85% des patients atteints de cancer du pancréas présentent au diagnostic des formes avancées de la maladie qui empêchent leur prise en charge thérapeutique efficace. Il est donc urgent de mettre en évidence des marqueurs diagnostics permettant de détecter plus tôt ces cancers, mais également leur rechute, afin d'améliorer leur prise en charge. Les miARNs (micro acides ribonucléiques) sont des biomarqueurs du cancer du pancréas, présentant une valeur clinique démontrée pour la détection précoce des tumeurs et le suivi de la réponse au traitement. Cependant, les méthodes actuelles d'extraction et de détection de ces molécules ne sont pas adaptées à une utilisation clinique. Les nouvelles technologies issues des méthodes de micro et nanofabrication ont le potentiel de permettre la mise en place de tests diagnostiques, offrant un haut degré de portabilité et de robustesse, une lecture en temps réel, et à bas coût. Nous proposons ici une plateforme nanofluidique couplée à une détection en fluorescence permettant la mesure en temps réel d'interactions moléculaires en milieu hyper-confiné. Nous décrivons dans un premier temps la plateforme de détection via un modèle théorique à une dimension basé sur la dynamique moléculaire permettant de prédire la capture spécifique des miARNs dans un nanocanal fonctionnalisé. L'originalité du système réside dans une accroche non homogène des miARNs sur la surface du capteur. Ainsi, nous démontrons que l'étude du profil spatial d'hybridation engendré permet de déterminer l'affinité du miARN capturé avec la séquence sonde en une seule étape, sans lavage. Nous démontrons également l'excellente spécificité du biocapteur qui permet la discrimination rapide (moins de 10 minutes) de SND (single nucleotide difference). Les performances du dispositif pour des applications au plus près des problématiques biologiques dans le cadre de la détection du cancer du pancréas sont enfin discutées : les effets de la préparation d'échantillon types biofluides complexes sur l'extraction de miARNs sont étudiés, puis deux approches permettant la détection de miARNs endogènes sont décrites et comparées, conduisant à la détection de miARNs extraits de cultures cellulaires modèles du cancer du pancréas. / 85% of patients affected by pancreatic adenocarcinoma (PDA) are diagnosed at an advanced stage, preventing effective care and curative treatments. Therefore, it is urgent to identify reliable biomarkers for the early detection of disease status, including relapse. MiRNAs (micro ribonucleic acids) are biomarkers of PDA, with demonstrated clinical value for early detection of tumors and monitoring of response to treatment. However, current methods of extraction and detection of miRNA are not compatible with clinical use. New technologies derived from micro and nanofabrication methods have the potential to facilitate the implementation of diagnostic tests, by offering a high degree of portability and robustness, short time to results at low cost. Here, we propose a nanofluidic platform coupled to fluorescence detection for the real time measurement of molecular interactions in a confined environment. We first describe the detection platform via a one-dimension theoretical model based on molecular dynamics to predict the capture of miRNAs into biofunctionalized nanochannels. The originality of the system lies in the non-homogeneous hybridization of miRNA targets onto the sensor. We demonstrate that the analysis of the spatial hybridization profile enables the determination of the affinity of the captured miRNA with the probe sequence in a wash-free single step. We then show the rapid discrimination (less than 10 minutes) of single nucleotide difference (SND) using this strategy. The performance of the device in the context of pancreatic cancer detection is discussed: the effect of sample preparation of complex biofluids is studied and two labeling approaches compatible with the detection of endogenous miRNAs are described and compared, leading to the detection of miRNAs extracted from model cell cultures of pancreatic cancer.

Leishmania are obligate intracellular protozoan parasites that are inoculated into human skin while a sand fly vector takes a blood meal with the resulting disease coined leishmaniasis. The twenty plus species of Leishmania known to cause human disease are found throughout tropical and subtropical regions of the world. Leishmaniasis affects at least eighty-eight countries with three hundred and fifty million people at risk for infection, resulting in an estimated seventy thousand deaths annually. Different species of Leishmania have developed distinct methods for host defense evasion, leading to a wide spectrum of pathologies within humans. Prior studies of macrophage infections with Leishmania have shown global changes in macrophage mRNA expression. We hypothesized miRNAs are important modifiers of mRNA changes during Leishmania infection. Analysis of miRNA expression patterns revealed that changes were detected primarily during macrophage infection with the low virulent logarithmically growing promastigotes. Profiling studies of mRNA and miRNA changes upon infection with promastigotes in logarithmic growth revealed a decrease in miR-200b and increase in miR-744 levels whereas infections with the highly virulent metacyclic promastigotes revealed a decrease in miR-708 levels. Furthermore, microarray studies revealed differences in macrophage mRNA levels between macrophages infected with the low virulent promastigotes verses the highly virulent promastigotes. Correlative studies between miRNA and mRNA changes suggested some of Leishmania induced changes in mRNA levels may be modified by miRNAs. The importance of Toll-like receptors (TLR) in detection of microbial products has been well-documented. Leishmania infection is known to initiate signaling through TLRs 2, 3, 4 and 9, of which TLRs 2, 4 and 9 signal through the adaptor molecule MyD88. We found that miR-200b, a microRNA decreased by infection of macrophages with the low virulent Leishmania promastigotes, regulates signaling through the TLR4 pathway by targeting and repressing MyD88 transcript levels. Furthermore, we have shown that MyD88 repression results in the decreased expression of the downstream effector molecules IL-6, CXCL9 and TNFΑ upon challenge with a TLR4 ligand. The suppression of miR-200b during Leishmania infection could serve to up-regulate inflammatory responses induced through TLR4 and other MyD88 dependent TLRs. This may be responsible, in part, for the decreased virulence of logarithmically growing compared to metacyclic promastigotes. Furthermore, low levels of inflammation may promote parasite survival by promoting the influx of inflammatory phagocytic cells to the site of infection in which the highly virulent parasites can survive. Microarray studies revealed a remarkable increase in expression of metallothionein (MT) transcripts in macrophages infected with low virulent promastigotes but not in macrophages infected with the highly virulent promastigotes. To explore a possible mechanistic role for metallothioneins in leishmaniasis, we used knock-out mice for MT-1 genes. Bone-marrow derived macrophages from MT-1 knock-out mice (MT-KO) generated higher levels of reactive oxygen species upon incubation with Leishmania promastigotes. Consistently, the initial ROS-induced killing of promastigotes, which occurs during the first hours of infection, was greater twenty-four hours after infection of MT-1 KO bone-marrow macrophages than in our wild type controls. Overall, data presented in this thesis documents changes to macrophage mRNA and miRNA expression patterns upon infection with Leishmania promastigotes that correspond to the overall parasite survival in the host macrophage.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2006. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 90-99).

Los microRNAs (miRNAs) son unas pequeñas moléculas de RNA (20-25nt) que no codifican para proteína, sin embargo actúan inhibiendo la traducción a proteína de RNAs mensajeros mediante la unión a su región UTR 3'. Se ha visto que estos miRNAs juegan un papel esencial en la regulación de la diferenciación celular y en el mantenimiento del estado pluripotente en las células madre. De la misma manera se los ha visto desregulados en múltiples tumores, llegando a ser considerados en algunos casos oncogenes o genes supresores de tumores.En la presente tesis se realizado un análisis de la expresión de miRNAs maduros en dos modelos tumorales diferentes: por un lado se ha analizado el patrón de expresión de miRNAs en tejido tumoral y normal de pacientes afectos de cáncer colorectal y en muestras de colon embrionario humano de embriones de 7-12 semanas de desarrollo. Por otro lado se ha analizado el patrón de expresión de miRNAs en ganglios de pacientes afectos de linfoma de Hodgkin clásico y en ganglios normales. Para ello se han analizado un total de 156 miRNAs maduros mediante stem-loop RT-PCR y PCR a tiempo real(TaqMan). La validación de los resultados se ha realizado mediante el uso de líneas celulares (DLD1 de cáncer colorectal, y L-428, HD-MY-Z y L-1236 de linfoma de Hodgkin) y mediante hibridación in situ de miRNAs con sondas de tipo LNA(Exiqon) en la plataforma automática Bond Max (Vision Biosystems).En el análisis del cáncer colorectal y la embriogénesis del colon se ha detectado una expresión solapada de miRNAs entre la mucosa colónica embrionaria y el cáncer colorectal. Se ha determinado una firma de miRNAs que caracteriza al cáncer colorectal de estadio I y II. Se ha definido también el patrón de expresión de miRNAs durante la embriogénesis del colon. Además hemos demostrado que el cluster de miRNAs miR-17-92 y su proteína diana E2F1 comparten un patrón de expresión común entre la embriogénesis del colon humano y la carcinogénesis colorectal, actuando en la regulación del proceso de proliferación celular. En este sentido, la hibridación in situ confirmó la sobreexpresión de miR-17-5p en la base de las criptas colónicas, en el compartimiento proliferativo. Por otro lado, en el estudio del patrón de expresión de miRNAs en el linfoma de Hodgkin clásico (LHc), se ha encontrado una firma de 25 miRNAs que caracterizan a este LHc. Entre estos miR-21, miR-134 y miR-138 mediante hibridación in situ se los ha detectado en el citoplasma de las células de Hodgkin/Reed Sternberg (H/RS). La validación de los 25 miRNAs en las líneas celulares ha demostrado que 20 son expresados por las líneas celulares y únicamente 5 son de expresión exclusiva del microambiente reactivo. Por otro lado se han definido 32 miRNAs que permiten discriminar entre el subtipo histológico esclerosis nodular, del subtipo celularidad mixta, de los cuales 11 mostraban diferencias que caracterizaban a las células tumorales de un tipo u otro. Además se analizó si la presencia del virus de Epstein Barr (EBV) estaba alterando el patrón de miRNAs en los pacientes de LHc EBV+ respecto a los EBV-, y se encontraron un conjunto de 10 miRNAs diferencialmente expresados entre los dos grupos de pacientes. Finalmente se vio que miR-138 estaba sobreexpresado en estadios iniciales (I-II) y se infraexpresaba en estadios avanzados (III-IV).Los miRNAs se deben considerar como moléculas claves tanto en la embriogénesis del colon, como en la transformación neoplásica del epitelio colónico, así como en el LHc, pudiendo ser utilizadas en un futuro como herramienta terapéutica. / MicroRNAs (miRNAs) are negative regulators of gene expression that play an important role in hematopoiesis and tumorigenesis and have been shown to be essential to regulate cell differentiation and maintenance of the pluripotent cell state.To date, no evidence has linked miRNA expression in embryonic and tumor tissue. We assessed the expression of mature miRNAs in human embryonic colon tissue and in colorectal cancer and paired normal colon tissue. Overlapping miRNA expression was detected between embryonic colonic mucosa and colorectal cancer. We demonstrated that miR-17-92 cluster and expression of its target E2F1 share a common pattern between human colon embryogenesis and colonic carcinogenesis, regulating the proliferation process. In this sense, in situ hybridization assay confirmed the overexpression of miR-17-5p in the crypt progenitor compartment. miRNAs pathways must be considered to be included as major players contributing to both embryonic development and neoplastic transformation of colonic epithelium. In other hand, we analyzed miRNA expression in classic Hodgkin lymphoma (cHL) and the influence of Epstein-Barr virus (EBV) infection on the miRNA expression profiles. The expression of 157 miRNAs in lymph nodes from 49 cHL patients and 10 reactive lymph nodes (RLNs) was analyzed by real-time polymerase chain reaction (PCR). Hierarchic clustering revealed 3 well-defined groups: nodular sclerosis cHL, mixed cellularity cHL, and RLNs. A distinctive signature of 25 miRNAs differentiated cHL from RLNs, and 36 miRNAs were differentially expressed in the nodular sclerosis and mixed cellularity subtypes. These results were validated in a set of 30 cHLs and 5 RLNs, and in 3 cHL cell lines. miR-96, miR-128a, and miR-128b were selectively down-regulated in cHL with EBV. Our findings suggest that miRNAs play an important role in the biology of cHL and may be useful in developing therapies targeting miRNAs.

No description available.

Understanding the molecular networks that maintain articular cartilage and regulate chondrogenic differentiation of mesenchymal stromal cells (MSCs) are important prerequisites for the improvement of cartilage repair strategies. The first study within this thesis demonstrates that equine cord blood-derived MSCs induced towards a chondrogenic phenotype showed significantly increased miR-140 expression from day 0 to day 14, which was accompanied by decreased expression of previously identified miR-140 targets; ADAMTS-5 and CXCL12. The second study shows that in vitro chondrogenesis on fibronectin coated-PTFE inserts results in more homogeneous hyaline-like cartilage with an increased number of differentiated cells compared with pellet cultures. Finally, the expression of miR-140, miR-9, miR-155 and miR-146a was investigated in an in vitro model of osteoarthritis and suggests a possible role for miR-146a. These results suggest that microRNAs may be useful for directing or enhancing eCB-MSC chondrogenic differentiation and for developing novel biomarker panels of in vivo joint health. / Danish Agency for Science, Technology and Innovation; Equine Guelph; Grayson-Jockey Club Research Foundation; BioE.

Despite improvements in treatment strategies for head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), clinical outcome has remained disappointing, with 5-year overall survival rates hovering around 40-50%, underscoring an urgent need to better understand the biological bases of this disease. We chose to address this challenge by studying the role of micro-RNAs (miRNAs), and iron in HNSCC. We performed global profiling on 51 primary HNSCC compared to 4 normal laryngeal epithelial tissues, and identified 38 differentially expressed miRNAs between cancer vs. normal patient tissues. Functional validation confirmed a tumour promoting phenotype for miR-106b and miR-375. Integrating these findings with global miR profiling of HNSCC revealed two significantly over expressed miRNAs in HNSCC cell lines and patient samples: miR-193b and miR-205. Knockdown of miR-205 and miR-193b in HNSCC cell lines significantly decreased cell proliferation and colony formation. Moreover, NF1 was identified as a target of miR-193b. Downstream targets of NF1 including active-RAS and p-ERK were also suppressed after miR-193b knockdown. Finally, HNSCC patients with high levels of miR-193b experienced a lower disease-free survival than patients with low miR-193b expression. The second approach we took to better understand the biology of HNSCC was to examine the involvement of iron in the disease. In a panel of HNSCC cell lines, hemochromatosis (HFE) was one of the most overexpressed genes involved in iron regulation. Knockdown of HFE in HNSCC cell lines significantly decreased intracellular iron levels, resulting in a significant decrease in HNSCC cell proliferation, DNA synthesis, and Wnt signalling. When iron was re-introduced back into the cell after HFE knockdown, these cellular changes were reversed, indicating that iron was mediating this phenotype. Concordantly, HNSCC cells treated with an iron chelator ciclopirox olamine (CPX) significantly reduced proliferation and clonogenic survival. Finally, patients with high HFE expression experienced a reduced survival compared to patients with low HFE expression, corroborating the oncogenic role of HFE in HNSCC. In summary, using two independent methods, we have identified two potential prognostic biomarkers for HNSCC, namely miR-193b and HFE. Characterization of these two molecules, exposed critically dysregulated pathways driving disease progression. Specifically, the miR-193b~NF1 axis uncovered a novel mechanism of RAS and p-ERK activation in HNSCC; similarly, HFE exposed a novel tumour promotion role of iron in this disease.

Despite improvements in treatment strategies for head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), clinical outcome has remained disappointing, with 5-year overall survival rates hovering around 40-50%, underscoring an urgent need to better understand the biological bases of this disease. We chose to address this challenge by studying the role of micro-RNAs (miRNAs), and iron in HNSCC. We performed global profiling on 51 primary HNSCC compared to 4 normal laryngeal epithelial tissues, and identified 38 differentially expressed miRNAs between cancer vs. normal patient tissues. Functional validation confirmed a tumour promoting phenotype for miR-106b and miR-375. Integrating these findings with global miR profiling of HNSCC revealed two significantly over expressed miRNAs in HNSCC cell lines and patient samples: miR-193b and miR-205. Knockdown of miR-205 and miR-193b in HNSCC cell lines significantly decreased cell proliferation and colony formation. Moreover, NF1 was identified as a target of miR-193b. Downstream targets of NF1 including active-RAS and p-ERK were also suppressed after miR-193b knockdown. Finally, HNSCC patients with high levels of miR-193b experienced a lower disease-free survival than patients with low miR-193b expression. The second approach we took to better understand the biology of HNSCC was to examine the involvement of iron in the disease. In a panel of HNSCC cell lines, hemochromatosis (HFE) was one of the most overexpressed genes involved in iron regulation. Knockdown of HFE in HNSCC cell lines significantly decreased intracellular iron levels, resulting in a significant decrease in HNSCC cell proliferation, DNA synthesis, and Wnt signalling. When iron was re-introduced back into the cell after HFE knockdown, these cellular changes were reversed, indicating that iron was mediating this phenotype. Concordantly, HNSCC cells treated with an iron chelator ciclopirox olamine (CPX) significantly reduced proliferation and clonogenic survival. Finally, patients with high HFE expression experienced a reduced survival compared to patients with low HFE expression, corroborating the oncogenic role of HFE in HNSCC. In summary, using two independent methods, we have identified two potential prognostic biomarkers for HNSCC, namely miR-193b and HFE. Characterization of these two molecules, exposed critically dysregulated pathways driving disease progression. Specifically, the miR-193b~NF1 axis uncovered a novel mechanism of RAS and p-ERK activation in HNSCC; similarly, HFE exposed a novel tumour promotion role of iron in this disease.

Les síndromes mielodisplàsiques (SMD) també anomenades preleucemia són un conjunt heterogeni de malalties del sistema hematopoiètic caracteritzades per un grau variable de displasia a la medul·la òssia i en sang perifèrica, un nombre de citopenies en sang perifèrica i un risc de transformació a leucemia mieloide aguda (LMA). La majoria de casos de SMD primaris es presenten sense cap relació amb circumstàncies etiològiques conegudes i tenen una major incidènica en persones d'edat avançada (>75 anys) tot i que també poden afectar a joves. El primer signe que es pot manifestar en un pacient amb aquesta malaltia i més comunment és l'anèmia, tot i que també és possible trobar un baix número de leucòcits en sang perifèrica i un número de plaquetes per sota del que és habitual.El Limfoma de Hodgkin (LH) és un càncer que s'origina al teixit limfàtic, generalment als ganglis linfàtics de la part superior del cos, i es pot propagar a través dels vasos limfàtics a d'altres ganglis, així com també es pot arribar a propagar al fetge i als pulmons. El LH suposa un 1% dels càncers aproximadament i un 10% de tots els limfomes. L'incidència és de 3 casos nous a l'any per cada 100.000 habitants, al contrari que els limfomes no Hodgkin la seva incidència es manté estable al llarg del temps.Els microRNAs són molècules de 22 nucleòtids de cadena senzilla, que no codifiquen per proteïna; aquestes molècules poden regular l'expressió dels seus gens diana unint-se de formacomplementària a l'RNA missatger. Des de que es van descubrir, han anat apareixent diversos estudis que avalen el seu paper d'aquests en processos tumorals. Se sap que els microRNAs es troben de forma freqüent en regions genòmiques "fràgils", associades al càncer. De fet, s'ha establert que els microRNAs tant poden actuar com a oncogens com a gens supressors de tumors.Des de fa pocs anys s'han establert patrons d'expressió de microRNAs per relacionar-los d'una forma directa amb el diagnòstic, l'estadi, la progressió de la malaltia, el pronòstic o la resposta al tractament. Aquests patrons s'han utilitzat per identificar aquells que són diana d'activació de vies oncogèniques o aquells que estan involucrats amb gens que codifiquen per proteïnes relacionades amb el càncer.En les SMD no es coneix amb precisió el mecanisme molecular que dóna lloc al curs evolutiu de la malaltia, tot i que se sap que en les fases inicials de la malaltia predomina el procés d'apoptosis cel·lular, mentre que en la transformació leucèmica predomina una autorenovació ilimitada. Tampoc no se sap si aquesta transformació es deu a canvis a la cèl·lula mare o a canvis en l'expressió gènica de les cèl·lules madures que adquireixen característiques de cèl·lula mare.Pel que fa al Limfoma de Hodgkin és una malaltia en que les cèl·lules neoplàsiques, les cèl·lules de Hodgkin y les de Reed-Sternberg, conformen menys de l'1 % de la cel·lularitat total. Ambdues cèl·lules deriven de cèl·lules B madures que en els centres germinals haurien d'haver entrat en apoptosi després d'adquirir mutacions poc beneficioses en els IgG, però que enlloc d'això aconsgueixen escapar de l'apoptosi malignitzant-se.Recentment, els microRNAs han adquirit una gran importància en la biologia tumoral ja que s'ha observat que poden jugar un paper clau en l'iniciació i progressió tumoral, tant si actuen com a oncogèns o com a gens supressors de tumors. En malalties hematooncològiques s'ha observat la importància dels microRNAs en la caracterització de leucèmies i linfomes, on la desregulació dels quals dóna lloc a una desregulació de la supervivència i la diferenciació de les cèl·lules progenitores hematopoiètiques, mitjançant la regulació de proteïnes claus en el control del cicle celul·lular o de l'apoptosis. A més, s'ha donat molta importància als microRNAs com a eina de gran ajut a l'hora de fer el diagnòstic, sobretot en aquelles patologies on el diagnòstic no és tant evident, ja que mitjançant l'anàlisi del patró d'expressió de microRNAs es pot realitzar la classificació tumoral de forma molt més acurada que mitjançant l'anàlisi de l'expressió de RNAs missatgers.Segons aquests fonaments, considerem que els microRNAs juguen un paper essencial en l'evolució de les SMD, tant en les seves fases més inicials com durant el procés de transformació a leucèmia mieloide aguda (LMA). Per tant, l'anàlisi del patró d'expressió dels microRNAs ens permetrà entendre millor la malaltia, així com detectar aquells pacients que arriben a fer una transformació leucèmica.Per altra banda, en el Limfoma de Hodgkin l'anàlisi dels miRNAs en ganglis limfàtics dels pacients ens permetran caracteritzar millor la malaltia, tant a nivell de célula tumoral com a nivell de microambient tumoral. D'aquesta manera, l'anàlisi dels microRNAs ens permetrà entendre millor els mecanismes pel quals les cèl·lules B de les que deriva la cèl·lula de H/RS escapen de l'apoptosis malignitzant-se.Basant-nos en tot allò exposat anteriorment, a l'hora de preparar la següent Tesi Doctoral ens hem marcat els següents objectius:A) OBJECTIUS GENERALS:Analitzar en pacients afectes d'una Síndrome Mielodisplàsica i en pacients amb un limfoma de Hodgkin l'expressió de microRNAs per tal de aprofundir en el coneixement de les dues malalties.B) OBJECTIUS ESPECÍFICS:Per les SMD:1. Analitzar en pacients afectes d'una Síndrome Mielodisplàsica l'expressió de microRNAs relacionats amb la hematopoiesis en comparació amb controls sans.2. Estudiar la relació entre l'expressió de microRNAs en mèdula òsea (MO) i sang perifèrica (SP) en pacientes afectes d'una SMD.3. Relacionar l'expressió dels microRNAs amb les característiques clíniques i el seu paper com a marcadors pronòstic.4. Investigar les cèl·ules diana on aquests microRNAs estan sobreexpresats mitjançant hibridació in-situ.Pel Limfoma de Hodgkin:5. Analitzar el patró d'expressió de microRNAs en ganglis linfàtics de pacients afectes d'un LH, respecte a ganglis linfàtics normals.6. Analitzar les possibles diferències entre l'expressió de microRNAs en els diferents subtipus (esclerosi nodular, cel·lularitat mixta).7. Identificar aquells microRNAs expressats en les cèl·lules tumorals mitjançant hibridació "in situ".8. Estudiar el paper que juga el virus de l'Epstein Barr en el desenvolupament del LH mitjançant els microRNAs.

Thesis (M.Sc.). / Written for the Dept. of Microbiology and Immunology. Title from title page of PDF (viewed 2008/05/29). Includes bibliographical references.