Neste estudo avaliou-se os efeitos do diabetes mellitus (DM) sobre dois sistemas: glândula parótida de ratos e células cultivadas in vitro. Foram avaliados respectivamente a composição da matriz extracelular e a migração de células expostas a elevada concentração de glicose. Na parótida observou-se aumento de colágenos III, IV e V, laminina e fibronectina, mediado por TGFb2. Em células isoladas observou-se que a glicose dificultou a polarização celular, reduziu a velocidade e direcionalidade de migração, reduziu a persistência e estabilidade das protrusões celulares e a maturação de adesões. Estas alterações estão relacionadas à ativação da GTPase Rac1, dependente de estresse oxidativo. Este estudo sugere, pela primeira vez, que: 1) a hipofunção salivar pode envolver um espessamento da lâmina basal de capilares e parênquima por mecanismos previamente observados em outros orgãos-alvo de complicações diabéticas e 2) que a glicose exerce um efeito direto sobre a migração celular, fator que pode contribuir para a cicatrização deficiente em indivíduos diabéticos. / In this study we evaluated the effects of DM on two different systems: the rat parotid gland and in vitro cultured cells. Extracellular matrix composition and the migratory behavior of cells exposed to a high glucose concentration (HG) were evaluated, respectively. In the parotid, DM led to an increase in collagens III, IV and V, laminin and fibronectin, through a TGFb2-dependent mechanism. In cultured cells, HG impaired cell polarization, reduced migration velocity and directionality, reduced the persistence and stability of protrusive cellular processes, as well as adhesion maturation. These effects were related to Rac1 GTPase activation, dependent on the oxidative stress promoted by HG. This study suggests, for the first time, that: 1) salivary hypofunction in DM might involve the thickening of capillary and parenchyma basal lamina, through mechanisms already described in other target organs for diabetic complications and 2) that glucose directly impairs cell migration, and this effect may contribute to the chronic wound healing observed in diabetic patients.

Os peptídeos INKKI e YPVQPFTE foram isolados a partir da hidrólise da b-caseína bovina e correspondem às seqüências 26-30 e 114-121 respectivamente. A atividade proliferativa foi avaliada em culturas primárias de linfócitos T. A atividade antitumoral in vitro foi realizada em culturas de B16F10. Foi utilizado grupo com 40 camundongos da linhagem C57BL/6J para avaliar a atividade antitumoral. Nossos resultados mostraram que o peptídeo INKKI apresentou resposta proliferativa semelhante ao mitógeno comercial PHA. O peptídeo YPVEPFTE mostrou ter ação proliferativa maior do que a apresentada pelo mitógeno comercial PHA. O peptídeo INKKI mostrou ação quimiotáxica. O tratamento in vitro mostrou que somente o pentapeptídeo INKKI induz seletiva atividade citotóxica para as células de melanoma. Os animais portadores de tumores dorsais apresentaram significativa inibição da capacidade de crescimento e a metastatização. Conclui-se que os peptídeos apresentam ação significativa tanto nos experimentos in vitro como in vivo sugerindo um possível papel fisiológico. / Peptides INKKI and YPVQPFTE were isolated from the bovine b-casein after hydrolysis corresponding to the 23-30 and 114-121 sequence, respectively. Evaluation of the proliferative activity in primary cultures of lymphocytes. The activity antitumor in vitro was accomplished culture of was studied. Groups with 40 C57BL/6J lines mice had been used to evaluate the antitumoral activity. Our results showed that peptide presented similar proliferative response to the PHA commercial mitogen. The peptide YPVEPFTE showed to have proliferative action larger than presented by the commercial mitogen. The peptide INKKI showed in the chemotactic action. The treatment in vitro had shows that the peptide INKKI induces selective citotoxicity. The bearing animals of dorsal tumors had presented significant inhibition of the capacity of growth and the spread of methastasis. Thus, the peptides casein present significant action in in vitro and in vivo experiments, suggesting a possible physiologic role.

O glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral maligno mais comum e agressivo em adultos. Uma combinação de terapia padrão com outras terapias baseadas no conhecimento de sua biologia é necessária para melhorar a sobrevida de pacientes com GBM. Muitos estudos foram desenvolvidos em busca de proteínas de membrana expressas em GBM, pois são potenciais alvos para imunoterapia. A proteína transmembrânica CD99 foi descrita como altamente expressa em astrocitomas de diferentes graus de malignidade. Embora seu mecanismo de ação ainda não seja totalmente compreendido, CD99 está envolvido na adesão e migração celular em diferentes tipos de tumores. O gene CD99 codifica duas proteínas distintas, denominadas isoforma 1, maior, de 32 kDa, e isoforma 2, gerada por splicing alternativo e menor, de 28 kDa. No presente estudo, foi demonstrada a expressão predominante da isoforma 1 em astrocitomas de diferentes graus de malignidade em comparação com o cérebro normal, bem como na linhagem celular de GBM humano U87MG. O transcriptoma das células U87MG transfectadas com siRNA para CD99 foi analisado em relação ao controle. Um total de 2.670 genes diferencialmente expressos foi identificado. Uma análise de enriquecimento no banco de dados DAVID revelou os seguintes processos como os mais significativos: junções aderentes célula-célula; adesão célula-célula envolvendo ligação de caderina e adesão celular. Ensaios funcionais baseados nestes achados (migração, invasão e adesão) foram realizados com células U87MG após o silenciamento de CD99 com dois shRNAs diferentes. A eficiência de silenciamento foi de 80 e 97%, para o shCD991 e 2, respectivamente, confirmada a nível de expressão do gene e da proteína. O silenciamento de CD99 reduziu a migração e invasão para ambos os shRNAs, com diminuição mais acentuada da migração para o shCD99 2, com maior nível de silenciamento de CD99. No ensaio de adesão, a linhagem U87MG shCD99 1 apresentou propriedades adesivas mais baixas que o controle, enquanto o shCD99 2 apresentou resultado oposto, com maior adesão celular do que seu controle. Provavelmente o silenciamento de CD99 afetou a redução da adesão celular em um padrão distinto, sugerindo que o resultado pode ser dependente do nível de expressão remanescente de CD99. Além disso, o CD99 e a faloidina colocalizaram nos lamelipódios e filopódios, sugerindo um papel importante no rearranjo do citoesqueleto. Foi demostrado, ainda, que o silenciamento de CD99 levou à redução da proliferação celular in vitro e diminuição do tumor in vivo. Camundongos imunodeficientes nos quais foram implantadas células silenciadas no cérebro apresentaram uma maior sobrevida que os animais que receberam células controle. A via de sinalização pela qual CD99 modula a proliferação no GBM ainda precisa ser elucidada. Migração, invasão e proliferação são as principais características do GBM que limitam uma ressecção cirúrgica completa e, consequentemente, levam frequentemente à recorrência. Portanto, análises posteriores das vias ativadoras do CD99 no contexto da migração, invasão, proliferação celular e apoptose são válidas para revelar novas estratégias terapêuticas para limitar a progressão do GBM / Glioblastoma (GBM) is the most common and aggressive malignant brain tumor in adults. A combination of standard therapy with other biologically based therapies is necessary to improve the survival of patients with GBM. Many studies have been developed in pursuit of expressed membrane proteins in GBM, which are potential targets for immunotherapy. The transmembrane protein CD99 is highly expressed in different malignant grades of astrocytomas. Although its mechanism of action is not still fully understood, CD99 is involved in cell adhesion and migration in different type of tumors. The CD99 gene encodes two distinct transmembrane proteins, named isoform 1, longer with 32 kDa, and isoform 2, generated by alternative splicing, shorter with 28 kDa. In the present study, we demonstrated predominant expression of isoform 1 in astrocytomas of different malignant grades compared to normal brain, and in the human GBM cell line U87MG. The transcriptome of U87MG cell line transfected with siRNA for CD99 was analyzed in relation to control. A total of 2.670 differentially expressed genes were identified. An enrichment analysis by DAVID Bioinformatics Database revealed the following processes as the most significant: cell-cell adherens junction; cadherin binding involved in cell-cell adhesion and cell-cell adhesion. Functional assays based on these findings (migration, invasion and adhesion) were performed with U87MG cells after knocking down CD99 with two different shRNAs. The CD99 silencing efficiency was 80 and 97%, for shCD99 1 and 2, respectively, confirmed at gene and protein level. The CD99 knockdown reduced migration and invasion for both shRNA, with the highest decrease of migration observed in the higher CD99 knocked down cells. In adhesion assay, shCD99 1 U87MG showed lower adhesive properties than the control, whereas shCD99 2 cells presented opposite results, with higher cell adhesion than control. Probably CD99 knockdown affected in the reduction of cell adhesion in a distinct pattern, suggesting that the result is dependent on CD99 remaining expression level. Additionally, CD99 and phalloidin colocalized at lamellipodia and filopodia, sugesting that CD99 plays an important role to cytoskeleton rearrangement. It has also been demonstrated that CD99 silencing caused reduction of cell proliferation in vitro and decreased tumor in vivo. Immunodeficient mice in which knocked down cells were implanted in the brain had a longer survival than animals that received control cells. The signaling pathway by which CD99 modulates proliferation in GBM still needs to be elucidated. Migration, invasion and proliferation are major characteristics of GBM, which limits the complete surgical tumor resection, and consequently leads to tumor recurrence. Therefore, further analysis of CD99 activating pathways in the context of cell migration, invasion, proliferation and apoptosis is worthwhile to unveil new therapeutic strategies to halt GBM progression

A programação epigenética do genoma por metilação do DNA, modificação das histonas e remodelamento da cromatina é crucial para o desenvolvimento e o crescimento normal dos mamíferos e alterações nesses mecanismos contribuem diretamente para a transformação maligna. Em função do papel relevante da metilação do DNA na carcinogênese, da importância e da necessidade de identificação de marcadores moleculares em tumores de cabeça e pescoço e dos resultados já obtidos pelo grupo, o presente trabalho teve por objetivo geral investigar o perfil de metilação de ilhas CpG em carcinomas primários de cabeça e pescoço (CECP), bem como identificar e iniciar estudos funcionais de biomarcadores candidatos para diagnóstico e prognóstico desses tumores. Alguns genes previamente descritos com padrões anormais de metilação em neoplasias humanas (CDH1, CDH13, DAPK, CDKN2A, RASSF1A, SOCS3 e TIMP3), além de outros dois genes (MX1 e SLC15A3) identificados em nosso estudo anterior, foram analisados em amostras normais e margens cirúrgicas de CECP por meio da técnica de pirosequencimento de DNA após tratamento com bissulfito de sódio. As análises estatísticas não mostraram diferenças significativas para a maioria dos genes analisados, com exceção do gene SLC15A3, que apresentou diferença significativa (p<0,05) entre tumores e amostras de sangue de doadores saudáveis. Diferentemente, os resultados obtidos com a metodologia de PCR-MSP em nosso trabalho anterior mostraram que o gene MX1 está metilado em CECP. Os estudos funcionais do MX1, por RNA de interferência, ensaios de migração e citometria de fluxo mostraram que seu produto contribui para migração e proliferação celular, e talvez para resistência à apoptose. Os resultados sugeriram que o nível de expressão do MX1 pode ser um preditor do potencial metastático em carcinoma epidermóide / The genome epigenetic programming by DNA methylation, histone modification and chromatin remodeling is crucial for normal growth and development in mammals and changes in these mechanisms contributes directly to malignant transformation. Regarding the role of DNA methylation in carcinogenesis, the importance and necessity for the identification of molecular markers in head and neck tumors, and the results already obtained by the group, this study was aimed at investigating the methylation profile of CpG islands in primary head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC), and to identify and initiate functional studies of candidate biomarkers for diagnosis and prognosis of these tumors. Therefore, some genes previously described with abnormal methylation pattern in humans tumors (CDH1, CDH13, DAPK, CDKN2A, RASSF1A, and TIMP3 SOCS3), and two other genes (MX1 and SLC15A3) identified in our previous study were analyzed in normal samples, surgical margins, and in HNSCC by pyrosequencing after sodium bisulfite treatment. The statistical analysis showed no significant differences for most of analyzed genes, except for the SLC15A3, which showed significant difference (p <0.05) between tumors and blood samples from healthy donors. However, our earlier results showed a higher frequency of MX1 hypermethylation in primary HNSCC using the PCR-MSP methodology. To gain a better understanding of the role MX1 in cancer biology we investigated whether a downregulation of MX1 by interference RNA contribute to apoptosis resistance and cell migration during cancer development. Wound healing and flow cytometry assays were performed to determine changes in cell motility, death and cell cycle in SCC cells. The results indicated that low levels of MX1 could regulate the cell cycle, increase proliferation, and enhance tumor cell migration in HNSCC cell lines, but it might not contribute to apoptosis resistance. It also suggests that the level of MX1 expression may be a predictor of metastatic potential in HNSCC

O dimorfismo sexual relacionado à hipertensão arterial surge na adolescência e persiste por toda vida adulta. Homens apresentam maior incidência de doenças cardiovasculares quando comparados a mulheres de mesma faixa etária. O mesmo perfil é observado em modelos animais de hipertensão, nos quais machos apresentam maiores níveis pressóricos quando comparados a fêmeas. Dessa forma, a testosterona é frequentemente relacionada à hipertensão arterial. Entretanto, os mecanismos pelos quais a testosterona exerce efeitos vasculares ainda não estão esclarecidos. O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da testosterona sobre a geração de espécies reativas de oxigênio (EROs), importantes mediadores do processo hipertensivo, em células da musculatura lisa vascular (CMLV) de ratos normotensos e espontaneamente hipertensos (SHR). Os receptores para andrógenos, as fontes de EROs (papel da NADPH oxidase), bem como os efeitos funcionais celulares (migração celular) relacionados aos efeitos da testosterona também foram analisados. Para tanto, CMLV do leito mesentérico de ratos Wistar (W), Wistar-Kyoto (WKY) e SHR foram isoladas, cultivadas e estimuladas com testosterona 10-7mol/L em diferentes tempos, de acordo com cada protocolo. Sempre que necessário, as células foram pré-incubadas por 30 minutos com inibidores específicos para o estudo dos mecanismos envolvidos, tais como: flutamida (inibidor do receptor clássico para andrógenos), apocinina (inibidor da NADPH oxidase), PP2 (inibidor da c-Src), actinomicina D (inibidor da transcrição gênica) e cicloheximida (inibidor da síntese protéica). Nossos resultados indicam que a testosterona induz a geração de EROs por mecanismos dependentes do tempo e da linhagem de ratos, de modo que células isoladas de animais SHR são mais sensíveis a testosterona. Esta geração ocorre por dois mecanismos principais: um mediado pelo receptor clássico para andrógenos (AR) e outro mediado pelo receptor de membrana para andrógenos (ARm), resultando em efeitos genômicos e não-genômicos, respectivamente. Enquanto os efeitos genômicos são comuns, isto é, são observados em células de animais normotensos e hipertensos, os efeitos não-genômicos são específicos, e ocorrem exclusivamente em células de animais hipertensos. A geração genômica de EROs, mediada pelo AR, depende da modulação da expressão de subunidades da NADPH oxidase. Por outro lado, a geração não-genômica, é mediada pelo ARm, independe de síntese protéica, e ocorre devido à ativação de vias de sinalização específicas, reguladoras do complexo enzimático NADPH oxidase. As EROs formadas a partir do estímulo com a testosterona tanto por mecanismos genômicos ou não-genômicos levam a migração celular por mecanismos mediados pelo RA. Nossos resultados sugerem que a testosterona tem papel importante na função de células da musculatura lisa vascular, o que pode contribuir para algumas alterações vasculares características do processo hipertensivo. Portanto, nosso trabalho é o primeiro a demonstrar que a testosterona regula vias de sinalização redox em CMLV levando a efeitos funcionais importantes, relacionados ao remodelamento vascular, os quais podem contribuir para o desenvolvimento e manutenção da hipertensão arterial. / Sexual dimorphism related to hypertension begins at childhood and persists through adulthood. The incidence of cardiovascular diseases is higher in men when compared to age-matched women. Although testosterone has been associated to the sexual dimorphism in hypertension, the mechanisms whereby testosterone acts in the vasculature remain unclear. The main objective of this study was to determine whether testosterone induces reactive oxygen species (ROS) generation, key players on hypertension, in vascular smooth muscle cells (VSMC) isolated from normotensive and hypertensive rats. The signaling pathways and the androgen receptors activated by testosterone, the role of NADPH oxidase in ROS generation and the cellular outcomes (cell migration) were also determined. Accordingly, VSMC isolated from the mesenteric bed of Wistar (W), Wistar-Kyoto (WKY) and spontaneously hypertensive (SHR) rats were stimulated with testosterone 10-7mol/L for different periods of time, according to each protocol. Whenever appropriate, cells were pre-incubated with specific inhibitors, such as flutamide 10-5mol/L (nuclear androgen receptor antagonist), apocynin 3x10-5mol/L (NADPH oxidase inhibitor), PP2 10-5mol/L (c-Src inhibitor), actinomycin D 10-5mol/L (inhibitor of gene transcription), and cycloheximide 10-5mol/L (protein synthesis inhibitor). Our findings demonstrate that testosterone induces ROS formation in a time and strain-dependent manner. Augmentation of ROS formation is higher in SHR-VSCMC, indicating an increased sensitivity of SHR-VSMC to testosterone stimuli. Testosterone-induced ROS production occurs by two main mechanisms: the first mediated through the classical androgen receptor (AR) and the second mediated through membrane-associated androgen receptor (ARm), leading to genomic and non-genomic effects, respectively. Whereas the genomic effects occur in VSMC from both strains, non-genomic effects are only observed in SHR-VSMC. The genomic ROS production is mediated through AR and depends on modulation of NADPH oxidase subunits. On the other hand, non-genomic ROS formation is mediated through RAm, does not rely on protein synthesis and occurs via specific signaling pathways that regulate NADPH oxidase. Genomic and non-genomic ROS production by testosterone leads to a common final effect: VSMC migration, indicating that testosterone plays a key role in VSMC function. These results indicate that testosterone signals through redox-sensitive pathways, important in c-Src-mediated migration of VSMCs in SHR. Such processes may contribute to vascular remodeling in hypertension.

O dimorfismo sexual relacionado à hipertensão arterial surge na adolescência e persiste por toda vida adulta. Homens apresentam maior incidência de doenças cardiovasculares quando comparados a mulheres de mesma faixa etária. O mesmo perfil é observado em modelos animais de hipertensão, nos quais machos apresentam maiores níveis pressóricos quando comparados a fêmeas. Dessa forma, a testosterona é frequentemente relacionada à hipertensão arterial. Entretanto, os mecanismos pelos quais a testosterona exerce efeitos vasculares ainda não estão esclarecidos. O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da testosterona sobre a geração de espécies reativas de oxigênio (EROs), importantes mediadores do processo hipertensivo, em células da musculatura lisa vascular (CMLV) de ratos normotensos e espontaneamente hipertensos (SHR). Os receptores para andrógenos, as fontes de EROs (papel da NADPH oxidase), bem como os efeitos funcionais celulares (migração celular) relacionados aos efeitos da testosterona também foram analisados. Para tanto, CMLV do leito mesentérico de ratos Wistar (W), Wistar-Kyoto (WKY) e SHR foram isoladas, cultivadas e estimuladas com testosterona 10-7mol/L em diferentes tempos, de acordo com cada protocolo. Sempre que necessário, as células foram pré-incubadas por 30 minutos com inibidores específicos para o estudo dos mecanismos envolvidos, tais como: flutamida (inibidor do receptor clássico para andrógenos), apocinina (inibidor da NADPH oxidase), PP2 (inibidor da c-Src), actinomicina D (inibidor da transcrição gênica) e cicloheximida (inibidor da síntese protéica). Nossos resultados indicam que a testosterona induz a geração de EROs por mecanismos dependentes do tempo e da linhagem de ratos, de modo que células isoladas de animais SHR são mais sensíveis a testosterona. Esta geração ocorre por dois mecanismos principais: um mediado pelo receptor clássico para andrógenos (AR) e outro mediado pelo receptor de membrana para andrógenos (ARm), resultando em efeitos genômicos e não-genômicos, respectivamente. Enquanto os efeitos genômicos são comuns, isto é, são observados em células de animais normotensos e hipertensos, os efeitos não-genômicos são específicos, e ocorrem exclusivamente em células de animais hipertensos. A geração genômica de EROs, mediada pelo AR, depende da modulação da expressão de subunidades da NADPH oxidase. Por outro lado, a geração não-genômica, é mediada pelo ARm, independe de síntese protéica, e ocorre devido à ativação de vias de sinalização específicas, reguladoras do complexo enzimático NADPH oxidase. As EROs formadas a partir do estímulo com a testosterona tanto por mecanismos genômicos ou não-genômicos levam a migração celular por mecanismos mediados pelo RA. Nossos resultados sugerem que a testosterona tem papel importante na função de células da musculatura lisa vascular, o que pode contribuir para algumas alterações vasculares características do processo hipertensivo. Portanto, nosso trabalho é o primeiro a demonstrar que a testosterona regula vias de sinalização redox em CMLV levando a efeitos funcionais importantes, relacionados ao remodelamento vascular, os quais podem contribuir para o desenvolvimento e manutenção da hipertensão arterial. / Sexual dimorphism related to hypertension begins at childhood and persists through adulthood. The incidence of cardiovascular diseases is higher in men when compared to age-matched women. Although testosterone has been associated to the sexual dimorphism in hypertension, the mechanisms whereby testosterone acts in the vasculature remain unclear. The main objective of this study was to determine whether testosterone induces reactive oxygen species (ROS) generation, key players on hypertension, in vascular smooth muscle cells (VSMC) isolated from normotensive and hypertensive rats. The signaling pathways and the androgen receptors activated by testosterone, the role of NADPH oxidase in ROS generation and the cellular outcomes (cell migration) were also determined. Accordingly, VSMC isolated from the mesenteric bed of Wistar (W), Wistar-Kyoto (WKY) and spontaneously hypertensive (SHR) rats were stimulated with testosterone 10-7mol/L for different periods of time, according to each protocol. Whenever appropriate, cells were pre-incubated with specific inhibitors, such as flutamide 10-5mol/L (nuclear androgen receptor antagonist), apocynin 3x10-5mol/L (NADPH oxidase inhibitor), PP2 10-5mol/L (c-Src inhibitor), actinomycin D 10-5mol/L (inhibitor of gene transcription), and cycloheximide 10-5mol/L (protein synthesis inhibitor). Our findings demonstrate that testosterone induces ROS formation in a time and strain-dependent manner. Augmentation of ROS formation is higher in SHR-VSCMC, indicating an increased sensitivity of SHR-VSMC to testosterone stimuli. Testosterone-induced ROS production occurs by two main mechanisms: the first mediated through the classical androgen receptor (AR) and the second mediated through membrane-associated androgen receptor (ARm), leading to genomic and non-genomic effects, respectively. Whereas the genomic effects occur in VSMC from both strains, non-genomic effects are only observed in SHR-VSMC. The genomic ROS production is mediated through AR and depends on modulation of NADPH oxidase subunits. On the other hand, non-genomic ROS formation is mediated through RAm, does not rely on protein synthesis and occurs via specific signaling pathways that regulate NADPH oxidase. Genomic and non-genomic ROS production by testosterone leads to a common final effect: VSMC migration, indicating that testosterone plays a key role in VSMC function. These results indicate that testosterone signals through redox-sensitive pathways, important in c-Src-mediated migration of VSMCs in SHR. Such processes may contribute to vascular remodeling in hypertension.

A programação epigenética do genoma por metilação do DNA, modificação das histonas e remodelamento da cromatina é crucial para o desenvolvimento e o crescimento normal dos mamíferos e alterações nesses mecanismos contribuem diretamente para a transformação maligna. Em função do papel relevante da metilação do DNA na carcinogênese, da importância e da necessidade de identificação de marcadores moleculares em tumores de cabeça e pescoço e dos resultados já obtidos pelo grupo, o presente trabalho teve por objetivo geral investigar o perfil de metilação de ilhas CpG em carcinomas primários de cabeça e pescoço (CECP), bem como identificar e iniciar estudos funcionais de biomarcadores candidatos para diagnóstico e prognóstico desses tumores. Alguns genes previamente descritos com padrões anormais de metilação em neoplasias humanas (CDH1, CDH13, DAPK, CDKN2A, RASSF1A, SOCS3 e TIMP3), além de outros dois genes (MX1 e SLC15A3) identificados em nosso estudo anterior, foram analisados em amostras normais e margens cirúrgicas de CECP por meio da técnica de pirosequencimento de DNA após tratamento com bissulfito de sódio. As análises estatísticas não mostraram diferenças significativas para a maioria dos genes analisados, com exceção do gene SLC15A3, que apresentou diferença significativa (p<0,05) entre tumores e amostras de sangue de doadores saudáveis. Diferentemente, os resultados obtidos com a metodologia de PCR-MSP em nosso trabalho anterior mostraram que o gene MX1 está metilado em CECP. Os estudos funcionais do MX1, por RNA de interferência, ensaios de migração e citometria de fluxo mostraram que seu produto contribui para migração e proliferação celular, e talvez para resistência à apoptose. Os resultados sugeriram que o nível de expressão do MX1 pode ser um preditor do potencial metastático em carcinoma epidermóide / The genome epigenetic programming by DNA methylation, histone modification and chromatin remodeling is crucial for normal growth and development in mammals and changes in these mechanisms contributes directly to malignant transformation. Regarding the role of DNA methylation in carcinogenesis, the importance and necessity for the identification of molecular markers in head and neck tumors, and the results already obtained by the group, this study was aimed at investigating the methylation profile of CpG islands in primary head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC), and to identify and initiate functional studies of candidate biomarkers for diagnosis and prognosis of these tumors. Therefore, some genes previously described with abnormal methylation pattern in humans tumors (CDH1, CDH13, DAPK, CDKN2A, RASSF1A, and TIMP3 SOCS3), and two other genes (MX1 and SLC15A3) identified in our previous study were analyzed in normal samples, surgical margins, and in HNSCC by pyrosequencing after sodium bisulfite treatment. The statistical analysis showed no significant differences for most of analyzed genes, except for the SLC15A3, which showed significant difference (p <0.05) between tumors and blood samples from healthy donors. However, our earlier results showed a higher frequency of MX1 hypermethylation in primary HNSCC using the PCR-MSP methodology. To gain a better understanding of the role MX1 in cancer biology we investigated whether a downregulation of MX1 by interference RNA contribute to apoptosis resistance and cell migration during cancer development. Wound healing and flow cytometry assays were performed to determine changes in cell motility, death and cell cycle in SCC cells. The results indicated that low levels of MX1 could regulate the cell cycle, increase proliferation, and enhance tumor cell migration in HNSCC cell lines, but it might not contribute to apoptosis resistance. It also suggests that the level of MX1 expression may be a predictor of metastatic potential in HNSCC

O glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral maligno mais comum e agressivo em adultos. Uma combinação de terapia padrão com outras terapias baseadas no conhecimento de sua biologia é necessária para melhorar a sobrevida de pacientes com GBM. Muitos estudos foram desenvolvidos em busca de proteínas de membrana expressas em GBM, pois são potenciais alvos para imunoterapia. A proteína transmembrânica CD99 foi descrita como altamente expressa em astrocitomas de diferentes graus de malignidade. Embora seu mecanismo de ação ainda não seja totalmente compreendido, CD99 está envolvido na adesão e migração celular em diferentes tipos de tumores. O gene CD99 codifica duas proteínas distintas, denominadas isoforma 1, maior, de 32 kDa, e isoforma 2, gerada por splicing alternativo e menor, de 28 kDa. No presente estudo, foi demonstrada a expressão predominante da isoforma 1 em astrocitomas de diferentes graus de malignidade em comparação com o cérebro normal, bem como na linhagem celular de GBM humano U87MG. O transcriptoma das células U87MG transfectadas com siRNA para CD99 foi analisado em relação ao controle. Um total de 2.670 genes diferencialmente expressos foi identificado. Uma análise de enriquecimento no banco de dados DAVID revelou os seguintes processos como os mais significativos: junções aderentes célula-célula; adesão célula-célula envolvendo ligação de caderina e adesão celular. Ensaios funcionais baseados nestes achados (migração, invasão e adesão) foram realizados com células U87MG após o silenciamento de CD99 com dois shRNAs diferentes. A eficiência de silenciamento foi de 80 e 97%, para o shCD991 e 2, respectivamente, confirmada a nível de expressão do gene e da proteína. O silenciamento de CD99 reduziu a migração e invasão para ambos os shRNAs, com diminuição mais acentuada da migração para o shCD99 2, com maior nível de silenciamento de CD99. No ensaio de adesão, a linhagem U87MG shCD99 1 apresentou propriedades adesivas mais baixas que o controle, enquanto o shCD99 2 apresentou resultado oposto, com maior adesão celular do que seu controle. Provavelmente o silenciamento de CD99 afetou a redução da adesão celular em um padrão distinto, sugerindo que o resultado pode ser dependente do nível de expressão remanescente de CD99. Além disso, o CD99 e a faloidina colocalizaram nos lamelipódios e filopódios, sugerindo um papel importante no rearranjo do citoesqueleto. Foi demostrado, ainda, que o silenciamento de CD99 levou à redução da proliferação celular in vitro e diminuição do tumor in vivo. Camundongos imunodeficientes nos quais foram implantadas células silenciadas no cérebro apresentaram uma maior sobrevida que os animais que receberam células controle. A via de sinalização pela qual CD99 modula a proliferação no GBM ainda precisa ser elucidada. Migração, invasão e proliferação são as principais características do GBM que limitam uma ressecção cirúrgica completa e, consequentemente, levam frequentemente à recorrência. Portanto, análises posteriores das vias ativadoras do CD99 no contexto da migração, invasão, proliferação celular e apoptose são válidas para revelar novas estratégias terapêuticas para limitar a progressão do GBM / Glioblastoma (GBM) is the most common and aggressive malignant brain tumor in adults. A combination of standard therapy with other biologically based therapies is necessary to improve the survival of patients with GBM. Many studies have been developed in pursuit of expressed membrane proteins in GBM, which are potential targets for immunotherapy. The transmembrane protein CD99 is highly expressed in different malignant grades of astrocytomas. Although its mechanism of action is not still fully understood, CD99 is involved in cell adhesion and migration in different type of tumors. The CD99 gene encodes two distinct transmembrane proteins, named isoform 1, longer with 32 kDa, and isoform 2, generated by alternative splicing, shorter with 28 kDa. In the present study, we demonstrated predominant expression of isoform 1 in astrocytomas of different malignant grades compared to normal brain, and in the human GBM cell line U87MG. The transcriptome of U87MG cell line transfected with siRNA for CD99 was analyzed in relation to control. A total of 2.670 differentially expressed genes were identified. An enrichment analysis by DAVID Bioinformatics Database revealed the following processes as the most significant: cell-cell adherens junction; cadherin binding involved in cell-cell adhesion and cell-cell adhesion. Functional assays based on these findings (migration, invasion and adhesion) were performed with U87MG cells after knocking down CD99 with two different shRNAs. The CD99 silencing efficiency was 80 and 97%, for shCD99 1 and 2, respectively, confirmed at gene and protein level. The CD99 knockdown reduced migration and invasion for both shRNA, with the highest decrease of migration observed in the higher CD99 knocked down cells. In adhesion assay, shCD99 1 U87MG showed lower adhesive properties than the control, whereas shCD99 2 cells presented opposite results, with higher cell adhesion than control. Probably CD99 knockdown affected in the reduction of cell adhesion in a distinct pattern, suggesting that the result is dependent on CD99 remaining expression level. Additionally, CD99 and phalloidin colocalized at lamellipodia and filopodia, sugesting that CD99 plays an important role to cytoskeleton rearrangement. It has also been demonstrated that CD99 silencing caused reduction of cell proliferation in vitro and decreased tumor in vivo. Immunodeficient mice in which knocked down cells were implanted in the brain had a longer survival than animals that received control cells. The signaling pathway by which CD99 modulates proliferation in GBM still needs to be elucidated. Migration, invasion and proliferation are major characteristics of GBM, which limits the complete surgical tumor resection, and consequently leads to tumor recurrence. Therefore, further analysis of CD99 activating pathways in the context of cell migration, invasion, proliferation and apoptosis is worthwhile to unveil new therapeutic strategies to halt GBM progression

O presente estudo comparou os efeitos da ativação e inibição do EGFR em duas linhagens de câncer de pulmão, cultivadas em monocamada ou esferoides. Os esferoides foram cultivados sem elementos de matriz extracelular. As células A549 e HK2 apresentaram, respectivamente, 3 e 6 cópias do gene ErbB1 por núcleo, embora a expressão de EGFR seja menor nas células HK2. A ativação de EGFR por EGF ou inibição por AG1478 não promoveu mudanças na proliferação celular. Entretanto, as células cultivadas em monocamada, estimuladas com EGF, exibiram alterações na disposição dos microfilamentos de actina e aumento na velocidade de migração celular. UO126 e LY294002 foram adicionados às culturas para inibir, respectivamente, as vias ERK e Akt. A linhagem A549, cultivada em monocamada, não apresentou envolvimento das vias de sinalização de ERK e Akt na migração celular induzida por EGF, mas foi observado o envolvimento dessas vias nos esferoides. Já a linhagem HK2 apresentou o envolvimento de Akt para promover a migração celular após estímulo com EGF nas duas formas de cultivo. / This study compared the effects of activation and inhibition of EGFR in two cell lines of lung cancer, grown in monolayer or spheroids. Spheroids were cultured without extracellular matrix components. HK2 and A549 cells showed, respectively, 3 and 6 ErbB1 gene copies per nucleus, while EGFR expression is lower in the HK2 cells. The activation by EGF or EGFR inhibition by AG1478 did not cause changes in cell proliferation. However, cells cultured in monolayers stimulated with EGF, showed changes in the arrangement of actin microfilaments and increased the speed of cell migration. UO126 and LY294002 were added to the cultures to inhibit, respectively, the ERK and Akt pathways. A549 cells grown in monolayer did not show involvement of ERK and Akt signaling pathways in the cell migration induced by EGF, but was observed involvement of such pathways in the spheroids. HK2 cells showed involvement of Akt to promote cell migration after EGF stimulation in monolayers and in spheroids.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O gênero Pterodon compreende algumas espécies largamente distribuídas sobre a região central do Brasil. Seus frutos são comercialmente disponíveis no mercado da flora medicinal sendo amplamente utilizados pelas suas propriedades farmacológicas como antirreumático, anti-inflamatório e analgésicas. O objetivo deste trabalho foi biomonitorar o fracionamento do extrato hexânico de <i>Pterodon polygalaeflorus Benth</i>. (ExPpg), utilizando modelos de inflamação aguda (edema de pata e bolha de ar). O fracionamento/sub-fracionamento foi realizado por cromatografia em coluna de sílica e as amostras analisadas por cromatografia em camada fina e cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massas. O edema de pata foi induzido em camundongos SW por injeção (s.c.) de carragenina. Uma hora antes da inoculação de carragenina os animais foram tratados v.o. com veículo (EtOH 15%, 1,25% Tween-20), indometacina (10 mg/kg p.c.) ou ExHPpg/frações/sub-frações de Ppg. No modelo bolha de ar, a cavidade foi desenvolvida em camundongos SW através da injeção de ar estéril (s.c.) no dorso e a inflamação induzida por carragenina. Uma hora antes de inocular a carragenina os animais foram tratados (v.o) com o veículo, indometacina (10 mg/kg) ou ExHPpg/Fr2Ppg/sub-frações. Após 4 h o exsudato da bolha foi coletado para contagem total e diferencial de leucócitos (Panótico rápido) e dosagem de proteínas (biureto), e a pele referente à bolha foi removida para análises macroscópica e histológica (HE). Também foi realizado estudo de migração de neutrófilos pelo ensaio do <i>transwell</i>. Após demonstração do efeito antiedematogênico do ExHPpg, este foi fracionado em quatro frações. A fração Fr2Ppg, mais ativa no modelo de edema de pata, também inibiu os diferentes parâmetros inflamatórios avaliados no modelo de bolha de ar, com a menor dose testada, e foi sub-fracionada em cinco sub-frações. Destas, as SF2.1 e SF2.2 foram as que mostraram melhor efeito anti-inflamatório pelo modelo da bolha de ar. Em relação ao grupo controle com carragenina, o ExHppg, Fr2Ppg, SF 2.1 e SF 2.2, na dose 0,02 mg/kg, exerceram inibições de 70,6%, 62,8%, 54,7% e 79% no número total de células no exsudato, reduções de 76,8%, 76,9%, 71,1% e 73,3% na concentração de proteína, respectivamente. Com a dose de 0,2 mg/kg, foram observadas inibições apenas para ExHPpg e SF 2.1, com intensidades menores, na leucometria total (62,9% e 48,62%, respectivamente), e na concentração de proteína para SF 2.1 e SF 2.2 (reduções de 68,2% e 30,4%, respectivamente). As análises macroscópica e histológica mostraram redução importante da vasodilatação e do infiltrado inflamatório pelo tratamento com o ExHppg, Fr2Ppg, SF 2.1 e SF 2.2. No ensaio de <i>transwell</i> a Fr2Ppg exibiu 31,4% de inibição na migração de neutrófilos. As sub-frações SF2.1 e SF2.2 foram avaliadas por GC-MS, identificando-se de diversos compostos majoritários. Em resumo, este trabalho confirma o potencial anti-inflamatório da espécie <i>Pterodon polygalaeflorus</i> e mostra um fracionamento efetivo do ExHPpg quanto à composição e ação anti-inflamatória. / The genus Pterodon comprises some species widely distributed over the central region of Brazil. Its fruits are commercially available on the market of the medicinal flora, being widely used by their pharmacological properties as antipyretic, anti-inflammatory and analgesic. The aim of this work was to guide the fractionation of hexanic extract of <i>Pterodon polygalaeflorus</i> Benth. fruits (ExPpg), using acute inflammation models (paw edema and air pouch). The extract fractionation was done by column chromatography on silica and the samples were analyzed by thin layer chromatography and gas chromatography coupled with mass spectrometer. Paw edema was induced in SW mice by (s.c.) injection of carrageenan in the right paw. One hour before the carrageenan inoculation, animals were orally treated with vehicle (EtOH 15, 1.25 Tween-20), indomethacin (10 mg/kg bow.) or ExHPpg/fractions/sub-fractions of Ppg. In the air pouch model, the cavity was developed in SW mice through sterile air injection (s.c.) on the back and the inflammation induced by carrageenan inoculation in this cavity. An hour before carrageenan injection the animals were orally treated with the vehicle, indomethacin (10 mg/kg) or ExHPpg/Fr2Ppg/sub-fractions. After four hours the air pouch exudate was collected for the total and differential leukocyte counts (fast Panotic) and protein determination (biuret reaction), and the skin of the air pouch was removed to macroscopic and histological analyses (HE). In vitro neutrophil migration was performed by transwell assay. After demonstration of the anti-edematogenic effect of ExHPpg, this extract was fractionated into four fractions. The Fr2Ppg fraction, most active in paw edema model, also inhibited, in the lowest dose tested, the different inflammatory parameters evaluated in air pouch model. Then, it was sub-fractioned in five sub-fractions. The SF 2.1 and SF 2.2 were the sub-fractions with higher anti-inflammatory effects in the air pouch model. In relation to the carrageenan control group, ExHPpg, Fr2Ppg, SF 2.1 and SF 2.2, in 0.02 mg/kg dose, showed inhibitions of 70.6%, 62.8%, 54.7% and 79% in the total leukocyte counts in the exudate and reductions of 76.8%, 76.9%, 71.1% and 73.3% in the protein concentration, respectively. With the 0.2 mg/kg dose, reductions were observed only for total leukocyte counts after treatment with ExHPpg or SF 2.1 (62.9 and 48.62, respectively), and for protein concentration in animals treated with SF 2.1 and SF 2.2 (reductions of 68.2% and 30.4%, respectively). Macroscopic and histological analyses of air pouch tissues showed important reductions of vasodilation and inflammatory infiltrate by treatment with ExHPpg, Fr2Ppg, SF 2.1 and SF 2.2. In the transwell assay the Fr2Ppg exhibited inhibition of 31.4% of neutrophil migration. The SF 2.1 and SF 2.2 sub-fractions were analyzed by GC-MS, identifying some major compounds. Concluding, this work confirms the anti-inflammatory potential of <i>Pterodon polygalaeflorus</i> species and shows an effective ExHPpg fractionation in relation to the composition and anti-inflammatory effect.