A difteria é uma doença imunoprevinível que permanece endêmica em diversas regiões do mundo. Além dos casos de difteria clássica, doenças invasivas como endocardite, osteomielite, pneumonia e infecções relacionadas à cateter, tem acometido indivíduos adultos parcialmente imunizados. A natureza multifatorial dos fatores de virulência que favorecem a formação de biofilme e sobrevivência em macrófagos tem sido evidenciada para o Corynebacterium diphtheriae. Entretanto, escassos são os trabalhos que investigaram a influência de condições ambientais na virulência do patógeno. Uma vez que agentes oxidantes são capazes de gerar radicais livres e levar ao estresse oxidativo que, consequentemente, podem resultar em resposta adaptativa e influenciar na formação do biofilme e na virulência bacteriana, o presente trabalho teve como objetivo geral avaliar os efeitos do peróxido de hidrogênio (H2O2), paraquate e telurito de potássio (K2TeO3) em propriedades biológicas de cepas de C. diphtheriae de origens diversas. Os resultados demonstraram que as amostras de C. diphtheriae apresentaram níveis de resistência ao K2TeO3, H2O2 e paraquate, porém em intensidades variadas e independentes da capacidade de produção da toxina diftérica. Algumas amostras, toxinogênicas ou não, isoladas do trato respiratório superior demonstraram resposta adaptativa para H2O2 passando, portanto, a expressar resistência aumentada após uma prévia exposição ao referido agente oxidante. C. diphtheriae não exibiu respostas adaptativas para o K2TeO3 e paraquate. C. diphtheriae foi capaz de produzir biofilme na superfície de substratos abióticos de natureza hidrofílica (vidro) e hidrofóbica (poliestireno) na presença de agentes oxidantes K2TeO3, H2O2 e paraquate. A presença dos agentes oxidantes influenciou na formação de biofilme de algumas amostras. O paraquate inibiu a produção de biofilme de todas amostras. A amostra TR241 teve a produçao de biofilme inibida na presença dos três agentes oxidantes analisados. Por outro lado, a presença de H2O2 e do K2TeO3 estimulou a produção de biofilme de algumas amostras. Para todas as amostras de C. diphtheriae testadas, independentes das origens, biotipos e da capacidade de produção de toxina diftérica, os ensaios moleculares indicaram a presença de sequências gênicas cromossômicas homólogas, codificadores da proteína DIP 0906 (TeR) e da proteína DIP 1421 (OxyR), envolvidos na resistência ao telurito e na proteção contra o estresse oxidativo, respectivamente. Não foi observada correlação da suscetibilidade e a resposta adaptativa aos agentes oxidantes com as diferentes características bacterianas: origem, sítio de isolamento, produção de toxina diftérica, metabolização de sacarose e produção de biofilme. Em conclusão, o estresse oxidativo foi capaz de influenciar fatores de virulência do C. diphtheriae, como a capacidade de produçao de biofilme, que podem estar contribuindo para a patogenia da difteria clássica assim como de doenças invasivas causadas por cepas atoxinogênicas. / Diphtheria is a disease it could be preventable by immunization although remains endemic in many regions of the world. Besides the classical cases of diphtheria, invasive diseases such as endocarditis, osteomyelitis, pneumonia and catheter-related infections, has affected adults partially immunized. The multifactorial nature of virulence factors that promote biofilm formation and survival in macrophages have been shown to Corynebacterium diphtheriae. However, few are the studies that investigated the influence of environmental conditions on the virulence of the pathogen. Since oxidants are capable of generating free radicals lead to oxidative stress and, consequently, may result in adaptive response and influence in biofilm formation and bacterial virulence, this study aimed to evaluate the effects of hydrogen peroxide (H2O2), paraquat and potassium tellurite (K2TeO3) in biological properties of strains of C. diphtheriae of different origins. The results show that the strains of C. diphtheriae showed levels of resistance K2TeO3, H2O2 and paraquat, but in varying intensities and independent production capacity of diphtheria toxin. Some samples, toxigenic or non-toxigenic, isolated respiratory tract demonstrated adaptive response to H2O2 passing thus expressing increased resistance after exposure prior to said oxidizing agent. C. diphtheriae seemed not display adaptive responses to K2TeO3 and paraquat. C. diphtheriae was able to produce biofilm on the surface of substrates abiotic hydrophilic in nature (glass) and hydrophobic (polystyrene) in the presence of oxidizing agents - K2TeO3, H2O2 and paraquat. The presence of oxidizing agents influence the biofilm formation of some samples.The paraquat inhibited the production of biofilm from all samples. The sample TR241 had inhibited the production of biofilm in the presence of oxidizing agents three analyzed. Moreover, the presence of H2O2 and K2TeO3 stimulated biofilm production of some samples. For all samples C. diphtheriae tested, independent of the origins and biotypes production capacity of diphtheria toxin, molecular assays indicated the presence of chromosomal gene sequences homologous to genes involved in tellurite resistance and protection against oxidative stress present in other bacterial species, genes encoding protein DIP 0906 (Ter) and protein DIP 1421 (oxyR). No correlation was observed susceptibility and adaptive response to oxidants with different biological activities bacterial: origin, isolation site, production of diphtheria toxin, sucrose metabolism and biofilm production. In conclusion, oxidative stress was able to influence virulence factors of C. diphtheriae, as the capacity of production of biofilm, which may be contributing to the pathogenesis of diphtheria classical as well as invasive disease caused by strains non-toxigenic.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Corynebacterium diphtheriae é um importante patógeno humano e agente causal da difteria. Embora seja observada uma redução mundial no número de casos da doença, a difteria permanece endêmica em muitos países e surtos são esporadicamente notificados. No Brasil, o último surto ocorreu no estado no Maranhão e revelou mudanças em aspectos clínico-epidemiológicos da doença. Diferentemente da maioria das cepas de difteria brasileiras, que pertencem ao biovar mitis, nesse surto dois diferentes pulsotipos de C. diphtheriae biovar intermedius foram isolados. Além disso, sinais patognomônicos da doença não foram relatados em parte dos casos. C. diphtheriae também vem sendo relacionado com quadros de infecções invasivas, apesar de ser reconhecido como patógeno tipicamente extracelular. Em conjunto, estas mudanças no perfil das infecções por C. diphtheriae sugerem a existência de outros fatores de virulência além da produção da toxina diftérica. Neste sentindo, foram realizadas análises de tipagem molecular e de genômica comparativa para avaliar a diversidade genética e o potencial de virulência de cepas de C. diphtheriae isoladas de difteria clássica e infecções invasivas. Os resultados obtidos demonstram a circulação de diferentes clones invasores no Brasil. Além disso, revelaram diferenças marcantes na presença e na composição de ilhas de patogenicidade entre as amostras, bem como nos genes sob regulação do DtxR e nas sequências dos corinefagos integradas ao cromossomo bacteriano. Uma vez que o potencial invasor bacteriano e a persistência no ambiente podem estar relacionados à tolerância ao estresse oxidativo, foram procurados nos genomas sequenciados, genes possivelmente envolvidos neste processo. Dentre estes, os genes DIP0906, predito como gene de resistência ao oxidante telurito (TeO32-), e DIP1421, codificador do regulador transcricional OxyR, foram caracterizados funcionalmente e tiveram seus papéis na patogenicidade investigados. Ensaios in vivo utilizando o nematódeo Caenorhabditis elegans demonstraram que ambos são importantes para a virulência de C. diphtheriae. Além da resistência ao TeO32, DIP0906 parece contribuir para a resistência ao peróxido de hidrogênio (H2O2) e para a viabilidade no interior de células respiratórias humanas. Já OxyR, além de controlar negativamente a resposta ao H2O2, parece estar envolvido com a ligação de C. diphtheriae a proteínas plasmáticas e de matriz extracelular. Adicionalmente, foi investigada resistência e a capacidade de adaptação de C. diphtheriae frente a agentes oxidantes, através da indução de resposta adaptativa e/ou resistência cruzada e da formação de biofilme. As cepas de C. diphtheriae apresentaram diferentes níveis de resistência e um comportamento heterogêneo na presença dos agentes oxidantes, o que sugere a existência de diferentes estratégias de sobrevivência e adaptação de C. diphtheriae nas condições de estresse oxidativo. / Corynebacterium diphtheriae is an important human pathogen and the main causal agent of diphtheria. Although a reduction in the number of diphtheria cases is observed worldwide, diphtheria remains endemic in many countries and outbreaks are still reported sporadically. In Brazil, the last outbreak occurred in Maranhão and revealed changes in clinical and epidemiological diphtheria aspects. Despite most Brazilian C. diphtheriae belong to mitis biovar, in this outbreak were isolated two different pulsotypes of C. diphtheriae biovar intermedius. Furthermore, diphtheria pathognomonic features were absent in some cases. C. diphtheriae has also been associated with invasive infections, although typically recognized as extracellular pathogen. Together, these changes in profile of C. diphtheriae infections suggest the existence of other virulence factors besides the diphtheria toxin. In order to access the genetic diversity and the potential virulence of C. diphtheriae strains isolated from classical diphtheria and invasive infections, molecular typing and comparative genomics analyzes were conducted. The results demonstrated the circulation of different invasive clones in Brazil. Furthermore, they revealed differences in the presence and in the gene content of pathogenicity islands among C. diphtheriae strains. Differences were also found in DtxR regulon and in corynephages sequences. Once the bacterial invasiveness and persistence in the environment may be related to the tolerance to oxidative stress, determinants involved in this process were searched in C. diphtheriae genomes. Among these, the genes DIP0906, predicted as tellurite (TeO32-) resistance gene and DIP1421, an oxyR homolog, were characterized. Moreover, their roles in diphtheria bacilli pathogenesis were investigated. In vivo assays, using the nematode Caenorhabditis elegans, showed that both genes are important for C. diphtheriae virulence. DIP0906 seems to contribute to the resistance to hydrogen peroxide (H2O2) and to intracellular survival in human respiratory cells, besides involved in resistance to TeO32-. OxyR negatively controls the H2O2 response and appears to be involved with C. diphtheriae binding to plasma and extracellular matrix proteins. Additionally, bacterial resistance and adaptation, through the induction of adaptive response and / or cross-resistance and biofilm formation, of C. diphtheriae strains against oxidative agents were investigated. C. diphtheriae strains showed different oxidative resistance levels and a heterogeneous behavior in the presence of the agents, which suggest the existence of different strategies for adaptation of diphtheria bacilli under oxidative stress conditions.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / A difteria é uma síndrome toxêmica causada pelo Corynebacterium diphtheriae. Embora programas de imunização mantenham a doença sob controle em países desenvolvidos, a difteria ainda permanece endêmica em diversas partes do mundo, especialmente em indivíduos parcialmente imunizados para toxina diftérica. Junto a isso, nos últimos 20 anos, tem-se observado a ocorrência crescente de quadros de infecções sistêmicas causados por cepas atoxinogênicas. A penicilina e eritromicina são as principais drogas de escolha no tratamento destas infecções, entretanto, a escassez de trabalhos reavaliando a terapia de escolha e a influência dos antibióticos no processo de interação bacteriana com células epiteliais humanas são escassos, logo compreendem aspectos que justificam o presente estudo. O objetivo principal deste projeto consiste na análise da influência do pré-tratamento de células epiteliais Hep-2 com os antimicrobianos penicilina e eritromicina na colonização e viabilidade intracelular de amostras de C. diphtheriae. As monocamadas foram submetidas ao tratamento prévio com doses séricas terapêuticas de penicilina (5g mL1) e eritromicina (1,92 g mL1) por 24 horas e os antibióticos foram removidos por lavagens com PBS antes da interação com a suspensão bacteriana (MOI de 107). Três horas após a infecção, o padrão de aderência foi investigado como também, realizada a análise das bactérias viáveis associadas e internalizadas nas monocamadas. O pré-tratamento com penicilina induziu a formação de perfil de aderência difuso (AD) pelas amostras estudadas. Microorganismos que normalmente apresentam padrão de aderência localizado (AL) passaram a expressar perfil (AD) após pré-tratamento das camadas com ambos antimicrobianos. A expressão do tipo agregativo (AA) não foi influenciada pela presença de eritromicina. A penicilina e a eritromicina reduziram o número de bactérias viáveis associadas às células HEp-2 na maioria das oportunidades. Entretanto, a penicilina interferiu em maior magnitude nesse processo. As três amostras invasoras de C. diphtheriae (HC01, HC04 e BR5015), apresentaram maior capacidade de sobrevivência no compartimento intracelular, independente do pré-tratamento. A expressão dos perfis de aderência assim como a capacidade de sobrevivência no compartimento intracelular frente aos antimicrobianos testados mostraram-se independentes da produção de toxina e dos percentuais de associação com as células HEp-2. Foi observada uma maior eficiência da eritromicina na eliminação de bactérias viáveis internalizadas reforçando a utilização clínica da eritromicina tanto no tratamento de pacientes quanto na erradicação do estado de portador. Novos estudos serão desenvolvidos para investigar alterações na expressão de fatores de virulência por amostras de C. diphtheriae na interação com células HEp-2 pré-tratadas com antimicrobianos e a influência sobre a evolução clínica das infecções por corinebactérias / Diphtheria is a syndrome caused by Toxigenic Corynebacterium diphtheriae. Although immunization programs have kept diphtheria under control in the great majority of developed countries, the disease remains endemic in many parts of the world, especially in individuals partially immunized to diphtheria toxoid. Additionally, an increase in the number of cases of systemic infections caused by non-toxigenic strains has been observed along the last 20 years. Penicillin and erythromycin have long been the drugs of choice for the treatment of C. diphtheriae infections, though the studies reviewing the choice of treatment and the influence of antibiotics in the process of bacterial interaction with human epithelial cells are scarce, and comprise the aspects that justify the present investigation. The main objective was to analyze the influence of pre-treatment of HEp-2 epithelial cells with the penicillin and erythromycin in adherence and intracellular viability of C. diphtheriae strains. HEp-2 monolayers were pre-treated for 24 hours with the serum concentration doses of penicillin (5g mL-1) and erythromycin (1.92 mg mL-1), and antibiotics were removed by washing with PBS before infection with bacterial suspension (MOI of 107). Three hours post-infection, the adherence pattern was investigated, and both percentage of viable cell-associated bacteria and intracellular bacteria was determined. Penicillin treatment induced the bacterial strains to exhibit diffuse adherence patterns (DA). Microorganisms that usually express localized adherence patterns (LA) began to express DA pattern after pre-treatment of monolayers with both antibiotics. Erythromycin did not influence the aggregative adherence pattern (AA). Penicillin and erythromycin reduced the number of viable HEp-2 cell-associated bacteria for the most of the strains. However, penicillin interfered in this process in a greater magnitude. The C. diphtheriae invasive strains (HC01, HC04 and BR5015) showed higher ability to survive within the intracellular compartment, regardless of pre-treatment. The expression of adherence patterns as well as the ability to survive in the intracellular environment of pre-treated cells, proved to be independent of toxin production and the usual percentage of association with HEp-2 cells. A higher efficiency in the reduction of intracellular viability with the use of erythromycin was observed for the majority of strains, and reinforces the clinical use of erythromycin in the treatment of patients alongside the eradication of the carrier state. Further studies will be necessary to investigate the changes in the expression of virulence factors in C. diphtheriae during the interaction with HEp-2 cells pre-treated with antimicrobials and the influence on the clinical evolution of corynebacterial infections

A difteria é uma doença imunoprevinível que permanece endêmica em diversas regiões do mundo. Além dos casos de difteria clássica, doenças invasivas como endocardite, osteomielite, pneumonia e infecções relacionadas à cateter, tem acometido indivíduos adultos parcialmente imunizados. A natureza multifatorial dos fatores de virulência que favorecem a formação de biofilme e sobrevivência em macrófagos tem sido evidenciada para o Corynebacterium diphtheriae. Entretanto, escassos são os trabalhos que investigaram a influência de condições ambientais na virulência do patógeno. Uma vez que agentes oxidantes são capazes de gerar radicais livres e levar ao estresse oxidativo que, consequentemente, podem resultar em resposta adaptativa e influenciar na formação do biofilme e na virulência bacteriana, o presente trabalho teve como objetivo geral avaliar os efeitos do peróxido de hidrogênio (H2O2), paraquate e telurito de potássio (K2TeO3) em propriedades biológicas de cepas de C. diphtheriae de origens diversas. Os resultados demonstraram que as amostras de C. diphtheriae apresentaram níveis de resistência ao K2TeO3, H2O2 e paraquate, porém em intensidades variadas e independentes da capacidade de produção da toxina diftérica. Algumas amostras, toxinogênicas ou não, isoladas do trato respiratório superior demonstraram resposta adaptativa para H2O2 passando, portanto, a expressar resistência aumentada após uma prévia exposição ao referido agente oxidante. C. diphtheriae não exibiu respostas adaptativas para o K2TeO3 e paraquate. C. diphtheriae foi capaz de produzir biofilme na superfície de substratos abióticos de natureza hidrofílica (vidro) e hidrofóbica (poliestireno) na presença de agentes oxidantes K2TeO3, H2O2 e paraquate. A presença dos agentes oxidantes influenciou na formação de biofilme de algumas amostras. O paraquate inibiu a produção de biofilme de todas amostras. A amostra TR241 teve a produçao de biofilme inibida na presença dos três agentes oxidantes analisados. Por outro lado, a presença de H2O2 e do K2TeO3 estimulou a produção de biofilme de algumas amostras. Para todas as amostras de C. diphtheriae testadas, independentes das origens, biotipos e da capacidade de produção de toxina diftérica, os ensaios moleculares indicaram a presença de sequências gênicas cromossômicas homólogas, codificadores da proteína DIP 0906 (TeR) e da proteína DIP 1421 (OxyR), envolvidos na resistência ao telurito e na proteção contra o estresse oxidativo, respectivamente. Não foi observada correlação da suscetibilidade e a resposta adaptativa aos agentes oxidantes com as diferentes características bacterianas: origem, sítio de isolamento, produção de toxina diftérica, metabolização de sacarose e produção de biofilme. Em conclusão, o estresse oxidativo foi capaz de influenciar fatores de virulência do C. diphtheriae, como a capacidade de produçao de biofilme, que podem estar contribuindo para a patogenia da difteria clássica assim como de doenças invasivas causadas por cepas atoxinogênicas. / Diphtheria is a disease it could be preventable by immunization although remains endemic in many regions of the world. Besides the classical cases of diphtheria, invasive diseases such as endocarditis, osteomyelitis, pneumonia and catheter-related infections, has affected adults partially immunized. The multifactorial nature of virulence factors that promote biofilm formation and survival in macrophages have been shown to Corynebacterium diphtheriae. However, few are the studies that investigated the influence of environmental conditions on the virulence of the pathogen. Since oxidants are capable of generating free radicals lead to oxidative stress and, consequently, may result in adaptive response and influence in biofilm formation and bacterial virulence, this study aimed to evaluate the effects of hydrogen peroxide (H2O2), paraquat and potassium tellurite (K2TeO3) in biological properties of strains of C. diphtheriae of different origins. The results show that the strains of C. diphtheriae showed levels of resistance K2TeO3, H2O2 and paraquat, but in varying intensities and independent production capacity of diphtheria toxin. Some samples, toxigenic or non-toxigenic, isolated respiratory tract demonstrated adaptive response to H2O2 passing thus expressing increased resistance after exposure prior to said oxidizing agent. C. diphtheriae seemed not display adaptive responses to K2TeO3 and paraquat. C. diphtheriae was able to produce biofilm on the surface of substrates abiotic hydrophilic in nature (glass) and hydrophobic (polystyrene) in the presence of oxidizing agents - K2TeO3, H2O2 and paraquat. The presence of oxidizing agents influence the biofilm formation of some samples.The paraquat inhibited the production of biofilm from all samples. The sample TR241 had inhibited the production of biofilm in the presence of oxidizing agents three analyzed. Moreover, the presence of H2O2 and K2TeO3 stimulated biofilm production of some samples. For all samples C. diphtheriae tested, independent of the origins and biotypes production capacity of diphtheria toxin, molecular assays indicated the presence of chromosomal gene sequences homologous to genes involved in tellurite resistance and protection against oxidative stress present in other bacterial species, genes encoding protein DIP 0906 (Ter) and protein DIP 1421 (oxyR). No correlation was observed susceptibility and adaptive response to oxidants with different biological activities bacterial: origin, isolation site, production of diphtheria toxin, sucrose metabolism and biofilm production. In conclusion, oxidative stress was able to influence virulence factors of C. diphtheriae, as the capacity of production of biofilm, which may be contributing to the pathogenesis of diphtheria classical as well as invasive disease caused by strains non-toxigenic.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é um patógeno relacionado ao desenvolvimento de quadros de diarréia aguda ou persistente. A resposta inflamatória induzida por EAEC está relacionada à liberação de interleucina 8, que atua estimulando a transmigração de neutrófilos através do epitélio. Os macrófagos, de forma similar aos neutrófilos, são células fagocíticas que produzem espécies reativas de oxigênio (ERO), como o peróxido de hidrogênio (H2O2). Neste trabalho, avaliamos as consequências da interação de diferentes cepas clínicas com macrófagos humanos ativados da linhagem U-937. Todas as cepas testadas apresentaram filamentos nos testes de aderência aos macrófagos, diferentemente do que ocorre na interação com outras linhagens celulares como HEp-2, T84 e Caco-2. O ferro é um microelemento essencial para bactérias, sendo utilizado como cofator de enzimas e que também pode participar da geração de ERO através da reação de Fenton. Considerando-se a possibilidade de que o H2O2 produzido pelos macrófagos possa gerar radical hidroxil através da reação de Fenton, testes de aderência foram realizados com as amostras cultivadas na presença do captador de ferro 2,2-dipiridil. Tal fato não suprimiu a formação de filamentos, entretanto diminuiu a aderência das cepas EAEC 042 e 17-2. Com o objetivo de produzir uma resposta adaptativa ao H2O2, as culturas bacterianas foram pré-tratadas com uma dose sub-letal de H2O2 por 60 minutos antes de aderirem aos macrófagos. Nossos resultados mostraram que o pré-tratamento também não inibiu o aparecimento de filamentos em relação às culturas não tratadas. Além disto, foi observado que o pré-tratamento com o H2O2 reduziu a aderência das amostras de EAEC ao tapete celular. A filamentação é uma das respostas SOS, induzida pela presença de danos e/ou bloqueio na síntese da molécula de DNA. Com o objetivo de verificar se o H2O2 produzido pelos macrófagos estaria causando danos induzindo o sistema SOS e a filamentação bacteriana, foram realizados testes de viabilidade com mutantes derivados de E. coli K12 deficientes em enzimas do reparo por excisão de bases (BW535) e na resposta SOS (DM49). Nossos resultados mostram que os mutantes apresentaram os níveis de sobrevivência semelhantes ao observado para cepa selvagem isogênica (AB1157). Todos estes resultados em conjunto indicam que o H2O2 não é o indutor da filamentação nos testes de aderência. Macrófagos ativados apresentam ação microbicida através da ação da enzima indolamina dioxigenase (IDO), associada à redução do aminoácido L-triptofano. Desta forma, realizamos testes qualitativos de aderência de EAEC aos macrófagos suplementando o meio de interação com este aminoácido. Nossos resultados mostram que a adição de triptofano ao meio de interação reduz o número de filamentos por campo. Desta forma, aventamos a hipótese de que a depleção do triptofano seja responsável pela indução de resposta SOS, tendo como conseqüência a filamentação das bactérias. / Enteroaggregative Escherichia coli is a pathogen related to cases development of acute or persistent diarrhea. The inflammatory response induced by EAEC is linked to induction of IL-8 release, which acts stimulating neutrophils diapedesis through the epithelium. Macrophages, similarly to neutrophils, are phagocytic cells that produce reactive oxygen species (ROS), such as H2O2. Iron is an essential microelement to bacteria, been used as cofactor of enzymes in fundamental cellular processes but it is involved in ROS generation through Fenton reaction. On this report we evaluated the consequences of different EAEC strains interaction with activated human macrophages (U937 lineage). All tested strains showed filaments on the adherence tests with macrophages, unlike to what occurs in the interaction with other cellular lineages as HEp-2, T84 e Caco-2. Considering the possibility of H2O2 macrophage produced generates hydroxyl radical through Fenton reaction, the strains were grown in medium containing iron chelator 2,2-dipiridil. Iron chelation did not suppress filamentation, however decreased the adherence of 042 e 17-2 strains. Strains pretreated with a H2O2 subletal dose (60 M) by 60 minutes, which resulted in a bacterial adaptative response, also did not decrease the filamentation associated to adherence beside H2O2 pretreatment decreased the adherence of EAEC strains tested. In order to verify if H2O2 induces filamentation through DNA lesions and SOS induction, we evaluated the survival of a triple mutant deficient in three enzymes involved in BER and a mutant deficient in SOS response induction, both E. coli K12 derived. Both mutants presented similar survival levels like wild strain. This result suggest that H2O2 is not involved in SOS induction and filamentation response. Activated macrophages show microbicidal action, which is related to enzymes such as IDO (indoleamine dioxygenase), associated to reduction of L-tryptophan available to microorganism. In this way, we performed adhrence macrophages assays supplementing the interaction medium with L-tryptophan. Our results showed that tryptophan addition reduced the filamentation of adhered EAEC strains. Thus, we suggested that L-tryptophan reduction could be responsible for SOS response induction and bacterial filamentation.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Por serem organismos filtradores, os mexilhões devem ser extraídos para consumo somente de águas com padrões microbiológicos regulamentados pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente, uma vez que intoxicações alimentares de origem bacteriana são as consequências mais comuns relacionadas ao consumo destes moluscos. Após a retirada dos costões, estes organismos passam por processos de fervura, lavagem, acondicionamento em sacos plásticos e transporte até a chegada ao mercado onde são comercializados; etapas estas, realizadas sem cuidados assépticos. Objetivando avaliar a qualidade microbiológica de mexilhões Perna perna coletados na praia de Itaipu, Niterói, RJ; após a sua fervura; e comercializados no Mercado São Pedro, foram realizadas contagens de coliformes totais e termotolerantes e pesquisa de Escherichia coli, Salmonella spp. e Vibrio spp. por metodologia convencional e molecular em amostras obtidas destes locais. Pelo teste de disco-difusão foi observado o perfil de resistência das cepas isoladas. Do total de amostras analisadas (27) apenas 3 dos mexilhões que sofreram processo de aferventação, 1 do comercializado e 3 do in natura, se encontravam dentro dos padrões aceitáveis pela legislação. Não houve diferença significativa entre as contagens de coliformes termotolerantes dos diferentes mexilhões analisados, mas sim entre os períodos seco e chuvoso. Somente uma das nove coletas de água mostrou-se própria para o cultivo de mexilhões (até 14 CF/mL). Foram isoladas e caracterizadas fisiológicamente, 77 estirpes da espécie E. coli, sendo confirmadas molecularmente por PCR os sorotipos EPEC, STEC e EAEC; 4 cepas Salmonella spp. sendo apenas uma confirmada por PCR; e das 57 cepas caracterizadas como Vibrio spp., 51 foram confirmadas por PCR, sendo 46 Vibrio spp., 2 V. cholerae, 1 V. vulnificus, 1 V. parahaemolyticus e 1 V. mimicus. Entre as estirpes de E. coli, 13% apresentaram multirresistência e 15,6% apresentaram resistência múltipla. A estirpe de Salmonella spp. se mostrou sensível a todos os antimicrobiados testados. Das estirpes de Vibrio spp. testadas, 68,6% apresentaram multirresistência e 72,5% apresentaram resistência múltipla. A partir da pesquisa de genes direto do caldo de enriquecimento foi possível detectar todos os genes pesquisados, com exceção para os sorotipos de Salmonella e V. cholerae. Baseado nos resultados do presente trabalho pode-se inferir que os mexilhões, amplamente comercializados no município de Itaipú, podem se constituir em risco para a saúde pública dos consumidores no Rio de Janeiro, necessitando dos órgãos competentes uma eficiente fiscalização nos pontos de venda e cultivo destes moluscos. / Mussels (Perna perna) feed by filtering large quantities of water, enabling the retention of environmental bacteria and virus in their bodies. For this reason bacterial foodborne intoxications associated with these bivalves are common therefore mussels used for human consumption have to come from coastal areas where the microbiological quality of the water complies with current legislation laid down by the Conselho Nacional do Meio Ambiente. Following harvest these mussels go through a process of washing, boiling, packing and then transported to the fish markets for retail. During these processes and techniques normally no food hygiene plan is followed which may enable microorganisms growth and cross-contamination. The aim of this study was to determine the microbiological quality of Perna perna growing in Itaipu beach, Niterói, RJ from direct harvest (boiled and raw) and retailed at the São Pedro fish market. By using the MPN test it was possible to determine the total and faecal coliforms and by conventional and molecular techniques it was detected and identified the Escherichia coli, Salmonella spp. and Vibrio spp. present in the samples. The antimicrobial susceptibility test was also performed to determine the antimicrobial resistance profile of the isolated strains. From all the samples studied (27) only 7 samples had results complying with the legislation, 3 which suffered boiling process in the laboratory, 3 raw samples and 1 samples from the fish market. There were no significant differences between samples regarding the faecal coliforms count, however there was significant differences between samples collected in different seasons (dry and rainy). From all the nine water samples collected only one demonstrated to be proper for the production and harvest of mussels (lower than 14 CF/mL). There were 77 E. coli strains who were isolated and physiologically characterized and those results confirmed by PCR the sorotypo EPEC, STEC and EAEC; 4 strains of Salmonella spp. only one confirmed by PCR; and from the 57 strains identified as Vibrio spp., 51 were confirmed by PCR, where 46 were Vibrio spp., 2 V. cholerae, 1 V. vulnificus, 1 V. parahaemolyticus and 1 V. mimicus. From all the E. coli strains 13% were multi-resistant and 15.6% showed multiple resistance. All the Salmonella spp. strains demonstrated sensitivity to all tested antimicrobials. In the Vibrio spp. strains 68.6% were multi-resistant and 72.5% had multiple resistance Targeted genes were all possible to detect directly from the analysis of the enrichment broth with the exception for Salmonella and V. cholera genes. The present study provided results that demonstrate the poor microbiological quality of the mussels retailed in Itaipú borough which can represent a public health risk for all local and tourist population. These outcome brings to light how inspections in all food chain of the product are paramount for public health.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Chronic hepatitis C has been associated with non-organ-specific autoantibodies (NOSA) production. Despite of increasing number of researches about this subject, there is no agreement among the authors of which autoantibodies are produced during combinated therapy of interferon and ribavirin or the clinical relevance of NOSA in patientâs organism. Our aim was to evaluate the profile of NOSA in patients with chronic hepatitis C who attended to Walter CantÃdio Hospital (HUWC) and received combinated antiviral therapy (interferon-ribavirin). A total of 34 patients with hepatitis C were studied. Anti-nuclear antibody (ANA), anti-smooth muscle antibody (SMA), anti-liver/kidney microsomal antibody type 1 (LKM-1) and anti-mitochondrial antibody (AMA) were detected by indirect immunofluorescence. The presence of NOSA was related to clinical and epidemiological variables and to the outcome of antiviral combination therapy with interferon-alfa and ribavirin. Patients were classified as nonresponders, relapsers or long-term responders depending on the outcome of treatment. In our study, before therapy, 23 patients were NOSA positive (SMA was detected in 6 patients, SMA and AMA in 10 and SMA, AMA and ANA in 7). On the 24th week of treatment, 24 patientes were NOSA positive (SMA was detected in 4 patients, SMA and AMA in 10, ANA and SMA in 1, ANA and AMA in 1 and SMA, AMA and ANA in 8). NOSA behavior did not show significant variation during treatment. The overall rate of long-term response was 26,5% (9/34). Long-term response occurred in 17,4% (4/23) of NOSA positive patients and 45,5% (5/11) of NOSA negative patients. Positivity of autoantibodies was not associated with gender, age, viral genotype or aminotransferase levels. In conclusion, ANA was the only NOSA associated with treatment outcome. The absence of NOSA might indicate a significantly higher chance for viral clearance in response to combination therapy for chronic hepatitis C infection. / A hepatite crÃnica pelo vÃrus C tem sido associada à produÃÃo de autoanticorpos nÃo-ÃrgÃo especÃficos (NOSA). Apesar do aumento do nÃmero de pesquisas nessa Ãrea, ainda nÃo existe um consenso entre quais autoanticorpos tÃm seus nÃveis elevados devido ao tratamento combinado de interferon e ribavirina, nem sua influÃncia no desfecho do mesmo ou a relevÃncia clÃnica da presenÃa desses autoanticorpos no organismo do pacientes. O objetivo do presente estudo foi avaliar o perfil de NOSA em pacientes com hepatite C crÃnica atendidos no Hospital UniversitÃrio Walter CantÃdio (HUWC) e submetidos à terapia combinada de interferon-alfa e ribavirina. Para isso, um total de 34 pacientes com hepatite C foram estudados. Os anticorpos anti-nuclear (FAN), anti-mÃsculo liso (SMA), anti-microssomal de fÃgado e rim do tipo 1 (LKM-1) e anti-mitocÃndria (AMA) foram detectados atravÃs de imunofluorescÃncia indireta. A presenÃa de NOSA foi relacionada a variÃveis clÃnicas e epidemiolÃgicas e à resposta ao tratamento. Os pacientes foram classificados, em relaÃÃo à resposta ao tratamento, como nÃo respondedores, recidivantes ou respondedores (resposta virolÃgica sustentada). Em nosso estudo, 23 pacientes foram NOSA reagentes (SMA foi detectado em 6 pacientes, SMA e AMA em 10 e SMA, AMA e FAN em 7). Na 24 semana de tratamento, 24 pacientes foram NOSA reagentes (SMA foi detectado em 4 pacientes, SMA e AMA em 10, FAN e SMA em 1, FAN e AMA em 1 e SMA, AMA e FAN em 8). A variaÃÃo dos tÃtulos dos autoanticorpos durante o tratamento nÃo foi significativa. O percentual total de respondedores foi de 26,5% (9/34). A resposta virolÃgica sustentada foi obtida por 17,4% (4/23) dos pacientes NOSA reagentes e 45,5% (5/11) dos pacientes nÃo reagentes para NOSA. A presenÃa de autoanticorpos nÃo foi associada a gÃnero, idade, genÃtipo viral ou nÃveis de transaminases. Conclui-se que o FAN foi o Ãnico NOSA significativamente associado à resposta à terapia. A ausÃncia de NOSA indica uma tendÃncia à resposta virolÃgica sustentada no tratamento da hepatite C crÃnica.

Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2015-11-19T16:38:58Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rodrigo Cesar Assis Caixeta - 2014.pdf: 3427166 bytes, checksum: 4e0cd6ad305c26afada6419c7fc8663c (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-11-20T13:08:46Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rodrigo Cesar Assis Caixeta - 2014.pdf: 3427166 bytes, checksum: 4e0cd6ad305c26afada6419c7fc8663c (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-20T13:08:46Z (GMT). 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The cervical specimens were analyzed at the Center for Clinical Analysis Rômulo Rocha, Faculty of Pharmacy/UFG, by qualified professionals following strict quality control. The detection of HPV-DNA was made by PCR using pools of primers PGMY09/PGMY11. The diagnosis of BV was established from the observation of the presence of 20% or more of clue cells in cervical smears. The IC was assessed by counting the number of leukocytes in cervical smears in five noncontiguous with increased microscopic fields 1000X average, according Castle et al. (2001). Statistical analyzes with hierarchical logistic and control of confounding variables regression model were performed. The magnitude of association was estimated by calculating the odds ratio (OR) with confidence intervals (CI*) of 95%. 251 samples were included, with 54,9% (138/251) of adolescents aged between 15 and 19 years and 45,1% (113/251) of young women aged between 20 and 25 years. Positive results for cytological abnormalities accounted for 9,5% (24/251) of all cervical smears. The diagnosis of atypical squamous cells of undetermined significance (atypical squamous cells of undetermined significance - ASCUS) (50,0% 12/24) and squamous intraepithelial lesions (low grade squamous intraepithelial lesion - LSIL) (29,1 % 7/24) were more frequent. The overall prevalence of HPV, BV, and CI 44,2% (111/251), 41,0% (103/251) and 83,2% (209/251), respectively. Of the variables investigated, VB (OR = 2,46 CI*: 1,26 to 3,80; p: 0,006) and the detection of abnormal cytological diagnosis (OR = 1.36 CI*: 1.07 to 1.74; p: 0.013) were associated with HPV positivity in multivariate analysis. Whereas the detection of cytological abnormalities there was a significant association with HPV and BV detected in the same patient (OR = 2,59 CI*: 1,09 to 6,20; p: 0,032) and for the detection of HPV, BV and CI together (OR = 3,58 CI*: 1,06 to 12,15; p: 0,040), however, they didn’t remain independently associated in bivariate analysis. BV and cytological abnormalities were independently associated with HPV infection in adolescents and young women. HPV, BV and CI in cervical smears can indicate high possibility to detect cytological abnormalities in adolescents and young women. / HPV, VB e IC são condições frequentes em adolescentes e mulheres jovens. Estudos têm relatado que VB e IC podem ser cofatores para a aquisição e persistência do HPV, possibilitando o desenvolvimento de anormalidades citológicas precursoras do câncer do colo uterino. Assim, o objetivo desse estudo foi estimar a prevalência de HPV, VB e IC em adolescentes e mulheres jovens e verificar se estas condições estão associadas à detecção de anormalidades citológicas em esfregaços cervicais em adolescentes e mulheres. Foram incluídas amostras de pacientes sexualmente ativas e usuárias do Sistema Único de Saúde (SUS) que realizaram exame citopatológico através do método convencional. Os esfregaços cervicais foram analisados no Centro de Análises Clínicas Rômulo Rocha, da Faculdade de Farmácia/UFG, por profissionais qualificados e seguindo rigoroso controle de qualidade. A detecção de DNA do HPV foi feita por PCR, utilizando os pools de primers PGMY09/PGMY11. O diagnóstico de VB foi realizado a partir da observação da presença de 20% de células indicadoras nos esfregaços cervicais. A IC foi avaliada através da média da contagem do número de leucócitos nos esfregaços cervicais, em cinco campos microscópicos não adjacentes com aumento de 1000X, segundo Castle et al. (2001). Foram realizadas análises estatísticas com modelo de regressão logística hierárquica e controle de variáveis de confusão. A magnitude de associação foi estimada através do cálculo de odds ratio (OR) com intervalos de confiança (IC*) de 95%. Foram incluídas 251 amostras, sendo 54,9% (138/251) de adolescentes com faixa etária entre 15 e 19 anos e 45,1% (113/251) de mulheres jovens com idades entre 20 e 25 anos. Resultados positivos para anormalidades citológicas representaram 9,5% (24/251) do total de esfregaços cervicais. Os diagnósticos de células escamosas atípicas de significado indeterminado (Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance – ASC-US) (50,0% 12/24) e lesão intraepitelial escamosa de baixo grau (Low grade Squamous Intraepithelial Lesion - LSIL) (29,1% 7/24) foram mais frequentes. As prevalências totais de HPV, VB e IC foram de 44,2% (111/251), 41,0% (103/251) e 83,2% (209/251), respectivamente. Das variáveis investigadas, VB (OR = 2,46 IC*: 1,26-3,80, p: 0,006) e a detecção de diagnóstico citológico anormal (OR = 1,36 IC*: 1,07-1,74, p: 0,013) foram associadas com a positividade para HPV pela análise multivariada. Considerando a detecção de anormalidades citológicas, houve uma associação significativa com o HPV e VB detectado no mesmo paciente (OR = 2,59 IC*: 1,09-6,20, p: 0,032), bem como para a detecção de HPV, VB e IC em conjunto (OR = 3,58 IC*: 1,06-12,15, p: 0,040), no entanto, eles não permaneceram independentemente associadas na análise bivariada. VB e esfregaço cervical anormal foram independentemente associados a infecção por HPV em adolescentes e mulheres jovens. HPV, VB e IC em esfregaços cervicais pode indicar uma maior possibilidade de detectar anormalidades citológicas em adolescentes e mulheres jovens.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-11-03T14:46:10Z No. of bitstreams: 2 Tese - Milton Camplesi Júnior - 2013.pdf: 1024643 bytes, checksum: cb368bee54b97ea46107c5023cb02036 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-11-03T14:53:13Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Milton Camplesi Júnior - 2013.pdf: 1024643 bytes, checksum: cb368bee54b97ea46107c5023cb02036 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-03T14:53:13Z (GMT). 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In this study was verified the incidence of fungal infections in 117 patients undergoing hematopoietic stem cell transplantation (HSCT), whose data such as age, gender and underlying disease were cataloged. Blood samples of these 392 patients were collected, and tested for detection of GM using ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) test and cultivated in culture medium containing biphasic brain heart infusion (broth) and Sabouraud dextrose (agar) for isolation of fungal. The fungi isolated were subjected to in vitro susceptibility testing using broth microdilution method for the antifungal agents: itraconazole, voriconazole, fluconazole, caspofungin and amphotericin B. Among the data obtained from HSCT patient it has been found that the mean age was 35,7 years and the largest number belonged to the age group between 21 and 60 years; 52,2% were male, 53% had received allogeneic stem cell transplant. Leukemias (55,5%) were the main diseases responsible for transplant. Fungal isolates from clinical samples were identified as A. fumigatus (02), Aspergillus flavus (01), Fusarium sp (01), Acremonium strictum (01), Candida parapsilosis (06), Candida tropicalis (06) and Candida albicans (04). Of all patients analyzed 19,6% (23/117) had two or more positive samples for GM. According to European Organization for Research and Treatment of Cancer, invasive aspergillosis was interpreted as proven in 2,5% defined by growth of Aspergillus in culture, 5,9% as probable for the detection of GM in blood and pulmonary infiltrates and 2,5% as possible by radiological changes suggestive of aspergillosis and negative GM. The mortality rate for AI proven/probable was 60% and showed that the disease was significantly associated with the risk of death (P <0,05). The filamentous fungi were more susceptible in vitro to voriconazole, while higher susceptibility of the yeast was found to Caspofungin. Considering that the crude mortality rate of IA is very high and the early therapy may lead to improved prognosis, we could suggest that the Platelia Aspergillus GM EIA in serum of patients could be useful as screening tools for identification in patients at high risk of developing IA. / Infecções fúngicas invasivas têm emergido nas últimas duas décadas como uma das principais micoses causadoras de infecções nosocomiais, merecendo destaque aquelas causadas por espécies de Candida e Aspergillus. A aspergilose invasiva (AI) apresenta alta taxa de mortalidade e a detecção precoce de Aspergillus pode ser de extrema importância para o tratamento e consequentemente evitar a morte do paciente. O galactomanana (GM), componente protéico da parede celular de Aspergillus spp, pode ser detectado no soro, urina, líquido cefalorraquidiano e lavado bronqueoalveolar. A detecção de GM nos estágios iniciais da doença é considerada um marcador útil no diagnóstico precoce da doença. Neste estudo foi verificada a incidência de infecções fúngicas nos pacientes transplantados de células tronco hematopoiéticas (HCTH) procedentes do Hospital Araújo Jorge de Goiânia-GO. Foram analisados 117 pacientes dos quais foram catalogados dados como idade, gênero e doença de base. Destes pacientes foram coletadas 392 amostras de sangue e analisadas para detecção de GM por ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) e por cultivo em meio bifásico contendo brain heart infusion (caldo) e Sabouraud dextrose (ágar) para isolamento de fungos. Testes de suscetibilidade in vitro utilizando o método de microdiluição em caldo para os agentes antifúngicos: itraconazol, voriconazol, fluconazol, caspofungina e anfotericina B foram utilizados para os fungos isolados. Dentre os dados obtidos dos pacientes TCTH verificou-se que a média de idade foi de 35,7 anos e o maior número pertencia à faixa etária entre 21 e 60 anos com 52,2% pertencentes ao sexo masculino. Nestes pacientes havia 53% de receptores alogênicos e das doenças associadas os diferentes tipos de leucemias (55,5%) foram as principais responsáveis pelo transplante. Dos fungos isolados das amostras clínicas, foram identificados dois Aspergillus fumigatus, um Aspergillus flavus, um Fusarium sp, um Acremonium strictum, seis Candida parapsilosis, seis Candida tropicalis e quatro Candida albicans. Do total de pacientes analisados 19,6% (23/117) apresentaram duas ou mais amostras positivas para GM. Seguindo a classificação do European Organization for Research and Treatment of Cancer, a aspergilose invasiva foi interpretada como provada em 2,5%, definida pelo crescimento de Aspergillus em cultivo, 5,9% como provável pela detecção de GM no sangue e presença de infiltrados pulmonares e 2,5% como possível por alterações radiológicas sugestivas de aspergilose e GM negativo. A taxa de mortalidade para AI provada/provável foi de 60% e mostrou que a doença estava significativamente associada com o risco de morte (P <0,05). Os fungos filamentosos mostraram-se mais suscetíveis in vitro ao voriconazol, enquanto para as leveduras a maior suscetibilidade foi encontrada para caspofungina. Considerando-se que a taxa de mortalidade da AI é muito elevada e a terapia inicial pode levar ao melhor prognóstico da doença, pode-se sugerir que a detecção de GM no soro de pacientes TCTH é uma ferramenta útil para a identificação de pacientes com risco elevado de desenvolver AI, a fim de reduzir a alta mortalidade relacionada a esta condição.