Les microARN sont des petits ARN non codants d’une vingtaine de nucléotides qui ont pour fonction de réguler l’expression des gènes en se fixant sur l’extrémité 3’UTR d’ARNm cibles, permettant ainsi leur dégradation ou l’arrêt de leur traduction en protéines. A ce jour, de nombreuses études ont montré l’implication des microARN dans divers processus physiologiques ou pathologiques ; leur rôle dans la réponse de l’organisme aux substances toxiques environnementales commence à être évoqué.La FPI appartient au groupe des pneumopthies interstitielles diffuses idiopathique dont elle est la forme la plus fréquente. Elle se caractérise par la présence de foyers de prolifération de fibroblastes/myofibroblastes responsables d’une production excessive de matrice extracellulaire, une destruction progressive et irréversible de l’architecture pulmonaire entrainant la perte de la fonction respiratoire. L’agression répétée de l’épithélium respiratoire par des composés chimiques environnementaux (ou xénobiotiques) est fortement suspectée dans le déclenchement de la FPI.Le premier objectif de mes travaux de recherche a été d’identifier des microARN susceptibles d’intervenir dans la pathogenèse de la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) et de préciser la (les) fonction(s) de ces microARN d’intérêt. Pour atteindre cet objectif, nous avons étudié deux microARN, le miR-199a-5p et le miR-214-3p qui présentaient la particularité d’être significativement surexprimés dans les poumons de souris souffrant de fibrose pulmonaire. L’analyse systématique des profils d’expression des gènes de fibroblastes surexprimant le miR-199a-5p et le miR-214-3p nous a permis d’identifier un grand nombre de gènes qui étaient significativement modulés par ces deux microARN. Nous avons pu établir l’implication respective du miR-199a-5p et du miR-214-3p dans la régulation de la voie profibrotique TGFβ et dans l’apoptose des fibroblastes pulmonaires médiée par le Fas-ligand. L’ensemble de nos résultats nous permet de suggérer l’utilisation de molécules ciblées contre ces 2 microARN dans le traitement de la FPI.Le second objectif de mes travaux de recherche a été d’identifier le modèle cellulaire in vitro le plus proche du tissu pulmonaire afin d’étudier l’impact des composés toxiques environnementaux sur la pathogenèse des maladies respiratoires et, en particulier, de la FPI. Pour cela, nous avons comparé les profils d’expression génique de l’ensemble des protéines impliquées dans le métabolisme et l’éliminations des xénobiotiques, de 10 lignées cellulaires et de 4 cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques humaines, à ceux précédemment observés par notre équipe dans les tissus broncho-pulmonaires humains. L’exposition du modèle cellulaire le plus pertinent à des polluants atmosphériques permettra d’identifier les microARN associés à la toxicité pulmonaire de ces composés chimiques et de vérifier si ces microARN régulent des voies de signalisations communes à celles impliquées dans la pathogenèse de la FPI. / MicroRNAs are small non-coding RNAs with about 20 nucleotides that regulate gene expression by binding to the 3' UTR end of target mRNAs, thus allowing their degradation or stopping their translation into proteins. To date, many studies have shown the involvement of microRNAs in various physiological or pathological processes; their role in the body's response to environmental toxic substances is beginning to be mentioned. It is characterized by the presence of fibroblast/myofibroblast proliferation foci responsible for excessive extracellular matrix production, progressive and irreversible destruction of lung architecture leading to loss of respiratory function. The repeated aggression of the respiratory epithelium by environmental (or xenobiotic) chemicals is strongly suspected in the initiation of IVF. The first objective of my research was to identify microRNAs that may be involved in the pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis (IVF) and to specify the function(s) of these microRNAs of interest. To achieve this objective, we studied two microRNAs, miR-199a-5p and miR-214-3p, which had the particularity of being significantly overexpressed in the lungs of mice with pulmonary fibrosis. Systematic analysis of the expression profiles of fibroblast genes overexpressing miR-199a-5p and miR-214-3p allowed us to identify a large number of genes that were significantly modulated by these two microRNAs. We were able to establish the respective involvement of miR-199a-5p and miR-214-3p in the regulation of the profibrotic pathway TGFβ and in Fas-ligand mediated apoptosis of pulmonary fibroblasts. The second objective of my research was to identify the in vitro cellular model closest to lung tissue in order to study the impact of environmental toxic compounds on the pathogenesis of respiratory diseases and, in particular, of IVF. To do this, we compared the gene expression profiles of all proteins involved in the metabolism and elimination of xenobiotics, 10 cell lines and 4 primary cultures of human bronchial epithelial cells, with those previously observed by our team in human bronchopulmonary tissues. Exposure of the most relevant cellular model to air pollutants will identify the microRNAs associated with the pulmonary toxicity of these chemical compounds and verify whether these microRNAs regulate signaling pathways common to those involved in the pathogenesis of IVF.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introdução: O linfoma difuso de grandes celulas B do idoso Epstein-Barr positivo (EBV+DLBCLe) afeta individuos com mais de 50 anos sem imunodefiCiência previa documentada, e apresenta evolucao clinica desfavoravel. Atualmente nao existe um padrao caracteristico da expressao de microRNAs (miRNAs) nesta doenca. Portanto, este estudo tem por objetivo caracterizar um perfil de assinatura para esta nova entidade e explorar miRNAs como biomarcadores e potenciais alvos terapeuticos alternativos para EBV+DLBCLe. Metodos: Setenta e um pacientes com mais de 50 anos e diagnostico de LDGCB foram considerados potenciais candidatos a serem EBV+DLBCLe. A deteccao do EBV (EBER-1) foi realizada por hibridacao in situ. Quatro amostras EBV+ e quatro amostras EBV negativas foram analisadas atraves de PCR quantitativo em tempo real (qPCR). O RNA foi extraido a partir de blocos de parafina e o cDNA inserido em duas plataformas contendo, cada uma, 384 miRNAs humanos. Consideramos miRNAs diferencialmente expressos aqueles que apresentaram expressao com valor acima ou abaixo de 1,5. Resultados: 8,5% dos pacientes com LDGCB foram considerados EBV positivos. A sobrevida global dos pacientes com EBV+DLBCLe foi inferior a dos pacientes EBV negativos (p= 0,0201, teste Log-rank). Foram encontrados 10 miRNAs diferencialmente expressos entre os dois grupos, mas apenas sete alcancaram diferencas estatisticamente significantes a serem validadas em uma coorte multicentrica (29 EBV + DLBCLe versus 65 LDGCB). Confirmamos o aumento de expressao de hsa-miR-126, hsa-miR-146a, hsa-miR-146b, hsa-miR-150 e hsa-miR-222, e tambem a diminuicao de expressao de hsa-miR-151 nos casos EBV+DLBCLe quando casos EBV+ foram comparados com EBV negativos. Utilizando o cutoff de 1,5, o hsa-miR-146b mostrou especificidade de 91,4 %, para identificar os casos EBV+, AUC = 0,8849. Embora o hsa-miR-222 tenha presentado aumento de expressao em menos de 1/3 dos casos, tambem mostrou alta especificidade (98,5%) e valor preditivo positivo (90%), AUC = 0,8180, no grupo EBV + quando comparado com o grupo EBV negativo, com o mesmo cutoff. Conclusoes: O merito do presente estudo foi propor uma assinatura de miRNA para uma doenca recentemente descrita e destacar o hsa-miR-146b e hsa-miR-222 como possiveis biomarcadores e alvos terapeuticos para EBV+DLBCLe. Antagomirs para hsa-miR-146b e hsa-miR-222 (este ultimo em teste em alguns tipos de cancer) tambem poderiam ser utilizados como terapia adjuvante ao R-CHOP nos casos de EBV+DLBCLe, nos quais confirmamos pior prognostico / FAPESP: 2010/17668-6 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-25 / A epigenética estuda mecanismos reguladores da atividade e herança gênica que independem de modificações na seqüência de nucleotídeos do DNA. Os principais eventos epigenéticos são: metilação do DNA e modificações pós traducionais em histonas. miRNAs correspondem a moléculas de RNAs bem pequenas que se associam a mRNA alvos promovendo a desestabilização ou degradação dos mesmos. É estimado que mais de 30% de todos os mRNAs sejam regulados por miRNAs. Desta forma, os miRNAs representam componentes essenciais em diversos processos biológicos, tais como proliferação celular, apoptose e resposta ao estresse. Tanto alterações nos mecanismos epigenéticos quanto modificações no perfil de expressão de miRNAs pode modificar a expressão dos componentes do ciclo celular. Alguns estudos sugerem que o câncer é uma doença do ciclo celular. Neste contexto, o objetivo do presente estudo foi determinar a contribuição dos componentes do ciclo celular na gênese do melanoma e seus possíveis reguladores. Para tal, foi utilizado um modelo murino de gênese do melanoma, no qual várias linhagens celulares foram obtidas após submeter melanócitos melan-a a ciclos sequenciais de bloqueio de ancoragem. Alterações significativas foram identificadas na expressão dos componentes do ciclo celular, p53, p21, ciclina D1 e Cdk4 durante o processo de transformação maligna dos melanócitos. Foi verificada perda da expressão da p53 ao mesmo tempo em que foi observado aumento na expressão de p21 na linhagem de melanoma agressivo. Observaram-se também alterações na expressão de Dnmt1 durante a gênese do melanoma. Ensaios de imunoprecipitação de proteínas mostraram que p53 interage com Dnmt1 somente nos melanócitos melan-a. Vinte e cinco miRNAs foram encontrados diferencialmente expressos ao longo do processo de transformação de melanócitos e os miRNAs 138, 340 5p, 678 e 330 foram reconhecidos como possíveis reguladores de p53, ciclina D1 e Cdk4 e p21, respectivamente. Estes dados sugerem a contribuição da maquinaria epigenética e dos miRNAs na regulação do ciclo celular e demonstram a importância do equilíbrio destas vias para manutenção do um fenótipo celular. Alterações nos componentes do ciclo celular estão envolvidas com transformação maligna de melanócitos melan-a e os eventos epigenética podem contribuir com estas alterações. Os alvos terapêuticos que visam os componentes da maquinaria epigenética podem representar úteis intervenções contra o câncer. Além disso, a proteína p53 interage com um dos principais componentes das máquinas epigenética, Dnmt1, indicando que p53 pode regular essa enzima e contribuir para a manutenção do padrão de metilação do DNA. Os miRNAs identificados também representam moléculas envolvidas na gênese do melanoma e, por isso, são fortes candidatos no desenvolvimento de novas terapias. / Epigenetic studies regulatory mechanisms of the activity and inheritance in gene expression that is independent of modifications in the nucleotide sequence. The main epigenetic events are: DNA methylation and histone pos-translational modifications. miRNAs are non-coding RNAs that bind to mRNA targets and disturb their stability and/or translation, thus acting in the post-transcriptional regulation. It is estimated that over 30% of mRNAs are regulated by miRNAs and therefore these molecules are considered essential in the processing of many biological responses, such as cell proliferation, apoptosis and stress responsiveness. Changes in the epigenetic machinery like modifications in miRNA expression profile can modify the expression of cell cycle components. Some studies suggest that cancer is also a disease of cell cycle. In this regard the aim of the present study was identify the contribution of cell cycle components in melanoma genesis and their possible regulators. For that it was used a murine model of melanoma genesis in which several cell lineages were obtained after submitting melan-a melanocytes to sequential cycles of anchorage blockade. Significant alterations were identified in expression of the cell cycle components, p53, p21, cyclin D1 and cdk4 along melanocyte malignant transformation. It was observed loss of p53 expression in the same time that was observed an increase in expression of p21 in the aggressive melanoma lineages. It was also observed alterations in the expression of dnmt1 during the genesis of melanoma. Protein immunoprecipitation assays showed that p53 interact with dnmt1 only in melan-a melanocytes. Twenty five miRNAs were found differentially expressed along the process of malignant transformation and the miRNAs 138, 340-5p, 678 and 330 were recognized as possible regulators of p53, cyclin D1, Cdk4 and p21, respectively. These data show the contribution of epigenetic and miRNA machinery in the regulation of cell cycle and the importance of the equilibrium of these pathways in maintenance of cell phenotype. Cell cycle components imbalance are involved in malignant transformation of melan-a melanocytes and epigenetic machinery might contribute to these alterations. The therapeutic targets that focus on epigenetic machinery could be useful interventions against cancer. Besides that, the p53 protein interacts with one of the major components of the epigenetic machinery, dnmt1. This indicates that the components of cell cycle may regulate this enzyme and contribute for the maintenance of DNA methylation pattern. The miRNAs identified also represent strong candidates in the contribution of melanoma genesis. They may be useful as therapeutic targets on interventions against cancer. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

A hipertrofia cardíaca é uma adaptação do coração frente a estímulos de crescimento, sejam eles patológicos e irreversíveis como a sobrecarga de pressão ou de volume, ou fisiológicos e reversíveis como a gravidez e o exercício físico. A hipertrofia derivada de estímulos patológicos é conhecida como mal adaptativa enquanto que a hipertrofia proveniente de estímulos ditos fisiológicos é conhecida como benéfica ou adaptativa. Embora ambas hipertrofias tenham fatores em comum no que diz respeito ao crescimento do cardiomiócito e adaptações moleculares, elas acabam divergindo para desfechos completamente diferentes. A hipertrofia patológica evolui para um quadro de disfunção cardíaca ao passo que a hipertrofia fisiológica não acarreta nenhum dano funcional ao miocárdio. Essa linha tênue entre um fenótipo e outro envolve mecanismos celulares complexos que ainda precisam ser esclarecidos. Dentro deste cenário, os microRNAs aparecem como reguladores de diversos processos celulares, e têm sido associados ao crescimento miocárdico. Portanto, nosso objetivo foi comparar o padrão de expressão de microRNAs entre os modelos de hipertrofia fisiológica, induzido por natação (SWIM), e o modelo de hipertrofia patológica, induzida por bandeamento aórtico transtorácico (TAC). As análises foram realizadas após 28 dias para o modelo de natação, e 35 dias para o modelo de TAC. A comparação foi realizada através da técnica de microarranjo de microRNAs (Affymetrix). Interessantemente, apenas 20 microRNAs apresentaram níveis de expressão distinta entre os dois modelos de hipertrofia. Destes, 12 microRNAs apresentaram aumento de expressão (miR-193a-3p, miR-299a-5p, miR- 127-5p, miR-214-5p, miR-188-5p, miR-326-3p, miR-6395, miR-547-3p, miR-199a-5p, miR-381-3p, miR-223-3p e miR-199b-5p) e 8 estavam com seus níveis diminuídos (miR11 708-5p, miR-30c-1-3p, miR-22-5p, miR-6921-5p, miR-30a-3p, miR-30e-3p, miR-27a-5p and miR-6975-5p) no grupo TAC em relação ao grupo SWIM. Além disso, apenas 3 microRNAs, miR-21a-5p, miR-206-3p e miR-1983, apresentaram aumento de expressão tanto no grupo TAC quanto no grupo SWIM em comparação aos grupos SHAM e Sedentário, respectivamente. Após isso, foi realizada uma busca por possíveis alvos destes microRNAs na base de dados KEGG Pathway que identificou 4 rotas enriquecidas (665 genes) entre os alvos dos microRNAs reduzidos, e 80 rotas (3394 genes) fortemente associadas aos microRNAs que estavam aumentados no grupo TAC comparado ao SWIM. Conclui-se que existem microRNAs específicos para o desenvolvimento da hipertrofia cardíaca fisiológica, bem como patológica conforme os dados obtidos na análise de microarranjo. Além disso, os possíveis alvos destes microRNAs parecem estar envolvidos em rotas bastante envolvidas no crescimento celular, sobrevivência e adaptação cardíaca. / Cardiac hypertrophy is a heart adaptation in response to growth stimuli whether pathological and irreversible such as pressure overload or physiological and reversible as pregnancy and exercise. Hypertrophy because of pathological stimuli is known as mal adaptive while the one that comes from physiological triggers is known as beneficial or adaptive. Although both have similarities about cardiomyocyte growth and molecular adaptations, they diverge to distinct outcomes. The pathological hypertrophy evolves to a pattern of cardiac dysfunction while the physiological one does not cause any damage to the heart. This tenuous line between those phenotypes involves complex cellular mechanisms that need to be clarified. In this context, microRNAs are considered as regulators of many biological processes, and have been associated to myocardial growth. Therefore, our aim was to compare microRNA expression between physiological (swiminduced) and pathological (TAC-induced) hypertrophy. The analysis was performed after 28 days for SWIM protocol and 35 days for TAC model. The comparison was done using microRNA microarray technology (Affymetrix). Interestingly, only 20 microRNAs were differential expressed between both models. Out of those, 12 were up regulated (miR- 193a-3p, miR-299a-5p, miR-127-5p, miR-214-5p, miR-188-5p, miR-326-3p, miR-6395, miR-547-3p, miR-199a-5p, miR-381-3p, miR-223-3p and miR-199b-5p) while 8 were down regulated in TAC group compared to SWIM group. Besides, only 3 microRNAs, miR-21a-5p, miR-206-3p and miR-1983, were upregulated in TAC and SWIM model compared to SHAM and SED groups. After that, a search at KEGG Pathway database retrieved 4 pathways (665 genes) enriched with targets from microRNAs downregulated and 80 pathways (3394 genes) enriched with targets from up-regulated microRNAs in in 13 TAC group compared to SWIM group. In conclusion, there are microRNAs specific committed to the physiological cardiac hypertrophy development as well to the pathological cardiac growth as observed in our microarray data. Furthermore, the possible targets of those microRNAs could be involved in pathways associated with cellular growth, survival and cardiac adaptation.

Submitted by Morgana Andrade (morgana.andrade@ufes.br) on 2016-04-06T19:38:36Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese_defesa_Paolla M. V. Abreu_para capa dura.pdf: 9884169 bytes, checksum: 4a899fd021d8b6129d63eb15679acdaf (MD5) / Approved for entry into archive by Patricia Barros (patricia.barros@ufes.br) on 2016-05-16T17:12:06Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese_defesa_Paolla M. V. Abreu_para capa dura.pdf: 9884169 bytes, checksum: 4a899fd021d8b6129d63eb15679acdaf (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-16T17:12:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese_defesa_Paolla M. V. Abreu_para capa dura.pdf: 9884169 bytes, checksum: 4a899fd021d8b6129d63eb15679acdaf (MD5) / CAPES / O mamoeiro (Carica papaya L.) é uma das fruteiras mais cultivadas e o mamão um dos frutos mais consumidos nas regiões tropicais e subtropicais do mundo. O Brasil é um dos maiores produtores mundiais de mamão e está dentre os principais países exportadores. As doenças, no entanto, constituem os principais fatores limitantes da produção. A meleira do mamoeiro, causada pelo Papaya meleira virus (PMeV) é uma doença importante na produção de mamão capaz de causar a perda completa da produção. Apesar disso, pouco se conhece sobre os mecanismos de interação e de resposta do mamoeiro contra o PMeV e ainda não existe no mercado cultivares resistentes a este vírus. Sabe-se que a expressão de proteínas como a subunidade 20S do proteasoma é maior durante a infecção, sugerindo que a proteólise seja um mecanismo importante de resposta de defesa. Atualmente 10.598 microRNAs de plantas estão depositados no banco de dados Plant miRNAs Database, mas somente dois, miR162 e miR403 são codificados especificamente por C. papaya. Neste estudo, sequências conhecidas de microRNAs provenientes de diferentes espécies de plantas foram utilizadas na predição in silico de microRNAs no genoma de mamoeiro. Um total de 462 microRNAs foram preditos, representando 72 famílias de miRNAs conhecidas. A expressão de 11 microRNAs, cujos alvos estão envolvidos na degradação via proteasoma 20S e 26S e em outras vias de resposta a estresse, foi comparada por qRT-PCR em amostras de folhas de plantas sadias e infectadas com PMeV. A expressão de microRNAs envolvidos na degradação de proteínas via proteasoma aumentou em resposta a um baixo acúmulo relativo de PMeV e diminuiu com o aumento do acúmulo relativo viral. Por outro lado, a expressão de microRNAs envolvidos na resposta da planta ao estresse biótico diminuiu em resposta ao baixo acúmulo relativo viral e aumentou com o aumento do acúmulo relativo de PMeV. Os genes descritos como alvos de alguns dos miRNAs tiveram sua expressão modulada de uma maneira dependente. Diante dos resultados, alguns miRNAs foram apontados como importantes para a aplicação biotecnológica. Este estudo representa uma compreensiva predição de microRNAs em mamoeiro. A expressão diferencial de microRNAs específicos e a modulação de seus genes alvos é de grande ajuda para entender a interação particular entre o mamoeiro e o PMeV, responsável pelo desenvolvimento da meleira. / Carica papaya L. is one of the most cultivated and consumed fruits in tropical and subtropical regions worldwide. Brazil is among the largest producers and exporters of papaya fruit. The pre-harvest diseases of papaya plants are the main limitation for fruit production. Papaya sticky disease is caused by the Papaya meleira virus (PMeV). It is a commercially important pathology in papaya culture potentially causing the complete loss of fruit production. Despite of this, little is known about the papaya interaction and response mechanisms against PMeV and there is not a papaya variety resistant to the virus. It is known that papaya 20S proteasome subunit levels of increase during PMeV infection, suggesting that proteolysis is an important feature of the plant defense response mechanisms. To date, 10,598 plant microRNAs have been identified in the Plant miRNAs Database (name of the DB), but only two microRNAs, miR162 and miR403, are from papaya. In this study, plant microRNA sequences were used to search for putative microRNAs in the papaya genome. A total of 462 microRNAs, representing 72 microRNA families, were predicted to occur in papaya. Out of these, the expression of 11 microRNAs, whose targets are known to be involved in 20S and 26S proteasomal degradation and in other stress response pathways, was estimated using real-time PCR, comparing healthy and infected papaya leaf tissues. The expression of miRNAs involved in proteasomal degradation increased in response to very low levels of PMeV titre and decreased as the viral titre increased. In contrast, biotic stress-related miRNAs levels decreased in papaya tissues infected with low virus titre and increased at high PMeV levels. Corroborating this results, analysed target genes for this miRNAs had their expression modulated in a dependent manner. With the results, some miRNAs were identified as relevant to the biotechnological application. This study represents a comprehensive prediction of miRNAs in papaya. The data presented here might help to complement the available molecular and genomic tools for the study of papaya. The differential expression of specific miRNAs and the modulation of their target genes will be helpful for understanding the particular interaction of PMeV and papaya responsible of disease development

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:25:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:48:47Z : No. of bitstreams: 1 000845999_20180227.pdf: 347925 bytes, checksum: 3a31aa79333a7cdbe8ce3d8722a87de9 (MD5) Bitstreams deleted on 2018-03-02T12:39:57Z: 000845999_20180227.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2018-03-02T12:40:54Z : No. of bitstreams: 1 000845999.pdf: 1832367 bytes, checksum: 99a50f0dd46526bfabff0be50a865649 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Níveis elevados de Hb F na vida adulta podem apresentar efeitos benéficos para indivíduos com anemia falciforme e talassemia beta. Dentre os elementos genéticos que atuam na regulação da expressão da Hb F são conhecidos os fatores de transcrição e os microRNAs. Os objetivos do trabalho foram rastrear, por footprinting filogenético, fatores de transcrição que apresentam sítios de ligação nas regiões não-codificantes dos genes da γ-globina, e microRNAs candidatos à regulação desses genes, além de avaliar a expressão desses microRNAs selecionados in silico em diferentes grupos de indivíduos com perfis distintos de expressão de Hb F. As análises in silico para o rastreamento dos fatores de transcrição foram realizadas comparando as sequências dos genes HBG1 e HBG2 de espécies de primatas do Velho e do Novo Mundo com as sequências da espécie Homo sapiens. O rastreamento in silico dos microRNAs preditos à regulação dos genes da γ-globina foi realizado a partir da utilização de bancos de dados públicos de microRNA. Para as análises de expressão dos microRNAs selecionados foram analisadas 38 amostras de sangue periférico, divididas em cinco grupos de estudo: grupo controle, anemia falciforme em uso ou não de hidroxiureia (HU), e talassemia beta na presença e ausência do alelo β0. Todas as amostras foram submetidas aos testes clássicos de diagnóstico de hemoglobinopatias, quantificação das frações de globinas por cromatografia e análise molecular para a genotipagem dos indivíduos com anemia falciforme (PCR-RFLP) e talassemia beta (PCR-AE e sequenciamento genômico), além da caracterização dos haplótipos βS e β-Tal (PCR-RFLP). Os reticulócitos foram isolados a partir do sangue total e submetidos à extração de microRNA. As análises de expressão dos microRNAs foram realizadas por PCR em tempo real (RT-PCR e q-PCR). As análises in silico apontaram... / High levels of Hb F in adulthood may have beneficial effects for sickle cell anemia and beta-thalassemia. Some of the genetic elements that act in the regulation of Hb F expression are transcription factors and microRNAs. The aim of this study was to use phylogenetic footprinting to screen transcription factors that have binding sites in the γ-globin genes' noncoding regions, and miRNAs candidates to modulating Hb F levels, also evaluating the expression of microRNAs selected from in silico analyses in different groups with distinct profiles of Hb F expression. In silico analysis to screening of transcription factors were performed using bioinformatics tool VISTA, comparing the sequences of HBG1 and HBG2 genes in species of the Old and New World primates with the Homo sapiens sequences. The screening of predicted microRNAs to regulation of γ-globin genes was performed using public databases of microRNA. For the expression analyses of the selected microRNAs, we analized thirty-eight peripheral blood samples, divided into five groups: control group, sickle cell anemia using or not hydroxyurea (HU), and beta-thalassemia with and without allele β0. All samples were tested to hemoglobinopathies by classical diagnostic tests, quantification of globin fractions by chromatography and molecular analyses for genotyping of sickle cell anemia (PCR-RFLP) and beta-thalassemia (PCR-AE and genomic sequencing), and the characterization of haplotypes βS and β-Tal (PCR-RFLP). The reticulocytes were isolated from whole blood and submitted to microRNAs extraction. The analyses of the microRNAs expression were performed by real-time PCR (RT-PCR and qPCR). In silico analyses showed 13 transcription factors conserved between the analyzed species, which have binding sites in non-coding regions of both γ-globin genes, involved in regulating of the Hb F expression: BP1, CDC5, c-MYB, COUPTFII, CP2, GATA-1, GATA-2, NF-E2...

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:25:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-03-15. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:46:38Z : No. of bitstreams: 1 000844048_20160312.pdf: 733130 bytes, checksum: 4c63392d725a9495e9543a2df54d0223 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-03-14T11:16:23Z: 000844048_20160312.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-03-14T11:17:05Z : No. of bitstreams: 1 000844048.pdf: 7529493 bytes, checksum: 9dd7b812bf35ed642076bb8874768278 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Infecção persistente pela Helicobacter pylori (H. pylori) promove inflamação crônica que resulta em danos na mucosa e o consequente desenvolvimento de lesões gástricas, como a gastrite crônica. Esta bactéria e seus fatores de virulência vacA e cagA influenciam na resposta imune do hospedeiro, desregulando a expressão de mediadores inflamatórios e microRNAs (miRNAs), assim ativando vias relacionadas ao processo carcinogênico. Portanto, a erradicação da H. pylori pode ter um papel importante para reverter lesões precursoras, prevenindo a transformação maligna. O presente estudo avaliou a influência da terapia de erradicação da bactéria na expressão do RNAm e da proteína de mediadores inflamatórios (TNFA, IL6, IL1B, IL12A, IL2 e TGFBRII) e de miRNAs (hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-181c-5p, hsa-miR-370-3p, hsa-miR-375 e miR-223-3p) em pacientes com gastrite crônica H. pylori positivos (Hp+), em comparação com pacientes com gastrite não infectados (Hp-). Também avaliou a relação entre os níveis de expressão dos miRNAs e os dos RNAm e proteínas e a participação em redes de interação, assim como a influência dos fatores de virulência bacteriano cagA e vacA sobre estes mediadores. A quantificação relativa (RQ) do RNAm e dos miRNAs foi realizada por PCR quantitativa em tempo real (qPCR) usando ensaio TaqMan® em 20 pacientes Hp- e 31 Hp+, os quais foram também avaliados três meses após o tratamento de erradicação da bactéria. A genotipagem de cagA e vacA foi realizada pela técnica de PCR, enquanto que a expressão protéica foi avaliada por imuno-histoquímica. Pacientes Hp+ apresentaram níveis aumentados do RNAm de TNFA, IL6, IL1B e IL12A, enquanto que IL2 e TGFBRII bem como os miRNAs miR-103, miR-181c, miR-370 e miR- 375 mostraram expressão reduzida. Após o tratamento, o RNAm de TNFA e IL6 apresentouse significantemente reduzido e de TGFBRII aumentado em pacientes... / Persistent infection by Helicobacter pylori (H. pylori) promotes chronic inflammation resulting in damage to the mucosa and the consequent development of gastric lesions as chronic gastritis. This bacterium and its virulence factors vacA and cagA influence the host immune response, deregulating the expression of inflammatory mediators and microRNAs (miRNAs), and activate pathways related to carcinogenic process. Thus, H. pylori eradication may have a key role to reverse precursor lesions, preventing malignant transformation. In the present study evaluated whether the eradication therapy of bacterium influences the mRNA and protein expression of inflammatory mediators (TNFA, IL6, IL1B, IL12A, IL2 and TGFBRII) and miRNAs (hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-181c-5p, hsa-miR-370-3p, hsa-miR-375 and miR-223-3p) in H. pylori-positive chronic gastritis patients (Hp+) and compared with non-infected gastritis patients (Hp-). We also evaluated the relationship between the expression levels of miRNAs with of mRNA and protein and participation in interaction networks, as well as the influence of bacterial virulence factors cagA and vacA on these mediators. Relative quantification (RQ) of mRNA and miRNAs was performed by qPCR-real time using TaqMan® assay in 20 patients Hp- and 31 Hp+, which were also evaluated three months after eradication treatment of the bacterium. Genotyping of cagA and vacA was performed by PCR, while the protein expression was assessed by immunohistochemistry. Hp+ patients showed increased mRNA levels for TNFA, IL6, IL1B and IL12A, while for IL2 and TGFBRII as well as for the miRNAs miR-103, miR-181c, miR-370 and miR-375 it were decreased. After treatment, only TNFA and IL6 mRNA were significantly reduced and TGFBRII increased in eradicated patients (p<0.05). On the other hand, all miRNAs, except to miR-223, were significantly increased after bacterium eradication (p<0.05). In general, the...

Orientador: Patricia Pintor dos Reis / Resumo: Introdução: O carcinoma hepatocelular (CHC) está entre as neoplasias de alta complexidade no diagnóstico, determinação do prognóstico e tratamento, sendo o sexto tipo de câncer mais comum no mundo e a segunda causa mais comum de morte por câncer. Uma variedade de genes alterados foram relatados, revelando heterogeneidade genética entre tumores de diferentes pacientes. Portanto, o insucesso terapêutico da terapia convencional pode ser parcialmente atribuído a essa heterogeneidade associada ao comportamento biológico tumoral. Sendo assim, justifica-se a necessidade de identificação de vias moleculares as quais podem conter biomarcadores clinicamente aplicáveis para a melhoria do diagnóstico e tratamento dos pacientes com CHC. Os resultados podem ter futuras aplicações clínicas utilizando miRNAs e os genes-alvo regulados por miRNAs como biomarcadores com valor diagnóstico, prognóstico e terapêutico. Objetivos: Identificar o perfil global de expressão de miRNAs (microRNoma) e os mRNAs-alvo potencialmente regulados por miRNAs em CHC. Pacientes e Métodos: Foram incluídas 18 amostras de tecido, fixadas em formalina e emblocadas em parafina (FFPE) de carcinoma hepatocelular, sendo 18 amostras tumorais e 18 amostras de tecido hepático histologicamente normal, adjacente ao tumor, dos mesmos pacientes. O perfil de expressão de miRNAs das amostras tumorais foi determinado utilizando o ensaio TaqMan Array Human MicroRAN Cards (TLDA) (card A) (Life Technologies). A análise dos dados util... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Orientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Coorientador: Francisco Javier Enguita / Banca: Daniel de Assis Santos / Banca: Nádia Rezende Barbosa Raposo / Banca: Cláudia Viana Maurer Morelli / Banca: Valéria Valente / Resumo: A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada por fungos do gênero Paracoccidioides e endêmica na América Latina. Três aspectos são de grande importância nessa doença: o desenvolvimento de antifúngicos e modelos alternativos para estudo dos mesmos e a busca de biomarcadores para o diagnóstico. O número de antifúngicos disponíveis é restrito, e problemas como efeitos adversos, interações medicamentosas e a ocorrência de isolados fúngicos resistentes são descritos. Neste contexto, a busca por novos compostos tem aumentado. Adicionalmente, modelos animais alternativos como Caenorhabditis elegans, zebrafish (Danio rerio) e Galleria mellonella são utilizados para o estudo de novos fármacos de forma simples e em grande escala. Neste trabalho, utilizou-se desses modelos para avaliação da eficácia antifúngica e toxicidade do ácido gálico e seus derivados ésteres de alquila (galatos). O composto com melhor atividade nesses modelos foi testado em camundongos. O galato de dodecila apresentou melhor eficácia e menor toxicidade no modelo C. elegans - C. albicans e menor efeito tóxico em embriões de zebrafish. Entretanto, em G. mellonella e camundongos infectados com Paracoccidioides, o composto não apresentou eficácia antifúngica, o que pode ser decorrente de sua baixa biodisponibilidade. Para resolver tal problema, os galatos foram associados a um sistema lipídico nanoestruturado. Tal associação foi benéfica, resultando em menor toxicidade em fibroblastos pulmonares e em z... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by the fungi of the genus Paracoccidioides, which is endemic in Latin America. Three aspects are of great importance in this disease: the development of new antifungals and the use of alternative models for their study and also, the search of biomarkers for diagnosis. The number of antifungal agents available is restricted, and problems such as adverse effects, drug interactions and the development of resistance are related to them. In this context, the search for new compounds has increased. In addition, alternative animal models such as Caenorhabditis elegans, zebrafish (Danio rerio) and Galleria mellonella have been used for the study of new drugs in a simple and large scale manner. In this work, these models were used to evaluate the antifungal efficacy and toxicity of gallic acid and its alkyl esters derivatives (gallates). The compound with the best activity in these models was tested in mice. Dodecyl gallate presented better efficacy and lower toxicity in the C. elegans - C. albicans model and lower toxic effect in zebrafish embryos. However, in G. mellonella and in mice infected with Paracoccidioides sp., the compound showed no antifungal efficacy, which may be explained due to its low bioavailability. To resolve such a problem, gallates were associated with a nanostructured lipid system. Such association was beneficial, resulting in lower toxicity in lung fibroblasts and zebrafish, as well as in greater efficacy in the murine model. Another aspect of this study concerns the investigation of microRNAs for PCM. MicroRNAs are small non-coding RNAs that perform functions in biological processes and diseases. Thus, with the aid of RT-qPCR, eight microRNAs were differentially expressed in the serum of patients with chronic PCM. In the lung cells, distinct microRNAs were observed according to... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by ELISA MATTIAS SARTORI null (elisamsartori@gmail.com) on 2016-06-23T20:05:53Z No. of bitstreams: 1 Elisa Mattias Sartori.pdf: 1436534 bytes, checksum: dd0f5ca15c561bf7bd3853e437fe11ee (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-06-27T18:58:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 sartori_em_dr_arafo.pdf: 1436534 bytes, checksum: dd0f5ca15c561bf7bd3853e437fe11ee (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-27T18:58:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 sartori_em_dr_arafo.pdf: 1436534 bytes, checksum: dd0f5ca15c561bf7bd3853e437fe11ee (MD5) Previous issue date: 2016-04-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Proposição: Este estudo teve como objetivo avaliar a modulação dos miRNAs que afetam o potencial osteogênico de CTMs em diferentes topografias de superfície de discos de vidro. Material e Métodos: Células tronco mesenquimais humanas foram plaqueadas nas diferentes superfícies e comparadas após 3, 7 e 14 dias para atividade de fosfatase alcalina, expressão de genes (Osteocalcina, Osteopontina, Sialo Proteína Óssea, Osterix, Runx2, BMP2 e ALP) e expressão de miRNAs. Microscopia eletrônica de varredura das superfícies com células foram obtidas para avaliação de adesão celular. Resultados: Atividade de fosfatase alcalina nas diferentes superfícies foi significantemente maior na superfície com nanotopografia. Do mesmo modo, a expressão de genes relacionados com osteoblastos foi mais elevada na superfície nano. Com 14 dias foi observado um aumento de 3.5 e 9 vezes para os genes Runx2 e Osterix, respectivamente. O gene da BMP2 e ALP também apresentou um aumento de 4 e 7 vezes comparado ao controle. Utilizando a tecnologia de sequenciamento de RNA (RNA-Seq) onde todos os RNAs existentes foram sequenciados, um total de 123 miRNAs com diferença de expressão foram encontrados comparando a superfície controle (dia 7) com a superfície nano (dia 14). 48 miRNAs apresentaram uma redução na expressão e 75 apresentaram um aumento de expressão. Alguns destes apresentaram marcadores para genes osteogênicos já identificados, tais como hsa-miR-135b-5p marcador para OCN, BSP, Runx2, CO15A1 e OSX, hsa-miR-122-5p marcador para OPN, hsa-miR-196a-5p marcador para BMP4, hsa-miR-26b-5p marcador para BMP2 e hsa-miR-148b-3p marcador para OPN. Conclusão: As superfícies com nanotopografia tem o potencial de melhorar a resposta de osseointegração de maneira a reduzir o tempo de osseointegração e também aumentar a produção de tecido ósseo ao redor dos implantes favorecendo assim áreas de qualidade óssea baixa. A utilização de miRNAs para alterar a resposta de diferenciação pode também ajudar a controlar o processo de osseointegração. / Purpose: This study aimed to evaluate the modulation of miRNAs that affect the osteogenic potential of MSCs in different surface topographies of glass disks. Material and Methods: Human mesenchymal stem cells (hMSCs) were plated on different surfaces of glass disks and compared at 3,7 and 14 days for alkaline phosphatase (ALP) activity, expression of genes (Osteocalcin, Osteopontin, Bone Sialo Protein, Osterix, Runx2, BMP2 and ALP) and expression of miRNAs. Scanning electron microscopy of surfaces with cells were obtained to analyse the attachment of cells. Results: ALP activity on different surfaces was significantly greater in the nanotopography surface. At day 14 there was a 3.5-fold and a 9-fold increase for Runx2 and Osterix gene, respectively. BMP2 and ALP also increased by 4- and 7-fold compared to control. Using RNA sequencing technology (RNA-Seq) a total of 123 miRNAs were found differently expressed comparing control (day 7) to nano surface (day 14). 48 miRNAs were downregulated and 75 were upregulated. Some of them regulated osteogenic genes such as hsa-miR-135b-5p that targets OCN, BSP, RUNX2, CO15A1 and OSX, hsa-miR-122-5p wich targets OPN, hsa-miR-196a-5p targets BMP4, hsa-miR-26b-5p that targets BMP2 and hsa-miR-148b-3p that targets OPN. Conclusion: Surfaces with nanotopography have the potential to improve osseointegration response in order to reduce the time of osseointegration and also increase the production of bone tissue around the implants improving low bone quality areas. The use of miRNAs to affect differentiation response may also help control the osseointegration process. / CAPES: BEX8187/14-2