El DNA mitocondrial (mtDNA) es útil para estudios de genética de poblaciones humanas debido a que su genoma está completamente caracterizado, es de herencia materna y tiene una tasa de evolución relativamente rápida. Las técnicas de DNA antiguo, que empezaron a desarrollarse en 1984, han añadido una variable temporal a este tipo de estudios a pesar de que existe cierta desconfianza debido al riesgo de contaminación de las muestras con DNA moderno. Por otra parte, el estudio de la población Catalana resulta interesante debido a que el análisis de componentes principales de marcadores clásicos mostró su diferenciación respecto a otras poblaciones ibéricas; diferenciación que fue corroborada por estudios de comparación de secuencias de mtDNA.Bajo estas consideraciones fue planteado como objetivo principal valorar las posibilidades que tienen los estudios de DNA antiguo a nivel poblacional, en la resolución de problemas como la estimación de la tasa de evolución y el origen del acervo genético mitocondrial europeo y el desarrollo de métodos fiables para la detección de la contaminación con DNA exógeno. Con este fin se analizó la población Catalana de dos épocas diferenciadas.Para el estudio de la población antigua se analizaron 52 individuos de la necrópolis de la Plaça Vella de Terrassa, Barcelona (s. XV-XVI) y se obtuvo mtDNA de 24 de ellos. En este análisis también se incluyeron diversos individuos de distintos yacimientos a manera de control metodológico. Para el análisis de la población contemporánea se caracterizó el mtDNA de 90 individuos de población residente de las ciudades de Terrassa y Barcelona y estudiantes de la Universidad Autónoma de Barcelona.En los 24 individuos de la Plaça Vella se encontraron 12 secuencias diferentes con un índice de diversidad que cae dentro del rango obtenido para otras poblaciones europeas. En estos individuos están representados 7 de los 9 haplogrupos europeos y la distribución que presentan también es similar a la que presentan la mayoría de poblaciones europeas. Estas observaciones junto con distintos criterios discutidos en esta tesis avalan la autenticidad de los resultados obtenidos.Con estos datos se realizó un análisis filogenético incluyendo información previamente publicada de 11 series poblacionales principalmente europeas. El análisis mostró una cercana relación entre las poblaciones antigua y actual de Cataluña y evidenció también la cercanía entre estas poblaciones y otras poblaciones mediterráneas en cuanto a su mtDNA. En cambio, la relación de la población Catalana con otras poblaciones ibéricas (Galicia y País Vasco) no resultó tan estrecha.Paralelamente a los estudios de las poblaciones antigua y actual, se llevó a cabo una investigación sobre las substancias que presentan los extractos de DNA antiguo que tienen un poder inhibitorio en las reacciones enzimáticas. El análisis comparativo apoya la hipótesis de que estas substancias sean alguna fracción de los ácidos húmicos, descartando las porfirinas, el daño del DNA y los iones libres de hierro. La hipótesis de que sean productos Maillard no fue rechazada pero no se obtuvo evidencia en favor de ella. Además, se encontró un método sencillo que disminuye los efectos negativos que presentan estas substancias durante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). / Mitochondrial DNA (mtDNA) is useful in population genetics studies because its genome is fully characterised, it is maternally inherited and it shows a fast evolution rate. Ancient DNA techniques, beginning in1984, have added a temporal variable to this kind of studies although there is some controversy around this kind of analysis, due to contamination problems with modern DNA. The study of the Catalonian population is interesting since previous reports have shown some differentiation of this population from other Iberian populations, by means of principal components analysis for classic markers. This differentiation has been corroborated in some studies by comparing mtDNA sequences.Under these considerations, the main objective of the present work was to assess the ability of ancient DNA studies - at population level - to solve problems such as the evolution rate estimation, the origin of the mitochondrial gene pool in Europe, and the development of reliable methods to detect exogenous DNA contamination. For this purpose, Catalonian populations from two different periods were analysed.For the ancient population, 52 individuals from the necropolis of PlaçaVella, Terrassa, Barcelona (XV-XVI centuries) were analysed. Mitochondrial DNA was recovered from 24 individuals. As a methodological control, several individuals from different sites were included in this study. For the contemporary population, the mtDNA from 90 contemporary individuals inhabitants of Terrassa and Barcelona cities and students from the Universitat Autònoma de Barcelona was analysed.There were 12 different sequences in the 24 individuals from the PlaçaVella, which showed an index of diversity fitting in the range observed for other European populations. These 24 individuals presented 7 out of the 9 European haplogroups and their distribution looked like most of the European populations. These observations, along with another criteria discussed in this work, support the authenticity of the results.The data obtained from the ancient population as well as from the contemporary population, were used in a phylogenetic analysis, including previously published information from 11 population series, mainly European. This analysis showed a close relationship between the ancient and contemporary populations from Catalonia, as well as between these populations and other Mediterranean populations, regarding its mtDNA. On the other hand, the relationship between Catalonian population and other Iberian populations (Galicia and Basque Country) was not so close.Besides the studies on ancient and contemporary populations, a research on the inhibitory substances usually found in ancient DNA extracts was carried out. The comparative analysis supports the hypothesis that these substances are a humic acid fraction, discarding another substances as the putative inhibitors. The possibility that these substances are Maillard reaction products was not rejected; however, there was no evidence supporting this possibility. In this work, a novel and simple method to overcome the PCR inhibition produced by these substances was uncovered.

Este trabajo es una contribución al estudio de la diversidad genética en las poblaciones americanas antiguas. Se ha analizado el DNA procedente de restos humanos esqueléticos de yacimientos mesoamericanos de tres épocas distintas, con dataciones que se ubican desde la época azteca prehispánica (post-clásico tardío) a la colonia del Virreinato de la Nueva España, con la finalidad de inferir, desde la visión de los linajes maternos, la dinámica de las poblaciones del Valle Central de México y el posible aporte genético del contingente español y africano que llegó a tierras americanas, específicamente a México, desde finales del siglo XVI. Se estudiaron los marcadores del DNA mitocondrial (mtDNA) a partir de restricción enzimática de fragmentos en la región codificante y de la secuenciación de un segmento de la región hipervariable I. Los distintos análisis se realizaron observando un estricto control de los criterios de autenticidad en relación a las condiciones de laboratorio, el uso de controles, la caracterización de los investigadores, diversidad genética, sentido filogenético y total correspondencia entre los marcadores mitocondriales, concordancia que es reconocida como un criterio de autenticidad cuando se analiza el mtDNA proveniente de restos antiguos. De los ciento dos individuos estudiados, ochenta y siete fueron clasificados entre los cuatro principales haplogrupos descritos para nativos americanos (A, B, C y D) y tres no segregaron para ninguno de estos haplogrupos, ni siquiera para el quinto y menos frecuente linaje americano, el haplogrupo X; a la luz de los datos de que se dispone hasta el momento es probable de que se trate de individuos cuyo linaje maternal pertenezca a alguno de los haplogrupos africanos (L1, L2 y L3), siendo la primera evidencia genética del aporte africano en época colonial. En los doce individuos restantes no se lograron amplificaciones positivas para más de un sitio de restricción, por lo cual fueron excluidos de la investigación. Los análisis de comparación entre las tres series antiguas permiten deducir una continuidad entre los linajes mitocondriales anteriores al contacto europeo y los linajes de la época colonial, no observándose diferencias significativas entre ellas. Sin embargo, la presencia de secuencias únicas en la serie de contacto permite hipotetizar un colapso poblacional en algunos núcleos indígenas. Los resultados obtenidos tanto a nivel de haplogrupos como de secuencias también han sido comparados con datos de poblaciones actuales y antiguas de América y Asia obtenidos de la literatura; y de esta manera, situar en el contexto poblacional americano las muestras antiguas del Valle Central mexicano. Los procedimientos de reconstrucción filogenética nos permiten deducir que las series antiguas del Valle Central de México tienen un vínculo por vía matrilineal con el resto de las poblaciones americanas, y especialmente con la población mexicana contemporánea de referencia. Además, está virtualmente ausente el aporte europeo en las muestras analizadas, debido posiblemente, a que el proceso de mestizaje que se produjo durante los siglos XVI y XIX fue de tipo unidireccional, hombre europeo-mujer indígena y el mtDNA sólo nos permite el análisis del aporte genético materno. / This paper is a contribution to the genetic diversity study in ancient American populations. DNA from Mesoamerican human skeletal remains from three different periods, which cover from the pre-Hispanic Aztec epoch (late post-classical) to the Viceroyalty of New Spain at the colonial period were analyzed, with the purpose to infer, with the information that the maternal lineages can provide us, Mexico's Central Valley population dynamics; and the possible genetic contribution of the Spanish and African contingents that arrived to the Americas, specifically to Mexico, since the last period of the XVIth century.Mitochondrial DNA (mtDNA) markers have been studied by both specific restriction enzyme analysis in the coding region and by sequencing of the hypervariable region I segment. The analyses were carried out with a strict control of the authenticity criteria, focusing on: laboratory conditions, use of blank controls, mtDNA characterization of laboratory researchers, genetic diversity, phylogenetic sense and total correspondence among mitochondrial markers, which is recognized as an authenticity criterium where mtDNA analysis from ancient remains is concerned. Of the hundred two individuals studied, eighty-seven were classified among the four major founding mtDNA haplogroups described for American natives (A, B, C, and D), three individuals didn't segregate for any of these haplogroups, not even for the fifth and less frequent American founding lineage, the haplogroup X; and it is probable that their maternal lineage belong to one of the African haplogroups (L1, L2 or L3), being the first genetic evidence of the African contribution in the colonial epoch. Finally, in twelve individuals positive amplifications were achieved in no more than one restriction site, reason by which they were excluded of the investigation. The analysis comparison among the three ancient series showed that there is continuity between mitochondrial lineages previous to the European contact and colonial lineages, and that there is not a significant difference among them. Nevertheless, the presence of exclusive lineages in contact series allows us to hypothesize a population collapse in some native groups. The results obtained using both methods of the mtDNA analysis have also been compared with ancient and current populations data from America and Asia available in the literature; and in this way, we have been able to place in the American context the Mexico's Central Valley samples. Phylogenetic reconstruction procedures permit to deduce that Mexico's Central Valley ancient series have a maternal link with the remaining American populations, and especially with the Mexican current population of reference. In addition the European contribution in the samples analyzed is virtually absent possibly owing to that the mestizaje process that was produced during the XVIth and XIXth centuries was of one-directional: European man - Native woman and mtDNA only permits maternal genetic analysis.

En els darrers anys, els tractaments antiretrovirals combinats (TARGA) ha convertit la infecció per l´HIV en una patologia de curs crònic. D´altra banda, l´ús d´antiretrovirals durant l´embaràs, el part i el període neonatal i la cesària electiva han reduït la taxa de transmissió vertical de la infecció per l´HIV per sota de l´1% en els països desenvolupats. L´evolució agressiva de la infecció per l´HIV en el pacient pediàtric aconsella una instauració precoç de tractaments TARGA, l´exposició als quals sovint es perllongarà durant anys. D´altra banda, la xifra de nounats sans nascuts de mare infectada per l´HIV i exposats a antiretrovirals en un moment clau per al desenvolupament de la persona va en augment. Els anàlegs de nucleòssids inhibidors de la transcriptasa inversa (NRTIs) són la base de qualsevol tractament antiretroviral, però inhibeixen també la DNA polimerasa gamma; aquest enzim està present en gairebé totes les cèl.lules eucariotes i és el responsable de la replicació del DNA de la mitocòndria, l´organel.la encarregada de la producció d´energia a partir de nutrients i oxigen. Malauradament, han sorgit noves patologies en aquests malalts degudes a l´ús crònic d´antiretrovirals, moltes de les quals s´han relacionat amb la toxicitat mitocondrial per NRTIs, com ara la síndrome de la lipodistròfia, la pancreatitis, la neuropatia perifèrica, la miopatia, l´osteopènia o la toxicitat hematològica. L´acidosi làctica fulminant és la patologia més greu que s´ha descrit en relació a l´us de NRTIs. L´espectre bioquímic i clínic de l´elevació plasmàtica dels nivells d´àcid làctic en pacients infectats per l´HIV és molt més ampli. La prevalença d´hiperLA asimptomàtica arriba al 25% en algunes sèries i, darrerament, s´han descrit casos d´hiperLA simptomàtica més lleu i d´evolució més benigna, sempre en pacients adults. En el nen, la literatura al voltant de la hiperlactacidèmia associada a l´ús d´antiretrovirals en l´edat pediàtrica és molt escassa. S´ha realitzat un estudi observacional prospectiu dels nivells plasmàtics d´àcid làctic en dues cohorts de pacients pediàtrics exposats a antiretrovirals: cohort 1, pacients infectats per l´HIV; cohort 2, pacients sans exposats a l´HIV durant la gestació, part i període neonatal. En la cohort 1 s´ha estudiat a 91 pacients (51 de sexe femení; edat mitjana de 8 anys). S´ha realitzat una mitjana de 8 determinacions d´àcid làctic per pacient i s´han identificat 24 episodis d´hiperlactacidèmia (rang: 2.4-4.9 mmol/l), sempre asimptomàtica. Globalment, la densitat d´incidència d´hiperlactacidèmia en aquest grup de pacients ha estat de 8.8 episodis per 100 pacients pediàtrics infectats per l´HIV-any, i ha afectat al 22% de la cohort. Tan sols l´inici precoç de tractaments TARGA i un temps acumulat més curt d´exposició a aquests tractaments s´han relacionat amb el risc de desenvolupar hiperlactacidèmia de forma estadísticament significativa. En la cohort 2 s´ha estudiat a 141 lactants sans nascuts de mare infectada per l´HIV i exposats a antiretrovirals durant l´embaràs, part i període neonatal. Se´ls ha realitzat determinacions plasmàtiques d´àcid làctic a les 6 setmanes i als 3, 6 i 12 mesos de vida. La taxa de prevalença d´hiperlactacidèmia en aquesta cohort ha arribat al 52%, amb valors màxims de 8.06, 10.1, 7.28 i 4.1 mmol/l en els diversos punts de tall i una tendència espontània cap a la normalització amb l´edat. Tres pacients de sexe femení han presentat un retràs lleu i autolimitat en el desenvolupament neurològic. Tan sols l´ús gestacional de didanosina s´ha relacionat amb un major risc de desenvolupar hiperlactacidèmia de forma estadísticament significativa. L´escassa i benigna repercussió clínica dels episodis d´hiperlactacidèmia i el fet que no hagin provocat canvis en l´estratègia terapèutica en cap dels pacients estudiats no justifiquen la determinació rutinària dels nivells plasmàtics d´àcid làctic en cap de les dues cohorts de pacients. / Nucleoside analogue reverse trancriptase inhibitors (NRTIs) play a pivotal role in HAART regimens, which have demonstrated efficacy in reducing both morbidity and mortality from AIDS and mother-to-child transmission of HIV infection. NRTIs inhibit also DNA polymerase gamma, which is an essential protein for mitochondrial DNA replication in human cells. Mitochondrial toxicity has been identified as the common pathway in a group of side effects associated with the use of NRTIs, including hyperlactatemia and lactic acidosis.A prospective observational study of optimally-obtained venous lactate (LA) concentrations in two cohorts of children exposed to antiretrovirals was performed. Cohort 1 included 91 HIV-infected pediatric patients (51 girls, mean age: 8y; LA obtained every 6m); cohort 2 included 141 uninfected infants born to HIV-infected mothers and exposed perinatally to antiretrovirals (LA obtained at 6w and 3, 6 and 12m of life). In cohort 1 the incidence rate for hyperLA (range: 2.4-4.9 mmol/l) was 8.8 episodes per 100 HIV-infected patients-year, never associating clinical symptoms. Prevalence rate: 22% of the cohort. Only a younger age at the beginning of HAART and a shorter duration of this treatment were identified as statistically significant risk factors for hyperlactatemia.Fifty-two per cent of infants in cohort 2 developed hyperlactatemia with spontaneous evolution towards normal levels with age in most cases (peak levels of 8.06, 10.1, 7.28 and 4.1 mmol/l at 6w and 3, 6 and 12m, respectively). Three girls presented a slight and self-limited delay in psychomotor development. Only the gestational use of didanosine was associated with a higher risk of hyperlactatemia. Considering that most cases of hyperlactatemia were symtom-free and the mild and self-limited evolution of the children who presented with neurologic symptoms, the random determination of LA would not be justified in any of these patients.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A obesidade é uma doença crônica, resultante do excesso de gordura no organismo. O aumento da obesidade no mundo, tem se revelado como um dos fenômenos clínicos e epidemiológicos da atualidade. Estudos populacionais e em modelos animais demonstram que a origem da epidemia da obesidade está relacionada a fatores genéticos, modificações de hábitos nutricionais, redução da atividade física, e alterações nutricionais durante a lactação, desempenhando um papel relevante no desenvolvimento da obesidade, DM2 e cardiomiopatias. As mitocôndrias são os coordenadores centrais do metabolismo energético, assim, alterações funcionais e estruturais dessa organela têm sido associadas à desordens metabólicas. Elas exercem um papel na sobrevivência e função dos cardiomiócitos devido à alta demanda energética do miocárdio. Desta forma, disfunções mitocondriais estão relacionadas com disfunções no miocárdio e conseqüente progressão de cardiomiopatias. Neste estudo, avaliamos a bioenergética e a ultraestrutura de cardiomiócitos de camundongos obesos e controle hiperalimentados durante a lactação. O consumo de oxigênio das fibras cardíacas foi avaliado por respirometria de alta-resolução, utilizando um oxígrafo-2K-Oroboros. A ultraestrutura dos cardiomiócitos foi analisada por microscopia eletrônica de transmissão e o conteúdo das proteínas Carnitina palmitoil transferase 1 (CPT1), Proteína desacopladora 2 (UCP2) , Transportador de glicose 1 e 4 (GLUT1) e (GLUT4), Proteína Kinase ativada por AMP (AMPK) e Proteína kinase ativada por AMP fosforilada p(AMPK) por Western blotting (WB). Além disso, o peso dos animais, a gordura retroperitoneal, epididimal e a glicemia em jejum foram determinadas. Nossos resultados confirmaram que os animais do grupo hiperalimentados (GH), aos 90 dias de vida, apresentaram aumento da massa corporal, de gordura epididimária e retroperitoneal comparado ao grupo controle (GC). As taxas respiratórias foram semelhantes nos dois grupos quando foram utilizados os substratos dos complexos I e II. Entretanto, quando o ácido graxo palmitoil-L-carnitina foi utilizado, a taxa respiratória máxima do GH foi significativamente menor. A análise ultraestrutural dos cardiomiócitos do GH demonstrou intenso dano na matriz mitocondrial e maior presença de gotículas de lipídios, caracterizando deposição ectópica. Os resultados do WB mostraram aumento significativo do conteúdo de CPT1 e UCP2 no GH comparado ao GC. Não foram encontradas diferenças significativas no conteúdo de GLUT1 entre os grupos, entretanto, observamos maior conteúdo do GLUT4 no GH. Além disso, encontramos maior conteúdo de AMPK no GH, ao passo que o conteúdo de pAMPK foi semelhante entre os grupos. Entretanto, a razão pAMPK/AMPK é significativamente menor no GH. Esses resultados sugerem que a hiperalimentação durante a lactação leva a obesidade na vida adulta com alterações na bioenergética e ultraestrutura dos cardiomiócitos. / Obesity is a chronic disease resulting from the excess of fat in the body. The increase of obesity in the world has been on the clinical and epidemiological phenomenon of the present. Population studies and animal models, show that the origin of the "obesity epidemic", is related to genetic factors and habits acquired during early and adult life, such as changes in dietary habits and reduction in physical activity. In this context, nutritional changes during the period of lactation play an important role in the development of obesity, type 2 Diabetes Mellitus and cardiovascular diseases. Mitochondria are the central coordinators of energy metabolism, playing a role in the survival and function of the cardiomyocytes due to high energy demand of the myocardium. Functional and structural alterations of this organelle have been associated with metabolic disorders as well to myocardium dysfunction, and consequent progression of cardiomyopathies. In this study, we evaluated the bioenergetics and the ultrastructure of cardiomyocytes from obese (OG) and control (CG) mice overfed during lactation. The oxygen consumption of cardiac fibers was assessed by high resolution respirometry, using a 2K-oxigraph-Oroboros. The ultrastructure of the cardiomyocytes was analyzed by transmission electron microscopy, and the content of proteins carnitine palmitoyltransferase 1 (CPT1), uncoupling protein 2 (UCP2), glucose transporter 1 and 4, (GLUT1) and (GLUT4), activated Protein kinase by AMP (AMPK) and AMP-activated protein kinase phosphorylated (pAMPK) was assessed by Western Blotting (WB). In addition, animal body mass, retroperitoneal and epididymal fat, and fasting blood glucose were determined. Our results confirmed that animals in group OG, at 90 days of life, showed an increase in body mass and mediastinun and retroperitoneal fat when compared with CG. Respiratory rates were similar in both groups when we used complexes I and II substrates. However, when palmitoil-L-carnitine fatty acid was used, the maximum respiratory rate of OG was significantly lower than CG. The ultrastructural analysis of the cardiomyocytes of OG showed intense damage in mitochondrial matrix and greater presence of lipid droplets, characterizing ectopic deposition. WB analyses showed a significant increase of CPT1 and UCP2 contents in OG compared to CG. There were no significant differences in GLUT1 content between groups; however, we observed a greater content of GLUT4 in OG. In addition, we found a higher content of AMPK in OG, while the content of pAMPK was similar between groups. However, the pAMPK/AMPK ratio was significantly lower in OG. These results suggest that overfeeding during lactation leads to obesity in adult life with changes in bioenergetics and ultrastructure of cardiomyocytes.

A subfamília Palaemoninae é um táxon bastante diverso, com alta variabilidade nas formas e estruturas de seus representantes. A grande diversidade de habitats e diferentes estratégias reprodutivas e comportamentais que esses crustáceos apresentam se reflete na sua elevada diversidade morfológica. O uso de ferramentas moleculares pode auxiliar em questões sobre a taxonomia, descendência e relações de parentesco para algumas espécies desse gênero, contribuindo pra a melhor compreensão de suas histórias evolutivas. Para a espécie Palaemon argentinus o uso de marcadores mitocondriais possibilitou a análise da homogeneidade genética da espécie, condizente com a hipótese de ocupação recente em ambientes dulcícolas. Complementarmente, foi demonstrada uma forte correspondência entre a estrutura populacional de P. argentinus e os eventos glaciais que moldaram a região de abrangência da espécie. Além disso, foram desenhados “primers” específicos para regiões microssatélites de P. argentinus que poderão ser utilizados em estudos futuros a respeito dos eventos que moldaram a história evolutiva recente desses camarões. A aplicação de ferramentas moleculares também resulta em importantes contribuições para o conhecimento sobre a evolução de Macrobrachium potiuna, para a qual foi verificado que a variação genética intraespecífica pode ser resultante de estruturação geográfica devido ao isolamento pela distância e às especializações de habitat, corroborando para a existência de espécies crípticas dentro de um grande “pool” de variação genética nesse grupo com taxonomia confusa.

Os lagartos do gênero Liolaemus WIEGMANN, 1834 pertencem à família Liolaemidae FROST et al., 2001. O gênero Liolaemus, com cerca de 200 espécies, inclui lagartos de moderado tamanho, principalmente lagartos pequenos, restritos à região austral da América do Sul. As regiões de ocorrência de Liolaemus incluem extensas áreas de areia eólica: as praias arenosas do Chile, Argentina, Uruguai e o sul do Brasil, assim como areias planas e sistemas de dunas dispersos por todo o interior da Argentina e Chile. No Brasil, o gênero é representado por três espécies: Liolaemus lutzae MERTENS, 1938; Liolaemus occipitalis BOULENGER, 1885 e Liolaemus arambarensis VERRASTRO et al., 2003. A espécie alvo deste estudo é Liolaemus occipitalis, que ocorre ao longo de todo o litoral do Rio Grande do Sul e litoral sul de Santa Catarina (até a ilha de Florianópolis). O objetivo do presente trabalho é apresentar um estudo filogeográfico e de diversidade morfológica desta espécie, com o intuito de aprofundar os conhecimentos sobre L. occipitalis e acerca da problemática de sua conservação, empregando uma análise molecular baseada em DNA mitocondrial, além de análises merística e morfométrica. Com esta finalidade, foram coletados exemplares de L. occipitalis (n = 78) em dez populações ao longo do gradiente geográfico da espécie. Os resultados demostraram que alguns caracteres merísticos e morfométricos apresentaram uma certa tendência de diferenciação entre populações do centro e do norte da distribuição geográfica da espécie; também um padrão mais abrangente de diferenciação entre populações do norte e do sul foi levemente indicado por alguns destes caracteres. Outros caracteres, porém, demonstraram-se variáveis de um modo geral não indicando nenhum padrão geográfico de diferenciação; e outros, ainda, apresentaram-se invariáveis ou com variabilidade não-significativa entre as populações analisadas. As análises moleculares indicaram uma estruturação entre as populações de L. occipitalis de Santa Catarina, o que não ocorreu nas populações do Rio Grande do Sul. Além disso, indicaram como provável centro de origem e dispersão da espécie a região do centro e/ou do sul de sua distribuição no Estado do Rio Grande do Sul. Verificou-se, também, a existência de fluxo gênico livre entre as populações estudadas, e a neutralidade das mutações apresentadas pelas seqüências analisadas.

Resumo não disponível

A fenilcetonúria (PKU) é caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo de fenilalanina (Phe) e seus metabólitos nos tecidos dos pacientes afetados. O dano neurológico é a marca da PKU e a Phe é considerada o principal agente neurotóxico nesta doença, cujos mecanismos de neurotoxicidade são pouco conhecidos. A alanina (Ala) é nutricionalmente um aminoácido não essencial. Ela é o principal aminoácido gliconeogênico porque pode originar piruvato e glicose, tendo sido, por este motivo, usada como um suplemento dietético em combinação com o hormônio de crescimento no tratamento de crianças subnutridas afetadas por algumas doenças metabólicas herdadas, para induzir o anabolismo. O principal objetivo do presente trabalho foi medir as atividades dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial (CCR) e succinato desidrogenase (SDH) no córtex cerebral de ratos Wistar sujeitos à hiperfenilalaninemia (HPA) quimicamente induzida e à administração crônica de Ala, desde o 6± até o 21± dia de vida pós-natal. Também investigamos o efeito in vitro da Phe e Ala nas atividades da SDH e CCR em córtex cerebral de ratos de 22 dias de idade. Os resultados mostraram uma redução nas atividades da SDH e complexos I + III no córtex cerebral de ratos sujeitos à HPA e também no córtex cerebral de ratos sujeitos à administração de Ala. Também verificamos que ambos: Phe e Ala inibiram in vitro a atividade dos complexos I + III por competição com NADH. Considerando a importância da SDH e CCR para a sustentação do suprimento energético para o cérebro, nossos resultados sugerem que o déficit energético possa contribuir para a neurotoxicidade da Phe em PKU. Em relação à Ala, ficou evidenciado que mais investigações serão necessárias antes de considerar a suplementação com Ala como uma terapia adjuvante válida para crianças com estas doenças.

Ctenomys flamarioni, comumente chamado tuco-tuco-das-dunas, é um roedor subterrâneo que habita a primeira linha de dunas costeiras do Estado do Rio Grande do Sul. Devido à pouca informação sobre este roedor e ao fato de ser uma espécie endêmica e ameaçada de extinção (principalmente pela redução e modificações antrópicas a que é submetido o ecossistema costeiro) o principal esforço desta tese foi centralizado na caracterização genética da variabilidade (e em como esta se encontra distribuída) em populações ao longo de toda a área de distribuição da espécie. Para isto foram utilizados dois tipos de marcadores moleculares, loci nucleares (nove loci de microssatélites) e seqüências de DNA mitocondrial (389 pares de bases da região controladora e 665 pares de bases do citocromo-b).Para três das dez populações amostradas foram incorporadas análises demográficas tanto a partir de dados de campo quanto a partir de dados genéticos através da utilização de loci de microssatélites. Para estas populações foram observadas diferenças significativas na proporção de machos e fêmeas (1:2, para os indivíduos adultos) e nas medidas utilizadas como estimativa de dimorfismo sexual (machos com maior peso e comprimento do corpo). Estas evidências sugerem um padrão de poliginia para C. flamarioni. As análises de estrutura genética indicaram forte diferenciação entre as populações, mas não a nível intrapopulacional. As estimativas de dispersão a partir dos dados genéticos utilizando índices de assignement (FST, FIS, mAIc, vAIc) e teste de AMOVA, mostraram diferenças não significativas entre machos e fêmeas, sugerindo dispersão de ambos os sexos. Todavia, a partir de estimativas de FST entre as populações mais próximas, foi inferida uma maior mobilidade dos machos. Quando a dispersão foi comparada entre aspopulações, esta foi significativamente maior para fêmeas, na população que habita a área mais preservada, e com menor densidade de indivíduos, em relação às outras duas. Para o total de populações, ambos os marcadores mostraram baixa variabilidade genética intrapopulacional, embora esta fosse mais crítica para o mtDNA. Para o conjunto de seqüências da região controladora mitocondrial (n = 89) analisadas foram obtidos sete haplótipos, enquanto que para as do citocromo-b (n = 45), cinco. Para os loci de microssatélites foi observado um número baixo de alelos por loci (entre três e oito). A variabilidade genética obtida foi divergente entre as nove populações estudadas, com valores de diversidade alélica que variaram de 1,1 a 3,6 e valores de heterozigosidade média de 0,21 a 0,70.As populações do sul da distribuição apresentaram os menores valores de variabilidade: a maioria dos loci nucleares em estado monomórfico e baixo número de haplotipos para os loci mitocondriais. O baixo polimorfismo obtido para os microssatélites não tem permitido o uso de testes estatísticos para detectar gargalos de garrafa. Todavia, para três das seis populações analisadas foi verificada a existência de reduções recentes do tamanho populacional. Os níveis de diferenciação genética entre populações foram maiores para os loci de microssatélites que para os de mtDNA, sugerindo assim baixo fluxo gênico atual e maior conectividade histórica entre as populações. Através dos testes de AMOVA, para os dois tipos de marcadores genéticos utilizados, foi observada correlação positiva entre a estruturação da variabilidade e a presença de duas das três possíveis barreiras geográficas ao fluxo gênico testadas. Os testes de Mantel evidenciaram um padrão de isolamento pela distância quando todas as populações foram consideradas na análise, mas não a nível regional.As árvores filogenéticas obtidas a partir dos diferentes métodos empregados evidenciaram relações pouco profundas entre os haplótipos, também sugeridas através das análises de Network. Estas últimas indicaram os haplótipos do norte da distribuição como os ancestrais, a partir dos quais teriam se originado os demais. A partir das diferentes abordagens utilizadas para testar a expansão demográfica (mismatch distribution, teste de Tajima, Fu, e modelo de crescimento exponencial), foi evidenciado sinal positivo, embora fraco, de expansão. O baixo poder dos testes empregados pode estar evidenciando, para a espécie, um padrão mais complexo de ocupação de sua atual área de distribuição, no qual flutuações do tamanho populacional, tanto históricas como contemporâneas, teriam um papel fundamental na redução da variabilidade genética. A partir de métodos semi e não-paramétricos foi estimado o tempo de divergência das principais linhagens filogenéticas de C. flamarioni (aproximadamente 90.000 anos) assim como uma taxa de mutação para o citocromo-b (μ = 0,019⁄ sítio ⁄ milhão de anos). Baseado nesta taxa de mutação, o tempo de ocorrência da principal expansão demográfica foi estimado em 60.000 anos. A partir dos resultados obtidos para os marcadores moleculares utilizados, e com o aporte de informação dos polimorfismos cariotípicos e protéicos reportados para a espécie, foi proposto: (1) duas Unidades Evolutivamente Significativas (ESUs) para C. flamarioni, a primeira formada pelas populações das regiões I, II e III, e a segunda incluindo as populações pertencentes à região IV; e (2) que cada uma das populações estudadas se constitua em uma unidade de manejo independente. / The tuco-tuco-das-dunas, Ctenomys flamarioni, is a subterranean rodent that inhabits the first line of the coastal dunes in State of Rio Grande do Sul. Due to the lack of information about this endemic rodent, and the threatened situation of the species (mainly as result of the anthropogenic changes over native coastal ecosystem), the effort of this thesis was focalized on the genetic variability characterization, and its distribution, over the total range of the species. With this aim two kinds of molecular markers were used: nine nuclear microsatellites loci and mitochondrial DNA sequences (389 base pairs of the control region and 665 base pairs of the cytochrome-b). In three of the ten populations sampled demographical analyses were done both from field and genetical data. For adult individuals significant differences were observed toward a female-biased sex-ratio (1 male:2 female) and sexual dimorphism (males heavier and larger than females). These evidences support a hypothesis of polygyny in C. flamarioni.Analysis of genetic structure revealed strong differentiation among populations, but no significant structure at the intrapopulation level. Non-significant values were obtained for the tested indexes, from assignment tests (FST, FIS, mAIc, vAIc) as well as from AMOVA, showing no evidence of sex-biased dispersal over populations. Nevertheless, for the nearest populations, non significant pairwise FST for males suggested a slightly male-biased dispersal pattern. In regard to inter-population differences, significant differences were clearer in the dispersal patterns among females with more dispersal for the population at the most preserved habitat than the two others. For all populations both microsatellites and mtDNA datasets showed low withinpopulation genetic variation but, it was more critical for mtDNA. For the mitochondrialcontrol-region set of sequences (n = 89) a total of seven haplotypes were obtained, and for the cytochrome-b dataset (n = 45) five haplotypes. The nine microsatellite loci surveyed were polymorphic with variable number of alleles by locus, ranging from three to seven. The same was observed with the genetic variability: the population mean diversity for varied between 1.1 to 3.6 alleles, and the mean observed heterozygosity across all loci ranged from 0.21 to 0.70. The three populations from the southern region of the range showed the lowest values of diversity: most of nuclear loci in monomorphic state and low number of haplotypes for the mtDNA datasets. The low number of polymorphic loci in these populations precluded the use of statistical test for bottleneck detection. However, for three of the six populations examined, a genetic signature of recent population size reduction was observed. Levels of genetic differentiation among populations were higher for microsatellites than mitochondrial loci, suggesting lower gene flow at the present than in the past. For both kinds of markers, the AMOVA analyses showed a substantial relationship between the genetic variation partitioning and two of the three hypothesized historical barriers to gene flow. Positive correlation between the genetic and geographic distances (isolation-by-distance pattern) was found when the total sampled range was considered but not at regional level. Phylogenetic tree analyses showed a shallow relationship between haplotypes, also suggested by the network approach. The northern haplotypes were suggested as the most ancient. Weak evidences of recent population expansion were obtained from the mismatch distribution, Tajima and Fu’s tests and using an exponential grow model. The lack ofpower of the applied tests may indicate by a complex pattern of the species occupation in its distribution range, in which historical and current reductions in population size possibly had a primary role in the reduction of genetic variability. Further analyses from nonparametric and semiparametric methods estimated a divergence time of haplotypic lineages of 90,000 years ago, in the Late Pleistocene, and a rate of cytochrome-b evolution μ = 1.9% per million years. Using this rate and assuming a stepwise scenario, the major increase in effective population size was estimated as occurring 60,000 years ago. Despite the lack of phylogeographic information to define Evolutionarily Significant Units (ESUs), based on the patterns of variation and divergence from the two kinds of markers and the previous allozyme and karyotype studies we propose, (1) two ESU,the first including north (I) and central (II and III) regions, and the second including all populations at the south of the distribution (IV); and (2) that each of the populations sampled should constitute an independent management unit.

Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2013-02-08T12:56:24Z No. of bitstreams: 1 renata_c_c_c_miranda_ioc_bcm_0028_2010.pdf: 1671883 bytes, checksum: 48fd7f615ea2df9b45686da5870f0202 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-02-08T12:56:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 renata_c_c_c_miranda_ioc_bcm_0028_2010.pdf: 1671883 bytes, checksum: 48fd7f615ea2df9b45686da5870f0202 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / A sepse e síndrome de disfunção orgânica múltipla representam um problema clínico de alta relevância, principalmente devido a sua grande incidência em pacientes críticos e aos seus altos índices de mortalidade. Apesar de medidas terapêuticas terem sido capazes de diminuir a mortalidade, observamos que muitos sobreviventes a sepse não são capazes de retomar suas atividades usuais. Estudos experimentais em animais são uma ferramenta importante para o estudo da fisiopatologia e da terapêutica da sepse. A encefalopatia associada à sepse (EAS) é muitas vezes a primeira disfunção orgânica a se manifestar. Clinicamente pode se apresentar como sonolência, agitação, delirium e coma. A presença da EAS está associado a maior mortalidade e pior prognóstico. Muitos pacientes apresentam dano cognitivo a médio e longo prazo que pode ser irreversível. Neste trabalho, padronizamos o modelo de injeção de fezes intraperitoneal em camundongos Swiss para facilitar o estudo da EAS. No modelo utilizado podemos caracterizar o choque com queda da pressão arterial 6 e 24h após a indução da sepse, disfunção metabólica caracterizada pelo aumento de lactato, disfunção hepática e renal com aumento de uréia, creatinina, TGO e TGP em 24h. A resposta inflamatória foi caracterizada pelo aumento de citocinas plasmáticas e no líquido peritoneal. IL-6 e MIP-1α aumentaram em 6h e 24h tanto no plasma quanto no líquido peritoneal. IL-1β, citocina de liberação precoce, teve aumento no plasma nas primeiras 6h. Leucócitos totais, mononucleares e neutrófilos diminuíram no plasma nas primeiras 6h com tendência a recuperação em 24h. No líquido peritoneal há um aumento na contagem de leucócitos, mononucleares e neutrófilos mais evidente em 24h. Dano cognitivo foi verificado em animais sobreviventes após 10 dias do insulto da sepse. Observamos aumento no consumo de oxigênio pelo córtex cerebral em 6h e seguido de queda em 24h. Houve aumento na captação de glicose pelo cérebro tanto em 6h e 24h. Aumento no dano oxidativo foi verificado a partir do aumento de TBARS em 6h nas regiões pré frontal, estriado, córtex e cerebelo. Concluímos que o modelo de injeção de fezes intraperitoneal é capaz de reproduzir a sepse clínica nos aspectos inflamatórios e de disfunção orgânica. O modelo também foi capaz de reproduzir a EAS com dano cognitivo, alterações no consumo de oxigênio pela mitocôndria, no metabolismo da glicose e de estresse oxidativo no cérebro. Mudanças no metabolismo energético, associado a aumento no consumo de glicose pelo córtex cerebral, além da resposta inflamatória propiciaram o estresse oxidativo. O conjunto de alterações observadas pode justificar o desenvolvimento de dano cognitivo persistente observado tanto neste modelo quanto na clínica. / Sepsis and multiple organ dysfunction syndrome represent a clinical problem of great importance, mainly due to its high incidence in critical patients and its high mortality. Although therapeutic measures have been able to reduce mortality, many sepsis survivors are not able to regain their usual activities. Experimental trials in animals are an important tool to study the pathophysiology and the treatment of sepsis. The sepsis associated encephalopathy is often the first organ dysfunction to arise. Clinically it may present as drowsiness, agitation, delirium and coma. The presence of sepsis associated encephalopathy is associated with increased mortality and worse prognosis. Many patients persist with cognitive impairment that may be irreversible. In this study, we established a model of abdominal sepsis in mice that facilitates the study of sepsis associated encephalopathy. From this model we detected cognitive impairment on the animals that survived sepsis, and acute changes related to sepsis associated encephalopathy as mitochondrial dysfunction, metabolic changes and oxidative damage. This model is characterized by the drop of blood pressure 6 and 24h after induction of sepsis, increased blood lactate and increased urea, creatinine, AST and ALT at 24 hours. Inflamation was characterized by increased inflammatory cytokines in plasma and peritoneal fluid. IL-6 and MIP-1α increased at 6h and 24h in both plasma and peritoneal fluid. IL-1β, an early release cytokine, was increased in plasma on the first 6h. Total leukocytes, mononuclear cells and neutrophils decreased in plasma during the first 6 hours with a tendency to recovery at 24 hours. Peritoneal fluid leukocytes, mononuclear cells and neutrophils increased markebly at 24h. We observed an increase in oxygen consumption by cerebral cortex in 6 h and then decreased at 24 hours. There was an increase in glucose uptake by the brain in both 6h and 24h. Oxidative damage was assessed by the increase of TBARS in 6h at the pre frontal regions, nucleus striatum, cortex and cerebellum. Cognitive impairment was observed in animals that survived 10 days after the insult of sepsis. We conclude that this model was able to reproduce inflammatory aspects and organ dysfunction observed in sepsis. The model was also able to reproduce sepsis associated encephalopathy and changes in cognitive damage, oxygen consumption, glucose metabolism and oxidative damage. Bioenergetic damage associated with high glucose uptake and inflammatory response leaded to oxidative damage. These acute changes may be responsible for the cognitive damage observed at this model and on clinical practice.