Orientador: Robson Francisco Carvalho / Resumo: A caquexia associada ao câncer é uma síndrome caracterizada pela grave perda de tecido musculo esquelético; que se estima que afeta mais de 50% de todos os pacientes com câncer e resulta em menor qualidade de vida devido a fadiga, fraqueza, redução da função imune, resistência à insulina e baixa tolerância e resposta à quimioterapia. Notavelmente, 20% das mortes relacionadas ao câncer são diretamente causadas pela caquexia. A principal limitação de que atualmente não há terapia direcionada, é o uso de abordagens tradicionais que não tratam a complexidade em sistemas biológicos, caracterizada por interações não-lineares de redes de regulação genética (GRN, do inglês Gene Regulatory Networks). Por esse motivo, ainda é necessária uma identificação dos componentes da GRN e uma compreensão quantitativa de sua integração temporal no controle das respostas celulares. Adquirir tal conhecimento é fundamental para capturar detalhes mecanicistas essenciais para direcionar estratégias terapêuticas para uma doença complexa, como a caquexia do câncer. Neste trabalho, examinamos a expressão genética do músculo esquelético em dois abordagens metodológicos diferentes: usando dados de expressão de genes estáticos e dinâmicos. Estruturamos nosso trabalho da seguinte maneira: o Capítulo 1 apresenta uma caracterização quantitativa das vias de sinalização e uma reconstrução de GRN no tecido musculo esquelético em ratos portadores de carcinoma de pulmão de Lewis (LLC, do inglês Lewis lung carcinoma... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Cancer cachexia is a syndrome characterized by the severe skeletal muscle wasting tissue; that affects more than 50% of all cancer patients and results in lower quality of life due to compromised fatigue, weakness, decreased immune function, insulin resistance and poor tolerance and response to radio and chemotherapy. Remarkably, approximately 20% of cancer-related deaths are estimated to be directly caused by cachexia. There is currently no effective targeted therapy and the main limitation lays on the traditional approaches that not deal with the inherent complexity, characterized by non-linear interactions, of gene regulatory networks (GRN). Thus, a clear identification of the components of gene regulation, and a quantitative understanding of their temporal integration to control cellular responses is fundamental for capture essential mechanistic details that will ultimately enable the development of direct therapeutic strategies for the treatment of cancer cachexia. Here, we examine genome-wide gene expression of muscle wasting under two different frameworks, using static and dynamic gene expression data. We structure this approach as follow: Chapter 1 presents a quantitative characterization of the signaling pathways and a GRN reconstruction of muscle wasting in Lewis Lung Carcinoma (LLC) tumor-bearing mice by integrating static mRNAs and microRNAs expression profiles. The results show that LLC mice reduced body weight in 20% and presented muscle and fat tissue wasting a... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Introdução: O transplante renal (TR) é o tratamento de escolha para uma significativa porção de pacientes com perda crônica terminal da função renal. Apesar dos progressos obtidos, a disfunção inicial do enxerto (DIE) permanece como uma importante complicação precoce muitas vezes levando à necessidade da biópsia renal. Essa, apesar de suas limitações, riscos e custos, é considerada padrão ouro para a avaliação das disfunções dos enxertos renais. Assim sendo é imprescindível estudar e buscar biomarcadores não invasivos capazes de diagnosticar as agressões aos transplantes renais, em especial na fase de DIE, quando os parâmetros funcionais não estão disponíveis. Objetivo: Analisar e quantificar a expressão do micro Ácido Ribonucleico (miRNA) mi RNA-146a-5p em amostras de sangue periférico e tecido renal de pacientes que desenvolveram disfunção do enxerto associados a lesões de isquemia e reperfusão após transplante renal. Métodos: Trata-se de um estudo transversal. Os pacientes submetidos a transplante renal que necessitarem de biópsia devido à presença de DIE foram convidados a participar da pesquisa e a assinarem o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. As amostras foram armazenadas no período de março de 2013 a abril de 2017. Posteriormente foi avaliada a expressão do micro RNA (miR-146 a-5p) em tecido renal e em sangue periférico. Resultados: Em amostras de biópsia renal, encontramos um aumento estatisticamente significativo na expressão de miR-146a-5p no grupo de disfunção inicial do enxerto (DIE, n=33) versus grupo de pacientes estáveis (STA, n=13), P= 0,019 no grupo de pacientes com rejeição aguda (RA, n=9) versus grupo de DIE não observamos diferença significativa, P=0,106, assim como o grupo de pacientes estáveis versus RA não observamos diferença significativa, P= 1,000. Diferença na análise global P = 0,008. No entanto, em amostras de sangue periférico encontramos aumento na expressão gênica de miR-146a-5p no grupo de DIE versus pacientes STA , porém, não foi estatisticamente significativo, P= 0,083. Não houve correlação entre a expressão miR-146a-5p nos diferentes grupos de biópsia e sangue periférico, P=0,541. Conclusão: A expressão do miR 146a-5p apresentou expressão gênica distinta na disfunção inicial do enxerto em amostras de biópsias, podendo vir a ser considerado potencial biomarcador de lesão de isquemia e reperfusão renal. / Introduction: Kidney transplantation is the treatment of choice for a significant portion of patients with chronic terminal loss of renal function. Despite the progress achieved, delayed graft function DGF remains an important early complication. Graft biopsy, despite its limitations, risks and costs, is considered a gold standard for the diagnosis of graft dysfunction. Therefore, it is imperative to study and search for noninvasive biomarkers capable of diagnosing injuries to kidney transplants, especially in the DGF period when functional parameters are not available. The objective of the present study was to analyze and quantify the expression of miRNA-146a -5p ribonucleic micro-acids (miRNAs) in peripheral blood and renal tissue samples obtained from patients who underwent renal transplantation and developed DGF which is associated with lesions of ischemia and reperfusion injuries, after renal transplantation. Methods: This is controlled cross-sectional study involving transplant recipients, between March 2013 and April 2017, that underwent DGF and received a graft biopsy. Patients had their tissue and peripheral blood samples stored and latter analyzed for the expression of the micro-RNA: miR-146a-5p in renal tissue and blood. (Continuatiation) Results: In graft tissue samples a statistically significant increase in miR-146a-5p expression in the initial graft dysfunction group (DIE, n=33) was observed in the comparison with the group of stable patients (STA, n=13) group, P=0,019. The difference wasn’t significant in the comparison with the acute rejection (AR, n=9) group versus group DIE, P=0,106, as well stable patients group versus AR we didn’t observe a significant difference, P=1,000 . Overall group significance P=0.008. However, in peripheral blood samples we found an increase in miR-146a-5p gene expression in the DIE group versus STA patients, however, it was not statistically significant, P = 0.083. There was no correlation between expression miR-146a-5p in the renal tissue and peripheral blood samples, P=0,541. Conclusion: We concluded that miR-146a-5p expression has a distinct pattern of expression in the setting of DGF and has the potential of becoming a biomarker for ischemia and reperfusion injury in kidney transplant recipients.

A hipertrofia cardíaca é uma adaptação do coração frente a estímulos de crescimento, sejam eles patológicos e irreversíveis como a sobrecarga de pressão ou de volume, ou fisiológicos e reversíveis como a gravidez e o exercício físico. A hipertrofia derivada de estímulos patológicos é conhecida como mal adaptativa enquanto que a hipertrofia proveniente de estímulos ditos fisiológicos é conhecida como benéfica ou adaptativa. Embora ambas hipertrofias tenham fatores em comum no que diz respeito ao crescimento do cardiomiócito e adaptações moleculares, elas acabam divergindo para desfechos completamente diferentes. A hipertrofia patológica evolui para um quadro de disfunção cardíaca ao passo que a hipertrofia fisiológica não acarreta nenhum dano funcional ao miocárdio. Essa linha tênue entre um fenótipo e outro envolve mecanismos celulares complexos que ainda precisam ser esclarecidos. Dentro deste cenário, os microRNAs aparecem como reguladores de diversos processos celulares, e têm sido associados ao crescimento miocárdico. Portanto, nosso objetivo foi comparar o padrão de expressão de microRNAs entre os modelos de hipertrofia fisiológica, induzido por natação (SWIM), e o modelo de hipertrofia patológica, induzida por bandeamento aórtico transtorácico (TAC). As análises foram realizadas após 28 dias para o modelo de natação, e 35 dias para o modelo de TAC. A comparação foi realizada através da técnica de microarranjo de microRNAs (Affymetrix). Interessantemente, apenas 20 microRNAs apresentaram níveis de expressão distinta entre os dois modelos de hipertrofia. Destes, 12 microRNAs apresentaram aumento de expressão (miR-193a-3p, miR-299a-5p, miR- 127-5p, miR-214-5p, miR-188-5p, miR-326-3p, miR-6395, miR-547-3p, miR-199a-5p, miR-381-3p, miR-223-3p e miR-199b-5p) e 8 estavam com seus níveis diminuídos (miR11 708-5p, miR-30c-1-3p, miR-22-5p, miR-6921-5p, miR-30a-3p, miR-30e-3p, miR-27a-5p and miR-6975-5p) no grupo TAC em relação ao grupo SWIM. Além disso, apenas 3 microRNAs, miR-21a-5p, miR-206-3p e miR-1983, apresentaram aumento de expressão tanto no grupo TAC quanto no grupo SWIM em comparação aos grupos SHAM e Sedentário, respectivamente. Após isso, foi realizada uma busca por possíveis alvos destes microRNAs na base de dados KEGG Pathway que identificou 4 rotas enriquecidas (665 genes) entre os alvos dos microRNAs reduzidos, e 80 rotas (3394 genes) fortemente associadas aos microRNAs que estavam aumentados no grupo TAC comparado ao SWIM. Conclui-se que existem microRNAs específicos para o desenvolvimento da hipertrofia cardíaca fisiológica, bem como patológica conforme os dados obtidos na análise de microarranjo. Além disso, os possíveis alvos destes microRNAs parecem estar envolvidos em rotas bastante envolvidas no crescimento celular, sobrevivência e adaptação cardíaca. / Cardiac hypertrophy is a heart adaptation in response to growth stimuli whether pathological and irreversible such as pressure overload or physiological and reversible as pregnancy and exercise. Hypertrophy because of pathological stimuli is known as mal adaptive while the one that comes from physiological triggers is known as beneficial or adaptive. Although both have similarities about cardiomyocyte growth and molecular adaptations, they diverge to distinct outcomes. The pathological hypertrophy evolves to a pattern of cardiac dysfunction while the physiological one does not cause any damage to the heart. This tenuous line between those phenotypes involves complex cellular mechanisms that need to be clarified. In this context, microRNAs are considered as regulators of many biological processes, and have been associated to myocardial growth. Therefore, our aim was to compare microRNA expression between physiological (swiminduced) and pathological (TAC-induced) hypertrophy. The analysis was performed after 28 days for SWIM protocol and 35 days for TAC model. The comparison was done using microRNA microarray technology (Affymetrix). Interestingly, only 20 microRNAs were differential expressed between both models. Out of those, 12 were up regulated (miR- 193a-3p, miR-299a-5p, miR-127-5p, miR-214-5p, miR-188-5p, miR-326-3p, miR-6395, miR-547-3p, miR-199a-5p, miR-381-3p, miR-223-3p and miR-199b-5p) while 8 were down regulated in TAC group compared to SWIM group. Besides, only 3 microRNAs, miR-21a-5p, miR-206-3p and miR-1983, were upregulated in TAC and SWIM model compared to SHAM and SED groups. After that, a search at KEGG Pathway database retrieved 4 pathways (665 genes) enriched with targets from microRNAs downregulated and 80 pathways (3394 genes) enriched with targets from up-regulated microRNAs in in 13 TAC group compared to SWIM group. In conclusion, there are microRNAs specific committed to the physiological cardiac hypertrophy development as well to the pathological cardiac growth as observed in our microarray data. Furthermore, the possible targets of those microRNAs could be involved in pathways associated with cellular growth, survival and cardiac adaptation.

Introdução: o transplante renal é o tratamento de escolha para uma significativa porção dos pacientes com perda crônica terminal da função renal. A rejeição aguda é uma importante complicação pós-transplante e entre outras disfunções agudas tem na biópsia do enxerto o padrão ouro para o seu diagnóstico. No entanto as biópsias apresentam uma série de limitações e riscos sendo necessário que se desenvolva biomarcadores não invasivos capazes de identificar disfunções do enxerto. Objetivos: analisar e quantificar a expressão dos microRNAs miR-142-3p, miR-155 e miR-210 em amostras de sangue periférico, urina e tecido renal coletadas de pacientes que submetidos à transplante renal que desenvolveram disfunção do enxerto. Métodos: estudo com delineamento transversal e executado no Laboratório de Biologia Molecular aplicado à Nefrologia (LABMAN), do Centro de Pesquisa Experimental do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. As amostras são de pacientes submetidos a transplante renal que necessitaram de biópsia, por critério clínico. A expressão dos miRNAs miR-142-3p, miR-155 e miR-210 nos materiais biológicos (tecido renal, sangue periférico e células do sedimento urinário) foi avaliada através da técnica de reação em cadeia da polimerase quantitativo em tempo real. Resultados: foi encontrada, no sangue periférico uma diminuição estatisticamente significativa na expressão do miR-142-3p no grupo de pacientes com rejeição aguda (n=23) quando comparado ao grupo com outras causas de disfunção do enxerto (n=68) (P = 0,01). Não houve diferença entre os grupos na expressão do miR-155 e do miR-210, tampouco para o miR142-3p nos demais compartimentos. Conclusão: miR-142-3p mostra uma expressão diferenciada de rejeição aguda de enxertos renais, há um envolvimento deste marcador no grupo de biomarcadores moleculares em potencial para a disfunção do enxerto renal. / Background: kidney transplantation is the treatment of choice for a significant portion of patients with end-stage kidney disease. Acute rejection is a major post-transplant complication among other acute disorders and has on graft biopsy the gold standard for diagnosis. Biopsy, however it is an invasive and potentially harmful procedure so it is desirable to develop new noninvasive markers for diagnosing graft dysfunction. Objective: to analyze and quantify the expression of microRNAs miR-142-3p, miR-155 and miR-210 in the peripheral blood, urinary sediment and kidney tissue obtained from patients who developed graft dysfunction after kidney transplantation. Methods: crosssectional study performed at the Laboratory of Molecular Biology applied to Nephrology (Labman), Center of Experimental Research from Hospital de Clinicas de Porto Alegre. The samples are from kidney transplant patients who undertook indication biopsies as a part of investigation of graft dysfunction. Micro-RNAs expression was evaluated by quantitative real-time polymerase chain reaction. Results: it was found that in peripheral blood, a significant decrease in the expression of miR-142-3p occurred in patients with acute rejection (n = 23) as compared to the group of patients with other causes of graft dysfunction (n = 68), (P = 0.01). No other significant differences were found in gene expression of miR-155 and miR-210, neither for miR142-3p in the other urine or kidney tissue. Conclusion: miR-142-3p presents differential expression in the peripheral blood of patients with rejecting kidney grafts. The role of miRNAs as biomarkers for kidney graft dysfunction is worth be further explored.

Nas últimas décadas, a molécula HLA-G despontou como uma importante molécula imunossupressora. O fato de a molécula HLA-G estar envolvida em diversos mecanismos de imunorregulação e, considerando sua expressão em doenças inflamatórias, sugere a possibilidade de um papel dessa molécula na patogênese e no curso de doenças reumatológicas. Com base nisso, esta tese teve como objetivo avaliar a influência da molécula HLA-G, bem como das variantes genéticas do gene HLA-G na suscetibilidade e no curso de doenças reumatológicas, buscando correlacionar fatores genéticos, moleculares, clínicos e imunológicos. Neste trabalho, avaliamos a influência de variantes alélicas da região 3’ não traduzida do gene HLA-G na suscetibilidade e curso do lúpus eritematoso sistêmico (LES), na suscetibilidade à artrite reumatóide (AR) e avaliamos a expressão de HLA-G solúvel (sHLA-G) em pacientes com AR e artrite idiopática juvenil (AIJ). Observamos que o mesmo haplótipo (D/G) parece estar associado tanto à suscetibilidade ao LES quanto à AR, apontando para o gene HLA-G como um potencial fator de suscetibilidade comum às duas doenças. Em AR, observamos maiores níveis de HLA-G solúvel no líquido sinovial de pacientes fator reumatóide-negativos (FR-) em comparação com pacientes FR+, e diferentes padrões de correlação entre os níveis plasmáticos de sHLA-G e parâmetros de atividade de doença após estratificarmos os grupos de pacientes para positividade para FR e gênero. Nossas observações, portanto, colocam a molécula e o gene HLA-G como elementos diretamente envolvidos na patogênese e curso dessas doenças e encorajam estudos futuros que procurem elucidar o papel da molécula HLA-G no curso de doenças reumatológicas. / In the last decades, HLA-G has emerged as a major immunosuppressive molecule. The fact that HLA-G is involved in various mechanisms of immunoregulation and given its expression in inflammatory diseases suggests the possibility of a role of this molecule in the pathogenesis and course of rheumatic diseases. This thesis aimed to evaluate the influence of HLA-G, as well as genetic variants of the HLA-G gene in the susceptibility and course of rheumatic diseases, seeking to correlate genetic, molecular, clinical and immunological factors. We evaluated the influence of allelic variants of the HLA-G gene 3 'untranslated region (3”UTR) in susceptibility and course of systemic lupus erythematosus, in the susceptibility to rheumatoid arthritis and we have also evaluated the expression of soluble HLA-G in patients with rheumatoid arthritis (RA) and juvenile idiopathic arthritis (JIA). We noted that the same haplotype (D/G) seems to be associated with susceptibility to RA and SLE, pointing to the HLA-G gene as a potential common susceptibility factor to both diseases. In RA, we observed higher levels of soluble HLA-G (sHLA-G) in synovial fluid (SF) from rheumatoid factor negative (RF-) patients as compared to RF+ patients, and different patterns of correlation between sHLA-G plasma levels and disease activity parameters after stratifying patient groups for RF positivity and gender. Our observations, therefore, put the gene and molecule HLA-G as directly involved elements in the pathogenesis and course of these diseases and encourage future studies that seek to elucidate the role of HLA-G in the course of rheumatic diseases.

nÃo hà / IntroduÃÃo: MutaÃÃes nos genes GNAS e AIP estÃo presentes em 35% e 3%, respectivamente, dos somatotrofinomas esporÃdicos. Recentemente, observa-se importÃncia biolÃgica crescente dos microRNAs (miRNAs) na tumorigÃnese hipofisÃria. Entretanto, mecanismos moleculares envolvidos na patogÃnese de 60% desses tumores permanecem nÃo elucidados. Objetivos: Identificar a prevalÃncia de mutaÃÃes nos genes GNAS e AIP em um grupo de somatotrofinomas esporÃdicos. Comparar parÃmetros clÃnicos e bioquÃmicos ao diagnÃstico como idade, tamanho tumoral e agressividade (escore Hardy), hormÃnio do crescimento (GH), prolactina (PRL) e Fator de Crescimento Insulin-Like I (IGF-1) e resposta as terapÃuticas entre os grupos com (gsp+) e sem (gsp-) mutaÃÃo no GNAS. Analisar a expressÃo dos genes GNAS e BTG2 e miRNAs entre somatotrofinomas e hipÃfises normais (HN) e a associaÃÃo entre a expressÃo com agressividade, a resposta à cirurgia e a todas as terapÃuticas adjuvantes disponÃveis. Material e MÃtodos: 26 pacientes com diagnÃstico de acromegalia. Tamanho tumoral foi avaliado por RNM/CT e o grau de invasibilidade pelo escore de Hardy (I a IV). GH basal ≤2.5μg/L ou nadir de GH apÃs o GTT≤1μg/L e IGF-1 normal para idade e sexo foram utilizados como critÃrio de cura apÃs cirurgia transesfenoidal (CTE). Como controle com o anÃlogo da somatostatina (AS), adotamos a normalizaÃÃo dos nÃveis de IGF-1 para idade e sexo. As amostras tumorais (n=26) foram obtidas durante a CTE, realizado histopatolÃgico e armazenadas a -70 ÂC, para estudos moleculares. HN (07) foram obtidas durante autÃpsias. RNA e DNA total foram extraÃdos pelo TRIzolÂ. Os cÃdons 201 e 227 do gene GNAS e o AIP completo foram sequenciados. ExpressÃo relativa dos genes GNAS e BTG2 e dos miRNAs let-7a, miR-16a, miR-21, miR-141, miR-143, miR-15a, miR-145, miR-23a, miR-23b e miR-24-2 foi avaliada por qPCR (sondas TaqMan), pelo mÃtodo 2-ΔΔCt. Resultados: A frequÃncia de mutaÃÃes no GNAS foi de 35% e no AIP 3,8%. NÃo houve diferenÃa entre as mÃdias de idade (39,0Â11,5 vs 43,6Â9,0 anos; p=0,32), nas concentraÃÃes plasmÃticas basais de GH (62,4Â128,1 vs 39,9Â48,3Âg/L; p=0,39), IGF-1 (435,5Â230,8 vs 556,9 238,3 %ULNR; p=0,32), PRL (25,7Â29,8 vs 30,9Â32,8 ng/L; p=0,69) e agressividade tumoral entre os gsp+ e gsp-(p=1,00). Ao analisar o uso do AS como terapÃutica adjuvante à CTE, observamos que 04/05 (80%) dos indivÃduos com somatotrofinoma gsp+ obtiveram controle da doenÃa, enquanto que no grupo gsp- 02/06 (33%) obtiveram controle (p=0,08). Quando associamos ao AS, os agonistas dopaminÃrgicos e/ou radioterapia externa, observamos que 05/05 (100%) dos pacientes gsp+ tiveram critÃrio de controle da doenÃa, contra (04/09) 44% no grupo gsp- (p=0,09). NÃo houve diferenÃa na expressÃo de GNAS entre os somatotrofinomas e as HN (1,07Â0,55 vs 0,98Â0,28; p=0,97), e entre os gsp+ e gsp- (1,04Â0,59 vs 1,10Â0,55; p=0,97, respectivamente). Os tumores Hardy I / II apresentaram maior expressÃo do GNAS do que os tumores classificados como III / IV (p=0,02). NÃo houve associaÃÃo entre a expressÃo do GNAS e o controle da doenÃa com cirurgia isolada ou com o uso de todas as terapÃuticas adjuvantes. Observamos hipoexpressÃo do BTG2 e dos miR-16a e miR-141 em somatotrofinomas quando foram comparados com as HN (p=0,002, fold=-6,63; p=0,01, fold=-10,00; p=0,0003, fold=-50,00, respectivamente) sem diferenÃas entre os gsp+ e gsp-. Houve hiperexpressÃo do miR-21 (p=0,02;fold=10,18) em somatotrofinomas (20,16Â18,48) quando comparado com as HN (2,52 Â3,56), sem diferenÃa entre os gsp + e gsp-. NÃo houve diferenÃa na expressÃo entre os grupos gsp+ e gsp- para os miRNAs let-7a, miR-21, miR-143, miR-15a, miR-23a e miR-24-2. Entretanto, miR-145 e miR-23b foram mais hipoexpressos no grupo gsp+ quando comparados ao gsp- (p=0,03, fold=-4,83 e p=0,02, fold=-2,77, respectivamente). NÃo houve associaÃÃo entre a expressÃo do BTG2 e o painel de miRNAs com agressividade e com o controle da doenÃa. ConclusÃo: Na presente sÃrie de somatotrofinomas, assumidos como esporÃdicos, a frequÃncia de mutaÃÃes nos genes GNAS (35%) e AIP (3,8%) foram semelhantes aos relatados na literatura. NÃo houve diferenÃas nas caracterÃsticas clÃnicas e bioquÃmicas, agressividade, resposta Ãs terapÃuticas, e na expressÃo diferencial do GNAS entre os pacientes com tumores gsp+ e gsp-. HipoexpressÃo de BTG2 (gene supressor tumoral relacionado Ãs vias de sinalizaÃÃo do p53 e do Rb), baixa expressÃo de miRNAs (supressores tumorais) e alta expressÃo de oncomirs em somatotrofinomas sugerem um papel desses na tumorigÃnese somatotrÃfica. / Introduction: Mutations in GNAS and AIP genes are present in 35% and 3%, respectively, of the sporadic somatotropinomas. Recently, increased biological importance of microRNAs (miRNAs) has been observed in pituitary tumorigenesis. However, the molecular mechanisms involved in the pathogenesis of 60% of these tumors remain to be elucidated. Objectives: To identify the prevalence of mutations in GNAS and AIP genes in a series of sporadic somatotropinomas. Compare clinical, bioquimical parametrer at diagnosis as age, tumor size and theirs aggressiveness, pre-operative growth hormone (GH), prolactin (PRL) and insulin-like growth factor-I (IGF-1) levels and treatment responsiveness between somatotropinomas with (gsp+) and without (gsp-) GNAS mutation.To analyze the expression of GNAS and BTG2 genes and a panel of miRNAs between somatotrofinomas and normal pituitaries (NP) and the association between the expression of these genes and miRNAs with aggressiveness, as well as disease control with surgery or control with all adjuvant therapeutic approaches. Material and Methods: 26 patients with acromegaly. GH basal ≤2.5μg/L or nadir after OGTT ≤1μg/L and normal IGF-I matched for age and sex were used as diagnosis and for cure criteria after transsphenoidal surgery (TS). As control after somatostatin analogues (SA), we adopted the normalization of IGF-I matched for age and sex. Tumor size was evaluated by MRI/CT and the degree of invasiveness by Hardy score (I to IV).Tumor samples (26) were obtained during TS, processed for histopathology and stored at -70ÂC for molecular studies. NP (07) were obtained during autopsy. Total DNA and RNA were extracted by TRIzolÂ. Codons 201 and 227 of the GNAS gene and the whole AIP gene were sequenced. Relative expression of BTG2 and GNAS genes and miRNAs let-7a, miR-16a, miR-21, miR-141, miR-143, miR-15a, miR-145, miR-23a, miR-23b, and miR-24-2 was measured by qPCR (TaqMan probes) using 2-ΔΔCt method. Results: Frequencies of GNAS and AIP mutations were 35% and 3.8%, respectively. There was no difference between the mean age (39.0  11.5 vs 43.6  9.0 years, p=0.32), basal GH (62.4Â128.1 vs 39.9  48.3 μg/L; p=0.39), IGF-I (435.5  230.8 vs. 556.9  238.3; p=0.32) and PRL (25.7  29.8 vs. 30.9  32.8 ng/L, p=0.69) in plasma concentration, and tumor aggressiveness (p=1.00) between (gsp+) and (gsp-) groups. We observed that 80% (04/05) of gsp+ whereas 33% (02/06) of the gsp- achieved control (p=0.07) after SA therapy adjuvant to TS. When SA, dopamine agonists and/or external radiotherapy were associated 100% (05/05) of gsp+ group and 44% (04/09) of gsp- group (p=0.08) showed disease control.There was no difference in GNAS expression between somatotropinomas and NP (1.07  0.55 vs 0.98  0.28, p=0.97) as well as between somatotropinomasgsp+ and gsp- (1.04  0.59 vs 1.10  0.55, p=0.97, respectively). Hardy I/II tumors showed higher GNAS expression than Hardy III/IV (p=0.02), but there was no association between GNAS expression and disease control with surgery alone or associated with other adjuvant therapies. We observed hypoexpression of BTG2 and miR-16a and miR-141 in somatotropinomas compared with NP (-6.6 fold, p=0.002; -10.0 fold, p=0.01; and -50.0 fold, p=0.0003, respectively) with no difference between gsp+ and gsp- somatotropinomas. There was miR-21 overexpression in somatotropinomas compared with NP (20.2  18.5 vs 2.5  3.6; 10.2 fold, p=0.02), with no difference between gsp+ and gsp- somatotropinomas. However, miR-145 and miR-23b were more hipoexpressed in gsp+ compared to gsp- (-4.8fold, p=0.03 and-2.7 fold, p=0.02). There was no association between the expression of BTG2 and a panel of miRNAs with aggressiveness or disease control. Conclusion: In this series of assumed sporadic somatotopinomas, the frequencies of mutations in GNAS (35%) and AIP (3.8%) were similar to the literature. There were no differences in clinical and biochemical characteristics, aggressiveness, response to therapy, and GNAS expression in patients with gsp+ and gsp- somatotropinomas. Hypoexpression of BTG2, a tumor suppressor gene related to p53 and Rb signaling pathways, low expression of tumor suppressor miRNAs and high expression of oncomirs in somatotropinomas suggest a role in the somatotrophic tumorigenesis.

Os microRNAs são pequenos RNAs, não-codificantes que funcionam como reguladores a nível pós-transcricional da expressão gênica. Nos últimos anos, novas evidências demonstram o papel importante dos microRNAs na regulação e desenvolvimento do sistema imune. Apesar da função de poucos microRNAs ser conhecida, a sua expressão alterada vêm sendo associada a patogênese de diversas doenças autoimunes, incluindo a artrite reumatóide (AR). Recentemente a expressão desregulada de uma série de microRNAs está sendo descrita em pacientes com AR, e o papel patogênico de apenas uma parte deles foi investigada em modelos animais. A artrite reumatóide é uma doença autoimune sistêmica caracterizada por um intenso processo inflamatório na sinóvia, podendo causar destruição óssea e articular. Os linfócitos T apresentam papel importante na indução, manutenção e progressão da doença. A artrite induzida por colágeno é um modelo animal amplamente utilizado por suas características fisiopatológicas muito similares à doença em humanos. A linhagem de camundongos DBA-1/J desenvolve a doença após imunização e booster com colágeno do tipo II, enquanto que a linhagem DBA-2/J se mostra refratária. Isso confere um sistema modelo de susceptibilidade/resistência à artrite, que pode ser estudado em diferentes abordagens. O objetivo do nosso estudo foi identificar o perfil transcricional e as redes de interação entre um grupo de microRNAs e seus respectivos alvos nos timócitos e linfócitos T CD3+ periféricos nos camundongos da linhagem DBA-1/J e DBA-2/J. Para a avaliação da expressão gênica, utilizou-se a tecnologia de microarrays. O uso de programas de análise e para a construção das redes foi imprescindível. Os resultados encontrados evidenciam uma expressão diferenciada de mRNAs e microRNAs em timócitos e linfócitos T CD3+ periféricos entre as duas linhagens utilizadas. Novos microRNAs foram encontrados nos diferentes estágios de desenvolvimento do linfócito T. Nas redes de interação microRNA-RNAm obtidas, genes importantes associados aos processos de sistema imune, adesão e diferenciação celular, apoptose, recombinação, ativação de linfócitos T e resposta inflamatória, foram encontrados como potenciais alvos. Além disso, em uma perspectiva clínica, baseados nos resultados obtidos em camundongo, nos encontramos a expressão do miR-505 nos linfócitos T de pacientes com AR. Nossos resultados contribuem para a melhor compreensão dos mecanismos molecular envolvidos na resistência/susceptibilidade a CIA. / MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNA molecules that modulate the expression of multiple protein-encoding genes at the post-transcriptional level. During the last several years, evidence has emerged to show their critical role for the regulation and development of immune system. Although the function of most mammalian miRNAs has yet to be determined, their aberrant expression has been associated with several autoimmune conditions, including rheumatoid arthritis (RA). Recently, the deregulated expression of a dozen miRNAs has been reported in patients with RA, and the pathogenic role of only a few of these has been investigated in experimental mouse models. RA is a systemic autoimmune disorder mainly characterized by the inflammation of synovial tissue that can lead to destruction of bone and cartilage. The role of effectors T cells in induction, maintenance and progression of the disease is now becoming better understood. Collagen-induced arthritis is an animal model widely studied due to its similarities to human disease. The DBA-1/J mouse strain develops arthritis after immunization process and booster with Type II collagen, and the DBA-2/J strain is refractory to the disease induction. This offers an useful susceptibility/resistance model-system to study RA. The aim of this study was to identify the expression profiles and interaction networks between a set of microRNAs and their mRNA targets in thymocytes and peripheral CD3+ T lymphocytes in DBA-1/J and DBA-2/J mice strain. For this purpose we used the microarray technology to evaluate the expression of the miRNAs and mRNAs as possible targets involved in this process. The use of bioinformatics software to reconstruct the networks was essential. The results show differential expression of mRNAs and miRNAs in thymocytes and peripheral CD3+ T lymphocytes between both strains. New miRNAs were found during all the stages of T cells development. The microRNA-mRNA interaction networks obtained in this study showed that important genes related to apoptose, immune system, recombination, cell adhesion and differentiation, inflammatory process and T cell activation were found as potential targets. In addition, in a clinical prospects, based on the results obtained in mice, we found the expression of the miRNA miR-505 in T cells of RA patients. Our results contribute to a better understand of the molecular mechanisms evolved in the resistance/susceptibility to CIA.

Orientador: Adriana Souza Torsoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Aplicadas / Made available in DSpace on 2018-08-24T18:35:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_RafaelaBenatti_M.pdf: 1191668 bytes, checksum: 30188f35804e6016d9ee2cffa54ee9d5 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O consumo materno de uma dieta rica em gordura (HFD) durante a gestação e lactação está intimamente relacionada ao acúmulo de lipídios no fígado, a resistência à insulina e ao aumento de citocinas no soro, na prole jovem e na idade adulta. MicroRNAs (miRNAs) têm sido relacionados com a biossíntese do colesterol e no metabolismo dos ácidos graxos. Nós avaliamos a modulação da síntese hepática de ácidos graxos (de novo), as vias da beta-oxidação e a expressão dos microRNAs miR-122 e miR -370 em prole recém desmamados (d28) de mães alimentadas com HFD (grupo HFD-O) ou ração padrão (grupo SC-O) durante a gestação e lactação. Comparado com os camundongos SC-O, os camundongos HFD-O apresentaram um maior peso corpóreo, maior massa de tecido adiposo e eram intolerantes à glicose e insulina. HFD-O camundongos também apresentaram níveis séricos elevados de colesterol, triglicérides, ácidos graxos não esterificados e maior fosforilação hepática de IKK e JNK em comparação com camundongos SC-O. Os níveis das proteínas FAS, ACC e HMGCR foram semelhantes entre os camundongos HFD-O e SC-O, enquanto os níveis de RNAm e proteína da SCD1 foram mais abundantes nos camundongos HFD-O comparados com camundongos SC-O. Curiosamente, a expressão de RNAm de genes relacionados com a ?-oxidação, como a ACADVL CPT1 estavam diminuídos em camundongos HFD-O. Embora não observamos uma diferença nos níveis de HNF4? hepáticas, a expressão de miR -122 estava diminuída, e a expressão de miR-370 estava aumentada em HFD-O em comparação com camundongos SC-O. Alterações no metabolismo lipídico hepático foram acompanhados pelo aumento da deposição de triglicerídes em camundongos HFD-O. Em conjunto, os nossos resultados sugerem fortemente que o consumo materno de HFD afeta precocemente o metabolismo lipídico da prole de camundongos através da modulação da expressão de genes e miRNAs relacionados com a ?-oxidação hepática e que podem contribuir para as alterações metabólicas na vida adulta / Abstract: Maternal consumption of high-fat diet (HFD) during pregnancy and lactation is closely related to liver lipid accumulation, insulin resistance, and increased serum cytokines in offspring and into adulthood. MicroRNAs (miRNAs) have been implicated in cholesterol biosynthesis and fatty acid metabolism. We evaluated the modulation of hepatic fatty acid synthesis (de novo), beta-oxidation pathways and miR-122 and miR-370 expression in recently weaned offspring (d28) of mice dams fed HFD (group HFD-O) or standard chow (group SC-O) during pregnancy and lactation. Compared with SC-O mice, HFD-O mice weighed more, had a larger adipose tissue mass and were more intolerant to glucose and insulin. HFD-O mice also presented more serum cholesterol, triglycerides, non-esterified fatty acids and hepatic IKK and JNK phosphorylation compared with SC-O mice. Protein levels of FAS, ACC and HMGCR were similar in HFD-O and SC-O mice, whereas SCD1 mRNA and protein were more abundant in HFD-O mice compared with SC-O mice. Interestingly, mRNA expression of ?-oxidation-related genes ACADVL and CPT1 was decreased in HFD-O mice. Although we did not observe a difference in hepatic HNF4? levels, the expression of miR-122 was reduced but that of miR-370 was increased in HFD-O mice compared with that in SC-O mice. Changes in hepatic lipid metabolism were accompanied by increased triglyceride deposition in HFD-O mice. Taken together, our results strongly suggest that maternal consumption of HFD affects the early lipid metabolism of offspring by modulating the expression of hepatic ?-oxidation-related genes and miRNAs that can contribute to metabolic disturbances in adult life / Mestrado / Metabolismo e Biologia Molecular / Mestra em Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo

La plupart des espèces végétales terrestres vivent en symbiose avec les champignons mycorhiziens à arbuscules (MA). Il s’agit d’une symbiose très ancienne datant de plus de 400 millions d’années. Les champignons MA sont des champignons du sol qui appartiennent aux Gloméromycètes. Ils sont présents dans la plupart des écosystèmes terrestres. Ainsi, ils peuvent être considérés comme une composante intégrale des racines des plantes. Ils forment dans les cellules racinaires corticales des structures fonctionnelles essentielles appelées arbuscules où ils apportent à la plante des minéraux nutritifs en échange de sucres. L’auxine est une phytohormone impliquée dans de nombreux processus de développement des plantes, y compris la dominance apicale, les tropismes, la structuration vasculaire et la formation de racines latérales. Le principal objectif de notre travail était d’étudier de manière approfondie le rôle de l’auxine dans le processus de développement des mycorhizes. On sait déjà que la symbiose MA stimule la formation de racines latérales dans les plantes hôtes, ce qui pourrait être due à une modification du métabolisme de l’auxine, de son transport ou de sa perception. Les microARNs (miARNs) sont des molécules d’ARN non codantes de ~ 21 nucléotides capables de réprimer l’expression de gènes en ciblant et clivant spécifiquement leur ARNm correspondant. Plusieurs miARNs interagissent avec la signalisation de l’auxine et parmi eux miR393 qui cible les récepteurs à l’auxine. Nous avons étudié le rôle de miR393 dans la colonisation mycorhizienne. Nous mettons en évidence que chez Solanum lycopersicum (Solanacées), Medicago truncatula (Fabaceae) et Oryza sativa (Poaceae), l’expression des précurseurs de miR393 diminue lors de la mycorhization. En outre nous montrons que DR5-GUS, un gène rapporteur de réponse à l’auxine, est préférentiellement exprimé dans les cellules de la racine contenant les arbuscules. En sur-exprimant miR393 dans les racines et donc en régulant négativement l’expression des gènes de récepteurs à l’auxine, nous montrons également que les arbuscules ne se développent pas normalement. En tant que composantes des complexes récepteurs d’auxine, les protéines Aux/IAA jouent un rôle majeur dans la voie de signalisation de l’auxine en réprimant l’activité des facteurs de transcription de type ARF. Nous avons vérifié dans des racines de tomate mycorhizées l’expression de 25 gènes AUX/IAA. Nous nous sommes concentrés sur IAA27 dont l’expression est induite lors des premiers stades de la symbiose MA. Nous observons qu’une répression par ARNi de l’expression de IAA27 dans des plants de tomate conduit à une forte diminution de la colonisation MA et du nombre des arbuscules. Puis nous montrons par des approches différentes que la régulation positive de la mycorhization par IAA27 est liée à la biosynthèse des strigolactones. Globalement, ces résultats appuient fortement l’hypothèse selon laquelle la signalisation de l’auxine joue un rôle important aussi bien dans le stade précoce de la mycorhization que dans la formation des arbuscules. / Most land plant species live in symbiosis with arbuscular mycorrhizal (AM) fungi. This is a very ancient symbiosis dating back to 450 million years. AM fungi are soil fungi that belong to the Glomeromycota. They are present in most terrestrial ecosystems. Thus they can be considered as an integral root component of plants. They form essential functional structures called arbuscules in root cortical cells at which mineral nutrients are released to the plant in exchange of sugars. The phytohormone auxin is involved in many developmental processes in plants, including apical dominance, tropisms, vascular patterning and lateral root formation. The main objective of our work was to investigate further the role of auxin in the mycorrhizal developmental process. We already know that AM symbiosis stimulates the lateral root formation in host plants, which could be due to modification of auxin metabolism, transport or perception. The microRNAs (miRNAs) are ~21-nucleotides noncoding RNAs that target corresponding mRNA transcripts for cleavage and transcriptional repression. Several miRNAs interact with auxin signaling and among them miR393 that targets auxin receptors. We investigated the role of miR393 in AM root colonization. In Solanum lycopersicum (Solanaceae), Medicago truncatula (Fabaceae) and Oryza sativa (Poaceae), expression of the precursors of the miR393 was down-regulated during mycorrhization. In addition DR5-GUS, a reporter for auxin response, was found to be preferentially expressed in root cells containing arbuscules. By over-expressing miR393 in roots and therefore down-regulating auxin receptor genes, arbuscules could not develop normally. As components of auxin receptor complexes, Aux/IAA proteins play a major role in auxin signaling pathway by repressing the activity of ARF type transcription factors. We checked the expression of 25 AUX/IAA genes in AM roots. Among them, we focused on IAA27 that was significantly up-regulated during the early stages of AM symbiosis. IAA27 down-regulation in plants led to a strong decrease of AM colonization and arbuscule abundance. We showed by different approaches that the positive regulation of mycorrhization by IAA27 was linked to strigolactone biosynthesis. Overall these results strongly support the hypothesis that auxin signaling plays an important role both in the early stage of mycorrhization and in the arbuscule formation.

Cette thèse cherche à discriminer au niveau génomique entre le développement d'embryons vers un mode de reproduction sexué et le développement vers un mode asexué chez le puceron du pois, Acyrthosiphon pisum. Cette discrimination passe par la création du réseau de régulation post-transcriptionnelle des microARN et des ARNm qui possèdent des cinétiques d'expression différentes entre ces deux embryogenèses ainsi que par l'analyse des modules d'interactions de ce réseau par l'utilisation de l'analyse de concepts formels. Pour ce faire, une stratégie en plusieurs étapes a été mise en place : la création d'un réseau d'interactions entre les microARN et les ARNm du puceron du pois ; l'extraction et la réduction du réseau aux microARN et ARNm qui possèdent des cinétiques différentes entre les deux embryogenèses à partir des données d'expression tirées du séquençage haut-débit ; l'analyse du réseau d'interactions réduit aux éléments d’intérêt par l'analyse de concepts formels. L'analyse du réseau a permis l'identification de différentes fonctions potentiellement importantes comme l'ovogenèse, la régulation transcriptionnelle ou encore le système neuroendocrinien. En plus de l'analyse du réseau, l'analyse de concepts formels a été utilisée pour définir une méthode de réparation de graphe biparti basée sur une topologie en "concepts" ainsi qu'une méthode de visualisation de graphes bipartis par ses concepts. / This thesis aims to discriminate between embryos development towards either sexual or asexual reproduction types in pea aphids, Acyrthosiphon pisum, at the genomic level. This discrimination involves the creation of a post-transcriptional regulation network between microRNAs and mRNAs whose kinetic expressions change depending on the embryogenesis. It also involves a study of this network's interaction modules using formal concept analysis. To do so, a three-step strategy was set up. First the creation of an interaction network between the pea aphid's microRNAs and mRNAs. The network is then reduced by keeping only microRNAs and mRNAs which possess differential kinetics between the two embryogeneses, these are obtained using high-throughput sequencing data. Finally the remaining network is analysed using formal concept analysis. Analysing the network allowed for the identification of several functions of potential interest such as oogenesis, transcriptional regulation or even neuroendocrine system. In addition to network analysis, formal concept analysis was used to create a new method to repair a bipartite graph based on its topology and a method to visualise a bipartite graph using its formal concepts.