Made available in DSpace on 2014-07-29T15:25:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 patricia kott.pdf: 7658177 bytes, checksum: ad9ad7831fb8596c7e55d3b1f0eee117 (MD5) Previous issue date: 2010-02-26 / Paracoccidioides brasiliensis is a thermo-dimorphic human pathogenic fungus that lives at 23”C in the mycelium phase (infecting phase) and at 37”C in the yeast phase (parasite phase). In attempt to survive, the cell wall of fungi can change its composition and/or structure in response to environmental stress by compensatory mechanisms. The molecules involved in these mechanisms are possible target for the development of effective antifungal agents. In P. brasiliensis, the main components of the cell wall are glucans and chitin polymers. These polymers make a primary barrier that is responsible for the structural integrity and form of the cell wall. In this work the behavior of P. brasiliensis was evaluated against stress conditions with the aim of study, for the first time, the mechanisms used by this fungus in the maintenance of the cell wall integrity. Our results shown that P. brasiliensis yeast cells are sensitive to cell wall stressors calcofluor white (CFW), congo red (CR), SDS, KCl, NaCl and sorbitol. There was an increase in the PbFKS1 transcripts expression and in the content of cell wall β- 1,3-glicana after treatment with all stressor agents. After treatment with SDS and KCl the PbGFA1 transcripts expression and the cell wall GlcNAc residues also increased. The transcript expression of PbGEL3 was also evaluated being increased after treatment with CFW, NaCl and sorbitol. Thus we showed that these molecules are involved in the maintenance of the cell wall against stress conditions. Apart from these analyses we obtained the active recombinant protein PbFks1pc. Through the anti-PbFks1pc antibody we performed immunocitolocalization assays. These experiments revealed the localization of PbFks1p in regions of apical growth in the mycelium phase and in the cell surface in yeast phase. / Paracoccidioides brasiliensis Š um fungo patog‰nico e termodim‚rfico que se apresenta na forma de micŠlio a 23”C (forma infectante) e na forma de levedura a 37”C (forma parasit€ria). A parede celular de fungos Š capaz de alterar sua composiƒ o e atŠ mesmo sua estrutura em resposta a condiƒ•es ambientais de estresse atravŠs de mecanismos compensat‚rios. As prote…nas envolvidas nestes mecanismos s o poss…veis alvos para o desenvolvimento de agentes antifˆngicos espec…ficos. Em P. brasiliensis, os principais pol…meros que constituem a parede celular s o glicanas e quitina. Estes pol…meros formam uma barreira prim€ria que Š respons€vel pela integridade estrutural e forma da parede celular. Neste trabalho, o comportamento de P. brasiliensis diante de situaƒ•es de estresse foi investigado com o intuito de estudar, pela primeira vez, os mecanismos utilizados por este fungo na manutenƒ o da integridade da parede celular. Nossos resultados mostram que cŠlulas leveduriformes de P. brasiliensis s o sens…veis aos agentes estressores da parede celular calcofluor white (CFW), congo red (CR), SDS, NaCl, KCl e sorbitol. Houve um aumento na express o de transcritos de PbFKS1 e no conteˆdo do pol…mero de β-1,3-glicana na parede celular ap‚s tratamento com todos os agentes estressores. Ap‚s tratamento com SDS e KCl a express o de transcritos de PbGFA1 assim como o conteˆdo de res…duos de GlcNAc na parede celular tambŠm aumentaram. A express o dos transcritos de PbGEL3 tambŠm foi avaliada estando aumentada ap‚s tratamento com CFW, NaCl e sorbitol. Desta forma, mostramos que estas molŠculas est o envolvidas na manutenƒ o da parede celular diante de situaƒ•es de estresse. AlŠm destas an€lises, a prote…na recombinante PbFks1pc ativa foi obtida. AtravŠs do anticorpo anti-PbFks1pc realizamos ensaios de imunocitolocalizaƒ o. Estes experimentos revelaram a presenƒa de PbFks1p em regi•es de crescimento apical no micŠlio e na superf…cie celular em cŠlulas leveduriformes.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Corynebacterium diphtheriae pode ser isolado tanto de quadros de difteria clássica, quanto de infecções sistêmicas, como endocardite. O fibrinogênio (Fbn) e a fibronectina (Fn) são glicoproteínas presentes na matriz extracelular de tecidos conjuntivos. A influência destas proteínas na patogênese das infecções locais e invasivas causadas por C. diphtheriae é objeto de estudo devido ao fato do bacilo diftérico poder ser encontrado em lesões nas quais o Fbn e a Fn são predominantes, incluindo a pseudomembrana diftérica e vegetações cardíacas presentes na endocardite infecciosa. São crescentes as evidências de que o C. diphtheriae pode, além de aderir, ser internalizado por células em cultura. No presente estudo, investigou-se a participação de C. diphtheriae e das proteínas de superfície 67-72p na aderência à Fn e ao Fbn de plasma humano e a eritrócitos. A aderência às células HEp-2 e internalização também foram analisadas. A participação de 67-72p nos mecanismos de morte celular foi avaliada através das colorações por Azul de Tripan e 46-diamidino-2-fenil indol (DAPI), pelo ensaio de redução utilizando dimetil-tiazol-difenil tetrazólio (MTT) e por citometria de fluxo. As 67-72p foram extraídas da superfície da amostra toxigênica C. diphtheriae subsp. mitis CDC-E8392 através de processos mecânicos e precipitação com sulfato de amônio saturado. Análises por SDS-PAGE e immunoblotting detectaram a presença das bandas protéicas de 67 e 72kDa nas amostras toxinogênicas e atoxinogênicas analisadas, as quais pertenciam aos biotipos fermentador e não fermentador de sacarose. C. diphtheriae foi capazes não só de formar agregados na presença de plasma de coelho, mas também de converter Fbn em fibrina independentemente da presença do gene tox. No entanto, a amostra atoxinogênica ATCC 27010 (tox-) foi menos aderente ao Fbn do que a homóloga ATCC 27012 (tox+). A interação bacteriana com eritrócitos foi inibida somente pela Fn. Ligações entre Fn e/ou Fbn com 67-72p foram demonstradas por dot blotting, ELISA e/ou ensaios utilizando fluorescência. As 67-72p foram capazes de inibir as interações bacterianas com o Fbn, indicando que 67-72p podem participar do processo de aderência do patógeno aos tecidos do hospedeiro. Através da microscopia óptica, demonstrou-se a ligação de 67-72p adsorvidas em microesferas de látex com células HEp-2. Anticorpos de coelho do tipo IgG anti 67-72p interferiram somente com a expressão do padrão de aderência do tipo difuso, normalmente apresentado pela amostra CDC-E8392. A Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e a inibição da internalização bacteriana pela IgG anti 67-72p ou por 67-72p indicaram o papel de 67-72p como invasina. Alterações do citoesqueleto de células HEp-2 com acumulação de actina polimerizada, induzida por microesferas sensibilizadas com 67-72p, foi observada pelo fluorescent actin staining (FAS) test. Foi visualizado um aumento no número de bactérias viáveis no compartimento intracelular após tratamento de células HEp-2 ou dos microrganismos com Fn. A presença de partículas de látex adsorvidas com 67-72p no interior de vacúolos frouxos em células HEp-2 sugeriu que estas proteínas podem causar efeito citotóxico. A avaliação através das colorações com Azul de Tripan, DAPI e os ensaios de redução utilizando MTT demonstraram um decréscimo na viabilidade de células tratadas com 67-72p. As mudanças morfológicas observadas 3 horas após o início do tratamento com 67-72p incluíram vacuolização, fragmentação nuclear e formação de corpúsculos apoptóticos. A citometria de fluxo revelou um decréscimo de 15,13% no volume/tamanho de células tratadas com 67-72p. Além disso, o ensaio utilizando Iodeto de Propídio (IP) e Anexina V (AV)-FITIC demonstrou que havia 66,1% de células vivas (IP-/AV-), 16,6% de células em apoptose inicial (IP-/AV+) e 13,8% de células em apoptose tardia ou necrose secundária. Em conclusão, as 67-72p estão diretamente envolvidas na interação com Fn e Fbn. As proteínas não fimbriais 67-72p são hemaglutininas implicadas na aderência a células respiratórias e na internalização. Além disso, estas proteínas podem atuar como fatores de virulência em potencial para induzir apoptose de células epiteliais nos estágios iniciais da difteria e nas infecções invasivas causadas pelo C. diphtheriae / Corynebacterium diphtheriae have been isolated from classical diphtheria and systemic infections such as endocarditis. Fibrinogen (Fbn) and fibronectin (Fn) are high molecular-weight glycoproteins that may be found in extracellular matrix of connective tissues. Their influence in the pathogenesis of local and in invasive C. diphtheriae infection is object of interest due to the fact that diphtheria bacilli is recovered from lesions where such proteins are predominant, including pharyngeal pseudomembrane and valve heart vegetations in infectious endocarditis. There is growing evidence that C. diphtheriae may adhere to and be internalized by cells in culture. The present study investigated the participation of C. diphtheriae strains and 67-72p, a surface protein, in adherence to human plasma Fn, Fbn, erythrocytes, adherence to and internalization by HEp-2 cells. The participation of 67-72p in promoting cell death was evaluated by the Trypan blue, DAPI staining methods, methylthiazole tetrazolium (MTT) reduction assay and flow cytometry. The 67-72p was extracted from C. diphtheriae subsp. mitis CDC-E8392 toxigenic strain, by mechanical process and ammonium sulfate fractionation. SDS-PAGE and immunoblotting analysis detected the polypeptide bands of 67 and 72 kDa in all toxigenic and nontoxigenic strains from both sucrose-fermenting and non-fermenting biotypes. Diphtheria bacilli were capable to both form bacterial aggregates in rabbit plasma and to convert Fbn to fibrin independently to the presence of tox gene, albeit the ATCC 27010 (tox-) strain was less adherent to Fbn than the parental strain ATCC 27012 (tox+). Bacteria-erythrocytes interaction was inhibited only by Fn. Interactions of Fn and/or Fbn with 67-72p were demonstrated by dot blotting, ELISA and/or fluorescence assays. Bacteria-Fbn interaction was inhibited by 67-72p, indicating that 67-72p may participate in the adhesion of the pathogen to host tissues. The interaction of HEp-2 cells with 67-72p-adsorbed latex microspheres was demonstrated by light microscopy. Rabbit IgG anti 67-72p was shown to interfere with diffuse adherence phenotype to HEp-2 cells displayed by CDC-E8392, but not by other phenotypes. Transmission electron microscopy (TEM) and the inhibition of bacterial internalization by anti 67-72p IgG and 67-72p indicated the role of 67-72p as invasin. Cytoskeletal accumulation of polymerized actin in HEp-2 cells induced by 67-72p-microspheres was observed by the fluorescent actin staining (FAS) test. Fn enhanced the intracellular viability of all strains tested. The presence of 67-72p-latex particles inside spacious vacuoles (SV) in HEp-2 cells, suggested a citotoxic effect of these proteins. Evaluation by the Trypan blue staining method, 4,6-Diamidine-2-phenylindole dihydrochloride DAPI and the 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reduction assay showed a significant decrease in viability of HEp-2 cells treated with 0.2 mg/ml 67-72p. Morphological changes in HEp-2 cells (vacuolization, nuclear fragmentation, and the formation of apoptotic bodies) was observed after 3 h post-treatment with 67-72p. Flow cytometry revealed a 15.13% reduction apoptotic volume of HEp-2 cells treated with 0.2 mg/ml 67-72p. Moreover, a double-staining assay using Propidium Iodide (PI)/Annexin V (AV) demonstrated the numbers of vital (PI-/AV-) (66.1%) vs. early apoptotic (PI-/AV+) (16.6%) cells and late apoptotic or secondary necrotic cells (PI+/AV+) (13.8%). In conclusion, the 67-72p are directly implicated in C. diphtheriae interaction with Fn and Fbn. The non-fimbrial Fn/Fbn binding 67-72p are hemagglutinins directly implicated in adherence to and internalization by respiratory epithelial cells. Moreover, 67-72p may act as a potential virulence factor to induce apoptosis of epithelial cells in the early stages of diphtheria and C. diphtheriae invasive infection

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / ExoU, uma citotoxina produzida pelo patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa e translocada para o citossol de células hospedeiras via sistema de secreção do tipo III, é associada à gravidade de infecções agudas. Estudos anteriores realizados em nosso laboratório relataram a potente atividade pró-inflamatória de ExoU, responsável por um intenso recrutamento de neutrófilos para o sítio de infecção. No presente trabalho, o efeito de ExoU na modulação da ativação do fator transcricional NF-κB e na regulação da expressão e da secreção da quimiocina para neutrófilos IL-8 foi avaliado em culturas de células epiteliais respiratórias e endoteliais humanas infectadas com a cepa PA103 de P. aeruginosa (produtora de ExoU) ou com a mutante deletada no gene exoU, PA103κexoU. Análises por RT-PCR semi-quantitativo mostraram que a infecção pela cepa produtora de ExoU levou ao aumento dos níveis de mRNA de IL-8, enquanto ensaios de alteração da mobilidade eletroforética (EMSA), supershift e com gene repórter mostraram que ExoU induziu a translocação nuclear do heterodímero transativador p65/p50 de NF-κB e a ativação da transcrição de genes dependente deste fator transcricional. Adicionalmente, o tratamento das culturas celulares com um inibidor de NF-κB antes da infecção bacteriana reduziu significativamente os níveis de mRNA de IL-8 e da secreção desta quimiocina. Em conjunto, estes resultados mostram que ExoU ativa NF-κB e, consequentemente, estimula a expressão e a secreção de IL-8 por células epiteliais respiratórias e células endoteliais infectadas com P. aeruginosa / ExoU, a cytotoxin produced by the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa that is translocated into host cell cytosol by the type three secretory system, has been associated with severity of acute infections. We have previously described the potent ExoU proinflammatory activity, which accounts for a market recruitment of neutrophils to infected tissues. In this present study, the effect of ExoU on the activation of the transcriptional factor NF-B and on the regulation of the expression and secretion of the chemokine IL-8 was investigated in human epithelial respiratory and endothelial cell cultures infected with the ExoU-producing PA103 P. aeruginosa or with the bacterial mutant with the deletion of the exoU gene PA103exoU. By semi-quantitative RT-PCR, ExoU was shown to significantly increase the expression of IL-8 mRNA. By electrophoretic mobility shift assay (EMSA), supershift and reporter assay ExoU was shown to induce the nuclear translocation of the NF-κB p65/p50 transactivator heterodimer as well as the NF-κB-dependent transcriptional activity. In addition, treatment both the IL-8 mRNA expression and the protein secretion. Together, our results show that ExoU activates NF-B and stimulates IL-8 expression and secretion by P. aeruginosa-infected human epithelial respiratory and endothelial cells

P. aeruginosa é um importante agente de infecções relacionadas à assistência em saúde. Habitualmente, o estabelecimento de infecções agudas é precedido pela colonização das mucosas dos pacientes. Não se sabe, porém, se os processos infecciosos são causados pelas próprias cepas bacterianas colonizadoras ou por outras com que os pacientes entrem em contato, dotadas ou não de maior potencial de virulência ou de resistência a antimicrobianos que as tornem mais eficientes como agentes infecciosos. Assim, este estudo teve como objetivos i) investigar a existência de potenciais diferenças entre amostras de P. aeruginosa que causaram apenas colonização e aquelas responsáveis por infecção, isoladas de um mesmo paciente, quanto a seus fenótipos de virulência e de não susceptibilidade a antimicrobiamos; ii) pesquisar a existência de associação entre características dos paciente, incluindo o tipo de evolução clínica, com as demais variáveis estudadas. No estudo foram incluídos 21 pacientes que desenvolveram infecção por P. aeruginosa durante sua internação no Centro de Terapia Intensiva do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, entre abril de 2007 e abril de 2008. De cada paciente foram selecionadas duas amostras bacterianas: a primeira isolada durante o episódio de infecção e a amostra colonizadora obtida imediatamente antes da ocorrência da infecção. As amostras selecionadas foram estudadas quanto a i) expressão de três mecanismos de virulência (citotoxicidade, aderência a células epiteliais respiratórias humanas e capacidade de formação de biofilme); ii) presença de genes codificadores das proteínas efetoras do sistema de secreção do tipo 3 (SST3 - exoS, exoT, exoU e exoY); iii) perfil de susceptibilidade a antimicrobianos, iv) perfil de fragmentação do DNA cromossômico por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). As amostras bacterianas obtidas de infecções agudas foram significativamente mais citotóxicas que aquelas obtidas de colonização. Embora sem diferença estatística, a citotoxicidade das amostras que causaram infecção em pacientes que evoluíram para óbito foi superior à citotoxicidade das amostras de pacientes que sobreviveram. O gene que codifica a toxina ExoU foi detectado em 16 amostras (38%), sendo nove de colonização e sete de infecção. Não houve diferença significativa entre as amostras de colonização e infecção quanto à aderência, produção de biofilme, expressão dos genes do SST3 e não-susceptibilidade às diferentes classes de antimicrobianos. Também não foi encontrada associação entre a não-susceptibilidade à quinolona, ou a outras classes de antimicrobianos, e a presença do gene exoU. As 42 amostras de P. aeruginosa estudadas foram incluídas em 20 genótipos. Em 10 deles foi detectado o gene exoU. Amostras de um mesmo genótipo foram uniformes quanto à expressão dos genes do SST3 e a não-susceptibilidade aos antimicrobianos, mas não quanto às outras variáveis estudadas. Em apenas sete pacientes (33,3%), as amostras de colonização e de infecção pertenciam ao mesmo genótipo. Assim, nesse estudo, o estabelecimento do processo infeccioso resultou não da perda do equilíbrio estabelecido entre os mecanismos de agressão das amostras colonizadoras e os de defesa do hospedeiro e sim da introdução de nova cepa bacteriana no organismo hospedeiro, cepa esta dotada de maior potencial citotóxico. / P. aeruginosa is an important agent of healthcare-associated infections. The establishment of acute infectious episodes is usually preceded by colonization of patient mucosa. However, it remains unknown whether the infectious processes are caused by bacterial strains previously colonizing the patient or by additional strains the patient may come into contact. These new isolates may carry greater virulence potential or antibiotic resistance that makes them more efficient as an infecting agent. Thus, the objetives of the present study were i) to investigate the existence of potential differences between P. aeruginosa isolates obtained from a colonized mucosa and isolates accounting for infectious processes, recovered from the same patient, with respect to virulence phenotypes and non-susceptibility to antimicrobial agents; ii) to investigate the existence of association between patient features, including the type of clinical outcome, with bacterial characteristics. The study included 21 patients who developed P. aeruginosa infection during their stay in the Intensive Care Unit of the University Hospital Clementino Fraga Filho, from April 2007 to April 2008. Two P. aeruginosa isolates were selected from each patient: the first isolate recovered from the infectious episode and the colonizing isolate obtained immediately before the onset of the infection. Features from the isolates investigated included: i) expression of three virulence mechanisms (cytotoxicity, adherence to human respiratory epithelial cells and biofilm formation); ii) presence of the genes encoding type III secretion system effector proteins (TTSS, exoS , exoT , exoU and exoY); iii) antimicrobial susceptibility profile; iv) profile of the bacterial chromossomic DNA fragmentation following analysis by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The bacterial isolates obtained from acute infections were significantly more cytotoxic than colonizing strains. Moreover, bacteria accounting for infectious episodes in patients who died were more cytotoxic than those recovered from patients who survived, although the differences were not statistically significant. The ExoU toxin encoding gene was detected in 16 (38%) P. aeruginosa isolates: nine colonizing and seven infecting strains. There was no significant difference between colonizing and infecting samples in their adherence, biofilm production, expression of TTSS genes and non- susceptibility to different classes of antimicrobials. There was also no association between non-susceptibility to quinolone, or to any other class of antimicrobial agents, and the presence of the exoU gene. Twenty PFGE genotypes were identified. Isolates from 10 genotypes harboured the exoU gene. Isolates included in the same PFGE genotype exhibited a similar profile of TTSS genes and non-susceptibility to antimicrobials, but not always a similar profile of expression the other variables investigated. In only seven patients (33.3%), the colonizing and infecting isolates belonged to a same genotype. Thus, in this study, the establishment of the infectious process did not result from the loss of the equilibrium established between the aggression mechanisms of colonizing bacteria and host defense but rather from the introduction, in the host organism, of a new bacterial strain, endowed with a greater cytotoxic potential.

P. aeruginosa é um importante agente de infecções relacionadas à assistência em saúde. Habitualmente, o estabelecimento de infecções agudas é precedido pela colonização das mucosas dos pacientes. Não se sabe, porém, se os processos infecciosos são causados pelas próprias cepas bacterianas colonizadoras ou por outras com que os pacientes entrem em contato, dotadas ou não de maior potencial de virulência ou de resistência a antimicrobianos que as tornem mais eficientes como agentes infecciosos. Assim, este estudo teve como objetivos i) investigar a existência de potenciais diferenças entre amostras de P. aeruginosa que causaram apenas colonização e aquelas responsáveis por infecção, isoladas de um mesmo paciente, quanto a seus fenótipos de virulência e de não susceptibilidade a antimicrobiamos; ii) pesquisar a existência de associação entre características dos paciente, incluindo o tipo de evolução clínica, com as demais variáveis estudadas. No estudo foram incluídos 21 pacientes que desenvolveram infecção por P. aeruginosa durante sua internação no Centro de Terapia Intensiva do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, entre abril de 2007 e abril de 2008. De cada paciente foram selecionadas duas amostras bacterianas: a primeira isolada durante o episódio de infecção e a amostra colonizadora obtida imediatamente antes da ocorrência da infecção. As amostras selecionadas foram estudadas quanto a i) expressão de três mecanismos de virulência (citotoxicidade, aderência a células epiteliais respiratórias humanas e capacidade de formação de biofilme); ii) presença de genes codificadores das proteínas efetoras do sistema de secreção do tipo 3 (SST3 - exoS, exoT, exoU e exoY); iii) perfil de susceptibilidade a antimicrobianos, iv) perfil de fragmentação do DNA cromossômico por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). As amostras bacterianas obtidas de infecções agudas foram significativamente mais citotóxicas que aquelas obtidas de colonização. Embora sem diferença estatística, a citotoxicidade das amostras que causaram infecção em pacientes que evoluíram para óbito foi superior à citotoxicidade das amostras de pacientes que sobreviveram. O gene que codifica a toxina ExoU foi detectado em 16 amostras (38%), sendo nove de colonização e sete de infecção. Não houve diferença significativa entre as amostras de colonização e infecção quanto à aderência, produção de biofilme, expressão dos genes do SST3 e não-susceptibilidade às diferentes classes de antimicrobianos. Também não foi encontrada associação entre a não-susceptibilidade à quinolona, ou a outras classes de antimicrobianos, e a presença do gene exoU. As 42 amostras de P. aeruginosa estudadas foram incluídas em 20 genótipos. Em 10 deles foi detectado o gene exoU. Amostras de um mesmo genótipo foram uniformes quanto à expressão dos genes do SST3 e a não-susceptibilidade aos antimicrobianos, mas não quanto às outras variáveis estudadas. Em apenas sete pacientes (33,3%), as amostras de colonização e de infecção pertenciam ao mesmo genótipo. Assim, nesse estudo, o estabelecimento do processo infeccioso resultou não da perda do equilíbrio estabelecido entre os mecanismos de agressão das amostras colonizadoras e os de defesa do hospedeiro e sim da introdução de nova cepa bacteriana no organismo hospedeiro, cepa esta dotada de maior potencial citotóxico. / P. aeruginosa is an important agent of healthcare-associated infections. The establishment of acute infectious episodes is usually preceded by colonization of patient mucosa. However, it remains unknown whether the infectious processes are caused by bacterial strains previously colonizing the patient or by additional strains the patient may come into contact. These new isolates may carry greater virulence potential or antibiotic resistance that makes them more efficient as an infecting agent. Thus, the objetives of the present study were i) to investigate the existence of potential differences between P. aeruginosa isolates obtained from a colonized mucosa and isolates accounting for infectious processes, recovered from the same patient, with respect to virulence phenotypes and non-susceptibility to antimicrobial agents; ii) to investigate the existence of association between patient features, including the type of clinical outcome, with bacterial characteristics. The study included 21 patients who developed P. aeruginosa infection during their stay in the Intensive Care Unit of the University Hospital Clementino Fraga Filho, from April 2007 to April 2008. Two P. aeruginosa isolates were selected from each patient: the first isolate recovered from the infectious episode and the colonizing isolate obtained immediately before the onset of the infection. Features from the isolates investigated included: i) expression of three virulence mechanisms (cytotoxicity, adherence to human respiratory epithelial cells and biofilm formation); ii) presence of the genes encoding type III secretion system effector proteins (TTSS, exoS , exoT , exoU and exoY); iii) antimicrobial susceptibility profile; iv) profile of the bacterial chromossomic DNA fragmentation following analysis by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The bacterial isolates obtained from acute infections were significantly more cytotoxic than colonizing strains. Moreover, bacteria accounting for infectious episodes in patients who died were more cytotoxic than those recovered from patients who survived, although the differences were not statistically significant. The ExoU toxin encoding gene was detected in 16 (38%) P. aeruginosa isolates: nine colonizing and seven infecting strains. There was no significant difference between colonizing and infecting samples in their adherence, biofilm production, expression of TTSS genes and non- susceptibility to different classes of antimicrobials. There was also no association between non-susceptibility to quinolone, or to any other class of antimicrobial agents, and the presence of the exoU gene. Twenty PFGE genotypes were identified. Isolates from 10 genotypes harboured the exoU gene. Isolates included in the same PFGE genotype exhibited a similar profile of TTSS genes and non-susceptibility to antimicrobials, but not always a similar profile of expression the other variables investigated. In only seven patients (33.3%), the colonizing and infecting isolates belonged to a same genotype. Thus, in this study, the establishment of the infectious process did not result from the loss of the equilibrium established between the aggression mechanisms of colonizing bacteria and host defense but rather from the introduction, in the host organism, of a new bacterial strain, endowed with a greater cytotoxic potential.

Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) é um dos principais microrganismos envolvidos nas Infecções relacionadas à Assistência à Saúde (IrAS). Porém, um clone de MRSA, o CA-MRSA, emergiu na comunidade e atualmente vem sendo agente de IrAS. O objetivo desta dissertação é avaliar fenotípica e genotipicamente 111 amostras de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina e sensíveis a antibióticos não ß-lactâmicos de pacientes atendidos em cinco hospitais no município do Rio de Janeiro. Utilizando os critérios padronizados pelo CLSI 2012, foram determinadas as susceptibilidades a 11 antimicrobianos pelo método de disco difusão em ágar e concentração inibitória mínima para vancomicina e oxacilina pelo método da microdiluição em caldo. A multirresistência (resistência a 3 ou mais antimicrobianos não ß-lactâmicos) foi observada em 31,5% das amostras, sendo que 53,2% apresentaram resistência ao antimicrobiano clindamicina, uma das opções para o tratamento empírico das infecções de pele/tecidos moles. 86,4% apresentaram concentração inibitória mínima (CIM) para vancomicina ≥ 1,0 g/mL ou seja, elevado percentual de amostras associadas ao fenômeno MIC creep, o qual está associado ao insucesso na terapia antimicrobiana anti-MRSA. Não foi observado até o momento nenhuma amostra com CIM ≥ 4cg/mL para vancomicina, entretanto, já há resistência à linezolida em quatro hospitais do estudo. A tipificação do SCCmec nos permitiu classificar 4,5% das amostras em HA-MRSA e 86,5% em CA-MRSA, nas quais a resistência heterogênea típica à oxacilina foi observada em 57,2%. A toxina de Panton-Valentine (PVL) foi identificada pela metodologia de PCR em 28% das amostras com genótipo CA-MRSA. Os fatores de riscos clássicos, da literatura, relacionados à infecção por HA-MRSA foram também observados nos pacientes com infecção por CA-MRSA portadoras de SCCmec IV e V. No intuito de verificar a existência de similaridades genéticas ou a presença de clone predominante entre as amostras dos cinco hospitais, foi realizada a técnica de eletroforese em gel sob campo pulsado (PFGE) e observou-se diversidade genética assim como a presença de amostras com padrões similares aos clones OSPC (18,5%) e USA400. Não foram encontradas amostras com padrões de eletroforese similares aos clones USA300, USA800 e CEB. É essencial a vigilância da resistência aos antimicrobianos não ß-lactâmicos no CA-MRSA, em especial à vancomicina. A mudança na epidemiologia deste microrganismo vem impactando os padrões característicos dos genótipos limitando os critérios de diferenciação entre eles. Neste contexto, as técnicas moleculares atuam como excelentes ferramentas de caracterização. O conhecimento do patógeno auxilia na elaboração e implementação de medidas preventivas, contribuindo para o controle da doença tanto no ambiente hospitalar quanto na comunidade. / Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is a major microrganism involved in healthcare associated infections (HAIs). However, a clone of MRSA, CA-MRSA, has emerged in the community and has been considered agent of HAIs. The goal of this dissertation is to evaluate phenotypically and genotypically 111 samples of methicillin-resistant Staphylococcus aureus susceptible to non ß-lactam antibiotics from patients treated in five hospitals in the city of Rio de Janeiro. Using the Clinical and Laboratory Standards Institute criteria were determined susceptibility to 11 antimicrobials by the disk diffusion method and minimal inhibitory concentration for oxacillin and vancomycin by broth microdilution method. The multidrug resistance (resistance to three or more non ß-lactam antibiotics) was observed in 31.5% of isolates, and 53.2% were resistant to the antimicrobial clindamycin, one of the choices in the empirical treatment of infections of skin / soft tissue. 86.4% showed minimal inhibitory concentration (MIC) for vancomycin ≥ 1.0 mg / mL, representing high percentage of samples associated with the MIC creep phenomenon, which can imply therapeutic failure. The typification of SCCmec enabled us to classify 4,5% of the samples in HA-MRSA and 86.5% in CA-MRSA, among which the typical heterogeneous oxacillin resistance was observed in 57.2%. The Panton-Valentine Leukocidin (PVL) toxin, one of the virulence factors involved in the pathogeneses of MRSA, was present in 28% of samples with genotype CA-MRSA. We performed uptake of demographic and clinical information on patients medical records and verified the presence of classical risk factors for HA-MRSA infection in individuals infected by CA-MRSA carrying SCCmec IV and V. In order to verify the existence of genetic similarities or the presence of predominant clone among the samples of the five hospitals, we applied the technique of pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and observed genetic diversity and the presence of samples with standards similar to OSPC clones (18.5%) and USA400. There were no samples with electrophoresis patterns similar to clone USA300, USA800 and CEB. Surveillance of resistance to non ß-lactam antibiotics is essencial in CA-MRSA, especially vancomycin. The change in the epidemiology of this microrganism has been impacting the characteristic patterns of genotypes limiting criteria of differentiation between them. In this context, molecular techniques serve as excellent characterization tools. Knowledge of pathogen assists in the development and implementation of preventive measures, contributing to disease control both in hospitals and in the community.

Pseudomonas aeruginosa é um importante agente de pneumonia, particularmente em pacientes submetidos à ventilação mecânica, que pode evoluir para sepse, com elevadas taxas de letalidade. Na sepse, o processo inflamatório sistêmico exacerbado favorece o desequilíbrio entre as vias de coagulação e fibrinólise e a instalação de um estado pró-coagulante, com o aparecimento de trombose microvascular, coagulação intravascular disseminada e falência de múltiplos órgãos. Conhecendo a potente atividade pró-inflamatória da toxina ExoU produzida por P. aeruginosa, decorrente de sua atividade fosfolipásica A2, o objetivo desta tese foi investigar seu potencial de indução de alterações hemostáticas relacionadas à patogênese da sepse. Utilizando modelo de sepse em camundongos inoculados, por via intratraqueal, com suspensões de P. aeruginosa produtora de ExoU (PA103) ou de cepa com deleção do gene exoU, não produtora da toxina, foi mostrado que ExoU determinou maior gravidade da infecção, maior taxa de letalidade, leucopenia, trombocitose, hiperpermeabilidade vascular e transudação plasmática, evidenciadas, respectivamente, pela maior concentração de proteínas nos lavados broncoalveolares (LBAs) e acúmulo do corante Azul de Evans, previamente inoculado nos animais, por via endovenosa, no parênquima renal. ExoU favoreceu, também, a ativação plaquetária, confirmada pela maior concentração de plaquetas expressando P-selectina em sua superfície, maior número de micropartículas derivadas de plaquetas e maior concentração plasmática de tromboxano A2. A histopatologia dos pulmões e rins dos animais infectados com PA103 confirmou a formação de microtrombos, que não foram detectados nos animais controles ou infectados com a cepa mutante. Nos pulmões, a produção de ExoU determinou intensa resposta inflamatória com maior concentração de leucócitos totais e polimorfonucleados, interleucina-6 e fator de necrose tumoral-α nos LBAs. A análise imunohistoquímica mostrou intensa deposição de fibrina nos alvéolos e septos interalveolares. A atividade pró-coagulante dependente do fator tissular detectada nos LBAs dos camundongos infectados com PA103 foi independente da produção do inibidor da via de ativação do fator tissular (TFPI), mas associada ao aumento da produção do inibidor do ativador do plasminogênio-1 (PAI-1). Para investigar a participação do fator de ativação plaquetária (PAF) na liberação de PAI-1, foi pesquisada a atividade da enzima PAF-acetil-hidrolase (PAF-AH) nos LBAs dos camundongos. A atividade de PAF-AH apresentou-se significativamente elevada nos LBA dos camundongos infectados com PA103. O tratamento dos animais com um inibidor do PAF, antes da infecção, resultou na diminuição significativa das concentrações de PAI-1 e de leucócitos totais, bem como da atividade pró-coagulante dos LBAs. In vitro, ExoU induziu maior expressão do RNA mensageiro de PAI-1 e maior liberação da proteína PAI-1 nos sobrenadantes de células epiteliais respiratórias da linhagem A549. O tratamento das células A549 com um anticorpo anti-receptor de PAF, antes da infecção, reduziu significativamente a concentração de PAI-1 nos sobrenadantes de células infectadas com a cepa selvagem. Estes resultados demonstraram um novo mecanismo de virulência de P. aeruginosa através da atividade pró-trombótica de ExoU e a possibilidade de utilização da identificação de ExoU em isolados clínicos de pacientes graves como um marcador prognóstico para estes pacientes. / Pseudomonas aeruginosa is an important agent of pneumonia, mainly in patients undergoing mechanical ventilation, which can progress to sepsis with high mortality rates. In sepsis, the systemic inflammatory process favors exacerbated imbalance between the coagulation and fibrinolysis pathways and the installation of a procoagulant state, leading to microvascular thrombosis, disseminated intravascular coagulation and multiple organ failure. Knowing the powerful proinflammatory activity of the P. aeruginosa toxin ExoU, secondary to its phospholipase A2 activity, the goal of this study was to investigate the ExoU potential to induce hemostatic changes related to sepsis pathogenesis. By using a murine model of pneumosepsis, obtained by the intratracheal injection of suspensions of the ExoU-producing PA103 P. aeruginosa strain or of its isogenic mutant PA103ΔexoU, defective in the toxin synthesis, ExoU was shown to enhance the severity of the infection and to induce higher mice mortality rate as well as leukopenia, thrombocytosis, vascular hyperpermeability and plasma transudation, evidenced, respectively, by the higher protein concentration in the bronchoalveolar lavage fluids (BALF) and accumulation of Evans blue dye, previously intravenous injectioned, in mice renal parenchyma. ExoU also favored platelet activation, evidenced by the higher concentration of platelets expressing P-selectin on their surface, greater number of platelet-derived microparticles and increased plasma concentration of thromboxane A2. Histopathology of the lungs and kidneys of PA103-infected animals confirmed the formation of microthrombi, which were not detected in controls or in animals infected with the bacterial mutant. In lungs, ExoU induced an intense inflammatory response with high concentrations of total and polymorphonuclear leukocytes, interleukin-6 and tumor necrosis factor-α in mice BALF. Immunohistochemical analysis showed intense fibrin deposition in the alveoli and interalveolar septa. The tissue factor-dependent procoagulant activity detected in BALF from PA103-infected mice did not depend on decreased production of tissue factor pathway inhibitor (TFPI) production, but was associated with increased concentration of plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1). To investigate the role of platelet activating factor (PAF) in PAI-1 release, we compared the activity of the enzyme PAF-acetylhydrolase (PAF-AH) in BALF from control and infected mice, and we observed that PAF-AH activity was significantly elevated in BALF from PA103-infected animals. Mice treatment with a PAF inhibitor prior to infection resulted in a significant reduction of PAI-1 concentration, as well as of BALF total leukocytes and procoagulant activity. In vitro, ExoU induced higher expression of PAI-1 m RNA and increased release of PAI-1 protein in supernatants from A549 epithelial respiratory cell cultures. A549 cell treatment with an anti-PAF receptor prior to infection significantly reduced PAI-1 concentration in supernatants from cells infected with the wild type strain. These results show a novel mechanism by which a baterial product can favor a prothrombotic activity and ExoU production by infecting P. aeruginosa isolates may have prognostic implications for patients.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Corynebacterium diphtheriae pode ser isolado tanto de quadros de difteria clássica, quanto de infecções sistêmicas, como endocardite. O fibrinogênio (Fbn) e a fibronectina (Fn) são glicoproteínas presentes na matriz extracelular de tecidos conjuntivos. A influência destas proteínas na patogênese das infecções locais e invasivas causadas por C. diphtheriae é objeto de estudo devido ao fato do bacilo diftérico poder ser encontrado em lesões nas quais o Fbn e a Fn são predominantes, incluindo a pseudomembrana diftérica e vegetações cardíacas presentes na endocardite infecciosa. São crescentes as evidências de que o C. diphtheriae pode, além de aderir, ser internalizado por células em cultura. No presente estudo, investigou-se a participação de C. diphtheriae e das proteínas de superfície 67-72p na aderência à Fn e ao Fbn de plasma humano e a eritrócitos. A aderência às células HEp-2 e internalização também foram analisadas. A participação de 67-72p nos mecanismos de morte celular foi avaliada através das colorações por Azul de Tripan e 46-diamidino-2-fenil indol (DAPI), pelo ensaio de redução utilizando dimetil-tiazol-difenil tetrazólio (MTT) e por citometria de fluxo. As 67-72p foram extraídas da superfície da amostra toxigênica C. diphtheriae subsp. mitis CDC-E8392 através de processos mecânicos e precipitação com sulfato de amônio saturado. Análises por SDS-PAGE e immunoblotting detectaram a presença das bandas protéicas de 67 e 72kDa nas amostras toxinogênicas e atoxinogênicas analisadas, as quais pertenciam aos biotipos fermentador e não fermentador de sacarose. C. diphtheriae foi capazes não só de formar agregados na presença de plasma de coelho, mas também de converter Fbn em fibrina independentemente da presença do gene tox. No entanto, a amostra atoxinogênica ATCC 27010 (tox-) foi menos aderente ao Fbn do que a homóloga ATCC 27012 (tox+). A interação bacteriana com eritrócitos foi inibida somente pela Fn. Ligações entre Fn e/ou Fbn com 67-72p foram demonstradas por dot blotting, ELISA e/ou ensaios utilizando fluorescência. As 67-72p foram capazes de inibir as interações bacterianas com o Fbn, indicando que 67-72p podem participar do processo de aderência do patógeno aos tecidos do hospedeiro. Através da microscopia óptica, demonstrou-se a ligação de 67-72p adsorvidas em microesferas de látex com células HEp-2. Anticorpos de coelho do tipo IgG anti 67-72p interferiram somente com a expressão do padrão de aderência do tipo difuso, normalmente apresentado pela amostra CDC-E8392. A Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e a inibição da internalização bacteriana pela IgG anti 67-72p ou por 67-72p indicaram o papel de 67-72p como invasina. Alterações do citoesqueleto de células HEp-2 com acumulação de actina polimerizada, induzida por microesferas sensibilizadas com 67-72p, foi observada pelo fluorescent actin staining (FAS) test. Foi visualizado um aumento no número de bactérias viáveis no compartimento intracelular após tratamento de células HEp-2 ou dos microrganismos com Fn. A presença de partículas de látex adsorvidas com 67-72p no interior de vacúolos frouxos em células HEp-2 sugeriu que estas proteínas podem causar efeito citotóxico. A avaliação através das colorações com Azul de Tripan, DAPI e os ensaios de redução utilizando MTT demonstraram um decréscimo na viabilidade de células tratadas com 67-72p. As mudanças morfológicas observadas 3 horas após o início do tratamento com 67-72p incluíram vacuolização, fragmentação nuclear e formação de corpúsculos apoptóticos. A citometria de fluxo revelou um decréscimo de 15,13% no volume/tamanho de células tratadas com 67-72p. Além disso, o ensaio utilizando Iodeto de Propídio (IP) e Anexina V (AV)-FITIC demonstrou que havia 66,1% de células vivas (IP-/AV-), 16,6% de células em apoptose inicial (IP-/AV+) e 13,8% de células em apoptose tardia ou necrose secundária. Em conclusão, as 67-72p estão diretamente envolvidas na interação com Fn e Fbn. As proteínas não fimbriais 67-72p são hemaglutininas implicadas na aderência a células respiratórias e na internalização. Além disso, estas proteínas podem atuar como fatores de virulência em potencial para induzir apoptose de células epiteliais nos estágios iniciais da difteria e nas infecções invasivas causadas pelo C. diphtheriae / Corynebacterium diphtheriae have been isolated from classical diphtheria and systemic infections such as endocarditis. Fibrinogen (Fbn) and fibronectin (Fn) are high molecular-weight glycoproteins that may be found in extracellular matrix of connective tissues. Their influence in the pathogenesis of local and in invasive C. diphtheriae infection is object of interest due to the fact that diphtheria bacilli is recovered from lesions where such proteins are predominant, including pharyngeal pseudomembrane and valve heart vegetations in infectious endocarditis. There is growing evidence that C. diphtheriae may adhere to and be internalized by cells in culture. The present study investigated the participation of C. diphtheriae strains and 67-72p, a surface protein, in adherence to human plasma Fn, Fbn, erythrocytes, adherence to and internalization by HEp-2 cells. The participation of 67-72p in promoting cell death was evaluated by the Trypan blue, DAPI staining methods, methylthiazole tetrazolium (MTT) reduction assay and flow cytometry. The 67-72p was extracted from C. diphtheriae subsp. mitis CDC-E8392 toxigenic strain, by mechanical process and ammonium sulfate fractionation. SDS-PAGE and immunoblotting analysis detected the polypeptide bands of 67 and 72 kDa in all toxigenic and nontoxigenic strains from both sucrose-fermenting and non-fermenting biotypes. Diphtheria bacilli were capable to both form bacterial aggregates in rabbit plasma and to convert Fbn to fibrin independently to the presence of tox gene, albeit the ATCC 27010 (tox-) strain was less adherent to Fbn than the parental strain ATCC 27012 (tox+). Bacteria-erythrocytes interaction was inhibited only by Fn. Interactions of Fn and/or Fbn with 67-72p were demonstrated by dot blotting, ELISA and/or fluorescence assays. Bacteria-Fbn interaction was inhibited by 67-72p, indicating that 67-72p may participate in the adhesion of the pathogen to host tissues. The interaction of HEp-2 cells with 67-72p-adsorbed latex microspheres was demonstrated by light microscopy. Rabbit IgG anti 67-72p was shown to interfere with diffuse adherence phenotype to HEp-2 cells displayed by CDC-E8392, but not by other phenotypes. Transmission electron microscopy (TEM) and the inhibition of bacterial internalization by anti 67-72p IgG and 67-72p indicated the role of 67-72p as invasin. Cytoskeletal accumulation of polymerized actin in HEp-2 cells induced by 67-72p-microspheres was observed by the fluorescent actin staining (FAS) test. Fn enhanced the intracellular viability of all strains tested. The presence of 67-72p-latex particles inside spacious vacuoles (SV) in HEp-2 cells, suggested a citotoxic effect of these proteins. Evaluation by the Trypan blue staining method, 4,6-Diamidine-2-phenylindole dihydrochloride DAPI and the 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reduction assay showed a significant decrease in viability of HEp-2 cells treated with 0.2 mg/ml 67-72p. Morphological changes in HEp-2 cells (vacuolization, nuclear fragmentation, and the formation of apoptotic bodies) was observed after 3 h post-treatment with 67-72p. Flow cytometry revealed a 15.13% reduction apoptotic volume of HEp-2 cells treated with 0.2 mg/ml 67-72p. Moreover, a double-staining assay using Propidium Iodide (PI)/Annexin V (AV) demonstrated the numbers of vital (PI-/AV-) (66.1%) vs. early apoptotic (PI-/AV+) (16.6%) cells and late apoptotic or secondary necrotic cells (PI+/AV+) (13.8%). In conclusion, the 67-72p are directly implicated in C. diphtheriae interaction with Fn and Fbn. The non-fimbrial Fn/Fbn binding 67-72p are hemagglutinins directly implicated in adherence to and internalization by respiratory epithelial cells. Moreover, 67-72p may act as a potential virulence factor to induce apoptosis of epithelial cells in the early stages of diphtheria and C. diphtheriae invasive infection

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / ExoU, uma citotoxina produzida pelo patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa e translocada para o citossol de células hospedeiras via sistema de secreção do tipo III, é associada à gravidade de infecções agudas. Estudos anteriores realizados em nosso laboratório relataram a potente atividade pró-inflamatória de ExoU, responsável por um intenso recrutamento de neutrófilos para o sítio de infecção. No presente trabalho, o efeito de ExoU na modulação da ativação do fator transcricional NF-κB e na regulação da expressão e da secreção da quimiocina para neutrófilos IL-8 foi avaliado em culturas de células epiteliais respiratórias e endoteliais humanas infectadas com a cepa PA103 de P. aeruginosa (produtora de ExoU) ou com a mutante deletada no gene exoU, PA103κexoU. Análises por RT-PCR semi-quantitativo mostraram que a infecção pela cepa produtora de ExoU levou ao aumento dos níveis de mRNA de IL-8, enquanto ensaios de alteração da mobilidade eletroforética (EMSA), supershift e com gene repórter mostraram que ExoU induziu a translocação nuclear do heterodímero transativador p65/p50 de NF-κB e a ativação da transcrição de genes dependente deste fator transcricional. Adicionalmente, o tratamento das culturas celulares com um inibidor de NF-κB antes da infecção bacteriana reduziu significativamente os níveis de mRNA de IL-8 e da secreção desta quimiocina. Em conjunto, estes resultados mostram que ExoU ativa NF-κB e, consequentemente, estimula a expressão e a secreção de IL-8 por células epiteliais respiratórias e células endoteliais infectadas com P. aeruginosa / ExoU, a cytotoxin produced by the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa that is translocated into host cell cytosol by the type three secretory system, has been associated with severity of acute infections. We have previously described the potent ExoU proinflammatory activity, which accounts for a market recruitment of neutrophils to infected tissues. In this present study, the effect of ExoU on the activation of the transcriptional factor NF-B and on the regulation of the expression and secretion of the chemokine IL-8 was investigated in human epithelial respiratory and endothelial cell cultures infected with the ExoU-producing PA103 P. aeruginosa or with the bacterial mutant with the deletion of the exoU gene PA103exoU. By semi-quantitative RT-PCR, ExoU was shown to significantly increase the expression of IL-8 mRNA. By electrophoretic mobility shift assay (EMSA), supershift and reporter assay ExoU was shown to induce the nuclear translocation of the NF-κB p65/p50 transactivator heterodimer as well as the NF-κB-dependent transcriptional activity. In addition, treatment both the IL-8 mRNA expression and the protein secretion. Together, our results show that ExoU activates NF-B and stimulates IL-8 expression and secretion by P. aeruginosa-infected human epithelial respiratory and endothelial cells

Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) é um dos principais microrganismos envolvidos nas Infecções relacionadas à Assistência à Saúde (IrAS). Porém, um clone de MRSA, o CA-MRSA, emergiu na comunidade e atualmente vem sendo agente de IrAS. O objetivo desta dissertação é avaliar fenotípica e genotipicamente 111 amostras de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina e sensíveis a antibióticos não ß-lactâmicos de pacientes atendidos em cinco hospitais no município do Rio de Janeiro. Utilizando os critérios padronizados pelo CLSI 2012, foram determinadas as susceptibilidades a 11 antimicrobianos pelo método de disco difusão em ágar e concentração inibitória mínima para vancomicina e oxacilina pelo método da microdiluição em caldo. A multirresistência (resistência a 3 ou mais antimicrobianos não ß-lactâmicos) foi observada em 31,5% das amostras, sendo que 53,2% apresentaram resistência ao antimicrobiano clindamicina, uma das opções para o tratamento empírico das infecções de pele/tecidos moles. 86,4% apresentaram concentração inibitória mínima (CIM) para vancomicina ≥ 1,0 g/mL ou seja, elevado percentual de amostras associadas ao fenômeno MIC creep, o qual está associado ao insucesso na terapia antimicrobiana anti-MRSA. Não foi observado até o momento nenhuma amostra com CIM ≥ 4cg/mL para vancomicina, entretanto, já há resistência à linezolida em quatro hospitais do estudo. A tipificação do SCCmec nos permitiu classificar 4,5% das amostras em HA-MRSA e 86,5% em CA-MRSA, nas quais a resistência heterogênea típica à oxacilina foi observada em 57,2%. A toxina de Panton-Valentine (PVL) foi identificada pela metodologia de PCR em 28% das amostras com genótipo CA-MRSA. Os fatores de riscos clássicos, da literatura, relacionados à infecção por HA-MRSA foram também observados nos pacientes com infecção por CA-MRSA portadoras de SCCmec IV e V. No intuito de verificar a existência de similaridades genéticas ou a presença de clone predominante entre as amostras dos cinco hospitais, foi realizada a técnica de eletroforese em gel sob campo pulsado (PFGE) e observou-se diversidade genética assim como a presença de amostras com padrões similares aos clones OSPC (18,5%) e USA400. Não foram encontradas amostras com padrões de eletroforese similares aos clones USA300, USA800 e CEB. É essencial a vigilância da resistência aos antimicrobianos não ß-lactâmicos no CA-MRSA, em especial à vancomicina. A mudança na epidemiologia deste microrganismo vem impactando os padrões característicos dos genótipos limitando os critérios de diferenciação entre eles. Neste contexto, as técnicas moleculares atuam como excelentes ferramentas de caracterização. O conhecimento do patógeno auxilia na elaboração e implementação de medidas preventivas, contribuindo para o controle da doença tanto no ambiente hospitalar quanto na comunidade. / Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is a major microrganism involved in healthcare associated infections (HAIs). However, a clone of MRSA, CA-MRSA, has emerged in the community and has been considered agent of HAIs. The goal of this dissertation is to evaluate phenotypically and genotypically 111 samples of methicillin-resistant Staphylococcus aureus susceptible to non ß-lactam antibiotics from patients treated in five hospitals in the city of Rio de Janeiro. Using the Clinical and Laboratory Standards Institute criteria were determined susceptibility to 11 antimicrobials by the disk diffusion method and minimal inhibitory concentration for oxacillin and vancomycin by broth microdilution method. The multidrug resistance (resistance to three or more non ß-lactam antibiotics) was observed in 31.5% of isolates, and 53.2% were resistant to the antimicrobial clindamycin, one of the choices in the empirical treatment of infections of skin / soft tissue. 86.4% showed minimal inhibitory concentration (MIC) for vancomycin ≥ 1.0 mg / mL, representing high percentage of samples associated with the MIC creep phenomenon, which can imply therapeutic failure. The typification of SCCmec enabled us to classify 4,5% of the samples in HA-MRSA and 86.5% in CA-MRSA, among which the typical heterogeneous oxacillin resistance was observed in 57.2%. The Panton-Valentine Leukocidin (PVL) toxin, one of the virulence factors involved in the pathogeneses of MRSA, was present in 28% of samples with genotype CA-MRSA. We performed uptake of demographic and clinical information on patients medical records and verified the presence of classical risk factors for HA-MRSA infection in individuals infected by CA-MRSA carrying SCCmec IV and V. In order to verify the existence of genetic similarities or the presence of predominant clone among the samples of the five hospitals, we applied the technique of pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and observed genetic diversity and the presence of samples with standards similar to OSPC clones (18.5%) and USA400. There were no samples with electrophoresis patterns similar to clone USA300, USA800 and CEB. Surveillance of resistance to non ß-lactam antibiotics is essencial in CA-MRSA, especially vancomycin. The change in the epidemiology of this microrganism has been impacting the characteristic patterns of genotypes limiting criteria of differentiation between them. In this context, molecular techniques serve as excellent characterization tools. Knowledge of pathogen assists in the development and implementation of preventive measures, contributing to disease control both in hospitals and in the community.