Neste estudo avaliou-se os efeitos do diabetes mellitus (DM) sobre dois sistemas: glândula parótida de ratos e células cultivadas in vitro. Foram avaliados respectivamente a composição da matriz extracelular e a migração de células expostas a elevada concentração de glicose. Na parótida observou-se aumento de colágenos III, IV e V, laminina e fibronectina, mediado por TGFb2. Em células isoladas observou-se que a glicose dificultou a polarização celular, reduziu a velocidade e direcionalidade de migração, reduziu a persistência e estabilidade das protrusões celulares e a maturação de adesões. Estas alterações estão relacionadas à ativação da GTPase Rac1, dependente de estresse oxidativo. Este estudo sugere, pela primeira vez, que: 1) a hipofunção salivar pode envolver um espessamento da lâmina basal de capilares e parênquima por mecanismos previamente observados em outros orgãos-alvo de complicações diabéticas e 2) que a glicose exerce um efeito direto sobre a migração celular, fator que pode contribuir para a cicatrização deficiente em indivíduos diabéticos. / In this study we evaluated the effects of DM on two different systems: the rat parotid gland and in vitro cultured cells. Extracellular matrix composition and the migratory behavior of cells exposed to a high glucose concentration (HG) were evaluated, respectively. In the parotid, DM led to an increase in collagens III, IV and V, laminin and fibronectin, through a TGFb2-dependent mechanism. In cultured cells, HG impaired cell polarization, reduced migration velocity and directionality, reduced the persistence and stability of protrusive cellular processes, as well as adhesion maturation. These effects were related to Rac1 GTPase activation, dependent on the oxidative stress promoted by HG. This study suggests, for the first time, that: 1) salivary hypofunction in DM might involve the thickening of capillary and parenchyma basal lamina, through mechanisms already described in other target organs for diabetic complications and 2) that glucose directly impairs cell migration, and this effect may contribute to the chronic wound healing observed in diabetic patients.

A cromoblastomicose é uma micose subcutânea, com alto índice de morbidade, sendo Fonsecaea pedrosoi (F. pedrosoi) considerado o maior agente etiológico dessa micose, caracterizando uma doença crônica, geralmente confinada na pele e tecidos subcutâneos. Raramente os indivíduos apresentam cura dessa doença, pois as terapias contemporâneas mostram-se deficientes e poucos trabalhos relatam a relação parasito-hospedeiro. As células dendríticas (DCs) são especializadas na apresentação de antígenos para linfócitos T naive induzindo respostas imunes primárias. Diante disso, propomos estudar a capacidade migratória de DCs após infecção com conídios de F. pedrosoi, uma vez que o processo de migração dessas células está intimamente ligado com a sua função sobre as células T, levando ao desenvolvimento de uma resposta imune adaptativa protetora. O fenótipo de DCs foi avaliado através de células obtidas dos linfonodos poplíteos, inguinais e patas de camundongos BALB/c após 12, 24 e 72 horas de infecção com conídios do fungo. Células obtidas foram marcadas com anticorpos específicos e analisadas por citometria de fluxo. Após 24 e 72 horas de infecção verificamos uma diminuição significativa na porcentagem de DCs nas patas, e um aumento significativo dessas células nos linfonodos após 72 horas. A expressão de marcadores de superfície como CCR7 e moléculas co-estimulatórias, mostraram-se diminuídas nas células obtidas das patas. Como no processo de imunofenotipagem podemos analisar DCs vindas de diversos locais, para melhor avaliar a capacidade migratória das DCs, células das patas foram marcadas in vivo injetando-se subcutaneamente o corante CFSE juntamente com conídios do fungo. Verificamos que após 12 e 72 horas, as DCs das patas dos animais infectados, migraram para os linfonodos regionais. Assim constatamos que o fungo F. pedrosoi é capaz de induzir a migração de macrófagos e neutrófilos para o sítio de infecção em poucas horas, leva ao aumento de células B nos linfonodos após 12 e 72 horas de infecção, e também leva ao aumento de linfócitos T CD4+ tanto no local de infecção quanto nos linfonodos. Os resultados também comprovam que o fungo F. pedrosoi foi capaz de ativar as DCs, induzindo sua migração para os linfonodos regionais. / The chromoblastomycosis is a subcutaneous mycosis with a high morbidity rate, Fonsecaea pedrosoi (F. Pedrosoi) being the largest etiologic agent of this mycosis, featuring a chronic disease, usually confined to the skin and subcutaneous tissues. Rarely do people have cure for this disease, because the therapies shown to be deficient contemporary and few studies report the host-parasite relationship. Dendritic cells (DCs) are specialized in presenting antigens to naïve T lymphocytes inducing primary immune responses. Therefore, we propose to study the migratory capacity of DCs after infection with conidia of F. pedrosoi, since the migration of these cells is intimately linked to its function on T cells, leading to development of a protective adaptive immune response. The phenotype of DCs was evaluated using cells obtained from popliteal lymph nodes, sub cutaneous tissue of BALB/c mice after 12, 24 and 72 hours of infection with conidia of the fungus. Cells were labeled with specific antibodies and analyzed by flow cytometry. After 24 and 72 hours of infection we found a significant decrease in the percentage of DCs in the sub cutaneous tissue, and a significant increase of these cells in the lymph nodes after 72 hours. The expression of surface markers such as CCR7 and costimulatory molecules, were reduced in cells obtained from the sub cutaneous tissue. Like the process of immunophenotyping we can analyze DCs coming from various locations, to better assess the migratory capacity of DCs, cells were stained paws in vivo by injecting dye subcutaneously with CFSE conidia of the fungus. We found that after 12 and 72 hours, DCs sub cutaneous tissue of infected animals migrated to regional lymph nodes. We found that the fungus F. pedrosoi is capable of inducing migration of macrophages and neutrophils to the site of infection within a few hours, leads to increased B-cells in lymph nodes after 12 and 72 hours of infection, and also leads to an increase of CD4 + T lymphocytes in both the site of infection and in the lymph nodes. The results also show that the fungus F. pedrosoi was able to activate the DCs, inducing their migration to regional lymph nodes.

Embora a terapia com uso de laser de baixa potência (TLBP) seja uma modalidade terapêutica amplamente estudada no meio científico, sua aplicação na clínica médica ainda gera controvérsias, já que a literatura reporta que a TLBP é capaz de promover a proliferação e diferenciação de células tumorais. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da TLBP no crescimento celular usando como modelo a linhagem B16F10 de melanoma murino em estado de homeostase e estado redox, além de verificar o comportamento quimiotáxico da linhagem B16F10 por meio do ensaio de migração transwell em resposta à TLBP em diferentes densidades de energia. Foram montados cinco grupos experimentais utilizando um laser de emissão vermelha em λ = 660 nm: Grupo controle (GC) onde nenhuma irradiação foi realizada; G30 (30J/cm2); G60 (60J/cm2); G90 (90J/cm2); G120 (120J/cm2); G150 (150J/cm2), com as respectivas doses utilizadas. Todos os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados obtidos foram submetidos à análise estatística. Sob as condições experimentais deste estudo, nossos resultados mostram que a TLBP neste comprimento de onda não promoveu mudanças no metabolismo celular nos tempos de 48 h e 72 h, independente do estado nutricional. Foi possível observar mudança no padrão de comportamento quimiotáxico da linhagem celular B16F10 irradiadas com laser de emissão vermelha. / The low power lasers (TLBP) is a therapeutic modality widely studied in scientific field, its application in clinical medicine still generates many conflicts since literature reports proliferation in cancer cells. The objective of this study was to evaluate the effects of TLBP on cell growth using as model the line B16F10 in state of homeostasis and redox state and investigate the chemotactic behavior of B16F10 lineage through transwell migration assay in response to TLBP in different energy densities. For this purpose five experimental groups were assembled using a laser emission at λ = 660 nm: control group (G0) where no irradiation was performed; G30 (30J/cm2), G60 (60J/cm2), G90 (90J/cm2); G120 (120J/cm2); G150 (150J/cm2) with the respective doses used. All experiments were performed in triplicate and the results were statistically analyzed. Under the experimental conditions of this study, our results show that TLBP did not induced changes in cellular metabolism that influence proliferation at 48 h and 72 h, independent nutritional status. It was possible to observe changes in behavior pattern chemotactic of cell line B16F10 with TLBP at red emission.

Câncer é a denominação de um conjunto de mais de cem doenças causadas pelo crescimento e multiplicação desordenados de células anormais capazes de invadir e se disseminar por diversos tecidos e órgãos. É considerado um problema de saúde mundial, sendo uma das maiores causas de morte. Dados da Organização Mundial da Saúde (OMS) indicam que 15% das mortes no mundo serão causadas por câncer em 2015. No Brasil, o Instituto Nacional do Câncer (INCA) estima 580 mil novos casos da doença para 2014. Apesar da vasta quimioterapia disponível, os tratamentos possuem alta toxicidade e estão sujeitos à resistência. Nesse contexto, a presente dissertação de mestrado tem como foco principal a identificação e caracterização de novos compostos com propriedades anticâncer. Os estudos foram realizados com base em dois alvos principais. O primeiro foi a proteína tubulina, um alvo anticâncer validado que é modulado por moléculas importantes como o taxol, a vimblastina e a colchicina. O segundo alvo foi a migração celular, característica relacionada ao processo de metástase, que é responsável por 90% das mortes por câncer. Uma série de acridinonas sintéticas foi avaliada in silico frente à proteína tubulina empregando métodos de modelagem molecular. Para tanto, fez-se uso de estruturas cristalográficas da proteína disponíveis no PDB (Protein Data Bank). Os resultados das análises de docagem molecular indicaram que as moléculas poderiam interagir com o sítio da colchicina e, dessa forma, atuariam como inibidoras da polimerização dos microtúbulos. Ensaios wound healing e em câmara de Boyden permitiram a identificação de quatro compostos com potente efeito de inibição da migração celular (valores de IC50 variando entre 0,294 e 1,7 μM) em uma linhagem metastática (MDA-MB-231). Estes compostos foram submetidos a ensaios de citotoxicidade frente à mesma linhagem tumoral e também apresentaram boa potência, com valores de IC50 variando entre 0,110 e 3 μM. Além disso, ensaios de citotoxicidade em células saudáveis mostraram que estes compostos inviabilizaram seletivamente células tumorais. Para a validação dos estudos in silico, ensaios de polimerização da tubulina foram conduzidos. Os resultados mostraram que as quatro moléculas ativas nos ensaios celulares atuam como inibidores de polimerização dos microtúbulos, com valores de IC50 variando entre 0,9 e 13 μM. Estudos das relações entre a estrutura e atividade (SAR) revelaram alguns aspectos interessantes nesta série de acridinonas, como, por exemplo, a perda de atividade, que se deu tanto nos ensaios celulares quanto nos ensaios bioquímicos, causada pela substituição de um grupo nitro da posição meta- por para- em duas moléculas da série. A progressão do ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo e os resultados mostraram que os compostos estudados são capazes de interromper o ciclo celular entre as fases G2 e M. A citometria fluxo também permitiu verificar a indução da apoptose celular devida à ação das moléculas. Em resumo, este trabalho possibilitou a identificação e caracterização de quatro compostos com propriedades antitumorais promissoras que serão utilizados como compostos líderes para posterior desenvolvimento como agentes anticâncer. / Cancer is a set of diseases with high diversity and aggressiveness. It is one of the major causes of death according to the World Health Organization (WHO), being responsible for 15% of worldwide deaths in 2015. In Brazil, the National Institute of Cancer (INCA) estimates 580,000 new cases of cancer for the year of 2014. Despite the vast availability of cancer chemotherapy, the treatments cause high toxic effects and are liable to resistance. In this context, the main goal of the present master\'s dissertation is the identification and the characterization of new compounds having anticancer properties. These studies were conducted based on two main targets. The first one was the protein tubulin, a validated anticancer target that is modulated by important molecules such as taxol, vinblastine and colchicine. The second target was the cellular migration, a feature related to the metastasis process, which causes 90% of the cancer deaths. A series of synthetic acridinones was studied in silico employing molecular modeling methods. For this, crystallographic structures of tubulin were collected from PDB (Protein Data Bank). The docking results indicated that the molecules could interact with the colchicine site and, thereby, could act as tubulin polymerization inhibitors. The series was assessed by the wound healing and Boyden chamber\'s assays using the metastatic cell line MDA-MB-231. In these assays, four compounds were identified as good inhibitors of cellular migration (IC50 values varying between 0.294 and 1.7 μM). These compounds were evaluated in cytotoxicity assays using the same cell line and presented good potency, with IC50 values varying between 0.110 and 3 μM. Furthermore, cytotoxicity assays using a healthy cell line showed that these compounds act selectively in tumor cells. For the validation of the in silico studies, tubulin polymerization assays were conducted. The results showed that the four active molecules in the cellular assays act as tubulin polymerization inhibitors, with IC50 values varying between 0.9 and 13 μM. Structure-activity relationship (SAR) studies revealed interesting structural aspects in this series of acridinones, for instance, the exchange of the nitro group substituent from the meta- to the para- position in two molecules of the series led to a lack of activity in both cellular and biochemical assays. The cell cycle progression was evaluated by flow cytometry, and the results showed that the four compounds are capable of arrest cells in the G2/M phase. Moreover, the apoptosis induction was verified using flow cytometry. In summary, this work provided the identification and characterization of four new compounds with promising antitumor properties. These molecules will be used as lead compounds for further development as anticancer agents.

Submitted by Ana Paula Macedo (ensino@ioc.fiocruz.br) on 2013-10-03T12:26:40Z No. of bitstreams: 1 Carolina Valença Messias.pdf: 1326403 bytes, checksum: adde2666bf9c1e45634b4ea4926b6090 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-03T12:26:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carolina Valença Messias.pdf: 1326403 bytes, checksum: adde2666bf9c1e45634b4ea4926b6090 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A leucemia linfoblástica aguda de células T (LLA-T) e o linfoma linfoblástico de células T (LL-T) são proliferações malignas de precursores de células T em diferentes estágios de maturação. LLA-T e LL-T são considerados atualmente duas formas de uma mesma doença, a leucemia/linfoma linfoblástico de células T (LLL-T), por compartilharem características morfológicas, imunofenotípicas e genéticas. Como os blastos de LLL-T apresentam características similares às de timócitos normais, moléculas envolvidas na migração destas células podem também estar envolvidas na migração ou homing dos linfoblastos no curso da doença. Neste sentido, foi demonstrado recentemente que o receptor 1 de esfingosina-1-fosfato (S1P1) é essencial para a saída de timócitos do timo. No presente estudo, decidimos avaliar a expressão e o papel do S1P1 na migração de quatro linhagens celulares de LLA-T (HPB-ALL, MOLT-4, CEM e JURKAT) em resposta ao seu ligante fisiológico, a esfingosina-1-fosfato (S1P). Observamos que a linhagem HPB-ALL apresentou baixa expressão de RNAm de S1P1, enquanto MOLT-4 e JURKAT apresentaram uma expressão mediana e CEM apresentou altos níveis de expressão de RNAm para este receptor. Em ensaios funcionais de migração celular observamos que a capacidade migratória das linhagens frente a S1P foi diretamente relacionada ao nível de expressão gênica do receptor. A S1P induziu a migração das linhagens analisadas em diferentes concentrações até 100 nM, e inibiu a migração quando aplicada em altas concentrações (1000 nM). As respostas migratórias foram acompanhadas pela modulação do citoesqueleto de actina. Dependendo da concentração de S1P utilizada, observamos polimerização (menores concentrações) ou despolimerização (maiores concentrações) da actina. Além disso, o prétratamento das células com W146 (inibidor de S1P1) bloqueou a migração das linhagens frente à S1P em menores concentrações e induziu a migração frente à S1P em altas concentrações, sugerindo que a migração seja especificamente mediada por S1P1. Nossos resultados sugerem que as interações mediadas por S1P/S1P1 modulam a migração não apenas de precursores de células T normais, mas também de linfoblastos de LLL-T. Desta forma, a interação S1P/S1P1 pode ser considerada como alvo para possíveis estratégias terapêuticas frente a estas neoplasias. / T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) and T-cell lymphoblastic lymphoma (TLBL) are malignant proliferations of T cell precursors at different stages of normal development. T-ALL and T-LBL are presently believed to represent two different forms of a single disease, the T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma (T-LLL), as they share morphological, immunophenotypic and genetic features. As T-LLL lymphoblasts present similar characteristics of normal T cell precursors, molecules involved on the migration of these cells might also be associated with migration and homing of T-ALL/LBL. In this context, the sphingosine-1-phosfate receptor 1 (S1P1), has been described as essential for mouse thymocyte migration and thymic egress. Herein, we evaluated the expression and role of S1P1 in four T-ALL cell lines (HPBALL, MOLT-4, CEM e JURKAT) in response to its physiological ligand, the sphingosine-1-phophate (S1P). We observed that HPB-ALL cells presented low expression levels of S1P1 mRNA, whereas MOLT-4 and JURKAT had medium levels and CEM showed high levels of S1P1 expression. In functional migration assays, we observed that the migratory response of the cells towards S1P was directly related with their expression levels of the receptor. S1P induced the migration of the cell lines analyzed in different concentrations up to 100 nM and inhibited cell migration at higher concentrations (1000 nM). Moreover, migratory responses were accompanied by the modulation of actin cytoskeleton. Depending on S1P concentrations, we observed actin polymerization (lower concentrations) or depolymerization (higher concentrations). Pre-treatment of the cells with W146 (a S1P1 inhibitor) blocked S1Pinduced migration at lower concentrations but induced migration towards S1P at high concentrations, suggesting that the migration is specifically mediated by S1P1. Our results suggest that interactions mediated by S1P/S1P1 can modulate cell migration of T-LLL blasts similarly to their normal T cell precursor counterparts. Accordingly, immune intervention upon this ligand/receptor interaction may be envisioned as a potential therapeutic strategy for these malignancies.

Embora a terapia com uso de laser de baixa potência (TLBP) seja uma modalidade terapêutica amplamente estudada no meio científico, sua aplicação na clínica médica ainda gera controvérsias, já que a literatura reporta que a TLBP é capaz de promover a proliferação e diferenciação de células tumorais. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da TLBP no crescimento celular usando como modelo a linhagem B16F10 de melanoma murino em estado de homeostase e estado redox, além de verificar o comportamento quimiotáxico da linhagem B16F10 por meio do ensaio de migração transwell em resposta à TLBP em diferentes densidades de energia. Foram montados cinco grupos experimentais utilizando um laser de emissão vermelha em λ = 660 nm: Grupo controle (GC) onde nenhuma irradiação foi realizada; G30 (30J/cm2); G60 (60J/cm2); G90 (90J/cm2); G120 (120J/cm2); G150 (150J/cm2), com as respectivas doses utilizadas. Todos os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados obtidos foram submetidos à análise estatística. Sob as condições experimentais deste estudo, nossos resultados mostram que a TLBP neste comprimento de onda não promoveu mudanças no metabolismo celular nos tempos de 48 h e 72 h, independente do estado nutricional. Foi possível observar mudança no padrão de comportamento quimiotáxico da linhagem celular B16F10 irradiadas com laser de emissão vermelha. / The low power lasers (TLBP) is a therapeutic modality widely studied in scientific field, its application in clinical medicine still generates many conflicts since literature reports proliferation in cancer cells. The objective of this study was to evaluate the effects of TLBP on cell growth using as model the line B16F10 in state of homeostasis and redox state and investigate the chemotactic behavior of B16F10 lineage through transwell migration assay in response to TLBP in different energy densities. For this purpose five experimental groups were assembled using a laser emission at λ = 660 nm: control group (G0) where no irradiation was performed; G30 (30J/cm2), G60 (60J/cm2), G90 (90J/cm2); G120 (120J/cm2); G150 (150J/cm2) with the respective doses used. All experiments were performed in triplicate and the results were statistically analyzed. Under the experimental conditions of this study, our results show that TLBP did not induced changes in cellular metabolism that influence proliferation at 48 h and 72 h, independent nutritional status. It was possible to observe changes in behavior pattern chemotactic of cell line B16F10 with TLBP at red emission.

Made available in DSpace on 2015-05-14T13:00:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2062572 bytes, checksum: 9bcbe0857802d8f4f40f9b34e5d8db1e (MD5) Previous issue date: 2014-02-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The species Herissantia tiubae ( K. Schum ) Brizicky, popularly known as mela-bode or lava prato , is a plant of Malvaceae family, used in folk medicine to treat fever and influenza. Other species of the Malvaceae family are used in traditional medicine and studies have shown anti-inflammatory, antinociceptive and diuretic activities. The aim of this study was to evaluate the activity of the hydroalcoholic extract of aerial parts of Herissantia tiubae (EHt) in experimental models of acute inflammation. The toxicity of EHt at dose of 2000 mg/kg was analyzed using the parameters: consumption of water and food, body weight, mortality and rates of weight of major organs, as well as biochemical and hematological parameters. To evaluate its antiedematogenic effect, Swiss mice pretreated with EHt (50, 100 or 200 mg/kg), were submitted to the paw edema induced by carrageenan and microvascular permeability induced by acetic acid protocols. To study its anti-inflammatory effect in vivo experimental models were used, such as: carrageenan-induced peritonitis, which evaluated cell migration and cytokine production (TNF-α, IL-1β and IL-6) and in vitro: production of NO, cytokines (TNF-α and IL-6) and L- selectin expression in RAW 264.7 macrophage lineage. No signs of acute toxicity were observed by the administration of EHt in male and female mice. Furthermore, pretreatment with EHt (50, 100 or 200 mg/kg) did not reduce paw edema induced by carrageenan, and did not decrease fluids extravasation mediated by acetic acid. Migration of neutrophils and release of cytokines (TNF-α and IL-1β) induced by carrageenan was reduced in animals treated with EHt (50 or 100 mg/kg). In vitro, EHt (50 or 25 μg/mL) reduced the production of NO, cytokines (TNF-α and IL-6) and expression of the adhesion molecule L-selectin in RAW 264.7 macrophages lineage. Therefore, these data suggest that EHt has antiinflammatory activity related to inhibition of cellular but not by vascular events of inflammation / A espécie Herissantia tiubae (K. Schum) Brizicky, conhecida popularmente como mela bode ou lava-prato, é uma planta da família Malvaceae, usada na medicina popular para tratar febre e influenza. Outras espécies da família Malvaceae são utilizadas na medicina tradicional e estudos comprovaram atividades anti-inflamatórias, antinociceptivas e diuréticas. O objetivo desse estudo foi avaliar a atividade do extrato hidroalcoólico das partes aéreas de Herissantia tiubae (EHt) em modelos experimentais de inflamação aguda. A toxicidade do EHt na dose de 2000 mg/Kg foi analisada, utilizando-se os parâmetros: consumo de água e ração, peso corporal, letalidade e índices de peso dos principais órgãos, bem como parâmetros bioquímicos e hematológicos. Para avaliar seu efeito antiedematogênico, camundongos Swiss pré-tratados com EHt (50, 100 ou 200 mg/kg) foram submetidos aos protocolos de edema de pata induzido por carragenina e permeabilidade microvascular induzida por ácido acético. Para estudar seu efeito anti-inflamatório foram utilizados modelos experimentais in vivo, tais como: peritonite induzida por carragenina, onde se avaliou migração de células e produção de citocinas (TNF-α, IL-1β e IL-6); e in vitro: produção de NO, citocinas (TNF-α e IL-6) e expressão da L-selectina em culturas de macrófagos da linhagem RAW 264.7. Não foram observados sinais de toxicidade aguda com a administração de 2000 mg/kg do EHt em camundongos macho e fêmea. Além disto, o prétratamento com o EHt (50, 100 ou 200 mg/kg) não reduziu o edema de pata induzido por carragenina, bem como não diminuiu o extravasamento de fluidos mediado pelo ácido acético. A migração de neutrófilos e a liberação de citocinas (TNF-α e IL-1β) provocadas pela carragenina foram reduzidas em animais tratados com o EHt (50 ou 100 mg/kg). In vitro, o EHt (50 ou 25 μg/mL) reduziu a produção de NO, citocinas (TNF-α e IL-6) e expressão da molécula de adesão L-selectina em macrófagos da linhagem RAW 264.7. Portanto, esses dados sugerem que o EHt possui atividade anti-inflamatória relacionada com a inibição dos eventos celulares e não vasculares da inflamação

Câncer é a denominação de um conjunto de mais de cem doenças causadas pelo crescimento e multiplicação desordenados de células anormais capazes de invadir e se disseminar por diversos tecidos e órgãos. É considerado um problema de saúde mundial, sendo uma das maiores causas de morte. Dados da Organização Mundial da Saúde (OMS) indicam que 15% das mortes no mundo serão causadas por câncer em 2015. No Brasil, o Instituto Nacional do Câncer (INCA) estima 580 mil novos casos da doença para 2014. Apesar da vasta quimioterapia disponível, os tratamentos possuem alta toxicidade e estão sujeitos à resistência. Nesse contexto, a presente dissertação de mestrado tem como foco principal a identificação e caracterização de novos compostos com propriedades anticâncer. Os estudos foram realizados com base em dois alvos principais. O primeiro foi a proteína tubulina, um alvo anticâncer validado que é modulado por moléculas importantes como o taxol, a vimblastina e a colchicina. O segundo alvo foi a migração celular, característica relacionada ao processo de metástase, que é responsável por 90% das mortes por câncer. Uma série de acridinonas sintéticas foi avaliada in silico frente à proteína tubulina empregando métodos de modelagem molecular. Para tanto, fez-se uso de estruturas cristalográficas da proteína disponíveis no PDB (Protein Data Bank). Os resultados das análises de docagem molecular indicaram que as moléculas poderiam interagir com o sítio da colchicina e, dessa forma, atuariam como inibidoras da polimerização dos microtúbulos. Ensaios wound healing e em câmara de Boyden permitiram a identificação de quatro compostos com potente efeito de inibição da migração celular (valores de IC50 variando entre 0,294 e 1,7 μM) em uma linhagem metastática (MDA-MB-231). Estes compostos foram submetidos a ensaios de citotoxicidade frente à mesma linhagem tumoral e também apresentaram boa potência, com valores de IC50 variando entre 0,110 e 3 μM. Além disso, ensaios de citotoxicidade em células saudáveis mostraram que estes compostos inviabilizaram seletivamente células tumorais. Para a validação dos estudos in silico, ensaios de polimerização da tubulina foram conduzidos. Os resultados mostraram que as quatro moléculas ativas nos ensaios celulares atuam como inibidores de polimerização dos microtúbulos, com valores de IC50 variando entre 0,9 e 13 μM. Estudos das relações entre a estrutura e atividade (SAR) revelaram alguns aspectos interessantes nesta série de acridinonas, como, por exemplo, a perda de atividade, que se deu tanto nos ensaios celulares quanto nos ensaios bioquímicos, causada pela substituição de um grupo nitro da posição meta- por para- em duas moléculas da série. A progressão do ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo e os resultados mostraram que os compostos estudados são capazes de interromper o ciclo celular entre as fases G2 e M. A citometria fluxo também permitiu verificar a indução da apoptose celular devida à ação das moléculas. Em resumo, este trabalho possibilitou a identificação e caracterização de quatro compostos com propriedades antitumorais promissoras que serão utilizados como compostos líderes para posterior desenvolvimento como agentes anticâncer. / Cancer is a set of diseases with high diversity and aggressiveness. It is one of the major causes of death according to the World Health Organization (WHO), being responsible for 15% of worldwide deaths in 2015. In Brazil, the National Institute of Cancer (INCA) estimates 580,000 new cases of cancer for the year of 2014. Despite the vast availability of cancer chemotherapy, the treatments cause high toxic effects and are liable to resistance. In this context, the main goal of the present master\'s dissertation is the identification and the characterization of new compounds having anticancer properties. These studies were conducted based on two main targets. The first one was the protein tubulin, a validated anticancer target that is modulated by important molecules such as taxol, vinblastine and colchicine. The second target was the cellular migration, a feature related to the metastasis process, which causes 90% of the cancer deaths. A series of synthetic acridinones was studied in silico employing molecular modeling methods. For this, crystallographic structures of tubulin were collected from PDB (Protein Data Bank). The docking results indicated that the molecules could interact with the colchicine site and, thereby, could act as tubulin polymerization inhibitors. The series was assessed by the wound healing and Boyden chamber\'s assays using the metastatic cell line MDA-MB-231. In these assays, four compounds were identified as good inhibitors of cellular migration (IC50 values varying between 0.294 and 1.7 μM). These compounds were evaluated in cytotoxicity assays using the same cell line and presented good potency, with IC50 values varying between 0.110 and 3 μM. Furthermore, cytotoxicity assays using a healthy cell line showed that these compounds act selectively in tumor cells. For the validation of the in silico studies, tubulin polymerization assays were conducted. The results showed that the four active molecules in the cellular assays act as tubulin polymerization inhibitors, with IC50 values varying between 0.9 and 13 μM. Structure-activity relationship (SAR) studies revealed interesting structural aspects in this series of acridinones, for instance, the exchange of the nitro group substituent from the meta- to the para- position in two molecules of the series led to a lack of activity in both cellular and biochemical assays. The cell cycle progression was evaluated by flow cytometry, and the results showed that the four compounds are capable of arrest cells in the G2/M phase. Moreover, the apoptosis induction was verified using flow cytometry. In summary, this work provided the identification and characterization of four new compounds with promising antitumor properties. These molecules will be used as lead compounds for further development as anticancer agents.

A cromoblastomicose é uma micose subcutânea, com alto índice de morbidade, sendo Fonsecaea pedrosoi (F. pedrosoi) considerado o maior agente etiológico dessa micose, caracterizando uma doença crônica, geralmente confinada na pele e tecidos subcutâneos. Raramente os indivíduos apresentam cura dessa doença, pois as terapias contemporâneas mostram-se deficientes e poucos trabalhos relatam a relação parasito-hospedeiro. As células dendríticas (DCs) são especializadas na apresentação de antígenos para linfócitos T naive induzindo respostas imunes primárias. Diante disso, propomos estudar a capacidade migratória de DCs após infecção com conídios de F. pedrosoi, uma vez que o processo de migração dessas células está intimamente ligado com a sua função sobre as células T, levando ao desenvolvimento de uma resposta imune adaptativa protetora. O fenótipo de DCs foi avaliado através de células obtidas dos linfonodos poplíteos, inguinais e patas de camundongos BALB/c após 12, 24 e 72 horas de infecção com conídios do fungo. Células obtidas foram marcadas com anticorpos específicos e analisadas por citometria de fluxo. Após 24 e 72 horas de infecção verificamos uma diminuição significativa na porcentagem de DCs nas patas, e um aumento significativo dessas células nos linfonodos após 72 horas. A expressão de marcadores de superfície como CCR7 e moléculas co-estimulatórias, mostraram-se diminuídas nas células obtidas das patas. Como no processo de imunofenotipagem podemos analisar DCs vindas de diversos locais, para melhor avaliar a capacidade migratória das DCs, células das patas foram marcadas in vivo injetando-se subcutaneamente o corante CFSE juntamente com conídios do fungo. Verificamos que após 12 e 72 horas, as DCs das patas dos animais infectados, migraram para os linfonodos regionais. Assim constatamos que o fungo F. pedrosoi é capaz de induzir a migração de macrófagos e neutrófilos para o sítio de infecção em poucas horas, leva ao aumento de células B nos linfonodos após 12 e 72 horas de infecção, e também leva ao aumento de linfócitos T CD4+ tanto no local de infecção quanto nos linfonodos. Os resultados também comprovam que o fungo F. pedrosoi foi capaz de ativar as DCs, induzindo sua migração para os linfonodos regionais. / The chromoblastomycosis is a subcutaneous mycosis with a high morbidity rate, Fonsecaea pedrosoi (F. Pedrosoi) being the largest etiologic agent of this mycosis, featuring a chronic disease, usually confined to the skin and subcutaneous tissues. Rarely do people have cure for this disease, because the therapies shown to be deficient contemporary and few studies report the host-parasite relationship. Dendritic cells (DCs) are specialized in presenting antigens to naïve T lymphocytes inducing primary immune responses. Therefore, we propose to study the migratory capacity of DCs after infection with conidia of F. pedrosoi, since the migration of these cells is intimately linked to its function on T cells, leading to development of a protective adaptive immune response. The phenotype of DCs was evaluated using cells obtained from popliteal lymph nodes, sub cutaneous tissue of BALB/c mice after 12, 24 and 72 hours of infection with conidia of the fungus. Cells were labeled with specific antibodies and analyzed by flow cytometry. After 24 and 72 hours of infection we found a significant decrease in the percentage of DCs in the sub cutaneous tissue, and a significant increase of these cells in the lymph nodes after 72 hours. The expression of surface markers such as CCR7 and costimulatory molecules, were reduced in cells obtained from the sub cutaneous tissue. Like the process of immunophenotyping we can analyze DCs coming from various locations, to better assess the migratory capacity of DCs, cells were stained paws in vivo by injecting dye subcutaneously with CFSE conidia of the fungus. We found that after 12 and 72 hours, DCs sub cutaneous tissue of infected animals migrated to regional lymph nodes. We found that the fungus F. pedrosoi is capable of inducing migration of macrophages and neutrophils to the site of infection within a few hours, leads to increased B-cells in lymph nodes after 12 and 72 hours of infection, and also leads to an increase of CD4 + T lymphocytes in both the site of infection and in the lymph nodes. The results also show that the fungus F. pedrosoi was able to activate the DCs, inducing their migration to regional lymph nodes.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Cell migration is a prominent feature in cancer metastasis and the characterization of proteins related to migration is important in order to understand the behavior of tumor cells and their invasiveness during tumor progression. Among the proteins involved in cell migration, isoforms of non-muscle myosin type II play a pivotal role in several events related to cell migration, such as contractility, adhesion and cellular signaling. There are three isoforms of myosin type II that can be expressed in mammalian cells: myosin IIA (MIIA), myosin IIB (MIIB) and myosin IIC (MIIC). However, few studies have been conducted to characterize the expression and distribution patterns in cells of different types of tumors, including oral squamous cell carcinoma. The aim of the study was to analyze the expression and distribution of isoforms of myosin II (A, B and C) in surgical fragments of squamous cell carcinoma. Fragments of surgical specimen were collected from different regions of the tumor: a tumor-free zone, the center of the tumor and the invasion zone. These samples (n = 4) were fixed, crioprotected, cut on criostat, submitted to immunolocalization of MIIA, MIIB and MIIC and analyzed on confocal microscopy. The three isoforms of myosin II were expressed differently and showed distinct distribution in accordance with the region of the tumor sample. MIIA and MIIC were overexpressed at the center zone when compared with the free zone, whereas strong staining revealed MIIB at the zone invasion. Based on these observations, the isoforms of myosin IIC and IIA appeared to be more associated with tumor proliferation while MIIB appeared to be more involved in the invasive behavior of tumor, indicating that the isoforms can participate in different ways regulating the behavior and development of tumor type analyzed. / A migração celular é uma característica proeminente na metástase do câncer e a caracterização de proteínas relacionadas com a migração é importante para que se compreenda o comportamento de células tumorais e sua capacidade de invasão durante a progressão tumoral. Entre as proteínas envolvidas na migração celular, as isoformas de miosina não-muscular do tipo II desempenham um papel central em vários eventos relacionados com a migração de células, como a contratilidade, a adesão e a sinalização celular. Existem três isoformas de miosina do tipo II que podem ser expressas em células de mamíferos: miosina IIA (MIIA), miosina IIB (MIIB) e miosina IIC (MIIC). Entretanto, poucos estudos têm sido realizados para caracterizar a sua expressão e padrões de distribuição em células de diferentes tipos de tumores, incluindo carcinoma epidermóide. O objetivo do estudo foi analisar a expressão e distribuição de isoformas de miosina II (A, B e C) em fragmentos de peça cirúrgica de carcinoma epidermóide. Os fragmentos de peça cirúrgica foram coletados a partir de distintas regiões do tumor: a zona livre de tumor, o centro do tumor e a zona de invasão. Estas amostras (n = 4) foram fixadas, crioprotegidas, cortadas em criostato, submetidas à imunolocalização de MIIA, MIIB e MIIC e analisadas em microscopia confocal. As três isoformas de miosina II foram expressas diferentemente e apresentaram distribuição distinta de acordo com a região da amostra de tumor. MIIA e MIIC foram superexpressas na zona central quando comparadas com a zona livre, ao passo que MIIB revelou forte marcação para região de zona de invasão. Com base nas presentes observações, as isoformas de miosina IIA e IIC pareceram estar mais associadas ao evento de proliferação tumoral ao passo que MIIB pareceu mostrar-se mais envolvida com o comportamento invasivo do tumor, indicando que as isoformas podem participar de formas distintas na regulação do comportamento e do desenvolvimento do tipo de tumor analisado.