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Efeitos dos principais ácidos graxos acumulados na deficiência da desidrogenase de acil-coa de cadeia média sobre homeostase energética mitocondrial e parâmetros de estresse oxidativo em cérebro de ratos jovensSchuck, Patrícia Fernanda January 2009 (has links)
A deficiência da desidrogenase de acil-CoA de cadeia média (MCAD) é o mais frequente defeito de oxidação de ácidos graxos, caracterizado bioquimicamente pelo acúmulo tecidual predominante dos ácidos graxos de cadeia média octanoato (AO), decanoato (AD) e cis-4-decenoato (AcD). Embora os sinais clínicos dos afetados sejam fundamentalmente neurológicos, os mecanismos fisiopatológicos do dano do sistema nervoso central apresentado pelos pacientes afetados por esse distúrbio ainda não estão esclarecidos. Tem sido, no entanto, levantada a hipótese de que os ácidos graxos acumulados nesta doença possam exercer efeitos tóxicos. Neste cenário, o objetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos in vitro dos ácidos AO, AD e AcD sobre parâmetros de função mitocondrial e de estresse oxidativo em cérebro de ratos de 30 dias de vida, uma vez que o metabolismo energético é muito ativo e as defesas antioxidantes estão diminuídas neste tecido. Inicialmente, observamos que todos os ácidos graxos testados dimuíram o potencial de membrana mitocondrial em preparações mitocondriais de cérebro de ratos, sendo que as concentrações mais altas testadas do AD e do AcD exerceram efeitos comparáveis ao de um clássico desacoplador da fosforilação oxidativa, sugerindo que estes ácidos graxos atuem como desacopladores. Os ácidos AO, AD e AcD também aumentaram o estado 4 da respiração mitocondrial e diminuíram os valores do índice de controle respiratório. Além disso, o AD e o AcD diminuíram o estado 3 da respiração tanto com glutamato/malato quanto com succinato como substratos, enquanto que o AO dimiuiu o mesmo parâmetro apenas com o succinato. Também encontramos uma diminuição na razão ADP/O na presença de AD e AcD. O atractilosídeo, inibidor do translocador de nucleotídeos de adenina (ANT), foi capaz de impedir parcialmente o efeito desacoplador do AD, sem alterar os efeitos do AO e do AcD, sugerindo um envolvimento deste translocador no efeito desacoplador do AD. O AO e o AD também diminuíram o consumo de oxigênio em mitocôndrias desacopladas. O AcD também diminuiu a produção de peróxido de hidrogênio, sendo seu efeito maior do que o da rotenona, que inibe o fluxo reverso de elétrons. Os AO e AD diminuíram as atividades dos complexos I-III e IV da cadeia transportadora de elétrons, e o AD também inibiu a atividade do complexo II-III. Todos os três ácidos graxos testados diminuíram o conteúdo de equivalentes reduzidos de NAD(P)H na matriz mitocondrial e a posterior adição de rotenona apenas reverteu o efeito do AO, sugerindo que estes equivalentes estejam sendo perdidos para o meio extramitocondrial. Os ácidos AD e AcD também induziram um maior inchamento mitocondrial, sugerindo que estes ácidos graxos possam atuar como desacopladores provavelmente devido a uma permeabilização nãoseletiva da membrana mitocondrial interna. Também avaliamos o efeito dos mesmos ácidos graxos sobre parâmetros de estresse oxidativo. Observamos que o AO, o AD e o AcD induziram um aumento na peroxidação lipídica em córtex cerebral de ratos, evidenciado por um aumento nos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e na medida de quimioluminescência espontânea. Os AD e AcD também causaram dano oxidativo proteico, visto que aumentaram o conteúdo de carbonilas e diminuíram o conteúdo de grupamentos sulfidrila. Além disso, todos os ácidos graxos testados diminuíram as defesas antioxidantes não-enzimáticas, evidenciado pela diminuição do potencial antioxidante total do tecido (TRAP). Entretanto apenas o AD e o AcD diminuíram os níveis de glutationa reduzida (GSH), o principal antioxidante não-enzimático presente no cérebro. O AcD não ocasionou um aumento nos níveis de TBA-RS em preparações mitocondriais de cérebro de ratos, sugerindo que outros componenentes celulares sejam essenciais para os efeitos pró-oxidantes deste ácido graxo. Entretanto, não foi observado nenhum efeito do AD sobre níveis de GSH e o conteúdo de grupamentos sulfidrila em preparações citosólicas, sugerindo um papel para a mitocôndria nos efeitos causados por este ácido graxo. Devemos também enfatizar que os efeitos mais pronunciados foram verificados pelo AcD, seguido do AD e por último do AO. Estes resultados, tomados em seu conjunto, indicam que os principais metabólitos acumulados na deficiência de MCAD exercem efeitos neurotóxicos importantes. Dessa forma, é possível que uma disfunção mitocondrial e o estresse oxidativo, possivelmente com outros mecanismos, atuem sinergicamente, colaborando para o dano neurológico apresentado pelos pacientes afetados pela deficiência da MCAD. / Medium-chain acyl-CoA dehydrogenase (MCAD) deficiency (MCADD) is the most frequent fatty acid oxidation disorder, leading to the accumulation of octanoic (AO), decanoic (AD) and cis-4-decenoic (AcD) acids. Considering that the pathophisiology of the neurological damage found in MCAD-deficient patients is not clear yet, and that a role for neurotoxic accumulating metabolites has been considered, the aim of the present work was to investigate the in vitro effect of AO, AD and AcD on mitochondrial function and oxidative stress parameters in 30-dayold rat brain. Initially we investigated the effect of these fatty acids on mitochondrial homeostasis, and we found that all these three metabolites diminished the mitochondrial membrane potential in mitochondrial preparations of rat brain, and the effects of the highest concentration of AD and AcD were similar to the CCCP effect, a classical uncoupler, suggesting that these fatty acids act as uncouplers of oxidative phosphorylation. AO, AD and AcD also increased state 4 respiration and decreased respiratory control ratio. AD and AcD also decreased state 3 respiration with either glutamate/malate or succinate as substrates, while AO only decreased in the presence of succinate. We also observed a decrease in the ADP/O ratio caused by AD and AcD. Atractyloside, an inhibitor of adenine nucleotide transporter (ANT), mildly prevented the uncoupler effect of AD, without any effect of AcD- and AO-induced effects, suggesting a role for ANT on AD-induced effects. AO and AD also diminished uncoupled state (state U) in mitochondrial preparations. AcD also decreased hydrogen peroxide production, and this effect was greater than rotenone effect, which inhibits the reverse electron flow. AO and AD inhibited the activities of the respiratory chain complexes I-III and IV, and AD also inhibited complex II-III activity. All the fatty acids tested decreased mitochondrial matrix NAD(P)H content, and the further addition of rotenone only reverted AO-induced effect, indicating that these reduced equivalents might be lost from the mitochondrial matrix. AD and AcD also induced a mitochondrial swelling, suggesting that these fatty acids act as uncouplers probably due to a non-selective mitochondrial inner-membrane. We also evaluated the effect of the same fatty acids on oxidative stress parameters. We first observed that lipid peroxidation was increased in the presence of AO, AD and AcD, as observed by the increase in the thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS) levels and spontaneous chemiluminescence. AD and AcD also caused protein oxidative damage, since they increased carbonyl content and decreased sulfhydryl group content. All the fatty acids tested also decreased the non-enzymatic antioxidant defenses, as they decreased the total radical-trapping antioxidant potential (TRAP). However, only AD and AcD decreased reduced glutathione (GSH) levels, the major antioxidant in the cell. AcD did not induce an increase in TBA-RS levels in mitochondrial preparations, suggesting that mitochondria were not involved in AcD-induced effects. Furthermore, AD did not alter GSH levels and sulfhydryl group content in cytosolic preparations, suggesting a role for mitochondria in AD-induced effects. Taken together, these results suggest that the MCADD accumulating fatty acids cause important neurotoxic effects. Thus, it is feasible that a mitochondrial dysfunction and oxidative stress, allied to other possible toxic effects, act synergistically, collaborating to the neurological damage found in MCAD-deficient patients.
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Alterações no crescimento e no metabolismo de plantas de tomate em resposta à salinidade são atenuadas pela elevada concentração de dióxido de carbono / Changes in the growth and metabolism of tomato plants in response to salinity are attenuated by high concentration of carbon dioxideBrito, Fred Augusto Lourêdo de 17 July 2016 (has links)
Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-06T14:33:41Z
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Previous issue date: 2016-07-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O crescimento e desenvolvimento das plantas envolvem processos que são sensíveis a salinidade dos solos. O aumento da concentração de dióxido de carbono ([CO 2 ]) na atmosfera durante as últimas décadas tem despertado crescente interesse na função desse gás como um sinal do ambiente envolvido na regulação do crescimento e desenvolvimento das plantas. Apesar da conhecida associação entre elevada [CO 2 ] e crescimento vegetal, pouco se sabe sobre as inter-relações entre o estresse salino e o metabolismo central na regulação do crescimento em plantas cultivadas sob elevada [CO 2 ]. Assim, no presente estudo, investigou-se a regulação metabólica e a modulação das trocas gasosas em resposta as alterações no crescimento de plantas de tomate (Solanum lycopersicum L. cv Santa Clara) imposta pelo estresse salino em plantas cultivadas em ambiente (400 μmol mol -1 ) e sob elevada [CO 2 ] (750 μmol mol -1 ). O NaCl promoveu redução na taxa de crescimento relativo (TCR) e biomassa total, atribuídas principalmente a redução na fotossíntese (A), condutância estomática (g s ) e concentração intercelular de CO 2 (C i ), sem ocorrer danos oxidativos e de fotoinibição. No entanto, os efeitos inibitórios do crescimento foram mitigados em plantas tratadas com NaCl cultivada em [CO 2 ] elevada, via aumentos em A, g s e C i . Ademais, aumentos dos níveis de carboidratos e aminoácidos, redução de ácidos orgânicos e baixa respiração no escuro em plantas sob estresse salino em [CO 2 ] ambiente afetou a capacidade energética das plantas. Por outro lado, a habilidade das plantas de tomate tratadas com NaCl em utilizar mais eficientemente o elevado nível de carbono sob [CO 2 ] elevada influenciou diretamente o seu crescimento. Em conclusão, os resultados mostram que [CO 2 ] elevada foi requerida para acoplar o metabolismo primário ao crescimento das plantas mantidas sob condições de estresse salino. / The plant growth and development involve processes that are sensitive to soil salinity. The increased carbon dioxide concentration ([CO 2 ]) into the atmosphere during the latest decades has attracted increasing interest in the function of this gas as an environmental signal involved in the regulation of plant growth and development. Despite the known association between elevated [CO 2 ] and plant growth, little is known about the interrelationships between salt stress and central metabolism in growth regulation in plants grown under elevated [CO 2 ]. Thus, in the present study, it was investigated metabolic regulation and modulation of gas exchange in response to changes in growth of tomato plants (Solanum lycopersicum L. cv Santa Clara) imposed by salt stress in plants grown under ambient (400 μmol mol -1 ) and elevated [CO 2 ] (750 μmol mol -1 ). NaCl promoted reduction in relative growth rate (TCR) and total biomass mainly attributed to decrease in photosynthesis (A), stomatal conductance (g s ) and intercellular CO 2 concentration (C i ), without the occurrence of oxidative damage and photoinhibition. However, the growth inhibitory effects were mitigated in plants treated with NaCl grown under elevated [CO 2 ] via increases in A, g s e C i . Furthermore, increases in the levels of carbohydrates and amino acids, reduction of organic acids and low dark respiration in plants under salt stress cultivated in ambient [CO 2 ] affected the energy capacity of the plants. On the other hand, the ability of tomato plants treated with NaCl to more efficiently use the high level carbon in the elevated [CO 2 ] directly influenced their growth. In summary, the results show that elevated [CO 2 ] was required to couple the primary metabolism to growth of plants cultivated under salt stress.
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Molecular and metabolic responses associated with the lack of autophagy following energy deprivation in Arabidopsis thaliana / Respostas moleculares e metabólicas associadas a ausência do processo autofágico durante limitação energética em Arabidopsis thalianaBarros, Jessica Aline Sousa 18 July 2016 (has links)
Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-08-14T17:47:20Z
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Previous issue date: 2016-07-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A oxidação de carboidratos na mitocôndria é a principal fonte de energia para metabolismo celular. Contudo, em condições de limitação energética, substratos alternativos são necessários para a manutenção da respiração. A oxidação de aminoácidos tem papel fundamental nesse processo gerando elétrons que podem ser transferidos para cadeia de transporte de elétrons mitocondrial através do sistema flavoproteína de transferência de elétrons/ flavoproteína de transferência de elétrons oxidoredutase da ubiquinona (ETF/ETFQO). A associação entre autofagia e o fornecimento de substratos alternativos para geração de energia tem sido relatada, porém pouco se sabe acerca do papel da autofagia no metabolismo primário para a manutenção do processo respiratório. Com intuito de se investigar a importância metabólica da autofagia durante o desenvolvimento e em condições de senescência induzida pela escuro, plantas mutantes de Arabidopsis thaliana com comprometimento do processo autofágico foram utilizadas. Mutantes atg apresentaram redução no crescimento e na produção de sementes. Sob escuro prolongado, fenótipos de senescência antecipada assim como redução no conteúdo de clorofila e na eficiência fotoquímica máxima do FSII (Fv/Fm) foram observados nos mutantes atg. A análise do perfil metabólico revelou uma extensa reprogramação metabólica em que o aumento do conteúdo de aminoácidos foi parcialmente comprometido, limitando seu uso como substrato para suprir a respiração nos mutantes atg. Adicionalmente, níveis de transcritos de genes envolvidos em vias de catabolismo de aminoácidos e degradação do cloroplasto (CV) foram induzidos nesses genótipos. Em conjunto, os resultados obtidos demonstram uma potencial função compensatória de CV como processo de degradação de proteínas em condições de limitação de carbono, particularmente quando o processo autofágico é comprometido. / The oxidation of carbohydrate in mitochondria is the primary energy source for cellular metabolism. However, during energy-limited conditions alternative substrates are required to support respiration. The oxidation of amino acids plays a key role in this process by generating electrons that can be transferred to mitochondrial electron transport chain via the electron transfer flavoprotein/ ubiquinone oxireductase (ETF/ETFQO) system. Compelling evidence has demonstrated the close association of autophagy in providing alternative substrates for power generation under carbohydrate-limited conditions; however, how and to which extent autophagy and primary metabolism interact to support respiration remains unclear. To obtain a comprehensive picture of the metabolic importance of autophagy during development and extended darkness Arabidopsis thaliana mutants with impairments in autophagy were used. atg mutants showed reduction of growth and seed production. Following extended darkness atg mutants were characterized by early signs of senescence as well as decreased chlorophyll content and maximum photochemical efficiency of PSII (Fv/Fm). Metabolite profile of dark-treated leaves revealed an extensive metabolic reprogramming in which increases in amino acids contents were partially compromised and thus limiting their utilization as substrate to sustain respiration in atg mutants. Additionally, transcript levels of genes involved in alternative pathways of respiration, amino acid catabolism, and chloroplast vesiculation (CV) were up-regulated in atg mutants. Our results thus suggest that autophagy contributes to energy availability by supplying amino acids for alternative pathways of respiration. Furthermore, our finding demonstrated the potential role of CV as a compensatory protein degradation pathway under C-limiting conditions when autophagy is impaired .
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Efeito da dieta hiperglicídica e do anabolizante undecilenato de boldenona sobre a bioquímica dos lipídios, perfil de citocinas, estado oxidativo e morfologia do coração em camundongos Apo-E -/- / Effect of the high carbohydrate and boldenone undelylenate in biochemistry of lipids and cytokines profile, oxidative status, heart morphology of Apo-E -/- miceBastos, Daniel Silva Sena 19 February 2016 (has links)
Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-07-05T10:58:26Z
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Previous issue date: 2016-02-19 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Neste estudo foram investigados os efeitos do anabolizante undecilenato de boldenona (Bol) e da dieta hiperglicídica (HC) no coração de camundongos Apo-E -/- . Quarenta camundongos fêmeas com 10 semanas de idade foram aleatoriamente distribuídos em 6 grupos com 8 animais cada. Controle) C57BL/6; NT) Apo-E -/- + dieta padrão; Bol) Apo-E -/- + dieta padrão + 20 mg/kg BOL; HC Apo-E -/- + HC; Bol 10 e Bol 20) Apo-E -/- + HC + 10 ou 20mg/kg Bol, respectivamente. A dieta HC foi desenvolvida de acordo com protocolo AIN- 93G para dietas purificadas. A boldenona foi administrada intraperiteonealmente três vezes por semana, durante oito semanas. Nossos dados indicam que HC e Bol sozinhos ou combinados aumentaram o peso dos animais, as concentrações séricas de LDL, e a atividade da glutationa-s- transferase no coração. Por outro lado, animais tratados com HC e Bol sozinhos apresentaram redução na atividade da catalase. Todos os grupos apresentaram redução das concentrações de malondialdeído. As concentrações séricas da isoenzima creatinoquinase CK-MB foram maiores nos animais tratados com Bol e HC sozinhos, mas não nas combinações. HC aumentou as concentrações séricas de TNF-α, IFN- , IL-2, IL-10 e IL-17. Nas combinações o efeito foi variável. A vascularização foi evidente nos tratamentos com Bol e HC sobretudo nas combinações. Enquanto HC sozinha aumentou a presença de infiltrado inflamatório esse efeito foi atenuado em BOL. Juntos esses dados mostram que tanto Bol quanto HC podem independentemente agravar a dislipidemia e induzir o remodelamento do miocárdio. Aparentemente, HC é potencialmente mais perigoso que Bol, induzindo um evidente estado pró-inflamatório sistêmico, que é diretamente relacionado a presença de infiltrado inflamatório. Contudo, Bol e HC podem prejudicar a atividade das enzimas antioxidantes alterando o balanço redox. / In this study we investigated the effects of high-carbohidrate dietary (HC) intake and boldenone undecylenate (Bol) on lipid and cytokine profiles, redox balance and heart morphology in Apo-E -/- mice. Female mice 10-weeks old, were randomized in 6 group with 8 animals each: Control) C57BL/6 + standard diet; NT) Apo-E -/- + standard diet; Bol) Apo-E -/- + standard dietary + 20 mg/kg Bol; HC) Apo-E -/- + HC; Bol 10 and Bol 20) Apo-E -/- + HSD + 10 or 20mg/kg BOL, respectively. The HSD was developed according the protocol AIN-93G for purified diets. Bol was administered intraperitoneally three times per week, for 8 weeks. Our data indicated that HC and Bol alone or combined increased body weight, LDL and HDL cholesterol serum levels, and cardiac activity of glutathione-s-transferase in Apo-E -/- mice. Conversely, animals treated with HC or Bol alone presented reduced activities of catalase and superoxide dismutase. All groups receiving HC or Bol presented reduced tissue levels of malondialdehyde. The creatine kinase-izoenzyme (CK-MB) levels were high in animals treated with BOL or HSD alone, but not combined. In general, HSD increased TNF-α, IFN- , IL-2, IL-10 and IL-17 serum levels. However, this effect was variable in animals receiving HSD plus BOL. Although HSD and BOL have not exercised detectable influence on the morphology of the cardiac parenchyma, tissue vascularization was markedly increased by both treatments, especially when combined and in a dose-dependent way. While HC alone increased myocardial accumulation of inflammatory cells, this effect was attenuated by Bol. Taken together, our findings indicated that both HC and Bol can independently aggravated the dyslipidemia and induce a marked vascular remodeling in cardiac tissue. Apparently, HC is potentially more dangerous that Bol, inducing a marked pro-inflammatory systemic status, which is potentially related to the cardiac inflammatory infiltrate in Apo-E -/- mice. Although HC and Bol can impair the activities of antioxidant enzymes, this effect seem to be harmful to the myocardium redox balance.
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Energy metabolism in Arbidopsis thaliana: TCA cycle evolution, amino acids degradation and alternative pathways / Degradação de aminoácidos e sua associação com o metabolismo energético em Arabidopsis thalianaCavalcanti, João Henrique Frota 17 July 2015 (has links)
Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-08-18T17:50:06Z
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Previous issue date: 2015-07-17 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Mitocondrias vegetais estão envolvidas em vários processos chaves da célula, vão além da produção de energica, tais como morte celular programada, amadurecimento de frutos, ou mesmo aqueles processos dependente de luz como fotossíntese e fotorrespiração. Dessa forma, aquisição mitocondrial pela célula hospedeira trouxe avanços para as atuais células vegetais: desde a manutenção de diversas vias metabólicas que incluem o metabolismo energético bem como processos de bissíntese de lipidios, nucleotidios e vitaminas. No tocante ao metabolismo energ- etico, destaca-se a herança do ciclo do ácido tricarboxílico. Este ciclo é uma via essencial relacionada com a produção de poder redutor (NADH e FADH 2 ), assimilação de nitrogênio e otimização da fotssíntese. Acredita-se que o ciclo do ácido tricarboxílico oprerasse como passos isoladados antes do processo endossimbiótico e somente após a aquisição da mitocôndria resultou que aquele organizar-se e atuasse como uma via cíclica. O cíclo do ácido tricarboxílico é composto por oito enzimas. Contudo, cada enzima é codificada por vários genes os quais são endereçados para diversos compartimetos celulares e, não somente, mitocôndrias. Essas enziimas locallizadas em diferentes comparimentos subcelulares acarretaram em uma possível ampla conecção entre mitocôndrias e outras organelas (peroxissomos e cloroplastos) permitindo fluxos alternativos dos intermediários do ciclo cujo resultado alterou seu funcionamento para um não convencional modo não cíclico. É bastante aceito que sob estresses, no quais reduzem os níveis de carboidratos. O ciclo do ácido tricarboxílico pode funcionar no modo não cíclico, devido a perda de esquelos carbônico que entram se fazendo necessário ser alimentado por reações anapleuróticas. Portanto, aminoácidos tornam-se fundamentais para suprir a respiração e síntese de ATP sob tais situações. Fortes evidencias demonstraram que aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA) e lisina podem fornecer elétrons para o sistema a cadeia de transporte de elétrons mitocondrial pela ação do sistema flavoproteína de transferência de elétrons (ETF)- ETF: ubiquinona oxidorredutase (ETF/ETFQO). Em plantas, duas enzimas: Isovaleril-CoA desidorgenase (IVDH) e (D)-2-hidroxidoglutarato desidrogenase (D2HGDH) foram caracterizadas como doadores de elétrons para o pool de ubiquinone através do sistema ETF/ETFQO a partir da degradação de BCAA e lisina, respectivamente. Na verdade, o catabolismo de BCAA mostra-se de uma importância fundamental para nutrir o ciclo do ácido tricarboxílico, principalmente, em situações de estresse enquanto lisina mostra uma estreia associação com o ciclo do ácido tricarboxílico sendo importante para fazer um elo da degradação de aminoácido com a geração de energia. A transferência de elétrons através da fdoacadeia transportadora de elétrons mitocondrial acopla a síntese de ATP a partir da regeneração de NADH e FADH 2 para fosforilar ADP a ATP. Contudo, o conhecimento com relação a organização do sistema de fosforilação oxidativa (OXPHOS) e sua via alternativa sob limitação energética permanece escasso. Assim, essa tese, a qual se concentra no funcionamento da respiração em um contexto que o ciclo do ácido tricarboxílico e via alternativa como doador de elétrons para cadeia transportadora de elétrons mitocondrial, é composta por três independentes capítulos centrados no metabolismo energético e respiração alternativa em Arabidopsis thaliana. Por isso, para se obter uma visão global de como ocorre o envolvimento e interação do ciclo do ácido tricarboxílico juntamente da via alternativa para coordenar o ajustamento das necessidades metabólicas e celulares, três abordagens experimentais foram usadas (i) uma abordagem in silico, nós investigamos a história evolucionária dos genes do ciclo do ácido tricarboxílico gerando um modelo para a origem dos genes do ciclo em plantas bem como seu comportamento submetido a uma série de estresse; (ii) a importância da biossíntese de lisina foi investigado usando mutante de Arabidopsis com reduzida atividade da enzima L,L-diaminopimelato aminotransferase (dapat) da via biossintética de lisina; (iii) reprogramação metabólica do sistema OXPHOS associado a limitação de carbono foi investigado. Rapidamente, os resultados apresentados aqui forneceram resultados que permitiu, no mínimo um prévio, a elaboração de mecanismo do metabolismo energético junto a vias alternativas. Primeiramente, permitiu a elucidação da origem evolutiva dos constituintes do ciclo do ácido tricarboxílico em plantas fornecendo elemento para a origem das isoformas presentes nos diferentes compartimentos subcelulares os quais que devem ser associados com eventos de transferência gênica ou com novas cópias geradas por duplicação genômica. Ademais, análises de co-expressão dos genes do ciclo em diferentes condições estressantes em ambos tecidos parte aérea e raiz demonstrou a presença de plasticidade molecular e forneceu uma explicação para o funcionamento do ciclo do ácido tricarboxílico em plantas. Após isso, o uso de Arabidopsis mutante com reduzida atividade para biossíntesi de lisina L,L-diaminopimelato aminotransferase (dapat) foi demonstrada que biossíntese de lisina simula condições de estresse e impacta no crescimento e metabolismo foliar. Por fim, uma avaliação de como o comportamento do sistema OXPHOS sob limitação de carbono e como vários aminoácidos podem impactar os complexos respiratórios foi possível demonstrar que o sistema OXPHOS tem sua função afetada por diferentes fontes de carbono e que vias alternativas são induzidas sob essas condições. Ademais, imunoensaios revelaram que é mais provável ser regulado por modificações pós traducionais. Juntos, esses resultados realçam a complexidade e especificidade da respiração vegetal durante evolução e que é differentemente afetado por linitações energéticas e pelo uso de substratos alternativos. Os resultados discutidos aqui suportam que ETF/ETFQo é uma via essencial capaz de doa elétrons para a cadeia transportadora de elétrons e que amioácidos são substratos alternativos para manter a respiração sob limitação de carbono. Os resultados obtidos são discutidos em um contexto de evolução metabólica mostrando estreia associação da metabolismo energético com metabolismo de aminoácidos e onde possível mcanísticos são devidamente discutidos. Palavras chaves: ciclo do ácido tricarboxílico; escassez de energia; evolução mitochondrial; fosforilação oxidativa; genes parálogos, metabolismo mitocondrial; neofuncionalização; respiração; resposta a estresse; substratos alternativos / Plant mitochondrion are involved in several key cellular processes that goesbeyond energy production being also associated with programmed cell death, fruit ripening and even light- associate process including phorespiration and photosynthesis. In this context, mitochondria acquisition by host cell brought evolutionary advances for the existing plant cell by the preservation of diverse metabolic pathways including both those related to energy metabolism as well as those associated with lipids, nucleotides and vitamin biosynthesis. The most notorious heritage is related to the tricarboxylic acid (TCA) cycle. The TCA cycle is an essential pathway which is related to reducing power (NADH and FADH2) generation, nitrogen assimilation and photosynthesis optimization. It has been suggested that the TCA cycle operated as isolated steps prior endosymbiosis events and that only after mitochondria acquisition it was possible for it to be organized and function as a cycle. The TCA cycle is composed by a set of eight enzymes. However, each enzyme is encoded by several genes which are targeting not just to mitochondria, but that are also imported into others subcellular compartments. These TCA enzymes located in other subcellular compartiments result in likely a broader connection between mitochondria and other organelles (e.g. peroxissome and chloroplast) allowing a bypass of the intermediates of the cycle switching his operation to an unusual in non-cyclic modes flux. It is also currently accepted that under stress conditions, which leads to decreases in carbohydrate levels, the TCA cycle can function in non-cyclic flux mode due to diminishing of carbon skeleton the enter it making required that be fed by anauplerotic reactions. Therefore, amino acids become essential to support respiration and ATP synthesis under such situations. Compelling evidence have demonstrated that branched chain amino acids (BCAA) and lysine can supply electrons to the mitochondrial electron transport chain (mETC) by the action of the electron transfer flavoprotein (ETF)-ETF: ubiquinone oxidoreductase (ETF/ETFQO) system and associated dehydrogenases. In plants, only isovaleryl- CoA dehydrogenase (IVDH) and (D)-2-hydroxyglutarate dehydrogenase (D2HGDH) have been characterized as electron donnor to the ubiquinol pool via this system so far by the degradation of BCAA and lysine, respectively. In fact, BCAA catabolism is of pivotal importance to provide intermediates to TCA cycle, particularly under stress situations, whereas lysine shows a strict association with the TCA cycle being required to couple amino acid degradation and energy generation. The electron transfer through the mETC is tightly coupled to ATP synthesis and use electron donates by NADH and FADH 2 to phosphorylate ADP to ATP. However, our knowledged regarding the organization of the mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) system and its alternatives pathways under energy limitation remains elusive. Thus, this thesis, which is focused on the function of respiration within the context of the role of the TCA cycle as well as the function of alternative electron donors to the mETC, iscomprised by three independent stand-alone chapters focusing on energy metabolism and alternative respiration in Arabidopsis thaliana. Hence to obtain a compreenhesive picture of how the TCA cycle evolved and to which extend its alternative pathways interact to adjust to different cellular and metabolic requirements, three experimental approaches were used: (i) by using bioinformatic approaches we investigated the evolutionary history of TCA cycle genes allowing the generation of a model for the origin of the TCA cycle genes in plants and connected its evolution with TCA cycle behavior under a range of stress; (ii) the importance of lysine deficiency were investigated by using an Arabidopsis mutant with reduced activity of the lysine biosynthesis enzyme L,L-diaminopimelate aminotransferase (dapat), and (iii) the metabolic reprograming associated with the OXPHOS system were investigated following carbon limitation.. In brief, the results presented here provided several novel findings and allowed, at least preliminarly, mechanistic interpretation thereof. First, it facilitate the elucidation of the evolutionary origem of the TCA cycle in land plants providing support to the contention that the origin of isoforms present in different subcellular compartments might be associated either with gene-transfer events which did not result in correct targeting or with new gene copys generated by genome duplication and horizontal transfer gene. Additionally, coexpression analyses of TCA cycle genes following different stress conditions in both shoot and root tissues demonstrated the presence of a large molecular plasticity and provided an explanation for the modular operation of the TCA cycle in land plants. Secondly, by using an Arabidopsis mutant with reduced activity of the Lys biosynthesis enzyme L,L-diaminopimelate aminotransferase (dapat) it was demonstrated that lysine biosynthesis deficiency mimics stress situation and impacts both plant growth and leaf metabolism.Thirdly, by evaluating OXPHOS system behavior following carbon starvation and how a range of amino acids can impact respiratory complexes it was possible to further demonstrate that OXPHOS is affected in function of the carbon source and that alternative pathways are induced under this condition.In addition, immunoblotting assays revealed that OXPHOS system is most likely regulated by posttranslational modification. When considered together these results highlight the complexity and specificity of plant respiration during evolution and that it is differently affected following energy limitation by the usage of alternative substrates. The results discussed here support the contention that ETF/ETFQO is an essential pathway able to donate electrons to the mETC and that amino acids are alternative substrates maintaining respiration under carbon starvation.The results obtained are discussed in the context of current models of metabolic evolution showing the strict association of energy metabolism with amino acids metabolism, and where possible, mechanistic insights are properly discussed. Key-words: alternative substrate respiration; energy deprivation; mitochondria evolution; mitochondria metabolism; neofunctionalization; OXPHOS; paralogous genes; stress response; TCA cycle;
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Efeitos dos ácidos graxos hidroxilados de cadeia longa acumulados na deficiência da desidrogenase de hidroxiacil-CoA de cadeia longa sobre parâmetros de bioenergética mitocondrial em fígado de ratosHickmann, Fernanda Hermes January 2015 (has links)
A deficiência da desidrogenase de hidroxiacil-coa de cadeia longa (LCHAD) é um erro inato do metabolismo de ácidos graxos. Pacientes acometidos apresentam acúmulo de ácidos graxos hidroxilados de cadeia longano sangue e tecidos. A sintomatologia é bastante variada, sendo que os pacientes apresentam hepatopatia e cardiomiopatia severa, assim como retinopatia, hipotonia, neuropatia periférica, atraso no desenvolvimento e na fala, letargia e convulsões. Considerando que a patofisiologia do dano hepático encontrado nos pacientes com deficiência da LCHAD não está esclarecida, o presente trabalho teve como objetivo investigar in vitro os efeitos dos ácidos 3-hidroxitetradecanoico (3HTA) e 3-hidroxipalmítico(3HPA) sobre importantes parâmetros da bioenergética mitocondrial, tais como os parâmentros respiratórios estado 3, estado 4, razão de controle respiratório (RCR) e estado desacoplado (U), bem como o potencial de membrana (ΔΨm), inchamento, capacidade de retenção de Ca2+ mitocondrial e estado redox do NAD(P) em mitocôndrias isoladas de fígado de ratos jovens. Os ácidos monocarboxílicos encontrados em maiores concentrações nos pacientes, 3HTAe 3HPA inibiram a respiração estimulada por ADP (estado 3), a desacoplada, o RCR, diminuíram o ΔΨm e o conteúdo de NAD(P)H e, em contraste, aumentaram a respiração lenta (estado 4) em mitocôndrias utilizando glutamato/malato ou sucinato como substratos. Além disso, o inibidor competitivo do translocador de nucleotídeo adenina (ANT) atractilosídeo atenuou o aumento no estado 4 provocado pelo 3HTA. Esses dados indicam que o 3HTA e o 3HPA atuam como inibidores metabólicos e desacopladores da fosforilação no fígado. Também verificamos que baixas concentrações desses ácidos graxos hidroxilados causam uma diminuição significante no ΔΨm e no conteúdo de NAD(P)H na presença de Ca2+. 3HTA e 3HPA também diminuíram a capacidade de retenção de Ca2+ e induziram inchamento em mitocôndrias. Os efeitos induzidos por 3HTA foram totalmente prevenidos pelos inibidores clássicos do poro de transição de permeabilidade (PTP) ciclosporina A e ADP, assim como pelo rutênio vermelho, um inibidor da captação de Ca2+, indicando abertura do PTP. Ademais, ditiotreitol e N-etilmaleimida não foram capazes de prevenir estes efeitos, descartando a oxidação dos grupamentos tióis do PTP como mecanismo de sua abertura. Finalmente, verificamos que o ácido dicarboxílico 3- hidroxitetradecanodioico (3HTDA), que também se acumula na deficiência da LCHAD e que é um análogo do 3HTA, não alterou os parâmetros de bioenergética mitocondrial. Em conjunto, nossos dados demonstram que os principais ácidos graxos monocarboxílicos hidroxilados de cadeia longa acumulados na deficiência da LCHAD prejudicam a homeostase energética mitocondrial em fígado. Presumimos que esse mecanismo possa explicar, pelo menos em parte, a disfunção hepática caracerística dos pacientes acometidos por essa doença. / Long-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (LCHAD) deficiencie is an inborn error of metabolism of fatty acid oxidation. Affected patients present blood and tissue accumulation of the 3-hydroxy fatty acids.Clinical presentation is characterized by a wide variety of symptoms, including severe hepatopathy and cardiomyopathy, as well as retinopathy, hypotonia, peripheral neuropathy, speech and developmental delay, lethargy and seizures.Considering that the pathophisiology of the hepatic damage found in LCHAD-deficient patients is not yet clear, the aim of the present work was to investigate the in vitro effects of 3-hydroxytetradecanoic (3HTA) and 3- hydroxypalmitic (3HPA)on inportant parameters of mitochondrial bioenergetics, namely the respiratory parameters state 3, state 4, respiratory control ratio (RCR) and state uncoupled (U), as well as mitochondrial membrane potential (ΔΨm), swelling, Ca2+ retention capacity and NAD(P) redox state in isolated liver mitochondria from young rats. The monocarboxylic acids found at higher concentrations in LCHADdeficient patients, 3HTA and 3HPA, inhibited the ADP-stimulated (state 3) and uncoupled respiration, decreased ΔΨm and NAD(P)H content and, in contrast, increased resting (state 4) respiration in mitochondrial preparations supported by glutamate plus malate or succinate.Furthermore, the competitive inhibitor of adenine nucleotide translocase (ANT) atractyloside, attenuated the 3HTA-induced increase of state 4 respiration. These data indicate that 3HTA and 3HPA act as metabolic inhibitors and uncouplers of oxidative phosphorylation in the liver.We also verified that low concentrations of these hydroxyl fatty acids caused a strong decrease of ΔΨm and NAD(P)H content in the presence of Ca2+. 3HTA and 3HPA also reduced Ca2+ retention capacity and induced swelling in mitochondria. The effects induced by 3HTA were totally prevented by the classical mitochondrial permeability transition (MPT) inhibitors cyclosporin A and ADP, as well as by ruthenium red, a Ca2+ uptake blocker, indicating MPT pore opening. Furthermore, dithiothreitol and N-ethylmaleimide were not able to prevent these effects, making unlikely an oxidation of thiol groups of the MPT pore as a mechanism of its opening. Finally, the dicarboxylic 3-hydroxytetradecanodioic acid (3HTDA), which also accumulates in LCHAD deficiency and is an analogue of 3HTA, did not alter mitochondrial bioenergetics parameters. Taken together, our data demonstrate that the major monocarboxylic long chain fatty acids accumulating in LCHAD deficiency disrupt energy mitochondrial homeostasis in the liver. It is proposed that this pathomechanism may explain at least in part the hepatic alterations characteristic of the affected patients.
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Fenótipos agressivos e propostas terapêuticas em tumores sólidosMotta, Leonardo Lisbôa da January 2015 (has links)
Estima-se que 1 em 5 pessoas morrerão de câncer e, neste momento 1 em 200 vivem com a patologia. Classicamente, é descrita como uma doença genética, e por muito tempo as abordagens terapêuticas focaram em mutações. Apesar de casos de sucesso, a eficácia terapêutica ainda é insuficiente, estima-se que 2 em 3 pessoas diagnosticadas com câncer morrerão de causas relacionadas à doença. Apesar da imensa variabilidade genética, diferentes mutações convergem para um número limitado de fenótipos. Assim, o estudo do câncer sob uma ótica evolutiva focando em fenótipos agressivos é uma alternativa promissora. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi investigar fenótipos agressivos em tumores sólidos, buscando caracterizar alterações e propor alvos e terapias. Para isto, investigou-se câncer de pulmão e mama sob diferentes aspectos biológicos. O capítulo I estudou metabolismo redox em câncer de pulmão de não-pequenas células (NSCLC). Aqui, demonstramos que o desbalanço redox oxidativo intracelular é um fenótipo agressivo. Posteriormente, sugerimos abordagens antioxidantes como uma boa proposta terapêutica. O capítulo II estudou adenocarcinoma de pulmão sob o contexto da reprogramação metabólica. Neste, sugerimos que o metabolismo glicolítico dependente de transportadores de glicose (GLUT’s) e lactato/piruvato (MCT’s) é um fenótipo agressivo. Por fim, propomos que inibidores para isoformas específicas destes transportadores podem ter impacto clínico nesta malignidade. O capítulo III investigou uma abordagem terapêutica para um fenótipo agressivo bem estabelecido, a resistência à hipóxia. Utilizando modelos in vitro e in vivo de câncer de mama triplo-negativo (TNBC), encontramos que o inibidor epigenético JQ1 é capaz de inibir genes e rotas importantes à sobrevivência da célula cancerosa em hipóxia. Utilizando modelos in vitro e in vivo de câncer de mama triplo-negativo (TNBC), encontramos que o inibidor epigenético JQ1 é capaz de inibir genes e rotas importantes à sobrevivência da célula cancerosa em hipóxia. Deste modo, é proposto esta abordagem epigenética na terapêutica de TNBC. Portanto, foi demonstrado aqui que a investigação de fenótipos agressivos é capaz de contribuir para a oncologia molecular, identificando padrões e apontando alvos. Foi dito no passado que “nada em biologia faz sentido senão à luz da evolução”, e foi sob esta filosofia que o presente trabalho foi desenvolvido e buscou contribuir na busca da cura do câncer. / It is estimated that 1 in 5 people will die of cancer, and now 1 in 200 live with this pathology. Classically, cancer is described as a genetic disease, and for a long time therapeutic approaches focused on mutations. Despite some successes, treatment efficacy is still insufficient, it is estimated that 2 out of 3 people diagnosed with cancer will die from causes related to the disease. Despite the large genetic variability, different mutation converge to a limited number of phenotypes. Thus, the investigation of cancer under an evolutive perspective that focus on aggressive phenotypes is an promising alternative approach. Therefore, this study aimed to investigate aggressive phenotypes in solid tumors, seeking to characterize changes and propose targets and therapies. For this, we investigated lung cancer and breast under different biological aspects. Chapter I studied redox metabolism in non-small cell lung cancer (NSCLC). Here, we show that redox imbalance favouring intracellular oxidative stress is an aggressive phenotype. Later, we suggest antioxidants approaches as a promising therapeutic window. Chapter II studied lung adenocarcinoma in the context of metabolic reprogramming. Herein, we suggest that the glycolytic metabolism dependent on transporters of glucose (GLUT's) and lactate / pyruvate (MCT's) is an aggressive phenotype. Then, we propose that inhibitors for specific isoforms of GLUT’s and MCT’s may have clinical impact in this malignancy. Chapter III investigated a therapeutic approach for cells that are resistant to hypoxia, a well-established aggressive phenotype. Using in vitro and in vivo models of triple negative breast cancer (TNBC), we find that the epigenetic inhibitor JQ1 is able to inhibit important genes and pathways in hypoxic cancer cell survival. Thus, we propose this epigenetic approach in the management of TNBC. Therefore, it was demonstrated here that investigation of aggressive phenotypes can contribute to the molecular oncology, identifying patterns and pointing targets. It was once said that "nothing in biology makes sense except in the light of evolution", this study was conducted under this philosophy to contribute in the search for the cure of cancer.
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Efeitos da glicina sobre a homeostase energética e redox, vias de sinalização das MAPK e marcadores de dano celular em cérebro de ratosMoura, Alana Pimentel January 2016 (has links)
A hiperglicinemia não-cetótica (HNC) é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência do sistema de clivagem da glicina (Gli), levando ao acúmulo tecidual e plasmático desse aminoácido. Apesar de a fisiopatologia do dano neurológico apresentado pelos pacientes afetados por HNC ainda não estar bem esclarecida, tem sido sugerido que o acúmulo de Gli é neurotóxico. O presente trabalho investigou inicialmente os efeitos ex vivo da administração intracerebroventricular (ICV) de Gli sobre o metabolismo energético e o imunoconteúdo das proteínas cinases dependentes de mitógenos (MAPK) p38, ERK1/2 e JNK, sinaptofisina e proteína Tau em córtex cerebral e estriado de ratos de 30 dias de vida. Verificamos que a injeção ICV de Gli reduziu a produção de CO2 a partir de glicose e inibiu as atividades das enzimas citrato sintase e isocitrato desidrogenase em estriado. A Gli também diminuiu as atividades dos complexos da cadeia transportadora de elétrons I-III em estriado e do IV em córtex cerebral. Além disso, a Gli diminuiu a atividade da enzima creatina cinase (CK) e de sua isoforma mitocondrial em córtex cerebral e estriado. O tratamento com os antioxidantes melatonina (MEL) e creatina e com o antagonista do receptor NMDA (MK-801) preveniu a diminuição das atividades da CK e dos complexos I-III e IV causado pela administração de Gli. Ainda verificamos que a Gli diminuiu o conteúdo de sinaptofisina, e a fosforilação da proteína Tau e das MAPK p38, ERK1/2 e JNK. O tratamento com MK-801 preveniu a diminuição da fosforilação da p38 causada pela Gli O próximo passo foi estudar o efeito ex vivo da injeção ICV de Gli sobre o metabolismo energético, a homeostase redox e parâmetros gliais em córtex cerebral de ratos neonatos. Foi demonstrado que a injeção de Gli em ratos de 1 dia de vida diminuiu a atividade do complexo IV da cadeia transportadora de elétrons e da CK, além de induzir aumento da geração de espécies reativas, diminuir as concentrações de glutationa reduzida (GSH), aumentar os níveis de malondialdeído (MDA) e modular a atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx). A injeção de Gli ainda foi capaz de induzir reatividade glial demonstrada pelo aumento da marcação de S100B em córtex cerebral e estriado, e GFAP em corpo caloso. Além disso, o tratamento com MEL preveniu a inibição do complexo IV e da enzima CK, o aumento dos níveis de MDA, a diminuição de GSH e o aumento de S100B causada pela Gli. Na última parte de nossa investigação foi examinado o efeito in vitro da Gli sobre a homeostase energética e redox em cerebelo de ratos de 30 dias de idade A Gli aumentou a produção de espécies reativas, os níveis de MDA e diminuiu as concentrações de GSH, sem alterar o metabolismo energético no cerebelo. Além disso, a adição de MEL, trolox (análogo hidrossolúvel da vitamina E) e MK-801 preveniram os efeitos deletérios da Gli sobre os níveis de MDA e GSH em cerebelo. Como conclusão, o nosso estudo mostra que a Gli causa um prejuízo na homeostase energética e induz estresse oxidativo em cérebro de ratos jovens e neonatos, bem como provoca reatividade glial em cérebro de neonatos. A Gli também altera as vias de sinalização das MAPK e causa dano neuronal em córtex cerebral e estriado, além de induzir estresse oxidativo in vitro em cerebelo. Portanto, alterações na homeostase redox e energética e excitotoxicidade parecem contribuir, ao menos em parte, para a fisiopatologia do dano neurológico apresentado pelos portadores da HNC. / Nonketotic hyperglycinemia (NKH) is an inborn error of metabolism caused by a deficiency of the glycine (GLY) cleavage system, leading to tissue accumulation of this amino acid. Although the pathophysiology of neurological damage presented by patients affected by NKH is not yet well understood, it has been suggested that increased concentrations of GLY are toxic for the central nervous system. Therefore, we initially investigated the ex vivo effect of a single intracerebroventricular (ICV) administration of GLY on energy metabolism and immunocontent of the mitogen-activated protein kinases (MAPK) p38, ERK1/2 and JNK, synaptophysin, and Tau protein in cerebral cortex and striatum of thirty-days-old rats. We verified that the administration of GLY decreased CO2 production using glucose as substrate, and inhibited the activities of citrate synthase and isocitrate dehydrogenase in striatum. GLY also decreased the activities of the respiratory chain complexes I-III in striatum and IV in cerebral cortex. Furthermore, GLY decreased the activity of creatine kinase (CK) and of its mitochondrial isoform in cerebral cortex and striatum The antioxidants melatonin (MEL) and creatine, and the NMDA receptor antagonist MK-801 prevented the GLY-induced decrease of the activities of CK and of the complexes I-III and IV. It was further observed that GLY injection decreased synaptophysin immunocontent and the phosphorylation of Tau protein, p38, ERK1/2 e JNK in rat brain. MK-801 treatment prevented the decreased phosphorylation of p38 caused by GLY. Next, we evaluated the ex vivo effect of GLY ICV administration on energy and redox homeostasis and glial parameters in brain of neonatal rats. GLY injection decreased the activities of respiratory chain complex IV and CK, and also induced the generation of reactive species, decreased reduced glutathione (GSH) concentrations, increased malondialdehyde (MDA) levels and modulated the activities of the antioxidant enzymes superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase. Moreover, GLY induced glial reactivity, as demonstrated by the increase in GFAP in corpus callosum and S100B in cerebral cortex and striatum MEL treatment prevented GLY-induced inhibition of complex IV and CK activities, decrease of GSH, and increase of MDA levels and S100B staining. In the last part of our study we assessed the in vitro effects of GLY on energy and redox homeostasis in cerebellum of thirty-day-old rats. We verified that GLY increased reactive species generation and MDA levels, and decreased GSH concentrations in rat cerebellum. Furthermore, the addition of MEL, trolox (hydrosoluble analogue of vitamin E) and MK-801 prevented MDA levels increase and GSH concentrations decrease caused by GLY. In conclusion, the present study demonstrated that GLY alters the energy metabolism and induces oxidative stress in brain of thirty-day-old and neonatal rats, and provokes glial reactivity in neonatal rat brain. GLY also alters MAPK signaling pathways and causes neuronal damage in rat cerebral cortex and striatum, besides inducing oxidative stress in cerebellum. Therefore, it may be presumed that bioenergetics dysfunction, oxidative stress and excitotoxicity contribute to the pathophysiology of brain damage observed in patients affected by NKH.
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Investigação dos efeitos da ornitina e da homocitrulina sobre as homeostases energética e redox em cerebelo e cultura de astrócitos de córtex cerebral de ratosZanatta, Angela January 2016 (has links)
A síndrome hiperornitinemia-hiperamonemia-homocitrulinúria (HHH) é um erro inato do metabolismo do ciclo da ureia, de caráter autossômico recessivo e caracterizada por um defeito no transporte mitocondrial de ornitina (Orn), levando a um acúmulo citosólico desse aminoácido, além do acúmulo de homocitrulina (Hcit) e amônia. Os sinais e sintomas clínicos são variáveis, dentre eles podemos citar coagulopatia, coma, letargia, retardo mental, atrofia cortical e ataxia cerebelar. Embora os sintomas neurológicos sejam frequentes, a fisiopatogenia dessa doença ainda é desconhecida. Nesse trabalho investigamos os efeitos in vitro e ex vivo da Orn e Hcit sobre importantes parâmetros de homeostase redox e energética em cerebelo de ratos de 30 dias de vida. Além disso, também investigamos os efeitos desses metabólitos sobre alguns parâmetros em astrócitos cultivados de córtex cerebral. Primeiramente investigamos os efeitos in vitro da Orn e Hcit sobre importantes parâmetros de homeostase redox e energética em cerebelo de ratos jovens. Ambos metabólitos aumentaram significativamente os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS). Além disso, esses níveis foram totalmente prevenidos pela melatonina e pela glutationa reduzida (GSH). Observamos também que os níveis da produção de nitratos e nitritos não foi alterada por nenhum dos metabólitos utilizados, por outro lado, a Hcit aumentou a produção de peróxido de hidrogênio Ao investigarmos os níves de GSH observamos que tanto a Orn quanto a Hcit reduziram esse parâmetro e que a Orn reduziu o conteúdo de grupamentos sulfidrila, indicando uma dimunioção nas defeas antioxidantes não enzimáticas. Com relação ao metabolism energetic, a Orn e Hcit diminuíram a atividade da enzima aconitase, porém não alteraram outros parâmetros estudados. Além disso, a redução causada pela Orn foi prevenida pela GSH, indicando que essa enzima é suscetível a oxidação causada por exxe aminoácido. Também investigamos os efeitos ex vivo da injeção intracerebelar de Orn e Hcit sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo e sobre a ativdade da Na+, K+ ATPase. A Orn aumentou significativamente os níveis de TBA-RS e atividade da superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase, glutationa redutase e glucose 6-fosfato desidrogenase e diminuiu a ativdade da Na+,K+-ATPase. Por outro lado, as concentrações de GSH não foram alteradas pelo tratamento com ornitina. Por fim, a Hcit não foi capaz de alterar nenhum dos parâmetros avaliados. Os efeitos da Orn e Hcit foram também investigados em astrócitos cultivados a partir de córtex cerebral de ratos neonatos. Observamos que Orn e Hcit diminuíram a viabilidade celular, a função mitocondrial e os níveis de GSH, porém não alteraram a produção de citocinas. Nossos resultados demonstram um prejuízo moderado na homeostase energética, porém, quando observamos a homeostase redox, observamos um dano mais pronunciado. Dessa forma, concluímos que alterações na homeostase energética, mas principalmente na homeostase redox podem estar envolvidos na fisiopatogenia do dano neurológico observado nos pacientes com a síndrome HHH. / Hyperornithinemia-hyperammonemia-homocitrullinuria (HHH) syndrome is an autosomal recessive disorder of urea cycle characterized by a defect in the transport of ornithine (Orn) into mitochondrial matrix leading to accumulation of Orn, homocitrulline (Hcit) and ammonia. The clinical signs and symptoms are variable, ranging from coagulopathy, coma, lethargy, mental retardation, cortical atrophy and cerebellar ataxia. Although neurological symptoms are frequent, the pathophysyology of this disorder is poorly known. In the present study, we investigated the in vitro and ex vivo effects of Orn and Hcit on important parameters of redox and energy homeostasis in cerebellum of 30-day-old rats. Besides that, we also investigated the effects of these metabolites on some parameters in cultured cortical astrocytes. We first studied the in vitro effects of Orn and Hcit on important parameters of redox and energy homeostasis in cerebellum of young rats. Orn and Hcit significantly increased thiobarbituric acid reative species (TBA-RS) levels that was totally prevented by melatonin and reduced glutathione (GSH). We also found that nitrate and nitrite production was not altered by any of the metabolites, in contrast to hydrogen peroxide production, which was significantly enhanced by Hcit. These results suggest that probably reactive nitrogen species were not involved on the observed results Furthermore, GSH concentrations were significantly reduced by Orn and Hcit and sulfhydryl content by Orn, implying an impairment of antioxidant defenses. As regards to energy metabolism, Orn and Hcit provoked a significant reduction of aconitase activity, without altering other parameters of energy metabolism. Furthermore, Orn-elicited reduction of aconitase activity was totally prevented by GSH, indicating that critical groups of this enzyme were susceptible to oxidation caused by this amino acid. We also investigated the ex vivo effects of intracerebellar administration of Orn and Hcit on important parameters of oxidative stress and on Na+, K+ ATPase activity. Similarly with our in vitro results, Orn significantly increased TBA-RS levels and the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR) and glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PDH), and reduced Na+,K+-ATPase activity. In contrast, GSH concentrations were not changed by Orn treatment. Furthermore, intracerebellar administration of Hcit was not able to alter any of these parameters. The effects of Orn and Hcit were also investigated in cultured cortical astrocytes. We observed that Orn and Hcit diminished cellular viability, mitochondrial function, GSH levels, without altering cytokine production. Our results demonstrate a mild impairment in energy metabolism, but mostly in redox homeostasis in cerebellum and cortical cultured astrocytes. Therefore, we conclude that alterations of energy metabolism and especially redox homeostasis may be involved in the pathophysiology of the neurological damage observed in patients with HHH syndrome.
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Efeito da esquila durante a gestação no metabolismo de ovelhas e cordeiros na fase pós-nascimento / Effect of shearing prepartum in ewes and lambs metabolism during perinatal periodGuyoti, Viviane Marques January 2013 (has links)
A perda anual de ovelhas em criações de sistema extensivo apresenta altos níveis na região Sul do Brasil. Na Serra Gaúcha essa porcentagem chega a 30% e torna-se um fator alarmante para propriedades com sistemas de produção de carne, leite e lã. As perdas reprodutivas em ovinos desta região estão relacionadas com a baixa taxa de concepção do rebanho e alta mortalidade perinatal de cordeiros (MPC) e frequentemente esses fatores são decorrentes de enfermidades, deficiências nutricionais durante o período gestacional e pós-parto ou por manejo inadequado de ovelhas e cordeiros. A MPC, definida como a morte de recém-nascidos imediatamente antes ou durante o parto e até os primeiros vinte e oito dias de vida é uma das principais causas de baixa taxa de desmame no Rio Grande do Sul (RS). Sua etiologia envolve ações complexas que circundam a ação individual e a interação de muitos fatores relacionados entre si. Estudos sobre as causas de MPC no RS têm apontado o complexo exposição/inanição e hipotermia, além da distocia como as duas principais patologias envolvidas nesses óbitos. Condições ambientais adversas, como o frio severo, também causam a morte em consequência da falta de adaptação do recém-nascido às novas condições de vida. A busca de informações que venham a elucidar as causas dessas perdas motivou a realização do presente estudo e o uso da esquila durante a gestação foi utilizado como uma possível ferramenta para minimizar a MPC. O efeito da esquila préparto (74 dias de gestação) sobre sobre o perfil metabólico e produtivo de ovelhas e no peso e desenvolvimento de seus cordeiros durante o primeiro mês de vida foram avaliados neste estudo. Um rebanho de 40 ovelhas gestantes da raça Corriedale foi dividido aleatoriamente em dois grupos: ovelhas com esquila completa (EC) e ovelhas mantidas com velo ou ovelhas controle (OC). As ovelhas e seus respectivos cordeiros foram avaliados em três momentos distintos durante o experimento: no parto, entre 15 e 21 dias de lactação e entre 22 e 45 dias de lactação. Os parâmetros de escore de condição corporal, dosagem de beta-hidroxibutirato, hematócrito, hemoglobina, lactato, glicose, peso corporal, peso da placenta e produção do leite foram mensurados e correlacionados. Os valores médios de hematócrito, hemoglobina e peso dos cordeiros apresentaram diferenças significativas (p< 0,05) entre os grupos EC e OC. O peso médio da placenta e a produção de leite apontaram diferença significativa enquanto que os achados para escore de condição corporal (ECC) e beta-hidroxibutirato não evidenciaram diferenças entre os grupos EC e OC, considerando todos os períodos em conjunto (p> 0,05). A produção leiteira de ovelhas do grupo EC (1.261,25 mL/dia) foi maior (p <0,05) do que no grupo OC (937,79 mL/dia). A esquila de ovelhas aos 74 dias de gestação mostrou-se como importante ferramenta para o melhor desenvolvimento de cordeiros na fase pós-nascimento de forma a contribuir para a diminuição da taxa de mortalidade perinatal. / The annual loss of sheep in extensive system has expressive levels in southern Brazil. It can reach 30% in some areas and becomes an alarming factor for properties with systems producing meat, milk and wool. Reproductive losses in sheep in this region are related to low conception rate of the herd and a high lamb perinatal mortality (LPM). Often these factors are due to diseases, nutritional deficiencies during pregnancy and postpartum period or inadequate management of ewes and lambs. Perinatal mortality is defined as lambs in the death of the neonate until the first twenty-eight days. The LPM is responsible for the low rate of weaning in Rio Grande do Sul (RS), southern Brazil. Its etiology involves complex actions and interaction of many factors related to each other. Studies about causes of the LPM in RS have showed the complex exposure, hypothermia and starvation, in addition to dystocia as the two main pathologies involved in these deaths. Adverse environmental conditions, such as severe cold, cause death due to the lack of adaptation of the newborn to the new living conditions also. The search for more information that might elucidate the causes of these losses motivated the present study and the use of shearing during pregnancy has been used as a possible tool to minimize LPM. The effect of pre-partum shearing (74 days gestation) on the metabolic and productive profile and weight of ewes and their lambs develop during the first month of life were studied. A flock of 40 pregnant Corriedale ewes were randomly divided into 2 groups: ewes completely sheared (EC) and ewes maintained with fleece or sheep control (OC). The ewes and their lambs were evaluated at three different times during the experiment: at birth, between 15 and 21 days of lactation and between 22 and 45 days of lactation. The parameters such as body condition score, betahydroxybutyrate, PVC, hemoglobin, lactate, glucose, body weight, placental weight and milk production were measured and correlated. The mean values of PVC, hemoglobin and lambs weight showed significant differences (p <0.05) between the EC and OC groups. The average weight of placenta and milk production showed a significant difference while the findings for body condition score (ECC) and beta-hydroxybutyrate showed no differences between groups EC and OC, considering all periods together (p> 0.05). Milk production of ewes of group EC (1261.25 mL / day) was higher (p < 0.05) than in the OC group (937.79 mL / day). Shearing of sheep at 74 days of pregnancy was a important tool for the better development of lambs in the post-birth in order to contribute to reducing the rate of perinatal mortality.
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