat genètica causa una reducció del contingut en proteïna, principalment en els músculs lents i oxidatius, la qual cosa correlaciona amb un increment en l'activitat µ-calpaïna, congruent amb una taxa de degradació de proteïnes incrementada Per contra, a l'obesitat nutricional, s'observa un increment en el contingut de proteïnes, fonamentalment en els músculs ràpids i glicolítics que no es va poder associar a variacions en l'activitat del sistema calpaïna, congruent amb una taxa de síntesi de proteïnes incrementada

El objetivo de esta tesis es: (1) determinar si el consumidor español asocia la grasa intramuscular (GIM) a la aceptabilidad de la carne de cerdo; (2) incrementar la GIM a través de estrategias nutricionales (adición de acido linoleico conjugado, reducción de vitamina A, reducción de proteína, lisina, suplementación con arginina y leucina). Los resultados mostraron que desde el punto de vista gustativo el consumidor prefiere la carne con un mayor contenido de GIM. Se obtuvo un incremento de la GIM al reducir el nivel de proteína (sin modificar la lisina) o al reducir el nivel de lisina (sin modificar la proteína) y al utilizar una línea genética grasa y no en una línea genética más magra. Se puede concluir que la modificación de la GIM a través de la dieta depende del genotipo, y que las modificaciones de los niveles de proteína y lisina son las más eficaces. / The objective of this thesis was: (1) to test if Spanish consumers associate intramuscular fat (IMF) content with acceptability of pork meat; (2) to increase IMF through nutritional strategies (supplementation with conjugated linoleic acid, reduction of vitamin A, reduction of protein, lysine, supplementation with arginine and leucine). Results showed that from the point of view of taste, consumers prefer the meat with a high IMF content. An increase of IMF was observed when dietary protein or lysine were reduced (without modifying lysine or protein content, respectively) in a fatter but not in a leaner genotype. It can be concluded that modification of IMF content through the diet depends on the genotype, and that changes in dietary protein and lysine levels elicit the greatest response.

El síndrome metabólico, la hiperlipemia familiar combinada (HLFC), la diabetes mellitus tipo 2 y la dislipemia secundaria al tratamiento del VIH son síndromes que conllevan un elevado riesgo cardiovascular. Comparten alteraciones en el metabolismo de las lipoproteínas y de los hidratos de carbono y en la función endotelial. Los genes implicados en estos procesos están regulados a nivel transcripcional por la vía de señalización de la vitamina A. Asimismo, diferentes estudios de ligamiento para estas patologías identificaron un locus común en la región cromosómica 1q21-23. Estas evidencias nos llevaron a plantear la siguiente hipótesis: alteraciones de la regulación génica modulada por la vitamina A, ya sea de origen genético o inducidas por determinados fármacos, como son el ácido retinoico y sus derivados, causan tanto la hiperlipemia como la disfunción endotelial y por lo tanto, un aumento del riesgo cardiovascular.En la región 1q21-23 se localiza el gen CRABP2 (transportador intracelular del ácido retinoico). En pacientes con HLFC identificamos dos nuevos polimorfismos: rs2236795 y rs74118740, y realizamos un estudio de asociación en tres poblaciones independientes. El gen CRABP2 está asociado con niveles más altos de colesterol LDL. Por otro lado, estudiamos el efecto del ácido retinoico 13-cis sobre la expresión génica en células vasculares endoteliales humanas (HUVEC). A concentraciones farmacológicas se identificaron cambios en los niveles de expresión que pueden suponer un aumento de la adhesión celular y de la eliminación de los remanentes de las lipoproteínas y una modificación del metabolismo de la HDL. Finalmente, en el estudio más detallado de uno de los genes, la prostaciclina sintasa (PGIS), se observó un aumento en la liberación de la prostaglandina I2 (inhibidor de la agregación plaquetar y vasodilatador) debido a la inducción de PGIS. Los resultados obtenidos en esta tesis aportan evidencias de que los procesos regulados por el ácido retinoico participan en estas patologías. / Metabolic syndrome, familial combined hyperlipidemia (FCHL), type 2 diabetes mellitus and dyslipidemia secondary to HIV treatment are syndromes linked to high cardiovascular risk, and alterations in lipoprotein and carbohydrate metabolism, as well as with endothelial function. The genes involved in these processes are regulated at the transcriptional level through the vitamin A signaling pathway. Also, several linkage studies have identified a common locus in 1q21-23. This evidence led us to the following hypothesis: vitamin A modulates gene regulation involved in these alterations either genetic or drug induced (such as retinoic acid and its derivatives); these alterations cause hyperlipidemia and endothelial dysfunction and therefore increase cardiovascular risk. Cellular retinoic acid binding protein II gene (CRABP2) is located in 1q21-23. We identified in FCHL patients two new polymorphisms (rs2236795 and rs74118740), and studied its association with dyslipidemia in three independent populations. CRABP2 gene is associated with higher levels of LDL cholesterol. Furthermore, we studied the effect of 13-cis retinoic acid on gene expression in human vascular endothelial cells (HUVEC). We identified changes in expression levels at pharmacological concentrations that caused an increase in either cell adhesion and lipoprotein remnants removal, and a modification of HDL metabolism. Finally, studying prostacyclin synthase gene in detail (PGIS), we observed an increase in the release of prostaglandin I2 (platelet aggregation inhibitor and vasodilator) due to the induction of PGIS. The results in this thesis provide evidence that the processes regulated by retinoic acid are involved in these pathologies.

Resultats anteriors mostraven que rates amb obesitat nutricional ("dieta de cafeteria") tenien un perfil metabòlic d'estalvi de nitrogen, mentre que pel model d'obesitat genètica (Zucker (fa/fa)) es suggeria un malbaratament de nitrogen. Es mostra una reducció en la taxa de recanvi d'alanina per l'animal sencer en el model d'obesitat nutricional, i un increment en el model d'obesitat genètica. La fracció anabòlica de la taxa és la responsable d'aquestes alteracions, suggerint perturbacions en el metabolisme de proteïnes.S'estudiaren músculs individuals, escollits per a assolir un rang ampli de perfils fibril·lars. L'obesitat genètica causa una reducció del contingut en proteïna, principalment en els músculs lents i oxidatius, la qual cosa correlaciona amb un increment en l'activitat µ-calpaïna, congruent amb una taxa de degradació de proteïnes incrementada Per contra, a l'obesitat nutricional, s'observa un increment en el contingut de proteïnes, fonamentalment en els músculs ràpids i glicolítics que no es va poder associar a variacions en l'activitat del sistema calpaïna, congruent amb una taxa de síntesi de proteïnes incrementada.

L'SSAO/VAP-1 és una proteïna amb una dualitat de funció; d'una banda, presenta activitat enzimàtica amino-oxidasa i, de l'altra, presenta propietats d'adhesió que la impliquen en l'extravasació de limfòcits en processos inflamatoris. Aquesta proteïna es troba altament expressada en el teixit adipós. En els darrers anys, s'ha passat de considerar el teixit adipós com un òrgan d'emmagatzematge energètic a considerar-lo un teixit de vital importància per al control del metabolisme glucídic de l'organisme implicat en la patologia diabètica. El transport de glucosa al teixit adipós i al múscul esquelètic és un pas limitant en l'ús de glucosa i la resistència a la insulina es manifesta en una disminució de la capacitat de la insulina per estimular el transport de glucosa en aquests teixits. Amb la intenció d'avaluar el possible paper fisiològic de l'abundància d'SSAO al teixit adipós, treballs previs d'aquest grup de recerca havien demostrat que substrats de l'SSAO en combinació amb vanadat podien estimular el transport de glucosa per via de l'estimulació de la translocació dels transportadors de glucosa GLUT4 a la membrana de la cèl·lula en adipòcits aïllats de rata. Així, el primer objectiu va ser:1. Estudiar el mecanisme molecular d'acció de la combinació de benzilamina i vanadat a les cèl·lules adiposes i determinar la molècula activa generada responsable dels efectes observats.Un cop demostrat l'efecte insulinomimètic de la combinació de benzilamina i vanadat sobre cèl·lules adiposes, calia passar a estudis in vivo en models animals; així els següents objectius van ser:2. Estudiar l'efecte de l'administració aguda o crònica de la combinació de benzilamina i vanadat sobre animals no diabètics i en models de diabetis de tipus 1 i tipus 2.3. Estudiar l'efecte del tractament crònic amb benzilamina i vanadat sobre el metabolisme del teixit adipós i del múscul esquelètic, així com sobre l'activitat dels illots pancreàtics.Atesa la importància del teixit adipós en la patologia diabètica, l'elevada activitat SSAO present en aquest teixit i el fet que l'activitat SSAO present en el plasma està augmentada en la diabetis mellitus, un altre objectiu va ser:4. Analitzar la participació del teixit adipós en l'alliberament de la forma soluble de l'SSAO/VAP-1.Els resultats obtinguts en la tesi han estat publicats en tres articles originals més un article de revisió, a més hi ha un article pendent d'acceptació. Les conclusions derivades són les següents.1. Els substrats de l'SSAO en combinació amb vanadat estimulen el transport de glucosa als adipòcits en condicions en les quals es produeix peroxovanadat, s'inhibeix l'activitat proteïna tirosina-fosfatasa i s'activa l'IRS-1, l'IRS-3, la PI3K i la PKB. 2. L'administració aguda de benzilamina i vanadat augmenta la tolerància a la glucosa de rates no diabètiques i en rates diabètiques de tipus 1 i 2; així mateix, estimula el transport de glucosa al múscul.3. L'administració crònica de benzilamina i vanadat normalitza la glucèmia en rates diabètiques.4. En rates diabètiques per estreptozotocina, l'administració crònica de benzilamina i vanadat augmenta el transport de glucosa basal i l'estimulat per insulina i la quantitat total de GLUT4, als adipòcits. En rates Goto-Kakizaki, augmenta el transport de glucosa i la quantitat de GLUT4 present a la membrana plasmàtica als adipòcits no estimulats i el transport estimulat per insulina al múscul.5. En rates Goto-Kakizaki, la combinació de benzilamina i vanadat estimula la secreció d'insulina en illots pancreàtics.6. La generació local de peroxovanadat basada en l'activitat SSAO pot representar una nova estratègia terapèutica per al tractament de la diabetis mellitus.7. Les cèl·lules adiposes alliberen SSAO soluble al medi de cultiu, en un procés dependent de metal·loproteases de matriu i regulat per factors implicats en la resistència a la insulina.

El canvi en l’estil de vida que s’ha produït en les societats desenvolupades els darrers anys ha tingut com a contrapartida l’aparició de conductes sedentàries i modificacions en la dieta. Com a conseqüència d’aquests factors s’han produït diverses alteracions metabòliques que han causat un augment de la prevalença de l’obesitat. Aquesta obesitat té una sèrie d’efectes adversos sobre la fisiologia cardiovascular i és considerada un important factor de risc pel desenvolupament de la insuficiència cardíaca. De fet, el consum de dietes amb un elevat contingut en greixos (HFD) s’ha relacionat amb una sèrie d’alteracions cardíaques directes com són la inflamació, la hipertròfia i la disfunció contràctil. Durant el procés inflamatori que es produeix en les esmentades malalties cardiovasculars, les cèl•lules cardíaques humanes secreten citocines i quimiocines proinflamatòries com el TNF-α, MCP-1, i IL-6, molècules que es troben sota el control transcripcional del factor de transcripció ubic i induïble anomenat NF-κB. Aquestes citocines exerceixen diversos efectes pleiotròpics autocrins en les cèl•lules cardíaques, tot produint un efecte de retroalimentació positiva del procés inflamatori que contribueix al desenvolupament d’aquestes malalties. En condicions normals, el cor de mamífers adults obté energia en forma d’ATP principalment a partir de la β-oxidació d’àcids grassos en el mitocondri, encara que aquest orgànul és capaç de catabolitzar altres substrats com la glucosa o el lactat per tal d’assegurar una font constant d’energia. Ara bé, en determinades circumstàncies, com és el cas de la hipertròfia i la insuficiència cardíaques, aquesta flexibilitat de substrat es veu compromesa i la β-oxidació d’àcids grassos es redueix degut a que la font principal d’energia passa a ser la glucosa. Aquests canvis metabòlics comporten una desregulació del control transcripcional de gens relacionats amb el transport, captació i catabolisme dels àcids grassos i la glucosa. En el miocardi, els factors de transcripció implicats en el control d’aquests gens inclouen ERRα i PPARβ/δ. Ambdós factors de transcripció, participen en l’activació de la PDK4, enzim clau en la modulació homeostàtica de la glucosa. Aquesta cinasa regula l’activitat de la PDC, enzim que catalitza la reacció de descarboxilació del piruvat a acetil-CoA, tot limitant l’ús de carbohidrats com a font d’energia en mitocondris i afavorint així la β-oxidació d’àcids grassos. En l’activació de la transcripció de PDK4 també hi participa PGC-1α, que interacciona amb ERRα i PPARβ/δ, tot incrementant-ne la seva activitat transcripcional. Estudis recents però, semblen indicar que no només aquests dos factors de transcripció participen en la regulació de PDK4. És el cas d’E2F1, un factor de transcripció clau en la regulació de la transició de la fase G1 a la fase S del cicle cel•lular i del qual la regió promotora del gen que codifica per PDK4 en presenta dos llocs d’unió. Estudis recents suggereixen que PPARβ/δ, que és la forma predominant en les cèl•lules cardíaques, pot atenuar les vies de senyalització inflamatòries i, per tant, interferir en la remodelació cardíaca. Aquesta funció és en gran mesura deguda a la capacitat dels PPAR, un cop han estat activats per agonistes, de formar complexos amb altres factors de transcripció activats, com ara NF-κB i STAT resultant així en la inhibició de l’activitat transcripcional d’aquests últims. Així l’ús d’agonistes PPARβ/δ podria ser un camí força interessant de cara a trobar potencials fàrmacs per tal de pal•liar les afeccions cardíaques derivades d’alteracions metabòliques i amb un rerefons inflamatori. En conjunt en aquest treball es presenten una sèrie de resultats destinats a conèixer de forma més detallada els mecanismes moleculars que relacionen les alteracions metabòliques i els processos inflamatoris en cor, per tal de poder buscar potencials dianes farmacològiques amb l’objectiu de prevenir i tractar aquests estats patològics. / The change in lifestyle that has occurred in developed societies in recent years has been accompanied by the rise of sedentary behavior and changes in diet that have caused an increasing obesity prevalence. Obesity has a huge number of adverse effects on cardiovascular physiology and is considered an important risk factor for heart failure developement. In fact, high fat diets have been linked with direct cardiac abnormalities such as inflammation, hypertrophy and contractile dysfunction. During the inflammatory process that occurs in these diseases, human cardiac cells secrete proinflammatory cytokines and chemokines such as TNF-α, MCP-1, and IL-6, molecules that are under the control of the ubiquitous and inducible transcription factor NF-κB. In certain circumstances, such in hypertrophy and heart failure, the substrate flexibility in heart is compromised and the fatty acids β-oxidation is reduced because the main source of energy becomes the glucose. These metabolic changes lead to a deregulation on the transcriptional control of genes associated with transport, uptake and catabolism of fatty acids and glucose. In the myocardium, among the transcription factors involved in the control of these genes we found ERRα and PPARβ/δ. Both transcription factors, are involved in PDK4 activation, an important enzyme in the homeostatic modulation of glucose. This kinase regulates PDC activity, an enzyme that catalyzes the decarboxylation from pyruvate to acetyl-CoA, limiting the use of carbohydrates as energy source in mitochondria and thus favoring the fatty acid β-oxidation. In the PDK4 transcription activation also participates PGC-1α, which interacts with ERRα and PPARβ/δ, increasing its transcriptional activity. However recent studies, suggest that not only these two transcription factors are involved in PDK4 regulation. Other transcription factors as E2F1, which is crucial for cell cycle control, may regulate PDK4 expression. Overall, the results shown in this work are aimed to learn in more detail the molecular mechanisms linking the metabolic disorders and inflammatory processes in heart, in order to find potential drug targets to prevent and treat these pathological states.