Nas últimas décadas, a molécula HLA-G despontou como uma importante molécula imunossupressora. O fato de a molécula HLA-G estar envolvida em diversos mecanismos de imunorregulação e, considerando sua expressão em doenças inflamatórias, sugere a possibilidade de um papel dessa molécula na patogênese e no curso de doenças reumatológicas. Com base nisso, esta tese teve como objetivo avaliar a influência da molécula HLA-G, bem como das variantes genéticas do gene HLA-G na suscetibilidade e no curso de doenças reumatológicas, buscando correlacionar fatores genéticos, moleculares, clínicos e imunológicos. Neste trabalho, avaliamos a influência de variantes alélicas da região 3’ não traduzida do gene HLA-G na suscetibilidade e curso do lúpus eritematoso sistêmico (LES), na suscetibilidade à artrite reumatóide (AR) e avaliamos a expressão de HLA-G solúvel (sHLA-G) em pacientes com AR e artrite idiopática juvenil (AIJ). Observamos que o mesmo haplótipo (D/G) parece estar associado tanto à suscetibilidade ao LES quanto à AR, apontando para o gene HLA-G como um potencial fator de suscetibilidade comum às duas doenças. Em AR, observamos maiores níveis de HLA-G solúvel no líquido sinovial de pacientes fator reumatóide-negativos (FR-) em comparação com pacientes FR+, e diferentes padrões de correlação entre os níveis plasmáticos de sHLA-G e parâmetros de atividade de doença após estratificarmos os grupos de pacientes para positividade para FR e gênero. Nossas observações, portanto, colocam a molécula e o gene HLA-G como elementos diretamente envolvidos na patogênese e curso dessas doenças e encorajam estudos futuros que procurem elucidar o papel da molécula HLA-G no curso de doenças reumatológicas. / In the last decades, HLA-G has emerged as a major immunosuppressive molecule. The fact that HLA-G is involved in various mechanisms of immunoregulation and given its expression in inflammatory diseases suggests the possibility of a role of this molecule in the pathogenesis and course of rheumatic diseases. This thesis aimed to evaluate the influence of HLA-G, as well as genetic variants of the HLA-G gene in the susceptibility and course of rheumatic diseases, seeking to correlate genetic, molecular, clinical and immunological factors. We evaluated the influence of allelic variants of the HLA-G gene 3 'untranslated region (3”UTR) in susceptibility and course of systemic lupus erythematosus, in the susceptibility to rheumatoid arthritis and we have also evaluated the expression of soluble HLA-G in patients with rheumatoid arthritis (RA) and juvenile idiopathic arthritis (JIA). We noted that the same haplotype (D/G) seems to be associated with susceptibility to RA and SLE, pointing to the HLA-G gene as a potential common susceptibility factor to both diseases. In RA, we observed higher levels of soluble HLA-G (sHLA-G) in synovial fluid (SF) from rheumatoid factor negative (RF-) patients as compared to RF+ patients, and different patterns of correlation between sHLA-G plasma levels and disease activity parameters after stratifying patient groups for RF positivity and gender. Our observations, therefore, put the gene and molecule HLA-G as directly involved elements in the pathogenesis and course of these diseases and encourage future studies that seek to elucidate the role of HLA-G in the course of rheumatic diseases.

Ng, Wing Chi Linda. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2007. / Includes bibliographical references (leaves 120-142). / Abstracts in English and Chinese. / Abstract --- p.i / Acknowledgement --- p.iv / Publications --- p.v / Abbreviations --- p.vi / Table of Contents --- p.viii / List of Tables --- p.xiii / List of Figures --- p.xiv / Chapter CHAPTER 1 --- INTRODUCTION --- p.1 / Chapter 1.1 --- Stem Cells --- p.1 / Chapter 1.1.1 --- Definition of Stem Cells --- p.1 / Chapter 1.1.2 --- Different Origins of Stem Cells --- p.2 / Chapter 1.1.3 --- Challenges and Importance of Stem Cell Research --- p.5 / Chapter 1.2 --- Adult Mesenchymal Stem Cells --- p.7 / Chapter 1.2.1 --- Characteristics of Adult Mesenchymal Stem Cells --- p.7 / Chapter 1.2.2 --- Adipose Tissue as an Alternate Source of MSCs --- p.8 / Chapter 1.2.3 --- Adipose Tissue Versus Bone Marrow as a Source of MSCs --- p.10 / Chapter 1.3 --- Adipose Tissue-derived Stem Cells (ATSCs) --- p.11 / Chapter 1.3.1 --- Cell Surface Marker Characteristic of ATSCs --- p.11 / Chapter 1.3.2 --- Global Gene Expression Profile of ATSCs --- p.14 / Chapter 1.3.3 --- Immunomodulatory Effect of ATSCs --- p.15 / Chapter 1.3.4 --- Proliferation Capacity of ATSCs --- p.17 / Chapter 1.3.5 --- Multilineage Differentiation of ATSCs --- p.18 / Chapter 1.3.5.1 --- Differentiation Capability of ATSCs : Adipogenesis --- p.18 / Chapter 1.3.5.2 --- Osteogenesis --- p.19 / Chapter 1.3.5.3 --- Skeletal and Smooth Muscle Myogenesis --- p.21 / Chapter 1.3.5.4 --- Cardiomyogenesis --- p.23 / Chapter 1.3.5.5 --- Chondrogenesis --- p.24 / Chapter 1.3.5.6 --- Neurogenesis --- p.27 / Chapter 1.4 --- Signaling Pathways in Stem Cells --- p.31 / Chapter 1.4.1 --- Wnt Signaling --- p.31 / Chapter 1.4.2 --- Notch Signaling --- p.33 / Chapter 1.4.3 --- Signaling Pathway of the TGF-β Superfamily --- p.34 / Chapter 1.5 --- Pathways Controlling Chondrogenesis --- p.36 / Chapter 1.6 --- MicroRNA --- p.39 / Chapter 1.6.1 --- MicroRNA - A Novel Gene Regulator --- p.39 / Chapter 1.6.2 --- Biogenesis of MicroRNAs --- p.40 / Chapter 1.6.3 --- Post-transcriptional Repression by MicroRNAs --- p.43 / Chapter 1.6.4 --- Role of MicroRNAs in Development --- p.45 / Chapter 1.6.5 --- MicroRNAs in Stem Cell Differentiation --- p.46 / Chapter 1.6.5.1 --- MicroRNA Expression Profile in ESCs --- p.46 / Chapter 1.6.5.2 --- Lineage Differentiation --- p.47 / Chapter 1.7 --- Project Aims --- p.52 / Chapter 1.8 --- Significance of Study --- p.53 / Chapter Chapter 2 --- Materials and Methods --- p.54 / Chapter 2.1 --- Sample Collection --- p.54 / Chapter 2.2 --- Isolation and Culture of ATSCs --- p.54 / Chapter 2.3 --- Measurement of Cell Growth --- p.55 / Chapter 2.4 --- Effect of Estrogen Treatment on ATSC Proliferation --- p.55 / Chapter 2.5 --- Multilineage Differentiation of ATSCs --- p.55 / Chapter 2.5.1 --- Chondrogenic Differentiation --- p.56 / Chapter 2.5.2 --- Neural Differentiation --- p.56 / Chapter 2.6 --- Immunocytochemical Analysis of Surface Markers and Lineage Specific Markers --- p.57 / Chapter 2.7 --- Alcian Blue Staining --- p.58 / Chapter 2.8 --- RNA Extraction --- p.58 / Chapter 2.9 --- Reverse Transcription --- p.59 / Chapter 2.10 --- Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction --- p.59 / Chapter 2.11 --- Statistical Analysis of Real-time PCR Data --- p.61 / Chapter 2.12 --- MicroRNA Profiling --- p.61 / Chapter 2.12.1 --- Reverse Transcription --- p.62 / Chapter 2.12.2 --- Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction --- p.62 / Chapter 2.13 --- mRNA Target Prediction of MicroRNA --- p.63 / Chapter 2.14 --- MicroRNA Knockdown Assay --- p.63 / Chapter 2.15 --- MicroRNA Over-expression Assay --- p.64 / Chapter 2.15.1 --- Vector Amplification --- p.64 / Chapter 2.15.1.1 --- Transformation --- p.64 / Chapter 2.15.1.2 --- Purification of Plasmid DNA --- p.65 / Chapter 2.15.1.3 --- Confirmation of Construct Insertion --- p.66 / Chapter 2.15.2 --- Transfection of Plasmid and Establishment of MicroRNA Precursor Expressing Cell Lines --- p.66 / Chapter 2.16 --- Gene Expression Microarry --- p.67 / Chapter 2.16.1 --- Preparation of Amplification and Labeling Reaction --- p.67 / Chapter 2.16.2 --- Purification of the Labeled/Amplified RNA --- p.68 / Chapter 2.16.3 --- RNA Fragmentation --- p.68 / Chapter 2.16.4 --- Hybridization --- p.69 / Chapter 2.16.5 --- Array Washing and Scanning --- p.69 / Chapter 2.16.6 --- Statistical Analysis of Microarray Data --- p.69 / Chapter CHAPTER 3 --- RESULTS --- p.71 / Chapter 3.1 --- Isolation and Characterization of ATSCs --- p.71 / Chapter 3.2 --- ATSCs Exhibited Multilineage Differentiation --- p.75 / Chapter 3.2.1 --- Chondrogenic Differentiation --- p.75 / Chapter 3.2.2 --- Expression of Chondrogenic Markers --- p.76 / Chapter 3.2.3 --- Neural Differentiation --- p.80 / Chapter 3.2.4 --- Expression of Neural Markers --- p.83 / Chapter 3.3 --- Effect of Donor's Reproductive Status on the Proliferation and Differentiation Capacity of ATSCs --- p.83 / Chapter 3.3.1 --- Expression of Stem Cell Makers --- p.86 / Chapter 3.3.2 --- Cell Proliferation Assay --- p.86 / Chapter 3.3.3 --- Differentiation Capacity of ATSCs --- p.89 / Chapter 3.4 --- Effect of E2 Treatment on the Proliferation Rate of ATSCs --- p.89 / Chapter 3.5 --- MicroRNA --- p.91 / Chapter 3.5.1 --- MicroRNA Expression Profile of Undifferentiated and Chondrogenic Differentiated ATSCs --- p.91 / Chapter 3.5.2 --- Clustering Analysis Identified MicroRNAs Segregate with ATSCs --- p.91 / Chapter 3.5.3 --- Identification of Differentially Expressed MicroRNAs in Chondrogenic-induced ATSCs --- p.95 / Chapter 3.5.4 --- mRNA Target Prediction for miR-199a --- p.97 / Chapter 3.6 --- Correlating MicroRNA Expression and mRNA Levels: Clues to MicroRNA Function --- p.97 / Chapter 3.6.1 --- Effect ofmiR-199a RNAi in Phenotypic Changes of Chondrogenic-induced ATSCs --- p.97 / Chapter 3.6.2 --- Identification of Potential Target Genes by Microarray Analysis of ATSCs with miR-199a Over-expression and Knockdown --- p.102 / Chapter CHAPTER 4 --- DISCUSSION --- p.104 / Chapter CHAPTER 5 --- CONCLUSIONS --- p.115 / APPENDICES --- p.117 / REFERENCES --- p.120

Os microRNAs são pequenos RNAs, não-codificantes que funcionam como reguladores a nível pós-transcricional da expressão gênica. Nos últimos anos, novas evidências demonstram o papel importante dos microRNAs na regulação e desenvolvimento do sistema imune. Apesar da função de poucos microRNAs ser conhecida, a sua expressão alterada vêm sendo associada a patogênese de diversas doenças autoimunes, incluindo a artrite reumatóide (AR). Recentemente a expressão desregulada de uma série de microRNAs está sendo descrita em pacientes com AR, e o papel patogênico de apenas uma parte deles foi investigada em modelos animais. A artrite reumatóide é uma doença autoimune sistêmica caracterizada por um intenso processo inflamatório na sinóvia, podendo causar destruição óssea e articular. Os linfócitos T apresentam papel importante na indução, manutenção e progressão da doença. A artrite induzida por colágeno é um modelo animal amplamente utilizado por suas características fisiopatológicas muito similares à doença em humanos. A linhagem de camundongos DBA-1/J desenvolve a doença após imunização e booster com colágeno do tipo II, enquanto que a linhagem DBA-2/J se mostra refratária. Isso confere um sistema modelo de susceptibilidade/resistência à artrite, que pode ser estudado em diferentes abordagens. O objetivo do nosso estudo foi identificar o perfil transcricional e as redes de interação entre um grupo de microRNAs e seus respectivos alvos nos timócitos e linfócitos T CD3+ periféricos nos camundongos da linhagem DBA-1/J e DBA-2/J. Para a avaliação da expressão gênica, utilizou-se a tecnologia de microarrays. O uso de programas de análise e para a construção das redes foi imprescindível. Os resultados encontrados evidenciam uma expressão diferenciada de mRNAs e microRNAs em timócitos e linfócitos T CD3+ periféricos entre as duas linhagens utilizadas. Novos microRNAs foram encontrados nos diferentes estágios de desenvolvimento do linfócito T. Nas redes de interação microRNA-RNAm obtidas, genes importantes associados aos processos de sistema imune, adesão e diferenciação celular, apoptose, recombinação, ativação de linfócitos T e resposta inflamatória, foram encontrados como potenciais alvos. Além disso, em uma perspectiva clínica, baseados nos resultados obtidos em camundongo, nos encontramos a expressão do miR-505 nos linfócitos T de pacientes com AR. Nossos resultados contribuem para a melhor compreensão dos mecanismos molecular envolvidos na resistência/susceptibilidade a CIA. / MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNA molecules that modulate the expression of multiple protein-encoding genes at the post-transcriptional level. During the last several years, evidence has emerged to show their critical role for the regulation and development of immune system. Although the function of most mammalian miRNAs has yet to be determined, their aberrant expression has been associated with several autoimmune conditions, including rheumatoid arthritis (RA). Recently, the deregulated expression of a dozen miRNAs has been reported in patients with RA, and the pathogenic role of only a few of these has been investigated in experimental mouse models. RA is a systemic autoimmune disorder mainly characterized by the inflammation of synovial tissue that can lead to destruction of bone and cartilage. The role of effectors T cells in induction, maintenance and progression of the disease is now becoming better understood. Collagen-induced arthritis is an animal model widely studied due to its similarities to human disease. The DBA-1/J mouse strain develops arthritis after immunization process and booster with Type II collagen, and the DBA-2/J strain is refractory to the disease induction. This offers an useful susceptibility/resistance model-system to study RA. The aim of this study was to identify the expression profiles and interaction networks between a set of microRNAs and their mRNA targets in thymocytes and peripheral CD3+ T lymphocytes in DBA-1/J and DBA-2/J mice strain. For this purpose we used the microarray technology to evaluate the expression of the miRNAs and mRNAs as possible targets involved in this process. The use of bioinformatics software to reconstruct the networks was essential. The results show differential expression of mRNAs and miRNAs in thymocytes and peripheral CD3+ T lymphocytes between both strains. New miRNAs were found during all the stages of T cells development. The microRNA-mRNA interaction networks obtained in this study showed that important genes related to apoptose, immune system, recombination, cell adhesion and differentiation, inflammatory process and T cell activation were found as potential targets. In addition, in a clinical prospects, based on the results obtained in mice, we found the expression of the miRNA miR-505 in T cells of RA patients. Our results contribute to a better understand of the molecular mechanisms evolved in the resistance/susceptibility to CIA.

Orientador: Sonia Marli Zingaretti / Banca: Tiago Antunes Paz / Banca: Janete Apparecida Desiderio / Resumo: A cana-de-açúcar é acometida por uma doença conhecida por "escaldadura das folhas" causada pela bactéria colonizadora do xilema Xanthomonas albilineans, considerada uma das principais doenças que atingem a cultura da canade-açúcar. A sintomatologia na fase crônica se caracteriza, principalmente, pelo aparecimento de uma faixa branca ao lado da nervura central da folha, a qual evolui para clorose total causando a morte da planta. Uma vez que o patógeno pode ser transmitido de várias maneiras, o seu controle demanda altos custos. Desta maneira, o desenvolvimento de cultivares tolerantes é uma boa opção para o controle efetivo da doença. A tolerância e sensibilidade das plantas aos fatores bióticos está relacionada com a expressão de genes, e dentre estes, os miRNAs (incluindo o miR397 e o miR319) têm sido relatados como importantes reguladores em vários mecanismos de resposta das plantas. O objetivo deste trabalho foi analisar a expressão de dois miRNAs (miR319 e miR397) em duas cultivares de cana-de-açúcar (RB86-7515 - tolerante e SP78-4467 - suscetível), infectadas por uma linhagem de X. albilineans (IACXa11), considerada a mais virulenta do Brasil. Para isto, as plantas foram cultivadas em vasos, inoculadas com X. albilineans e mantidas em casa de vegetação. Amostras de folhas e colmos foram coletadas em cinco períodos (24, 72, 144, 360 e 720 h) e a expressão dos miRNAs foi analisada pela técnica de Stem-loop RT-qPCR. Os miR397 e miR319 apresentaram-se diferencialmente expre... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Sugarcane is affected by a disease known as "leaf scald" caused by the bacterium Xanthomonas albilineans, which colonizes the xylem. This disease is one of the most important for sugarcane culture. The chronic phase is mainly characterized by the white band emergence along the central leaf vein, which causes total chlorosis of the leaf and plant death. Since the pathogen can be transmitted in many ways, his control demands high costs, and the development of tolerant cultivars is a good option for disease control. The plant tolerance and sensitivity to biotic factors is related to gene expression, and among these, the miRNAs (including miR397 and miR319), have been reported as important regulators in various plant response mechanisms. The aim of this work was to analyze the expression of two miRNAs (miR319 and miR397) in two sugarcane cultivars (RB86-7515 - tolerant, and SP78- 4467 - susceptible), infected by a strain of X. albilineans (IACXa11), the most virulent in Brazil. The plants were grown in vases, inoculated with X. albilineans and kept in a greenhouse. Samples of leaves and stems were collected in five periods (24, 72, 144, 360, and 720 h), and the miRNA expression was analyzed by Stem-loop RT-qPCR. The miR397 and miR319 expression were different between cultivars and tissues. In the susceptible cultivar (SP78-4467), during the first infection periods (24, 72 and 144 h), there was a late defense response when compared to the tolerant cultivar (RB86-7515). The miR319 presented the same expression profile in leaves and stems of the cultivar RB86-7515 (tolerant), suggesting that the pathogen recognition and defense mechanisms activation were modulated in both tissues. In general, miRNAs analyzes demonstrated that miR397 expression is lower when compared to miR319. The sa... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

El carcinoma infiltrante de mama constituye una entidad biológicamente heterogénea cuya subclasificación se ha establecido en base al estudio inmunohistoquímico y molecular. Sin embargo, los criterios de subclasificación todavía no están definidos para el subgrupo luminal, caracterizado por expresar receptores de estrógenos (RE) y progesterona (RP). Los luminales representan el fenotipo predominante (aproximadamente el 65% de los carcinomas infiltrantes de mama) y presentan niveles de respuesta variable a hormonoterapia (tamoxifeno) y características patológicas heterogéneas. La mayor actividad proliferativa, el nivel de positividad para receptores hormonales, la expresión de p53 o la positividad para Her-2 se han señalado como posibles factores relacionados con la respuesta a hormonoterapia y el pronóstico de estos tumores, si bien, no han permitido establecer estrategias claras de tratamiento entre los distintos subgrupos luminales. La determinación de factores moleculares que permitan identificar a las pacientes con mayor riesgo dentro del grupo luminal es de gran importancia ya que evitaría sobretratar a pacientes con tumores de buen pronóstico y pobre respuesta a quimioterapia, susceptibles de recibir únicamente tratamiento hormonal. Además, un mejor conocimiento de las vías implicadas en este grupo de cáncer de mama abriría la posibilidad de describir nuevas dianas terapéuticas. En la presente tesis doctoral se han estudiado 220 tumores de mama luminales en los que se ha evaluado la presencia de mutaciones “hotspot” en PI3KCA por genotipado con sondas de hidrólisis, y la expresión génica del ESR1, de los receptores tirosinaquinasa IGF1R y EGFR, de la quinasa citosólica c-Src y del mediador MED1 y de algunos de los microARNs relacionados con la señalización estrogénicas y más señalados por su participación en las neoplasias humanas (pri-miR-17~92, miR-21, miR-206, miR-222 y miR-Let-7a) por PCR cuantitativa a tiempo real. Se han estudiado las alteraciones de estas variables moleculares, su convivencia y su relación con las variables clínico-patológicas clásicas. Así mismo, se ha investigado el valor pronóstico de estos factores moleculares frente a la supervivencia libre de enfermedad y a la supervivencia global. Aunque la única variable capaz de discriminar entre los subtipos luminales fue el microARN Let-7a, se han observado distintas relaciones entre las variables moleculares estudiadas en función del subtipo y sobre todo ha destacado la influencia de la mutación de PI3K en estas relaciones. Nuestros resultados apuntan a que la oncogénesis de los luminales A está dirigida por la señalización estrogénica, mientras que otras vías con mayor potencial oncogénico intervienen en los luminales B, siendo responsables de su peor pronóstico. El EGFR, el miR-222 y el miR-21 podrían ser útiles marcadores pronóstico de estos tumores, si bien son necesarios más estudios sobre series más amplias de Luminales B para establecer los parámetros útiles para el seguimiento de estos pacientes.

Orientador: Ana Elizabete Silva / Banca: Cláudia Aparecida Rainho / Banca: Marília de Freitas Calmon Saiki / Resumo: Infecção persistente pela Helicobacter pylori (H. pylori) promove inflamação crônica que resulta em danos na mucosa e o consequente desenvolvimento de lesões gástricas, como a gastrite crônica. Esta bactéria e seus fatores de virulência vacA e cagA influenciam na resposta imune do hospedeiro, desregulando a expressão de mediadores inflamatórios e microRNAs (miRNAs), assim ativando vias relacionadas ao processo carcinogênico. Portanto, a erradicação da H. pylori pode ter um papel importante para reverter lesões precursoras, prevenindo a transformação maligna. O presente estudo avaliou a influência da terapia de erradicação da bactéria na expressão do RNAm e da proteína de mediadores inflamatórios (TNFA, IL6, IL1B, IL12A, IL2 e TGFBRII) e de miRNAs (hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-181c-5p, hsa-miR-370-3p, hsa-miR-375 e miR-223-3p) em pacientes com gastrite crônica H. pylori positivos (Hp+), em comparação com pacientes com gastrite não infectados (Hp-). Também avaliou a relação entre os níveis de expressão dos miRNAs e os dos RNAm e proteínas e a participação em redes de interação, assim como a influência dos fatores de virulência bacteriano cagA e vacA sobre estes mediadores. A quantificação relativa (RQ) do RNAm e dos miRNAs foi realizada por PCR quantitativa em tempo real (qPCR) usando ensaio TaqMan® em 20 pacientes Hp- e 31 Hp+, os quais foram também avaliados três meses após o tratamento de erradicação da bactéria. A genotipagem de cagA e vacA foi realizada pela técnica de PCR, enquanto que a expressão protéica foi avaliada por imuno-histoquímica. Pacientes Hp+ apresentaram níveis aumentados do RNAm de TNFA, IL6, IL1B e IL12A, enquanto que IL2 e TGFBRII bem como os miRNAs miR-103, miR-181c, miR-370 e miR- 375 mostraram expressão reduzida. Após o tratamento, o RNAm de TNFA e IL6 apresentouse significantemente reduzido e de TGFBRII aumentado em pacientes... / Abstract: Persistent infection by Helicobacter pylori (H. pylori) promotes chronic inflammation resulting in damage to the mucosa and the consequent development of gastric lesions as chronic gastritis. This bacterium and its virulence factors vacA and cagA influence the host immune response, deregulating the expression of inflammatory mediators and microRNAs (miRNAs), and activate pathways related to carcinogenic process. Thus, H. pylori eradication may have a key role to reverse precursor lesions, preventing malignant transformation. In the present study evaluated whether the eradication therapy of bacterium influences the mRNA and protein expression of inflammatory mediators (TNFA, IL6, IL1B, IL12A, IL2 and TGFBRII) and miRNAs (hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-181c-5p, hsa-miR-370-3p, hsa-miR-375 and miR-223-3p) in H. pylori-positive chronic gastritis patients (Hp+) and compared with non-infected gastritis patients (Hp-). We also evaluated the relationship between the expression levels of miRNAs with of mRNA and protein and participation in interaction networks, as well as the influence of bacterial virulence factors cagA and vacA on these mediators. Relative quantification (RQ) of mRNA and miRNAs was performed by qPCR-real time using TaqMan® assay in 20 patients Hp- and 31 Hp+, which were also evaluated three months after eradication treatment of the bacterium. Genotyping of cagA and vacA was performed by PCR, while the protein expression was assessed by immunohistochemistry. Hp+ patients showed increased mRNA levels for TNFA, IL6, IL1B and IL12A, while for IL2 and TGFBRII as well as for the miRNAs miR-103, miR-181c, miR-370 and miR-375 it were decreased. After treatment, only TNFA and IL6 mRNA were significantly reduced and TGFBRII increased in eradicated patients (p<0.05). On the other hand, all miRNAs, except to miR-223, were significantly increased after bacterium eradication (p<0.05). In general, the... / Mestre

Orientadora: Claudia Regina Bonini-Domingos / Banca: Ana Cristina Silva Pinto / Banca: Maria Stella Figueiredo / Banca: Flávia Cristina Rodrigues Lisoni / Banca: Marília de Freitas Calmon / Resumo: Níveis elevados de Hb F na vida adulta podem apresentar efeitos benéficos para indivíduos com anemia falciforme e talassemia beta. Dentre os elementos genéticos que atuam na regulação da expressão da Hb F são conhecidos os fatores de transcrição e os microRNAs. Os objetivos do trabalho foram rastrear, por footprinting filogenético, fatores de transcrição que apresentam sítios de ligação nas regiões não-codificantes dos genes da γ-globina, e microRNAs candidatos à regulação desses genes, além de avaliar a expressão desses microRNAs selecionados in silico em diferentes grupos de indivíduos com perfis distintos de expressão de Hb F. As análises in silico para o rastreamento dos fatores de transcrição foram realizadas comparando as sequências dos genes HBG1 e HBG2 de espécies de primatas do Velho e do Novo Mundo com as sequências da espécie Homo sapiens. O rastreamento in silico dos microRNAs preditos à regulação dos genes da γ-globina foi realizado a partir da utilização de bancos de dados públicos de microRNA. Para as análises de expressão dos microRNAs selecionados foram analisadas 38 amostras de sangue periférico, divididas em cinco grupos de estudo: grupo controle, anemia falciforme em uso ou não de hidroxiureia (HU), e talassemia beta na presença e ausência do alelo β0. Todas as amostras foram submetidas aos testes clássicos de diagnóstico de hemoglobinopatias, quantificação das frações de globinas por cromatografia e análise molecular para a genotipagem dos indivíduos com anemia falciforme (PCR-RFLP) e talassemia beta (PCR-AE e sequenciamento genômico), além da caracterização dos haplótipos βS e β-Tal (PCR-RFLP). Os reticulócitos foram isolados a partir do sangue total e submetidos à extração de microRNA. As análises de expressão dos microRNAs foram realizadas por PCR em tempo real (RT-PCR e q-PCR). As análises in silico apontaram... / Abstract: High levels of Hb F in adulthood may have beneficial effects for sickle cell anemia and beta-thalassemia. Some of the genetic elements that act in the regulation of Hb F expression are transcription factors and microRNAs. The aim of this study was to use phylogenetic footprinting to screen transcription factors that have binding sites in the γ-globin genes' noncoding regions, and miRNAs candidates to modulating Hb F levels, also evaluating the expression of microRNAs selected from in silico analyses in different groups with distinct profiles of Hb F expression. In silico analysis to screening of transcription factors were performed using bioinformatics tool VISTA, comparing the sequences of HBG1 and HBG2 genes in species of the Old and New World primates with the Homo sapiens sequences. The screening of predicted microRNAs to regulation of γ-globin genes was performed using public databases of microRNA. For the expression analyses of the selected microRNAs, we analized thirty-eight peripheral blood samples, divided into five groups: control group, sickle cell anemia using or not hydroxyurea (HU), and beta-thalassemia with and without allele β0. All samples were tested to hemoglobinopathies by classical diagnostic tests, quantification of globin fractions by chromatography and molecular analyses for genotyping of sickle cell anemia (PCR-RFLP) and beta-thalassemia (PCR-AE and genomic sequencing), and the characterization of haplotypes βS and β-Tal (PCR-RFLP). The reticulocytes were isolated from whole blood and submitted to microRNAs extraction. The analyses of the microRNAs expression were performed by real-time PCR (RT-PCR and qPCR). In silico analyses showed 13 transcription factors conserved between the analyzed species, which have binding sites in non-coding regions of both γ-globin genes, involved in regulating of the Hb F expression: BP1, CDC5, c-MYB, COUPTFII, CP2, GATA-1, GATA-2, NF-E2... / Doutor

Orientador: Ana Elizabete Silva / Coorientador: David J. Hughes / Banca: Marcelo Lima Ribeiro / Banca: Rui Manuel Vieira Reis / Banca: Débora Aparecida Pires de Campos Zuccari / Banca: Marilia De Freitas Calmon Saiki / Resumo: O câncer colorretal (CCR) está associado à patógenos como Fusobacterium nucleatum (Fn), que podem proporcionar um microambiente favorável para a tumorigênese em decorrência de alterações inflamatórias. Visando compreender o efeito de Fn no microambiente de lesões intestinais, avaliou-se a quantificação relativa (RQ) dessa bactéria em amostras de tecido de adenoma colorretal (ACR) e CCR, bem como sua correlação com a expressão de RNAm de mediadores inflamatórios (TLR2, TLR4, NFKB1, TNF, IL1B, IL6 e IL8) e de microRNAs (miRNAs) (miR-21-3p, miR-22-3p, miR-28-5p, miR-34a-5p e miR-135b-5p) envolvidos na resposta inflamatória e carcinogênese. Também delineou-se uma rede de interação miRNA:RNAm para auxiliar na compreensão da participação dos miRNAs no processo carcinogênico. Foram extraídos o DNA e o RNA de 27 amostras de tecido fresco de ACR e 43 de CCR e suas respectivas normais adjacentes. Os níveis de DNA de Fn e de RNAm dos mediadores inflamatórios e miRNAs foram quantificados por PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Níveis elevados de Fn foram detectados em ACR (RQ=5,64) e mais acentuadamente em CCR (RQ=8,67). Observou-se expressão elevada do RNAm de TLR4, IL1B, IL8 e miR-135b em ACR, e de TLR2, IL1B, IL6, IL8, miR-34a e miR-135b em CCR em comparação com seus respectivos tecidos normais. Além disso, miR-22 e miR-28 foram encontrados com expressão reduzida em CCR. A expressão de RNAm de IL1B, IL6, IL8 e miR-22 foi positivamente correlacionada com a quantificação de Fn em CCR... / Abstract: Colorectal cancer (CRC) is associated with pathogens such as Fusobacterium nucleatum (Fn), which can provide a favorable microenvironment for tumorigenesis due to inflammatory changes. In order to understand the effect of Fn on the microenvironment of intestinal lesions, the relative quantification (RQ) of this bacterium was evaluated in samples of colorectal adenoma tissue (CRA) and CCR, as well as its correlation with the mRNA expression of inflammatory mediators (TLR2, TLR4, NFKB1, TNF, IL1B, IL6 e IL8), and microRNAs (miR-21-3p, miR-22-3p, miR-28-5p, miR-34a-5p e miR-135b-5p) involved in the inflammatory response and carcinogenesis. A miRNA: mRNA interaction network was also delineated to aid in the understanding of miRNA participation in the carcinogenic process. DNA and RNA were extracted from 27 fresh tissue samples of CRA and 43 of CRC and their respective adjacent normal ones. Fn and mRNA levels of the inflammatory mediators and miRNAs were quantified by quantitative real-time PCR (qPCR). Elevated levels of Fn were detected in CRA (RQ=5.64 and more markedly in CRC (RQ=8.67). High mRNA expression of TLR4, IL1B, IL8 and miR-135b in CRA, and of TLR2, IL1B, IL6, IL8, miR-34a and miR-135b in CRC were observed in comparison with their respective normal tissues. In addition, miR-22 and miR-28 were found downregulated in CRC. The mRNA expression of IL1B, IL6, IL8 and miR-22 was positively correlated with the quantification of Fn in CRC. The mRNA expression of miR-135b and ... / Doutor

Orientador: Agnes Cristina Fett-Conte / Banca: Ana Elizabeth Silva / Banca: Paula Rahal / Banca: Ana Luiza Bossolani Martins / Banca: Flávio Naoum / Resumo: Síndromes Mielodisplásicas (SMDs) é a denominação de um grupo de doenças neoplásicas clonais das células hematopoéticas, mais frequentemente observadas em idosos, caracterizadas por citopenias, displasia, hematopoese ineficaz e risco elevado para leucemia mielóide aguda (LMA). Citopenia(s) persistente(s), por mais de seis meses, e ausência de critérios diagnósticos para SMD, caracteriza a Citopenia Idiopática de Significado Indeterminado (ICUS). ICUS foi definida recentemente e é pouco conhecida quanto aos fatores etiológicos. Já as SMDs são consideradas protótipos de doenças epigenéticas, uma vez que distúrbios na metilação de alguns genes que regulam proliferação e diferenciação celular têm sido considerados fatores causais. O gene SOX17, por exemplo, é um supressor de tumor expresso em vários tecidos e alterações no seu padrão de metilação já foram observadas em tumores sólidos e neoplasias hematológicas, entretanto, foram pouco estudadas nas SMDs e não há descrições de estudos em ICUS. Do mesmo modo, alguns microRNAs vem sendo utilizados como marcadores moleculares para diagnóstico e prognóstico para diversas anormalidades hematológicas, mas seu papel na etiologia e desenvolvimento das SMDs também é pouco conhecido. Neste contexto, este estudo propos investigar o padrão de metilação do gene SOX17 por MSP-PCR em células da medula óssea (MO) de pacientes com SMD e ICUS ao diagnóstico, e analisar alterações no padrão de expressão de microRNAs por RT-PCR em células da MO de... / Abstract: Myelodysplastic syndromes (MDS) denominates a group of neoplastic diseases of the hematopoietic cells, most commonly observed in elderly patients, characterized by cytopenias, dysplasia, ineffective hematopoiesis and high risk of acute myeloid leukemia (AML). Persistent cytopenia (s), for more than six months, and absence of diagnostic criteria for MDS, characterizes Idiopathic Cytopenia of Undetermined Significance (ICUS). ICUS has been recently defined, and little is known about its etiological factors. The MDSs are considered as prototypes of epigenetic diseases, due to the fact that methylation disorders of some genes that regulate cell proliferation and differentiation have been considered as causal factors. The SOX17 gene, for example, is a tumor suppressor expressed in several tissues and changes in its methylation pattern have already been observed in solid tumors and hematological malignancy, however, these changes have been little studied in MDS and there are no descriptions of studies in ICUS. Similarly, some microRNAs are being used as molecular markers for diagnosis and prognosis for various hematological abnormalities, but its role in the etiology and development of MDS is also poorly understood. In this context, this study aimed to investigate the methylation pattern of the SOX17 gene by MSP-PCR in bone marrow (BM) cells of patients diagnosed with MDS and ICUS, and to analyze changes in the expression pattern of microRNAs by RT-PCR in cells of BM for adults and ... / Doutor

Orientador: Karen Cristiane Martinez de Moraes / Banca: Camila Andrea de Oliveira / Banca: Dânia Elisa Christofoletti Mazzeo Morales / Resumo: O carcinoma hepatocelular (CHC) ocupa o 5º lugar entre os cânceres mais comum no mundo. No geral, cânceres apresentam alto risco de recorrência na forma de doença metastática. A identificação e caracterização funcional de genes associados à invasão e metástase é crucial para o desenvolvimento de novas terapias orientada contra esse processo. A proteína celular associada a migração e angiogênese (AAMP), está amplamente distribuída em muitos tipos de células com potencial migratório. Associado a isso, vários estudos apontam o papel crucial do metabolismo lipídico na iniciação das metástases. Estudos demonstram que os microRNAs (miRNAs) têm um papel central no controle das funções básicas das células. Um miRNA de grande interesse para este trabalho é o miRNA-149-3p. Em trabalhos realizados anteriormente pelo grupo de pesquisa, foi demonstrado que em células tumorais pulmonares (A549) esse miRNA foi apontado como um elemento de destaque no controle dos processos celulares de migração, pelo controle da proteína celular associada a migração e angiogênese (AAMP). Tendo em vista as doenças hepáticas, cabe avaliar os efeitos do miRNA-149-3p, considerando a existência de alvos putativos a esse miRNA, que se correlacionam diretamente com o metabolismo energético, buscando analisar pontos da via onde ocorre modulação ocasionada por este miRNA. Para as análises optou-se por trabalhar com as células SK-HEP-1 (linhagem metastática) e HEP-G2 (linhagem metabolizadora). Segundo as análises, de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Hepatocellular carcinoma (CHC) ranks 5th among the most common cancers in the world. In general, cancers are at high risk of recurrence in the form of metastatic disease. The identification and functional characterization of genes associated with invasion and metastasis is crucial for the development of new therapies targeted against this process. Cellular protein associated with migration and angiogenesis (AAMP), is widely distributed in many cell types with migratory potential. Associated with this, several studies point to the crucial role of lipid metabolism in the initiation of metastases. Studies have shown that microRNAs (miRNAs) play a central role in the control of basic cell functions. A miRNA of great interest for this work is miRNA-149-3p. In previous studies by the research group, it was demonstrated that in lung tumor cells (A549) this miRNA was indicated as a prominent element in the control of cellular migration processes, by the cellular protein control associated with migration and angiogenesis (AAMP). Considering the hepatic diseases, the effects of miRNA-149-3p can be evaluated, considering the existence of putative targets for this miRNA, which correlate directly with the energetic metabolism, seeking to analyze points of the pathway where the miRNA modulation occurs. For the analyzes we opted to work with the SK-HEP-1 (metastatic line) and HEP-G2 (metabolizing line) cells. According to the analyzes, it has been shown that for both SK-HEP-1 and HEP-G2 the... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre