Made available in DSpace on 2016-09-27T13:39:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-12-03. Added 1 bitstream(s) on 2016-09-27T13:45:06Z : No. of bitstreams: 1 000865034_20171203.pdf: 153851 bytes, checksum: 30ebdc494e0c9267585653b781683912 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-12-08T12:00:13Z: 000865034_20171203.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-12-08T12:01:06Z : No. of bitstreams: 1 000865034.pdf: 1774770 bytes, checksum: cbbb1c1e9d8ae900c12fb9153a166e2e (MD5) / A partir de uma biblioteca metagenômica de um consórcio microbiano degradador de óleo diesel, um clone (PL3C3) expressando um novo gene de protease foi selecionado dentre vinte e seis positivos para degradação de azocaseína. Através do sequenciamento, foi analisado um contig e identificado uma ORF que codifica a proteína, denominada ORF19 composta por 966 pb, 321 aminoácidos, exibindo 69% de identidade com uma alfa/beta hidrolase de Parvibaculum lavamentivorans DS-1(número de acesso ABS62095.1). A sequência da ORF19 após análise em um banco de dados de protease - MEROPS - mostrou 74,3% de identidade com uma serino-protease da família S9U (número de acesso MER095859). Através da análise filogenética, foi possível sugerir que a ORF19 é um novo membro desta família exibindo a tríade catalítica e motivos conservados característicos. A massa molecular da proteína foi estimado em 35 kDa, tendo por base a sua composição em aminoácidos e estimativas junto ao programa Protparam, e considerando o padrão de migração eletroforética da proteína em condições desnaturantes. O gene da ORF19 foi clonado no vetor de expressão pET28a, porém, a proteína recombinante não foi super-expressa em Escherichia coli BL21 (DE3). Contudo, a troca de hospedeiro, vetor, e estudos para uma super-expressão é necessário para a obtenção da proteína, visando sua futura caracterização. Este estudo contribui para a descoberta de uma nova serino-protease utilizando abordagens moleculares, como a metagenômica / From a metagenomic library of a microbial consortium that degrades diesel oil, a clone (PL3C3) expressing a novel protease gene was selected from twenty six positive for azocasein degradation. Through sequencing, an analysis was made contig and identified an ORF encoding a protein, called ORF19 composed of 966 bp, 321 amino acids, exhibiting 69% identity with an alpha / hydrolase beta Parvibaculum lavamentivorans DS-1 (accession number ABS62095. 1). The sequence of ORF19 after analysis of a protease database - MEROPS - showed 74.3% identity with a serine protease family S9U (access number MER095859). Through phylogenetic analysis, it was possible to suggest that ORF19 is a new member of this family displaying the catalytic triad and characteristic conserved motifs. The molecular mass of the protein was estimated at 35 KDa, based on its amino acid composition and estimates Protparam by the program, and considering the pattern of electrophoretic migration of the protein under denaturing conditions. The ORF19 gene was cloned into the pET28a expression vector, but not the recombinant protein was overexpressed in E. coli BL21 (DE3). However, the exchange of host, vector, and studies for overexpression is required to obtain the protein, for their further characterization. This study contributes to the discovery of a new serine protease using molecular approaches, as metagenomic

Orientador: João Pessoa de Araújo Junior / Coorientador: Alexander Welker Biondo / Banca: Maria Inês de Moura Campopos Pardini / Banca: Deilson Elgui de Oliveira / Banca: Jean Carlos Ramos da Silva / Banca: Walfrido Kuhl Svoboda / Resumo: Zoonoses emergentes com origem em animais selvagens representam a mais significante e crescente ameaça à saúde global. Os primatas não humanos contribuem com 20% das principais doenças humanas, são considerados o principal modelo experimental e também servem como sentinelas para diferentes doenças que acometem o homem. Os objetivos da presente tese foram desenvolver protocolos de metagenômica viral para detectar sequências de vírus a partir de plasma de primatas não humanos do Novo Mundo (Saimiri sciuratus, Aotus ainfulatus, Alouatta guariba e Sapajus apella) mantidos em cativeiro no Centro Nacional de Primatas (Belém, PA), no Refúgio Biológico Bela Vista (Foz do Iguaçu, PR) e no Parque Ecológico do Tietê (São Paulo, SP). A tecnologia Illumina (MiSeq) foi usada para o sequenciamento massivo e um fluxograma bioinformático foi desenvolvido para analisar as sequências obtidas. De forma geral, genomas correspondentes a diferentes famílias virais foram identificadas e ênfase foi dada ao torque teno vírus, ao vírus da hepatite G (tipos A e B), parvovírus e papilomavírus. Uma nova sequência de genoma completo do gênero Hepacivirus, família Flaviviridae, foi identificado em primatas do sul do Brasil. Os resultados demonstram a possibilidade de variedade de genomas virais presentes em primatas do Novo Mundo, considerados clinicamente saudáveis e destaca a importância de estudos que objetivam identificar possíveis vírus emergentes. Palavras-chave: doenças infecciosas emergentes, primatas não humanos do Novo Mundo, metagenômica viral, sequenciamento massivo e um fluxograma bioinformático foi desenvolvido para analisar as sequências obtidas. De forma geral,genomas correspondentes a diferentes famílias virais foram identificadas e ênfase foi dada ao torque teno vírus, ao vírus da hepatite G (tipos A e B), parvovírus e papilomavírus. Uma nova sequência de genoma completo do gênero Hepacivirus, família ... / Abstract: Wild animals-borne emerging zoonoses represent the most significant and growing threat to global health. Non-human primates contribute with 20% of major human diseases, as they are considered the main experimental model and also can be considered sentinels for different diseases that affect humans. The aims of the present thesis were to develop a viral metagenomics protocol to detect sequences from viruses in plasma from captive New World non-human primate species (Saimiri sciuratus, Aotus ainfulatus, Alouatta guariba e Sapajus apella) from National Primate Center (Belém, PA), Bela Vista Biological Sanctuary (BVBS, Foz do Iguaçu, PR), and Tietê Ecological Park (São Paulo, SP). The Illumina technology (MiSeq) was used for deep sequencing, and a bioinformatics pipeline was developed in order to analyze the sequences obtained. Overall, genomes corresponding to different viral families were identified from plasma, and emphasis was given to torque tenus virus, hepatitis G virus types A and B, parvovirus, and pappilomavirus. A new whole-genome sequence from Hepacivirus genus, Flaviviridae family, was identified in monkeys from Southern Brazil. The results demonstrate the wide variety of viral genomes present on clinically healthy New World monkeys and highlight the importance of studies that aim to identify possible emerging viruses / Doutor

Orientador: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Banca: Rodrigo Matheus Pereira / Banca: Janete Apparecida Desidério / Resumo: A partir de uma biblioteca metagenômica de um consórcio microbiano degradador de óleo diesel, um clone (PL3C3) expressando um novo gene de protease foi selecionado dentre vinte e seis positivos para degradação de azocaseína. Através do sequenciamento, foi analisado um contig e identificado uma ORF que codifica a proteína, denominada ORF19 composta por 966 pb, 321 aminoácidos, exibindo 69% de identidade com uma alfa/beta hidrolase de Parvibaculum lavamentivorans DS-1(número de acesso ABS62095.1). A sequência da ORF19 após análise em um banco de dados de protease - MEROPS - mostrou 74,3% de identidade com uma serino-protease da família S9U (número de acesso MER095859). Através da análise filogenética, foi possível sugerir que a ORF19 é um novo membro desta família exibindo a tríade catalítica e motivos conservados característicos. A massa molecular da proteína foi estimado em 35 kDa, tendo por base a sua composição em aminoácidos e estimativas junto ao programa Protparam, e considerando o padrão de migração eletroforética da proteína em condições desnaturantes. O gene da ORF19 foi clonado no vetor de expressão pET28a, porém, a proteína recombinante não foi super-expressa em Escherichia coli BL21 (DE3). Contudo, a troca de hospedeiro, vetor, e estudos para uma super-expressão é necessário para a obtenção da proteína, visando sua futura caracterização. Este estudo contribui para a descoberta de uma nova serino-protease utilizando abordagens moleculares, como a metagenômica / Abstract: From a metagenomic library of a microbial consortium that degrades diesel oil, a clone (PL3C3) expressing a novel protease gene was selected from twenty six positive for azocasein degradation. Through sequencing, an analysis was made contig and identified an ORF encoding a protein, called ORF19 composed of 966 bp, 321 amino acids, exhibiting 69% identity with an alpha / hydrolase beta Parvibaculum lavamentivorans DS-1 (accession number ABS62095. 1). The sequence of ORF19 after analysis of a protease database - MEROPS - showed 74.3% identity with a serine protease family S9U (access number MER095859). Through phylogenetic analysis, it was possible to suggest that ORF19 is a new member of this family displaying the catalytic triad and characteristic conserved motifs. The molecular mass of the protein was estimated at 35 KDa, based on its amino acid composition and estimates Protparam by the program, and considering the pattern of electrophoretic migration of the protein under denaturing conditions. The ORF19 gene was cloned into the pET28a expression vector, but not the recombinant protein was overexpressed in E. coli BL21 (DE3). However, the exchange of host, vector, and studies for overexpression is required to obtain the protein, for their further characterization. This study contributes to the discovery of a new serine protease using molecular approaches, as metagenomic / Mestre

Orientador: Eliana Gertrudes Macedo Lemos / Banca: Alessandro Minillo / Banca: Janete Apparecida Desidério Sena / Resumo: A estratégia de clonagem e sequenciamento do gene 16S rRNA é uma das técnicas moleculares que permite estimar e comparar a diversidade microbiana de diferentes amostras ambientais. O objetivo deste trabalho foi estimar a diversidade de microrganismos pertencentes ao Domínio Bactéria em um consórcio degradador de óleo diesel, por meio do sequenciamento parcial do gene 16S rRNA, assim como desenvolver uma nova metodologia de rastreamento em bibliotecas metagenômicas. O consórcio bacteriano foi obtido através de solo enriquecido com óleo diesel. O DNA metagenômico foi extraído com o auxílio do kit Fast DNA spin Kit for soil (Bio101- Quantum Biotechnologies) e amplificado por uma reação de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) com os oligonucleotídeos iniciadores FD1 e RD1 específicos para a o gene 16S rRNA. Os produtos de PCR foram clonados em vetor pGEM T Easy (Promega) e transformados em células competentes de Escherichia Coli DH5 . O sequenciamento parcial dos clones foi feito com oligonucleotideos universais do vetor. Para a prospecção gênica foi utilizado membranas de nylon com "pools" de DNA de todas as placas. A biblioteca obtida gerou 431 clones. Os clones obtidos apresentaram similaridade com o filo Proteobacteria, com representantes das classes Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteira e Betaproteobacteria. O gênero Pseudomonas apresentou-se com maior frequência de clones na biblioteca. O "software" DOTUR foi usado para determinar o número de unidades taxonômicas operacionais (OTUs). A curva de extinção indicou que os 431 clones sequenciado foram suficientes para estimar a diversidade bacteriana do consórcio. A metodologia testada baseado em "pools" de DNA foi eficiente na detecção e isolamento do gene Alkb na bilbioteca metagenomica. / Abstract: Cloning and sequencing of 16S rRNA gene it is one of the molecular techniques that permits estimate and compare the microbial diversity of different environmental samples. The aim of this work was estimate the diversity of microorganisms that belong to Bacteria domain in a consortium specialized in diesel oil degradation, through partial sequencing of 16S rRNA gene, as well as develop a new methodology for screening libraries in metagenomics. This consortium was obtained through enrichments achieved using diesel oil in soil samples. The metagenomic DNA was obtained using Fast DNA spin Kit for soil (Bio 101-Quantum Biotechnologies) and amplified by PCR (Polymerase chain reaction) with FD1 and RD1 oligonucleotides, which are specific for 16S rRNA gene. The PCR products were cloned into pGEM-TEasy vector (Promega) and Escherichia coli DH5 was used as the host cell for recombinant DNAs. The partial clones sequencing was obtained using universal primers of the vector. For the exploration of gene were used nylon membranes with Pools of DNA from all plates. The library generated from 431 clones. All clones sequenced showed similarity with the phylum Proteobacteria, distributed in Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteira and Betaproteobacteria classes. The Pseudomonas genus was the most abundant genus found in the metagenomic library. The DOTUR software was used to assigns sequences to operational taxonomic units (OTUs). Using the OTUs composition data, rarefaction curves were made to show that 431 sequences were enough to obtain a satisfactory coverage of diversity of the microbial consortium. The test methodology based on Pools of DNA isolation was effective in detecting the gene Alkb Library metagenomics. / Mestre

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2016-11-29T13:54:02Z No. of bitstreams: 1 Luciane de Nazare Almeida dos Reis.pdf: 1286764 bytes, checksum: e8ebbda7828d562331b43505ce6da593 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-29T13:54:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luciane de Nazare Almeida dos Reis.pdf: 1286764 bytes, checksum: e8ebbda7828d562331b43505ce6da593 (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / The peanut (Arachis hypogaea L.) is an important source of protein and oil, and considered one of the most cultivated plants in Brazil and worldwide, that provide products consumed in different ways. It is the fourth world largest oleaginous in seed production, cultivated in over 30 countries, where China leads with 40.8%, followed by India with 14% and Nigeria with 7.5%. Brazil occupies the 17th position, concentrated in the Southeast and South regions, and the State of São Paulo accounts for 91.4% of national production. Among the factors that limit the development of this crop, there are several viruses, which cause reduction on productivity and the value of the product for marketing. Up to now, 31 viral species, classified in the following genera and respective families have been recorded naturally infecting peanut: Begomovirus (Geminiviridae), Bromovirus (Bromoviridae), Carlavirus (Betaflexiviridae), Cucumovirus (Bromoviridae), Irlavirus (Bromoviridae), Luteovirus (Luteoviridae), Pecluvirus (Virgaviridae), Potexvirus (Alphafleviridae), Potyvirus (Potyviridae), Rhabdovirus (Rhabdoviridae), Soymovirus (Caulimoviridae), Tospovirus (Bunyaviridae), Tymovirus (Tymoviridae) e Umbravirus (Tombusviridae). Of these genera, Potyvirus has more species. The advent of metagenomics, combined with high-performance technologies (Next Generation Sequencing - NGS) provides the exploration of micro-universe in various areas of science, including the Plant Virology. These techniques, together with bioinformatics, act as excellent tools for detection and characterization of novel viruses, as well as, all the viral genomes of different species or strains present in certain samples. The objective of this work was to study the virome of peanut plants exhibiting typical virus symptoms, obtained from producing areas of 10 counties of the State of São Paulo by NGS. The viral isolates were maintained by successive passages to peanut plants by grafting, under greenhouse conditions at the University of Brasilia (UnB). To perform the NGN, samples were semipurified aiming enrichment of virus particles, followed by total RNA extraction and sequencing carried out by Illumina platform. The metagenomic analysis permitted the detection the complete genome of Peanut mottle virus virus - PeMoV (Potyvirus) and Groundnut ringspot virus - GRSV (Tospovirus). Biological (indicator plants), serological (Dot-ELISA) and molecular (RT-PCR) tests were performed in order to characterize some GRSV isolates from peanut, which sequences were identified by metagenomic. Molecular analysis of the gene encoding the N protein, used for species taxonomy within Tospovirus genus, was also carried out with the selected isolates A1, N1 and O1. These three isolates induced symptomatic response in at least one of the indicator species (Datura stramonium L.) used in this work and widely cited in the literature. Positive results for these isolates were also confirmed by serology, indicating the presence of GRSV in peanut producing counties in the State of São Paulo. Phylogenetic analyzes of the segments L, M and S of tospoviruses revealed that the peanut GRSV isolates studied in this work grouped with sequences of GRSV isolate from watermelon (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. & Nakai) and a recombinant isolate of GRSV and Tomato chlorotic spot virus - TCSV obtained from tomato (Solanum lycopersicum L.). However, the phylogenetic analysis using the N protein sequence, demonstrated that the present peanut isolate grouped with sequences of GRSV isolates previously studied in Brazil. After phylogenetic analysis for proteins of all GRSV segments, it is believed that the species GRSV and TCSV share the same M segment. The comparison of PeMoV coat protein sequences revealed that the Brazilian peanut isolate reported in this work is more phylogenetically related with the isolate from South Korea, obtained from soybean (Glycine max L.) with 98% identity. This is the first report in Brazil and in the world of the complete genome sequences of PeMoV and GRSV in peanuts, by using NGS. / O amendoim (Arachis hypogaea L.) é uma importante fonte de proteína e óleo, sendo considerada uma das plantas mais cultivadas no Brasil e no mundo, com grande diversidade de formas de consumo de seus produtos. É a quarta oleaginosa com maior produção mundial, cultivada em mais de 30 países, em que a China lidera com 40,8%, seguida pela Índia com 14% e Nigéria com 7,5%. O Brasil ocupa a 17ª posição, concentrada nas regiões Sudeste e Sul, sendo o Estado de São Paulo responsável por 91,4% da produção nacional. Dentre os fatores que limitam o desenvolvimento dessa cultura, encontram-se diversos vírus, os quais ocasionam a redução da produtividade e valor do produto para comercialização. Até o momento, já foram registradas, infectando naturalmente o amendoim, 31 espécies virais, classificadas nos seguintes gêneros e respectivas famílias: Begomovirus (Geminiviridae), Bromovirus (Bromoviridae), Carlavirus (Betaflexiviridae), Cucumovirus (Bromoviridae), Irlavirus (Bromoviridae), Luteovirus (Luteoviridae), Pecluvirus (Virgaviridae), Potexvirus (Alphafleviridae), Potyvirus (Potyviridae), Rhabdovirus (Rhabdoviridae), Soymovirus (Caulimoviridae), Tospovirus (Bunyaviridae), Tymovirus (Tymoviridae) e Umbravirus (Tombusviridae). Destes, o gênero Potyvirus é o que agrega maior número de espécies. O advento da metagenômica, aliada às tecnologias de alto desempenho (Next Generation Sequencing - NGS) vêm propiciando a exploração do universo de microrganismos em várias áreas das ciências, inclusive na Virologia Vegetal. Estas técnicas, juntamente com a bioinformática, atuam como excelentes ferramentas para detecção e caracterização de novos vírus e de todos os genomas virais presentes em determinadas amostras, sejam de diferentes espécies ou estirpes. O objetivo desse trabalho foi realizar estudo de viroma de plantas de amendoim exibindo sintomas típicos de viroses, obtidas de áreas produtoras de 10 municípios do Estado de São Paulo por NGS. Os isolados virais foram mantidos por sucessivas passagens para plantas de amendoim por meio de enxertia, em casa de vegetação da Universidade de Brasília (UnB). Para a realização do NGS, as amostras foram semipurificadas objetivando um enriquecimento de partículas virais seguido de extração de RNA total e o sequenciamento, realizado pela Plataforma Illumina Miseq. A análise metagenômica permitiu a detecção do genoma completo do Peanut mottle virus - PeMoV (Potyvirus) e do Groundnut ringspot virus - GRSV (Tospovirus). Análises biológicas (plantas indicadoras), sorológicas (Dot-ELISA) e moleculares (RT-PCR) foram realizadas com intuito de caracterizar alguns isolados de GRSV de amendoim cuja sequência foi identificada por metagenômica. Análises moleculares do gene que codifica a proteína N, amplamente utilizado em trabalhos de taxonomia no gênero Tospovirus, foram também realizadas com os isolados selecionados A1, N1 e O1. Estes três isolados induziram reação sintomatológica em pelo menos uma das espécies indicadoras (Datura stramonium L.) utilizadas nesse trabalho e amplamente citada na literatura. Resultados positivos para estes isolados foram também confirmados por sorologia, evidenciando a presença de GRSV em municípios produtores de amendoim no Estado de São Paulo. Análises filogenéticas para os segmentos L, M e S de tospovírus revelaram que o isolado de GRSV de amendoim estudado neste trabalho agrupou-se com sequências de um isolado de GRSV de melancia (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. & Nakai) e um isolado recombinante de GRSV e Tomato chlorotic spot virus - TCSV, obtido de tomate (Solanum lycopersicum L.). Entretanto, com a análise filogenética feita com a sequência da proteína N, ficou demonstrado que o presente isolado de amendoim se agrupou com sequências de isolados de GRSV previamente estudado no Brasil. Após análises filogenéticas para as proteínas de todos os segmentos de GRSV, acredita-se que as espécies de GRSV e TCSV compartilham o mesmo segmento M. Comparação das sequências da capa proteica de PeMoV, revelaram que o isolado brasileiro de amendoim relatado neste trabalho está mais relacionado filogeneticamente com um isolado obtido de soja (Glycine max L.), encontrado na Coréia do Sul, apresentando 98% de identidade. Este é o primeiro relato no Brasil e no Mundo das sequências do genoma completo de PeMoV e GRSV em amendoim, por meio do uso de NGS.

Orientador: Anita Jocelyne Marsaioli / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-19T01:24:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mantovani_SimoneMoraes_D.pdf: 4553084 bytes, checksum: 941c2cd131469cbd398d6bc132f763bd (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A utilização de biocatalisadores em processos industriais permite a obtenção de produtos de alto valor agregado em sintonia com as demandas de caráter tecnológico e de preservação ambiental. De maneira geral, o desenvolvimento de um biocatalisador envolve inicialmente a triagem da atividade de interesse, seguida da análise das propriedades como seletividade (regio e estereosseletividade) ou estabilidade, que podem ser posteriormente otimizadas por evolução dirigida ou desenho racional até a obtenção de um biocatalisador ótimo. Dessa maneira, os objetivos desse trabalho de tese foram aplicar diferentes metodologias para obtenção de biocatalisadores eficientes, que serão descritos em três capítulos. No capítulo I foi descrita a exploração de novos biocatalisadores por triagem da atividade enzimática em formato miniaturizado de biblioteca metagenômica composta por 864 clones utilizando sondas fluorogênicas, e que levou à detecção de quatro clones ativos para a hidrólise de ésteres. Posteriormente esses clones foram avaliados frente a substratos não modificados permitindo identificar um clone expressando uma enzima de alta quimio e enantiosseletividade para resolução cinética de éster propiônico (E > 100).. No capítulo II foi descrito o mecanismo da desracemização de álcoois secundários por células íntegras de Candida albicans CCT 0776 que consiste em um processo cíclico de oxidação e redução. A primeira etapa é catalisada por uma enzima altamente (S)-seletiva dependente de NADP e O2, seguida de redução pouco seletiva dependente de NADH. Esse sistema foi aplicado para diferentes álcoois e dióis, e possibilitou a detecção dos enantiômeros anti-Prelog com conversões de moderadas a altas (60 a 99 %) e altos excessos enantioméricos (80 a 90%) entre períodos de 20 a 120 h. Por fim, no Capítulo III foi descrito o trabalho de engenharia do citocromo P450Bm3 por exploração combinatória de alanina e posterior evolução dirigida para desmetilação regiosseletiva de substratos volumosos. Essa etapa foi desenvolvida durante o estágio de doutorando em Catech (EUA) sob a supervisão da Profa. Frances Arnold e permitiu a obtenção de variantes capazes de catalisar N-desmetilação de alcalóides e hidroxilação de esteróides com rendimentos moderados (20-80%). Todos esses resultados mostram a variedade de técnicas que podem ser empregadas para o desenvolvimento e aplicações de biocatalisadores visando transformações regio e estereosseletivas eficientes / Abstract: Biocatalysts have been widely applied in recent decades for industrial processes yielding high value products under environmentally friendly reaction conditions. The development of biocatalysts often begins with screening to identify enzymes with suitable activities followed by characterization of the enzymes chemo-, regio- and stereoselectivity or stability. However, identification of new biocatalysts does not always yield enzymes suitable for a given synthetic problem. To overcome this limitation, biocatalysts can be optimized by protein engineering using rational design or directed evolution. In this context, this thesis describes different methodologies that can be explored to obtain efficient biocatalysts for selective transformations. In Chapter I, functional screening of an 864 member metagenomic library derived from soil using a miniaturized assay based on fluorogenic substrates is described. These assays identified four clones capable of ester hydrolysis. Upon further evaluation using high value substrates, one clone, B6, was shown to display high chemo- and enantioselectivity (E>100) for propionic ester hydrolysis. Chapter II describes the study and application of secondary alcohols deracemization using Candida albicans CCT 0776 whole cells. Monitoring the reaction using phenylethanol as a substrate revealed this system furnishes the (R)-enantiomer in high yield and enantiomeric excess mediated by a cyclic process of oxidation and reduction. In summary the first step is catalyzed by a high S- selective enzyme dependent on NADP and O2 followed by a non-selective reduction catalyzed by an NADH-dependent enzyme. This whole cell biocatalyst was applied to different sec-alcohols and diols allowing the detection of the anti-Prelog products in moderate to high conversions (60 and 99%) and high enantiomeric excess (80 and 90%) within 20 to 120 hour incubation times. Finally, in Charpter III the engineering of cytochrome P450Bm3 by alanine combinatorial scanning mutagenesis followed by directed evolution was used to identify enzymes with regioselective demethylation of bulky substrates. These libraries furnished variants capable of catalyzing regioselective N-demethylation of alkaloids and diastereoselective hydroxylation of steroids in moderate yields. Taken together these studies show the variety of techniques that can be applied for development and application of biocatalysts enabling selective and efficient transformations / Doutorado / Quimica Organica / Doutor em Ciências

Orientadores: Valéria Maia Merzel, Anete Pereira de Souza / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T11:36:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SierraGarcia_IsabelNatalia_M.pdf: 3475320 bytes, checksum: 79a474111daa5266a55171dde25ca3b5 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A ocorrência de óleos biodegradados nos reservatórios de petróleo, juntamente com o isolamento das primeiras bactérias a partir destes ambientes, forneceu evidências de micro-organismos ativos no subsolo profundo. Os micro-organismos, habitantes comuns de reservatórios de petróleo, desenvolveram estratégias eficazes de biodegradação, baseados em sistemas enzimáticos e vias metabólicas especializadas, de maneira a acessar os hidrocarbonetos como fonte de carbono e energia. No entanto, o conhecimento atual da diversidade microbiana e dos processos metabólicos envolvidos na biodegradação em reservatórios de petróleo ainda é limitado, principalmente devido à dificuldade em recuperar a complexa comunidade microbiana presente em tais ambientes extremos. Essa limitação imposta pelo uso de técnicas de cultivo convencionais pode ser superada através do uso de abordagens independentes de cultivo, como a metagenômica, a qual permite o acesso ao potencial metabólico dos micro-organismos não cultivados. Em trabalho prévio, uma biblioteca metagenômica fosmidial derivada de enriquecimentos aeróbios e anaeróbios de petróleo foi construída e avaliada para a capacidade de crescimento microbiano em hexadecano como fonte de única de carbono. No presente estudo, foi analisada a capacidade de biodegradação de hexadecano e fenantreno pelos clones selecionados dessa biblioteca através de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM). As análises que se sucederam tiveram como objetivos a identificação e caracterização das sequências metagenômicas responsáveis pela biodegradação de hidrocarbonetos. A estratégia de clonagem aleatória "shotgun" seguida de sequenciamento dos clones foi utilizada para determinar a sequência inteira dos insertos fosmidias que mostraram relevantes capacidades de biodegradação. Cerca de 30 kb de sequência foram montados para o fosmideo 1A (91% de degradação do hexadecano e 5% do fenantreno) e 37 kb para o fosmideo 2B (98% de degradação do hexadecano e 44% do fenantreno), e em cada um foram reconhecidos 23 ORFs e 40 ORFs, respectivamente. As proteínas putativas foram identificadas por comparação das sequências de aminoácidos deduzidas. Várias proteínas envolvidas na degradação aeróbia e anaeróbia de diferentes compostos de hidrocarbonetos foram encontradas. As sequências que codificam estas enzimas não mostraram-se agrupadas em clusters completos de degradação, semelhantes aos encontrados nas bactérias degradadoras de hidrocarbonetos conhecidas. Os fragmentos metagenômicos continham apenas subconjuntos de genes pertencentes a várias vias, mostrando novos arranjos gênicos. Esses resultados reforçam o potencial da abordagem metagenômica para a prospecção e elucidação de novos genes e vias metabólicas, contribuindo para uma visão mais abrangente dos processos de biodegradação que ocorrem nos reservatórios de petróleo / Abstract: The occurrence of biodegraded oil in petroleum reservoirs, along with the isolation of the first bacteria from such environments, provided evidence for active microorganisms in the deep subsurface. Microorganisms are common inhabitants of petroleum reservoirs and they may have effective biodegrading strategies, based on specialized enzyme systems and metabolic pathways, as a form to access hydrocarbons as carbon and energy sources. However, the current knowledge of the microbial diversity and metabolic pathways involved in hydrocarbon biodegradation in petroleum reservoirs is still limited, mostly due to the difficulty in recovering the complex community present in such extreme environments. This limitation imposed by conventional culturing techniques can be circumvented by the metagenomic approach, which is a culture-independent molecular method that allows the access to the metabolic potential of previously uncultured microorganisms. In a previous work, a metagenomic fosmid library derived from aerobic and anaerobic petroleum enrichments were constructed and screened for the detection of microbial growth on hexadecane as sole carbon source. In this study, the biodegradation abilities on hexadecane and phenanthrene of selected clones were analyzed using Gas Chromatography - Mass Spectroscopy (GC-MS) and subsequent analyses aimed at the identification and characterization of metagenomic sequences responsible for the hydrocarbon biodegradation. The shotgun sequencing approach was used to determine the whole insert sequence of two fosmid clones showing different and relevant biodegradation capacities, FOS1A (91% hexadecane and 5% phenanthrene degradation) and FOS2B (98% hexadecane and 44% phenanthrene degradation). About 30 kb in sequence were assembled for the fosmid 1A and 37 kb for fosmid 2B, and 23 ORFs and 40 ORFs were recognized in each one, respectively. Putative proteins were identified by comparison of deduced aminoacid sequences. Several proteins involved in the degradation of different hydrocarbon compounds by aerobic and anaerobic pathways were found. The sequences coding these enzymes were not grouped together into complete clusters of degradation pathways similar to those already described in known hydrocarbon degrading bacteria. The metagenomic fragments contained only subsets of gene belonging to different pathways, showing novel gene arrangements. The results obtained in this study reinforce the potential of the metagenomic approach for the prospection and elucidation of new genes and pathways, contributing to a broader perspective of the biodegradation processes that take place in petroleum reservoirs / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Les mycotoxines telles que la fumonisine B1 (FB1) produites par les champignons du genre Fusarium sont particulièrement préoccupantes pour la filière maïsicole. L’ensilage de maïs est un processus de fermentation naturel susceptible de favoriser l’évolution des teneurs en FB1. La maîtrise du risque de contamination par la FB1 et la recherche de moyens permettant la décontamination des ensilages est donc nécessaire. L’objectif de ce travail est de caractériser le devenir de la FB1 dans les ensilages de maïs grain et de mettre en évidence l’existence d’agents microbiens capables de dégrader cette toxine. Pour cela, des mini-silos contenant du maïs grain naturellement contaminé en FB1 provenant de différents parcelles et issus des deux années de récolte ont été préparés. La stratégie analytique basée sur le dosage de la FB1 libre et la FB1 complexée par HPLC-MS/MS a révélé une diminution significative de la teneur en FB1 totale qui ne peut être attribuée à un mécanisme de complexation et résulte d’un mécanisme de dégradation. La recherche du microbiote associé à la dégradation de la FB1 a été réalisée par deux approches complémentaires : Une analyse métagénomique combinant l’extraction sélective de l’ADN microbien et le séquençage haut débit «shotgun» afin de comparer la diversité taxonomique et fonctionnelle d’un ensilage dégradant la FB1 et d’un ensilage moins dégradant. En parallèle, un criblage de microorganismes cultivables capables de métaboliser la FB1 a été conduit et a permis de confirmer les résultats de l’analyse globale. Ce travail apporte une première image du microbiote potentiellement associé à la dégradation de la FB1, ainsi que des activités microbiennes responsables. / Fungi of the genus Fusarium are one of the major contaminants of maize that can produce mycotoxins, such as the fumonisin B1 (FB1). Maize silage which is based on the fermentation of whole crop plant or grains is considered the main source of monogastrics and cattle feeding in Europe. The ensiling process could favor changes in FB1 content; however this has scarcely been documented. This led to questioning regarding the possibility of managing the microbiota during ensiling in order to reduce the level of mycotoxins exposure and improve feed quality. The aim of this work is to study the fate of FB1 during ensiling process of high moisture maize grain and to identify an endemic microbiota capable of degrading FB1. Laboratory scale silages were prepared with naturally contaminated FB1 grains from two cropping years. An analytical procedure allowed assessing both free and matrix associated FB1 forms and showed a significant decrease in total FB1 content that are not linked to the presence of bound FB1. Additionally, our data showed that the FB1 content decrease was mainly due to a degradation process. Identification of a potential microbiota responsible for FB1 degradation was conducted. A metagenomics approach combining a selective microbial DNA extraction and high-throughput shotgun sequencing showed microbial specific patterns between FB1 degrading and weakly degrading silage. These results were also supported by the isolation of microbial strains able to metabolize FB1. Ultimately, this work evidenced a microbiota associated to FB1 degradation and the functional diversity involved in this activity. Bacteria and yeasts have been obtained for further studies on degradation activities and their usage as silage starter.

La métagénomique comparative est dite de novo lorsque les échantillons sont comparés sans connaissances a priori. La similarité est alors estimée en comptant le nombre de séquences d’ADN similaires entre les jeux de données. Un projet métagénomique génère typiquement des centaines de jeux de données. Chaque jeu contient des dizaines de millions de courtes séquences d’ADN de 100 à 200 nucléotides (appelées lectures). Dans le contexte du début de cette thèse, il aurait fallu des années pour comparer une telle masse de données avec les méthodes usuelles. Cette thèse présente des approches de novo pour calculer très rapidement la similarité entre de nombreux jeux de données. Les travaux que nous proposons se basent sur le k-mer (mot de taille k) comme unité de comparaison des métagénomes. La méthode principale développée pendant cette thèse, nommée Simka, calcule de nombreuses mesures de similarité en remplacement les comptages d’espèces classiquement utilisés par des comptages de grands k-mers (k > 21). Simka passe à l’échelle sur les projets métagénomiques actuels grâce à un nouvelle stratégie pour compter les k-mers de nombreux jeux de données en parallèle. Les expériences sur les données du projet Human Microbiome Projet et Tara Oceans montrent que les similarités calculées par Simka sont bien corrélées avec les similarités basées sur des comptages d’espèces ou d’OTUs. Simka a traité ces projets (plus de 30 milliards de lectures réparties dans des centaines de jeux) en quelques heures. C’est actuellement le seul outil à passer à l’échelle sur une telle quantité de données, tout en étant complet du point de vue des résultats de comparaisons. / Metagenomics studies the genomic content of a sample extracted from a natural environment. Among available analyses, comparative metagenomics aims at estimating the similarity between two or more environmental samples at the genomic level. The traditional approach compares the samples based on their content in known identified species. However, this method is biased by the incompleteness of reference databases. By contrast, de novo comparative metagenomics does not rely on a priori knowledge. Sample similarity is estimated by counting the number of similar DNA sequences between datasets. A metagenomic project typically generates hundreds of datasets. Each dataset contains tens of millions of short DNA sequences ranging from 100 to 150 base pairs (called reads). In the context of this thesis, it would require years to compare such an amount of data with usual methods. This thesis presents novel de novo approaches to quickly compute the similarity between numerous datasets. The main idea underlying our work is to use the k-mer (word of size k) as a comparison unit of the metagenomes. The main method developed during this thesis, called Simka, computes several similarity measures by replacing species counts by k-mer counts (k > 21). Simka scales-up today’s metagenomic projects thanks to a new parallel k-mer counting strategy on multiple datasets. Experiments on data from the Human Microbiome Project and Tara Oceans show that the similarities computed by Simka are well correlated with reference-based and OTU-based similarities. Simka processed these projects (more than 30 billions of reads distributed in hundreds of datasets) in few hours. It is currently the only tool able to scale-up such projects, while providing precise and extensive comparison results.

Les données présentées dans ce manuscrit de thèse sont principalement basées sur l'analyse de séquences d'ADN extraites directement de l'environnement (et en particulier du sol) en les comparant aux données cumulées au fil des siècles sur les microorganismes cultivés en laboratoire. Les objectifs, difficultés, résultats et perspectives de cette approche, que l'on nomme « métagénomique », sont décrits. Un métagénome représente la diversité génétique d'un habitat défini (par exemple un sol du champ agricole) dans sa globalité. Ainsi, générer un métagénome a notamment pour but d’accéder à la diversité génétique de la majorité d'espèces récalcitrantes à la culture. Elle permet aussi d'estimer le potentiel fonctionnel d'un jeu de données métagénomiques représentant un écosystème, puis de le comparer à d'autres jeux de données, représentant quant à eux d'autres environnements. Enfin, un autre intérêt de cette approche est la possibilité, dans certains cas, d'assembler partiellement ou entièrement un métagénome, et ainsi de permettre la reconstruction de structures génétiques complexes, qu'elles représentent des plasmides ou des génomes, circulaires ou non. Ce manuscrit de thèse présente ces aspects de la métagénomique (extraction, séquençage, annotation, comparaison, assemblage) sur l'environnement sol, en se basant sur une prairie anglaise (Park Grass, Rothamsted Research) étudiée depuis plus de 150 ans. Les communautés microbiennes prédominantes ont été partiellement caractérisées, leur potentiel fonctionnel comparé à d'autre environnements majeurs de notre planète (océans, sédiments, neige, etc.). Parce que l'assemblage de ces données est très limité dû à une trop grande diversité, des expérimentations ont été faites en microcosmes afin de stimuler une partie de la communauté avant de générer de nouveaux jeux de données, hautement simplifiés. Cette approche a permis l'assemblage et l'étude structurelle de génomes correspondant à des espèces résistant à des conditions extrêmes (par exemple un apport considérable de mercure, ou de métaux lourds).Lorsque l'on regarde la métagénomique dans sa globalité, les perspectives apparaissent clairement : usant d'outils de plus en plus performants (séquençage, annotation, assemblage, etc.), les microbiologistes peuvent d'ores et déjà récolter le fruit de plus de trois milliards d'années d'évolution et d'adaptation microbienne. / Microbial ecology is beginning to interact with metagenomics and many microbiologists are attracted to metagenomics in the hope of discovering novel relationships between microorganisms and/or confirming that work done on isolates applies to the remaining uncultured members of the different ecosystems. With a growing number of available metagenomic datasets, metagenomes can be intensively mined by microbial ecologists in search of previously undetected correlations (both structural and functional). Here, we provide a preliminary exploration of 77 publically available metagenomes corresponding to DNA samples extracted from oceans, atoll corals, deep oceans, Antarctic aquatic environments, Arctic snows, terrestrial environments (sediments, soils, sludges, microbial fuel cell anode biofilms, acid mine drainage biofilms), polluted air, and animal and human microbiomes (human feces, mouse and chicken cecum, and cow rumen). Results show well-defined environmental specificities that emphasize microbial adaptation and evolution capabilities. Unexpected observations were also made for several ecosystems, thus providing new hypotheses about the life style of their microbial communities. Available metagenomes are a gold mine of underexploited information that could be used to explore specific microbial structural and functional relationships. The statistical analysis provided here depends in part on replicates from the different ecosystems. With the continued emphasis on metagenomic sequencing, future analyses should support rigorous statistical treatment. This preliminary metagenomic decryption could represent a pilot-scale test for a future Earth microbiome global comparison