Manguezais são considerados ecossistemas costeiros, localizados na transição entre os ambientes terrestre e marinho. Esse ambiente é característico de regiões tropicais e subtropicais, sendo encontrados em todo o mundo, principalmente no Brasil, Indonésia e Austrália. A ocorrência de grande quantidade de matéria orgânica potencializa o fato de que os microrganismos são importantíssimos na ciclagem de nutrientes nestes ambientes. Microrganismos endofíticos podem ser extremamente relevantes para os vegetais existentes em manguezais por habitarem o interior destes, em todo seu ciclo de vida ou somente em parte dele, sem prejudicá-lo ou causar qualquer dano aparente ao mesmo. Os endofíticos podem conferir ao seu hospedeiro características importantes, tais como, maior resistência a condições de estresse, suprimento de nutrientes e outros componentes de interesse biotecnológico (como enzimas, antibióticos e drogas de interesse farmacêutico). O presente estudo visou, assim, verificar a diversidade de bactérias diazotróficas endofíticas existentes em mangue vermelho (Rhizophora mangle) da Ilha do Cardoso (Cananéia SP) e estudar a biodiversidade funcional dos principais grupos e potencial biotecnológico. / Mangroves are considered a coastal ecosystem, located in the transition between the terrestrial and marine environments. This environment is typical of tropical and subtropical regions and is found throughout the world, mainly in Brazil, Indonesia and Australia. The occurrence of a large amount of organic matter enhances the fact that microorganisms are important in the cycling of nutrients in these environments. Endophytic microorganisms can be extremely relevant to the plant existing in mangrove swamps, because live in the interior of these, in its entire life cycle or only part of it, not harm him or cause any apparent damage to it. The endophytic can give to your host important characteristics such as greater resistance to conditions of stress, supply of nutrients and other components of biotechnological interest (such as enzymes, antibiotics and drugs of pharmaceutical interest). This paper therefore finds the diversity of endophytic diazotrophic bacteria exist in red mangrove (Rhizophora mangle) of Ilha do Cardoso (Cananéia - SP) and study the functional biodiversity of the main groups and potential biotechnology.

A Clorose Variegada dos Citros (CVC), doença que causa graves prejuízos à citricultura no estado de São Paulo, é causada pela bactéria Xylella fastidiosa que é transmitida pelas cigarrinhas Bucephalogonia xanthophis (Berg), Dilobopterus costalimai (Young), Acrogonia citrina (Marucci & Cavichioli) e Oncometopia facialis (Signoret). Durante a alimentação em plantas afetadas, esses insetos adquirem a bactéria, que coloniza o pré-cibário e o cibário, e depois são capazes de transmitir a doença para plantas sadias. Colonizando o xilema das plantas de citros encontram-se também bactérias endofíticas, que são microrganismos capazes de colonizar internamente tecidos de plantas sem causar dano aparente, e que podem interagir com patógenos no interior do hospedeiro. Este trabalho teve como objetivo avaliar a comunidade bacteriana associada as cigarrinhas vetoras de CVC, e observar as possíveis interações que ocorrem entre insetos vetores de X. fastidiosa e bactérias endofíticas de citros. Primeiramente foi feito um isolamento das bactérias da cabeça de cigarrinhas coletadas em pomares de citros afetados com CVC. Foram isoladas um total de 17230 bactérias de três espécies de cigarrinhas (O. facialis, D. costalimai e A. citrina) em três datas diferentes (22/março, 05/maio e 14/junho de 2002), que foram primeiramente classificadas em 9 grupos morfológicos. Do total, 120 bactérias representantes foram avaliadas por ARDRA e classificadas em 16 haplótipos, dos quais alguns foram identificados, por seqüenciamento da região 16S do rDNA, como Methylobacterium sp. e Curtobacterium sp., que são bactérias endofíticas de citros já descritas e que interagem com X. fastidiosa em citros. Primers específicos para estas bactérias foram utilizados para PCRs com o DNA total da cabeça de cigarrinhas e variou de 39,1% a 89,6% nas diferentes espécies. A comunidade bacteriana associada às cigarrinhas foi também avaliada por DGGE e apresentou variações quanto ao inseto hospedeiro e quanto à época das avaliações. Um isolado de M. mesophilicum expressando o gene da proteína verde fluorescente (GFP ? Green Fluorescent Protein) foi utilizado para experimento de transmissão deste endófito por B. xanthophis. Os insetos se alimentaram em membrana contendo a solução da bactéria e depois foram colocados em plantas de Catharanthus roseus. Das plantas, 13% apresentaram a bactéria fluorescente colonizando tecidos endofiticamente, o que indica que a cigarrinha é capaz de transmitir o endófito. Testes para a avaliação da produção de moléculas de quorum sensing (AHLs - Acil Homocerina Lactonas) foram feitos para M. mesophilicum e M. extorquens. Foram ainda desenvolvidos mutantes de M. extorquens, defectivos para a produção de biofilme e AHLs. / The Citrus Variegated Chlorosis (CVC), a very important disease which attacks citrus trees in the state of São Paulo, is caused by the xylem-limited bacteria, Xylella fastidiosa, which is transmitted by four species of sharpshooters (Cicadellidae) Bucephalogonia xanthophis (Berg), Dilobopterus costalimai (Young), Acrogonia citrina (Marucci & Cavichioli) and Oncometopia facialis (Signoret) which are capable of acquiring X. fastidiosa from the xylem while feeding. In plants, endophytic bacteria, which inhabit the interior of aerial plant parts developing an asymptomatic infection and show potential benefits as biocontrol agents of pests and diseases, may colonize the same niche of pathogens, such as X. fastidiosa, what could allow endophytes to interact with the pathogen. Bacteria were isolated from head of insect vectors, collected on affected citrus plants. From 17230 bacteria isolated from the heads of three insect species (O. facialis, D. costalimai and A. citrina) in three different days (22/march, 05/may and 14/june of 2002), 120 bacteria were tested with ARDRA and classified into 16 different haplotypes. The most frequent strains had their 16S rDNA fragment sequenced and they were identified as Methylobacterium sp. and Curtobacterium sp., bacteria which have been described as citrus endophytes which interact with X. fastidiosa. Total DNA of insect heads was used in Nested PCRs for detection of these citrus endophytes in insects. The frequencies of detection ranged from 39,1% to 89,6%. The bacterial community associated to sharpshooters was also evaluated by DGGE and presented variations due to insect host and time of the evaluations. One M. mesophilicum isolate, expressing the GFP (Green Fluorescent Protein), was used to test the transmission of endophytes by B. xanthophis. Insects fed on membranes containing a bacterial solution and after were trapped on Catharanthus roseus. From the evaluated plants, 13% presented the fluorescent protein colonizing endophytically, indicating that the insect is able to transmit the endophytic bacteria. Biofilm and quorum sensing molecules (AHLs - Acyl Homocerine Lactones) production by Methylobacterium sp. were tested, and M. extorquens mutants for both features were produced.

Os microrganismos endofíticos são aqueles, cultiváveis ou não, que habitam o interior da planta hospedeira sem causar danos aparentes ou estruturas externas visíveis. Essa interação planta-microrganismo é intrínseca a determinadas espécies de plantas e/ou bactérias. Nas últimas décadas os estudos de microrganismos endofíticos têm sido realizados em diversas plantas hospedeiras, sendo esses estudos direcionados, principalmente, para a diversidade e características benéficas induzidas, como o controle biológico de doenças. As doenças com sintomas de murcha e cancro são consideradas emergentes no setor florestal. O Brasil está entre os maiores produtores mundiais de Eucalyptus e a expansão do setor, juntamente com o cultivo clonal, tem acarretado o aumento da incidência de patógenos. O surgimento de novas doenças exige estudos relacionados tanto a interação do agente patogênico com hospedeiro quanto de todos os componentes do patossistema. Neste contexto, os microrganismos endofíticos e do rizoplano têm sido descritos como potenciais controladores biológicos de doenças. Dessa forma, o presente trabalho teve por objetivos avaliar a interação da comunidade bacteriana associada a Eucalyptus sp. com fungos causadores de murcha e cancro. Foi também estudada a diversidade e colonização desses endófitos em sementes e o efeito da germinação nessa interação. Adicionalmente, foi realizada uma busca por bactérias associadas a Eucalypus sp. com capacidade de controlar fungos causadores de murcha e cancro. Foi observado que a densidade bacteriana endofítica não difere entre as espécies de Eucalyptus citriodora, E. urophylla e E. globulus x E. grandis avaliadas e que esta comunidade cultivada é composta por bactérias pertencentes às classes Actinobacteria, Proteobacteria e Firmicutes. Com uso de diferentes ferramentas de estudo foi observado que a quantidade de bactérias endofíticas nas sementes aumenta proporcionalmente ao tempo de germinação. Foi observado também que os sintomas de murcha e cancro causados, principalmente, por Ceratocystis fimbriata podem ser causados por outros fungos patogênicos. Foram identificados 41 isolados bacterianos endofíticos e do rizoplano com capacidade de controlar fungos patogênicos causadores de murcha e cancro em Eucalyptus sp. Adicionalmente ao potencial para uso no controle biológico do cancro e da murcha de Eucalyptus, as bactérias de sementes aqui relatadas, podem ter papel importante de proteção das plantas no campo. Futuros estudos devem ser direcionados para identificação de genes associados a essa inibição, bem com análise dos fatores responsáveis por este controle biológico no campo. / The endophytic microorganisms are those, cultivated or not, that inhabit the interior of the plant host without causing apparent damages or visible external structures. This interaction plant-microorganism is specific to certain species of plants and/or bacteria. In the last few years studies of endophytic microorganisms have been carried out for several plant hosts, which are focused mainly to diversity and biotechnological potential, such as biological control of disease. Brazil is one of the largest world Eucalyptus producers and the increasing of the Eucalyptus production associated to clonally reproduction has allowed an increasing incidence of some pathogens. These new disease demands on studies related to causal agent and biotic and abiotic factors associated to the diseases. The canker of Eucalyptus is considered an emerging disease by several reforestation companies. In that way, the rhizoplane and endophytic microorganisms has been described as potential diseases biological control agents. In this context, the aims of the present work were to assess the bacterial community associated to Eucalyptus sp. plants and seeds, besides the interaction with the wilt and canker pathogenic fungi. We also assessed the diversity and colonization effect of seed germination on bacterial community. Additionally, was carried out a screening of the Eucalypus sp. associated bacteria against pathogenic fungi that cause wilt and canker. We observed that endophytic bacterial density doesn\'t differ among the species of Eucalyptus citriodora, E. urophylla and E. globulus x E. grandis and that this cultivated community is composed by follow bacterial classes Actinobacteria, Proteobacteria and Firmicutes. Using different study approaches was observed that the amount of endophytic bacteria in the seeds increases proportionally at the germination time. We also observed that the symptoms of wilt and canker caused, mainly, by Ceratocystis fimbriata may be caused by other pathogenic fungi too. Additionally, were identified 41 endophytic and rhizoplane bacterial isolates able to control pathogenic fungi that cause Eucalyptus wilt and canker. Besides to the wilt and canker biological control potential of that bacteria, the seed endophyte identified in the present work can have important function on plant protection in the field. New studies should be addressed for identification of genes related to antagonism, besides of factors responsible for biological control occurrence in the field.

Tecidos vegetais, incluindo as sementes, são habitados por microrganismos denominados endofíticos, cuja interação com a planta pode conferir características vantajosas ao hospedeiro. Sabe-se que o crescimento de plantas é influenciado por fatores como a síntese de ácido-indolacético (AIA), solubilização de fosfato, fixação de nitrogênio e controle de fungos fitopatogênicos. Antes da comercialização, as condições de armazenamento de sementes de soja podem restringir o desenvolvimento de microrganismos devido à baixa temperatura e umidade. Esse fato leva ao interesse de exploração de microrganismos endofíticos resistentes a essas condições. O estudo e a caracterização dessas comunidades são de grande interesse agronômico e biotecnológico, sendo possível sua aplicação em sementes, introduzindo no campo plantas com superior potencial de produção. Com os objetivos de comparar a comunidade bacteriana endofítica de sementes de soja geneticamente modificadas e convencionais; e de isolar e caracterizar essas comunidades, sementes de 12 cultivares de soja foram amostradas, de onde 3504 isolados bacterianos foram obtidos. Os isolados foram agrupados morfologicamente de acordo com a coloração e taxa de crescimento das colônias, sendo representantes de cada grupo morfológico (no total 176 isolados) agrupados pela técnica de ARDRA (Análise de Restrição de DNA Ribossomal Amplificado). Um total de 12 ribotipos foi observado compondo a comunidade cultivada de bactérias endofíticas de sementes de soja. Representantes destes ribotipos tiveram seus genes 16S rDNA parcialmente sequenciados, identificando os integrantes desta comunidade como: Acinetobacter sp., Bacillus sp., Brevibacterium sp., Chryseobacterium sp., Citrobacter sp., Curtobacterium sp., Enterobacter sp., Methylobacterium sp., Microbacterium sp., Micromonospora sp., Pantoea sp., Paenibacillus sp., Pseudomonas sp., Ochrobactrum sp., Streptomyces sp. e Tsukamurella sp. A comunidade bacteriana endofítica de sementes de soja provenientes de plantas genticamente modificadas apresentou uma diversidade maior comparada à comunidade bacteriana de plantas convencionais. Em relação ao potencial biotecnológico desta comunidade, os resultados demonstraram que os isolados foram capazes de controlar o crescimento de fungos fitopatogênicos por antagonismo (18%), sintetizar AIA (100%), solubilizar fosfato (39%) e fixar nitrogênio (18%). Os isolados com os melhores resultados nas análises in vitro foram inoculados em sementes de soja e avaliados em casa de vegetação quanto à habilidade de promover o crescimento das plantas. As plantas apresentaram diferentes respostas à inoculação das bactérias. A maior parte dos tratamentos mostrou influência negativa das bactéria nas plantas, enquanto que um isolado de Enterobacter sp. aumentou a massa da matéria seca de raiz. Mesmo não diferindo estatisticamente, alguns isolados mostraram tendência de aumento e outros de diminuição de biomassa da planta. / Plant tissues, including seeds, are inhabited by microorganisms called endophytes, whose interaction with the plant can offer advantages to the host. It is known that plants growth promotion is induced by indole acetic acid (IAA) synthesis, phosphate solubilization and nitrogen fixation, among others. The control of phytopathogenic fungi is also related to a good plant development. Before commercialization, the seed storage conditions can restrict the development of microorganism, due to the low temperature and humidity. This fact leads to the interest of exploring resistant microorganisms to those conditions. The study and the characterization of these communities are of great agronomic and biotechnological interest, being possible its application onto seeds, introducing in the field plants with a greater production potential. In this context, the aim of this study was to isolate and identify the endophytic bacteria community in soybean seeds and study the capacity of these isolates to promote growth in the host plant, including: phosphate solubilization, nitrogen fixation, IAA synthesize and antagonism against phytopathogenic fungi. From seeds of 12 cultivars, 3504 bacteria were isolated. The isolates were morphologically grouped according to the coloration and growth rate of the colony. Representatives of each morph group, totalizing 176, were analyzed using the Amplified Ribosomal Restriction Analysis (ARDRA) technique. A total of 12 ARDRA ribotypes were observed in the cultivable endophytic community of soybean seeds. Representatives of each ribotype had their 16S rDNA gene partially sequenced, allowing to the identification of the members of this community as: Acinetobacter sp., Bacillus sp., Brevibacterium sp., Chryseobacterium sp., Citrobacter sp., Curtobacterium sp., Enterobacter sp., Methylobacterium sp., Microbacterium sp., Micromonospora sp., Pantoea sp., Paenibacillus sp., Pseudomonas sp., Ochrobactrum sp., Streptomyces sp. and Tsukamurella sp. The endophytic bacterial community of soybean seeds from genetically modified plants showed a greater diversity compared to the bacterial community of conventional seeds. In relation to the biotechnological potential of the community, the outcomes demonstrate that the isolates were able to antagonist phytopathogenic fungi (18%), synthesize IAA (100%), solubilize phosphate (39%) and fix nitrogen (18%). The isolates with best in vitro outcomes were inoculated onto seeds and tested in greenhouse for their ability to promote growth in soybean. The plants answered differently to the inoculation of each bacterial isolate. The major part of the treatments demonstrated a negative influence of bacteria onto plants, while one Enterobacter sp. isolate increased the dry mass weight of roots. Even not differing statistically, some isolates showed a tendency to increase, meanwhile others to decrease the biomass of the plant.

A presença de bactérias na base de microplantas estabelecidas in vitro, acarreta o descarte da cultura, tornando a técnica onerosa. Entretanto, há de se considerar que nem sempre a presença dos microrganismos afeta o desenvolvimento das plantas em diferentes fases da micropropagação, inferindo que essas colônias são resultantes de exsudações de endófitos da espécie cultivada. Neste contexto, o presente trabalho visou verificar as possíveis influências da manifestação bacteriana endofítica no desenvolvimento in vitro de clones de Eucalyptus benthamii. Para tanto, foram útilizados quatro clones (BP101; BP115, BP118 e BP120), em duas etapas de desenvolvimento: multiplicação e alongamento e, embora o processo in vitro fosse o principal foco da pesquisa, as análises estenderam-se para a fase de aclimatização, ou seja, desenvolvimento ex vitro. As microcepas foram mantidas in vitro sob dois tipos de manifestações bacterianas, as quais por sua vez, foram distintas quanto à coloração em: manifestação de colônias amarelas e manifestação de colônias brancas e, o controle, sem manifestação. Para compreender o desenvolvimento das microplantas na presença dos microrganismos, foram avaliados os parâmetros referentes ao incremento em massa seca, número de brotações, brotações alongadas e enraizamento, bem como características anatômicas e bioquímicas (produção de malondealdeído e teor de nitrogênio) das mesmas. Por meio da identificação molecular por BOX-PCR os isolados bacterianos foram agrupados e posteriormente identificados por sequenciamento parcial do gene 16S rRNA. As linhagens bacterianas identificadas foram analisadas quanto à produção de AIA e fixação de nitrogênio, sendo as linhagens com os melhores resultados utilizadas na bacterização de microcepas de duas diferentes espécies de eucalipto (E. benthamii e E. cloeziana). Os resultados evidenciaram que nem toda presença microbiana in vitro é prejudicial às plantas micropropagadas, pelo contrário, observou-se que na maioria dos casos em E. benthamii, as manifestações possuem efeito neutro ou benéfico, promovendo o desenvolvimento das microplantas. As manifestações brancas e/ou amarelas constituíam uma associação de bactérias, com alta especificidade na interação endófito/microplanta. As análises moleculares identificaram similaridade com seis gêneros bacterianos: Curtobacterium (Actinobacteria), Bacillus e Aneurinibacillus (Firmicutes), Delftia (Betaproteobacteria), Bradyrhizobium, e Novosphingobium (Alphaproteobacteria), onde alguns deles mostraram-se comuns nos diferentes clones, sendo a Curtobacterium presente em todas as manifestações de todos os clones de E. benthamii analisados. Os resultados obtidos com a bacterização de diferentes espécies de eucalipto reforçam a especificidade da microbiota endofítica manifestada com seu hospedeiro, uma vez que a introdução de um isolado (inóculo) pode ocasionar alteração no equilíbrio do sistema de interação estabelecido, acarretando na redução ou simplesmente mantendo estável a taxa de crescimento das microplantas. Dessa forma, diante do atual panorama das biofábricas, as quais descartam inúmeras microplantas cultivadas in vitro em decorrência das manifestações bacterianas, evitar o descarte das microcepas e controlar sua manifestação, representa minimizar consideravelmente os prejuízos para as empresas e setores de pesquisas. / The occurrence of bacteria growing together with microplants in vitro conditions frequently lead to discard of the material, increasing the costs on the micropropagation techniques. However, the microorganisms presence on the bacterial cultures do not always affect the plant development during the different phases of micropropagation because the bacteria colony probability are originated from self microplants as endophytic manifestations. This study evaluated the possible influences of the endophytic bacterian manifestation in the development of Eucalyptus benthamii growing on in vitro conditions. To access the evaluations were used four clones (BP101, BP115, BP118 e BP120) in two phases of microplants in vitro development: multiplication and elongation. The microstumps were grown under two different kinds of bacterial manifestations, distinguishable by colors in: white colony manifestations, yellow colony manifestations and no manifestations (control). To elucidate the microstumps development under the microorganisms presence, were evaluated referent parameters to the dry mass increasing, number of shoots, elongated shoots and rooting, as well as anatomical and biochemical characteristics alterations (malondialdehyde and nitrogen content). After bacterial isolation, they were grouped and identified by BOX-PCR, using partial sequencing of 16S rRNA gene. On the sets of the identified bacteria were analyzed for the AIA production and the nitrogen fixation, and those with better results were used to bacterizate another microstumps of two different Eucalyptus species (E. benthamii and E. cloeziana). The results indicate that the presence of in vitro microrganisms and microstumps together not always affect negatively the plant development. In opposite, bacterial manifestations brought benefits, stimulating the microstumps growth or do not affecting the growth of E. benthamii in vitro conditions. Actually, the white and yellow manifestations represents clusters of different bacteria, with high specificity in the interaction microstumps and endophytic. Molecular approaches identified through similarity analysis, six bacterial genus: Curtobacterium (Actinobacteria), Bacillus and Aneurinibacillus (Firmicutes); Delftia (Betaproteobacteria), Bradyrhizobium and Novosphingobium (Alphaproteobacteria). The occurrences of several of the bacteria were common among some clones, and Curtobacterium was present in all clones of E. benthamii analyzed. The results obtained by bacterization of two different Eucalyptus species confirmed that there is a high specificity between endophytic microorganisms\" manifestations and its host plants, because the artificial bacteria introduction can causes alterations on the equilibrium of the establishment system of plant-microorganism interactions, reducing or stabilizing growth rates on microstumps. Considering the current situation about the biofactories, which usually discard great amount of cultivate microplants in vitro because of the bacterial manifestation, it´s possible avoid these plant discard and make a control of their manifestations, with the intention to minimize substantially the losses in biofactories and also in research laboratories.

A presença de bactérias na base de microplantas estabelecidas in vitro, acarreta o descarte da cultura, tornando a técnica onerosa. Entretanto, há de se considerar que nem sempre a presença dos microrganismos afeta o desenvolvimento das plantas em diferentes fases da micropropagação, inferindo que essas colônias são resultantes de exsudações de endófitos da espécie cultivada. Neste contexto, o presente trabalho visou verificar as possíveis influências da manifestação bacteriana endofítica no desenvolvimento in vitro de clones de Eucalyptus benthamii. Para tanto, foram útilizados quatro clones (BP101; BP115, BP118 e BP120), em duas etapas de desenvolvimento: multiplicação e alongamento e, embora o processo in vitro fosse o principal foco da pesquisa, as análises estenderam-se para a fase de aclimatização, ou seja, desenvolvimento ex vitro. As microcepas foram mantidas in vitro sob dois tipos de manifestações bacterianas, as quais por sua vez, foram distintas quanto à coloração em: manifestação de colônias amarelas e manifestação de colônias brancas e, o controle, sem manifestação. Para compreender o desenvolvimento das microplantas na presença dos microrganismos, foram avaliados os parâmetros referentes ao incremento em massa seca, número de brotações, brotações alongadas e enraizamento, bem como características anatômicas e bioquímicas (produção de malondealdeído e teor de nitrogênio) das mesmas. Por meio da identificação molecular por BOX-PCR os isolados bacterianos foram agrupados e posteriormente identificados por sequenciamento parcial do gene 16S rRNA. As linhagens bacterianas identificadas foram analisadas quanto à produção de AIA e fixação de nitrogênio, sendo as linhagens com os melhores resultados utilizadas na bacterização de microcepas de duas diferentes espécies de eucalipto (E. benthamii e E. cloeziana). Os resultados evidenciaram que nem toda presença microbiana in vitro é prejudicial às plantas micropropagadas, pelo contrário, observou-se que na maioria dos casos em E. benthamii, as manifestações possuem efeito neutro ou benéfico, promovendo o desenvolvimento das microplantas. As manifestações brancas e/ou amarelas constituíam uma associação de bactérias, com alta especificidade na interação endófito/microplanta. As análises moleculares identificaram similaridade com seis gêneros bacterianos: Curtobacterium (Actinobacteria), Bacillus e Aneurinibacillus (Firmicutes), Delftia (Betaproteobacteria), Bradyrhizobium, e Novosphingobium (Alphaproteobacteria), onde alguns deles mostraram-se comuns nos diferentes clones, sendo a Curtobacterium presente em todas as manifestações de todos os clones de E. benthamii analisados. Os resultados obtidos com a bacterização de diferentes espécies de eucalipto reforçam a especificidade da microbiota endofítica manifestada com seu hospedeiro, uma vez que a introdução de um isolado (inóculo) pode ocasionar alteração no equilíbrio do sistema de interação estabelecido, acarretando na redução ou simplesmente mantendo estável a taxa de crescimento das microplantas. Dessa forma, diante do atual panorama das biofábricas, as quais descartam inúmeras microplantas cultivadas in vitro em decorrência das manifestações bacterianas, evitar o descarte das microcepas e controlar sua manifestação, representa minimizar consideravelmente os prejuízos para as empresas e setores de pesquisas. / The occurrence of bacteria growing together with microplants in vitro conditions frequently lead to discard of the material, increasing the costs on the micropropagation techniques. However, the microorganisms presence on the bacterial cultures do not always affect the plant development during the different phases of micropropagation because the bacteria colony probability are originated from self microplants as endophytic manifestations. This study evaluated the possible influences of the endophytic bacterian manifestation in the development of Eucalyptus benthamii growing on in vitro conditions. To access the evaluations were used four clones (BP101, BP115, BP118 e BP120) in two phases of microplants in vitro development: multiplication and elongation. The microstumps were grown under two different kinds of bacterial manifestations, distinguishable by colors in: white colony manifestations, yellow colony manifestations and no manifestations (control). To elucidate the microstumps development under the microorganisms presence, were evaluated referent parameters to the dry mass increasing, number of shoots, elongated shoots and rooting, as well as anatomical and biochemical characteristics alterations (malondialdehyde and nitrogen content). After bacterial isolation, they were grouped and identified by BOX-PCR, using partial sequencing of 16S rRNA gene. On the sets of the identified bacteria were analyzed for the AIA production and the nitrogen fixation, and those with better results were used to bacterizate another microstumps of two different Eucalyptus species (E. benthamii and E. cloeziana). The results indicate that the presence of in vitro microrganisms and microstumps together not always affect negatively the plant development. In opposite, bacterial manifestations brought benefits, stimulating the microstumps growth or do not affecting the growth of E. benthamii in vitro conditions. Actually, the white and yellow manifestations represents clusters of different bacteria, with high specificity in the interaction microstumps and endophytic. Molecular approaches identified through similarity analysis, six bacterial genus: Curtobacterium (Actinobacteria), Bacillus and Aneurinibacillus (Firmicutes); Delftia (Betaproteobacteria), Bradyrhizobium and Novosphingobium (Alphaproteobacteria). The occurrences of several of the bacteria were common among some clones, and Curtobacterium was present in all clones of E. benthamii analyzed. The results obtained by bacterization of two different Eucalyptus species confirmed that there is a high specificity between endophytic microorganisms\" manifestations and its host plants, because the artificial bacteria introduction can causes alterations on the equilibrium of the establishment system of plant-microorganism interactions, reducing or stabilizing growth rates on microstumps. Considering the current situation about the biofactories, which usually discard great amount of cultivate microplants in vitro because of the bacterial manifestation, it´s possible avoid these plant discard and make a control of their manifestations, with the intention to minimize substantially the losses in biofactories and also in research laboratories.

A cultura de tecidos tem sido uma importante ferramenta amplamente utilizada para diversas finalidades, dentre elas a micropropagação tem merecido destaque devido à rápida produção de mudas saudáveis num espaço físico reduzido. Dentro deste contexto, o termo, plantas axênicas, tem sido difundido como um ideal a ser atingido nesta técnica, havendo a busca cada vez maior de métodos que eliminem de forma eficaz toda e qualquer contaminação que possa, eventualmente, crescer no meio de cultura. No entanto, cada vez mais se observa que a concepção de contaminação dentro da cultura de tecidos deve ser revista, assim como a de planta axênica, pois inúmeros trabalhos têm mostrado, que mesmo em microplantas assintomáticas consideradas axênicas, existe uma comunidade endofítica onipresente e que na sua grande maioria desempenha papel fundamental no estabelecimento, desenvolvimento e aclimatização das culturas, sendo, portanto, microrganismos benéficos que devem ser conservados no cultivo in vitro. Dessa forma, o presente trabalho teve como principal objetivo investigar a microbiota endofítica presente em diversas espécies de microplantas assintomáticas consideradas axênicas, independente de seu protocolo de cultivo in vitro, local, método de micropropagação e manipulação. Para tal, foram utilizadas microplantas assintomáticas, em fase de multiplicação por mais de um ano, provenientes de três laboratórios diferentes, submetidas à caracterização por meio de testes histoquímicos, à análises ultraestruturais, a isolamento em diferentes meios de cultura por dois métodos (trituração e fragmentação), à análises moleculares utilizando a extração do DNA genômico total e PCR-DGGE, além da extração e sequenciamento do DNA dos isolados obtidos. Os resultados obtidos pelo isolamento, testes moleculares e análises ultraestruturais, evidenciaram a presença de uma comunidade endofítica, colonizando os tecidos de diferentes espécies de microplantas, provenientes de três laboratórios distintos. Dessa forma, conclui-se que a inexistência de plantas axênicas deve ser considerada, futuramente, como um aspecto positivo dentro da cultura de tecidos, uma vez que, essa comunidade endofítica pode atribuir características de interesse agronômico às diferentes espécies vegetais. / Tissue culture has been an important tool widely used for various purposes, among them the micropropagation has been highlighted due to the rapid production of healthy seedlings in a small space. Within this context, the term axenic plant has been distributed as an ideal to be achieved in this technique, which the search based on numerous methods that effectively eliminate any contamination that may eventually grow into the culture medium. However, it is seen that the conception of contamination in tissue culture should be reviewed as well as axenic plants, because several studies have shown that even in asymptomatic microplants considered axenic, there is an ubiquitous and that the endophytic community mostly plays a fundamental role in the establishment, development and acclimatization of cultures, therefore, beneficial microorganisms that should be preserved in vitro. Thus, this study aimed to investigate the endophytic microbiota present in several species of micro asymptomatic considered \"axenic\" regardless of their protocol for in vitro culture, location, method of micropropagation and manipulation. For this purpose, were used asymptomatic microplants in multiplication stage by more than one year, from three different laboratories, and were submitted to characterization by histochemistry tests, ultrastructural analysis, isolation in different culture medium by two methods (grinding and fragmentation), molecular analyses using the extraction of total genomic DNA and PCR-DGGE, in addition to extracting and sequencing the DNA of the isolates obtained. The results obtained by the isolation, molecular and ultrastructural analysis, showed the presence of an endophytic community colonizing the tissues of different species of microplants, from three different laboratories. Thus, it was concluded that the inexistence of axenic plants should be considered in future as a positive aspect in the tissue culture, since this endophytic community can give agronomical traits to different crop species.

Tecidos vegetais, incluindo as sementes, são habitados por microrganismos denominados endofíticos, cuja interação com a planta pode conferir características vantajosas ao hospedeiro. Sabe-se que o crescimento de plantas é influenciado por fatores como a síntese de ácido-indolacético (AIA), solubilização de fosfato, fixação de nitrogênio e controle de fungos fitopatogênicos. Antes da comercialização, as condições de armazenamento de sementes de soja podem restringir o desenvolvimento de microrganismos devido à baixa temperatura e umidade. Esse fato leva ao interesse de exploração de microrganismos endofíticos resistentes a essas condições. O estudo e a caracterização dessas comunidades são de grande interesse agronômico e biotecnológico, sendo possível sua aplicação em sementes, introduzindo no campo plantas com superior potencial de produção. Com os objetivos de comparar a comunidade bacteriana endofítica de sementes de soja geneticamente modificadas e convencionais; e de isolar e caracterizar essas comunidades, sementes de 12 cultivares de soja foram amostradas, de onde 3504 isolados bacterianos foram obtidos. Os isolados foram agrupados morfologicamente de acordo com a coloração e taxa de crescimento das colônias, sendo representantes de cada grupo morfológico (no total 176 isolados) agrupados pela técnica de ARDRA (Análise de Restrição de DNA Ribossomal Amplificado). Um total de 12 ribotipos foi observado compondo a comunidade cultivada de bactérias endofíticas de sementes de soja. Representantes destes ribotipos tiveram seus genes 16S rDNA parcialmente sequenciados, identificando os integrantes desta comunidade como: Acinetobacter sp., Bacillus sp., Brevibacterium sp., Chryseobacterium sp., Citrobacter sp., Curtobacterium sp., Enterobacter sp., Methylobacterium sp., Microbacterium sp., Micromonospora sp., Pantoea sp., Paenibacillus sp., Pseudomonas sp., Ochrobactrum sp., Streptomyces sp. e Tsukamurella sp. A comunidade bacteriana endofítica de sementes de soja provenientes de plantas genticamente modificadas apresentou uma diversidade maior comparada à comunidade bacteriana de plantas convencionais. Em relação ao potencial biotecnológico desta comunidade, os resultados demonstraram que os isolados foram capazes de controlar o crescimento de fungos fitopatogênicos por antagonismo (18%), sintetizar AIA (100%), solubilizar fosfato (39%) e fixar nitrogênio (18%). Os isolados com os melhores resultados nas análises in vitro foram inoculados em sementes de soja e avaliados em casa de vegetação quanto à habilidade de promover o crescimento das plantas. As plantas apresentaram diferentes respostas à inoculação das bactérias. A maior parte dos tratamentos mostrou influência negativa das bactéria nas plantas, enquanto que um isolado de Enterobacter sp. aumentou a massa da matéria seca de raiz. Mesmo não diferindo estatisticamente, alguns isolados mostraram tendência de aumento e outros de diminuição de biomassa da planta. / Plant tissues, including seeds, are inhabited by microorganisms called endophytes, whose interaction with the plant can offer advantages to the host. It is known that plants growth promotion is induced by indole acetic acid (IAA) synthesis, phosphate solubilization and nitrogen fixation, among others. The control of phytopathogenic fungi is also related to a good plant development. Before commercialization, the seed storage conditions can restrict the development of microorganism, due to the low temperature and humidity. This fact leads to the interest of exploring resistant microorganisms to those conditions. The study and the characterization of these communities are of great agronomic and biotechnological interest, being possible its application onto seeds, introducing in the field plants with a greater production potential. In this context, the aim of this study was to isolate and identify the endophytic bacteria community in soybean seeds and study the capacity of these isolates to promote growth in the host plant, including: phosphate solubilization, nitrogen fixation, IAA synthesize and antagonism against phytopathogenic fungi. From seeds of 12 cultivars, 3504 bacteria were isolated. The isolates were morphologically grouped according to the coloration and growth rate of the colony. Representatives of each morph group, totalizing 176, were analyzed using the Amplified Ribosomal Restriction Analysis (ARDRA) technique. A total of 12 ARDRA ribotypes were observed in the cultivable endophytic community of soybean seeds. Representatives of each ribotype had their 16S rDNA gene partially sequenced, allowing to the identification of the members of this community as: Acinetobacter sp., Bacillus sp., Brevibacterium sp., Chryseobacterium sp., Citrobacter sp., Curtobacterium sp., Enterobacter sp., Methylobacterium sp., Microbacterium sp., Micromonospora sp., Pantoea sp., Paenibacillus sp., Pseudomonas sp., Ochrobactrum sp., Streptomyces sp. and Tsukamurella sp. The endophytic bacterial community of soybean seeds from genetically modified plants showed a greater diversity compared to the bacterial community of conventional seeds. In relation to the biotechnological potential of the community, the outcomes demonstrate that the isolates were able to antagonist phytopathogenic fungi (18%), synthesize IAA (100%), solubilize phosphate (39%) and fix nitrogen (18%). The isolates with best in vitro outcomes were inoculated onto seeds and tested in greenhouse for their ability to promote growth in soybean. The plants answered differently to the inoculation of each bacterial isolate. The major part of the treatments demonstrated a negative influence of bacteria onto plants, while one Enterobacter sp. isolate increased the dry mass weight of roots. Even not differing statistically, some isolates showed a tendency to increase, meanwhile others to decrease the biomass of the plant.

Os microrganismos endofíticos são aqueles, cultiváveis ou não, que habitam o interior da planta hospedeira sem causar danos aparentes ou estruturas externas visíveis. Essa interação planta-microrganismo é intrínseca a determinadas espécies de plantas e/ou bactérias. Nas últimas décadas os estudos de microrganismos endofíticos têm sido realizados em diversas plantas hospedeiras, sendo esses estudos direcionados, principalmente, para a diversidade e características benéficas induzidas, como o controle biológico de doenças. As doenças com sintomas de murcha e cancro são consideradas emergentes no setor florestal. O Brasil está entre os maiores produtores mundiais de Eucalyptus e a expansão do setor, juntamente com o cultivo clonal, tem acarretado o aumento da incidência de patógenos. O surgimento de novas doenças exige estudos relacionados tanto a interação do agente patogênico com hospedeiro quanto de todos os componentes do patossistema. Neste contexto, os microrganismos endofíticos e do rizoplano têm sido descritos como potenciais controladores biológicos de doenças. Dessa forma, o presente trabalho teve por objetivos avaliar a interação da comunidade bacteriana associada a Eucalyptus sp. com fungos causadores de murcha e cancro. Foi também estudada a diversidade e colonização desses endófitos em sementes e o efeito da germinação nessa interação. Adicionalmente, foi realizada uma busca por bactérias associadas a Eucalypus sp. com capacidade de controlar fungos causadores de murcha e cancro. Foi observado que a densidade bacteriana endofítica não difere entre as espécies de Eucalyptus citriodora, E. urophylla e E. globulus x E. grandis avaliadas e que esta comunidade cultivada é composta por bactérias pertencentes às classes Actinobacteria, Proteobacteria e Firmicutes. Com uso de diferentes ferramentas de estudo foi observado que a quantidade de bactérias endofíticas nas sementes aumenta proporcionalmente ao tempo de germinação. Foi observado também que os sintomas de murcha e cancro causados, principalmente, por Ceratocystis fimbriata podem ser causados por outros fungos patogênicos. Foram identificados 41 isolados bacterianos endofíticos e do rizoplano com capacidade de controlar fungos patogênicos causadores de murcha e cancro em Eucalyptus sp. Adicionalmente ao potencial para uso no controle biológico do cancro e da murcha de Eucalyptus, as bactérias de sementes aqui relatadas, podem ter papel importante de proteção das plantas no campo. Futuros estudos devem ser direcionados para identificação de genes associados a essa inibição, bem com análise dos fatores responsáveis por este controle biológico no campo. / The endophytic microorganisms are those, cultivated or not, that inhabit the interior of the plant host without causing apparent damages or visible external structures. This interaction plant-microorganism is specific to certain species of plants and/or bacteria. In the last few years studies of endophytic microorganisms have been carried out for several plant hosts, which are focused mainly to diversity and biotechnological potential, such as biological control of disease. Brazil is one of the largest world Eucalyptus producers and the increasing of the Eucalyptus production associated to clonally reproduction has allowed an increasing incidence of some pathogens. These new disease demands on studies related to causal agent and biotic and abiotic factors associated to the diseases. The canker of Eucalyptus is considered an emerging disease by several reforestation companies. In that way, the rhizoplane and endophytic microorganisms has been described as potential diseases biological control agents. In this context, the aims of the present work were to assess the bacterial community associated to Eucalyptus sp. plants and seeds, besides the interaction with the wilt and canker pathogenic fungi. We also assessed the diversity and colonization effect of seed germination on bacterial community. Additionally, was carried out a screening of the Eucalypus sp. associated bacteria against pathogenic fungi that cause wilt and canker. We observed that endophytic bacterial density doesn\'t differ among the species of Eucalyptus citriodora, E. urophylla and E. globulus x E. grandis and that this cultivated community is composed by follow bacterial classes Actinobacteria, Proteobacteria and Firmicutes. Using different study approaches was observed that the amount of endophytic bacteria in the seeds increases proportionally at the germination time. We also observed that the symptoms of wilt and canker caused, mainly, by Ceratocystis fimbriata may be caused by other pathogenic fungi too. Additionally, were identified 41 endophytic and rhizoplane bacterial isolates able to control pathogenic fungi that cause Eucalyptus wilt and canker. Besides to the wilt and canker biological control potential of that bacteria, the seed endophyte identified in the present work can have important function on plant protection in the field. New studies should be addressed for identification of genes related to antagonism, besides of factors responsible for biological control occurrence in the field.

A Clorose Variegada dos Citros (CVC), doença que causa graves prejuízos à citricultura no estado de São Paulo, é causada pela bactéria Xylella fastidiosa que é transmitida pelas cigarrinhas Bucephalogonia xanthophis (Berg), Dilobopterus costalimai (Young), Acrogonia citrina (Marucci & Cavichioli) e Oncometopia facialis (Signoret). Durante a alimentação em plantas afetadas, esses insetos adquirem a bactéria, que coloniza o pré-cibário e o cibário, e depois são capazes de transmitir a doença para plantas sadias. Colonizando o xilema das plantas de citros encontram-se também bactérias endofíticas, que são microrganismos capazes de colonizar internamente tecidos de plantas sem causar dano aparente, e que podem interagir com patógenos no interior do hospedeiro. Este trabalho teve como objetivo avaliar a comunidade bacteriana associada as cigarrinhas vetoras de CVC, e observar as possíveis interações que ocorrem entre insetos vetores de X. fastidiosa e bactérias endofíticas de citros. Primeiramente foi feito um isolamento das bactérias da cabeça de cigarrinhas coletadas em pomares de citros afetados com CVC. Foram isoladas um total de 17230 bactérias de três espécies de cigarrinhas (O. facialis, D. costalimai e A. citrina) em três datas diferentes (22/março, 05/maio e 14/junho de 2002), que foram primeiramente classificadas em 9 grupos morfológicos. Do total, 120 bactérias representantes foram avaliadas por ARDRA e classificadas em 16 haplótipos, dos quais alguns foram identificados, por seqüenciamento da região 16S do rDNA, como Methylobacterium sp. e Curtobacterium sp., que são bactérias endofíticas de citros já descritas e que interagem com X. fastidiosa em citros. Primers específicos para estas bactérias foram utilizados para PCRs com o DNA total da cabeça de cigarrinhas e variou de 39,1% a 89,6% nas diferentes espécies. A comunidade bacteriana associada às cigarrinhas foi também avaliada por DGGE e apresentou variações quanto ao inseto hospedeiro e quanto à época das avaliações. Um isolado de M. mesophilicum expressando o gene da proteína verde fluorescente (GFP ? Green Fluorescent Protein) foi utilizado para experimento de transmissão deste endófito por B. xanthophis. Os insetos se alimentaram em membrana contendo a solução da bactéria e depois foram colocados em plantas de Catharanthus roseus. Das plantas, 13% apresentaram a bactéria fluorescente colonizando tecidos endofiticamente, o que indica que a cigarrinha é capaz de transmitir o endófito. Testes para a avaliação da produção de moléculas de quorum sensing (AHLs - Acil Homocerina Lactonas) foram feitos para M. mesophilicum e M. extorquens. Foram ainda desenvolvidos mutantes de M. extorquens, defectivos para a produção de biofilme e AHLs. / The Citrus Variegated Chlorosis (CVC), a very important disease which attacks citrus trees in the state of São Paulo, is caused by the xylem-limited bacteria, Xylella fastidiosa, which is transmitted by four species of sharpshooters (Cicadellidae) Bucephalogonia xanthophis (Berg), Dilobopterus costalimai (Young), Acrogonia citrina (Marucci & Cavichioli) and Oncometopia facialis (Signoret) which are capable of acquiring X. fastidiosa from the xylem while feeding. In plants, endophytic bacteria, which inhabit the interior of aerial plant parts developing an asymptomatic infection and show potential benefits as biocontrol agents of pests and diseases, may colonize the same niche of pathogens, such as X. fastidiosa, what could allow endophytes to interact with the pathogen. Bacteria were isolated from head of insect vectors, collected on affected citrus plants. From 17230 bacteria isolated from the heads of three insect species (O. facialis, D. costalimai and A. citrina) in three different days (22/march, 05/may and 14/june of 2002), 120 bacteria were tested with ARDRA and classified into 16 different haplotypes. The most frequent strains had their 16S rDNA fragment sequenced and they were identified as Methylobacterium sp. and Curtobacterium sp., bacteria which have been described as citrus endophytes which interact with X. fastidiosa. Total DNA of insect heads was used in Nested PCRs for detection of these citrus endophytes in insects. The frequencies of detection ranged from 39,1% to 89,6%. The bacterial community associated to sharpshooters was also evaluated by DGGE and presented variations due to insect host and time of the evaluations. One M. mesophilicum isolate, expressing the GFP (Green Fluorescent Protein), was used to test the transmission of endophytes by B. xanthophis. Insects fed on membranes containing a bacterial solution and after were trapped on Catharanthus roseus. From the evaluated plants, 13% presented the fluorescent protein colonizing endophytically, indicating that the insect is able to transmit the endophytic bacteria. Biofilm and quorum sensing molecules (AHLs - Acyl Homocerine Lactones) production by Methylobacterium sp. were tested, and M. extorquens mutants for both features were produced.