Glioblastome machen etwa 47% aller intrinsischen Tumore des zentralen Nervensystems aus. Sie sind durch ein aggressives und invasives Wachstumsverhalten gekennzeichnet. Als erster wegweisender Schritt zur Therapie der Glioblastome gilt die frühe und möglichst vollständige Resektion, gefolgt von einer simultanen Radiochemotherapie. Dennoch sind Tumorrezidive binnen weniger Monate die Regel und es bestehen trotz intensiver Forschung bis heute kaum alternative Behandlungsoptionen. Das Verständnis für die Pathogenese der Glioblastome erfuhr in den letzten Jahren tiefgreifende Änderungen. Nach Berücksichtigung der molekularen Marker in der WHO- Klassifikation, wurden Glioblastome in zwei molekulare Gruppen unterteilt: die IDH-Wildtyp (95% der Fälle) und die IDH-mutierten Glioblastome. IDH-Wildtyp Glioblastome treten bei Patienten mit einem medianen Alter von 64 Jahren auf und gehen mit einer ungünstigen Prognose (medianes Überleben 14,2 Monate) einher. IDH-mutierte Glioblastome kommen vor allem bei jüngeren Patienten mit einem medianen Alter von 45 Jahren vor und weisen eine vergleichsweise bessere Prognose mit einem medianen Überleben von 4-5 Jahren auf. Bei IDH-Wildtyp Glioblastomen wurden am häufigsten TERTp-, und PTEN-Mutationen sowie EGFR-Amplifikationen beschrieben. Dabei stellt die TERTp-Mutation die häufigste somatische Alteration im Genom der IDH-Wildtyp Glioblastome dar. Die oben genannten molekularen Marker bieten eine solide Grundlage für die molekulare Diagnose der IDH- Wildtyp Glioblastome. Dennoch bleibt die Frage unbeantwortet, warum IDH-Wildtyp Glioblastome vor allem bei älteren Patienten auftreten und jüngere Patienten eine bessere Prognose besitzen. Unter der Annahme, dass IDH-Wildtyp Glioblastome ein altersspezifisches molekulargenetisches Profil aufweisen, welches wohlmöglich die Prognose beeinflusst, wurden daher die Tumor- und korrespondierenden Blutproben von 55 Patienten mittels Whole Exome Sequencing untersucht. Nach Filterung der Rohdaten wurden verschiedene Mutationen und Copy Number Variations identifiziert. Zur Validierung der Methode wurde zum einen ein Literaturabgleich der detektierten Alterationen durchgeführt und zum anderen einzelne Kandidatengene mittels Sanger Sequenzierung manuell bestätigt. Insgesamt wurden 1841 Mutationen auf 1544 verschiedenen Genen detektiert. Obwohl viele der 1544 Mutationen ohne Relevanz für die Pathogenese waren, konnte eine enorme Vielzahl an verschiedenen Treibermutationen nachgewiesen werden. Die manuell sequenzierte TERTp-Mutation war mit 76,4% am häufigsten aufgetreten. Weitere Treibermutationen, beispielsweise EGFR, TP53, PTEN, PI3K-Gruppe, NF1 und PDGFRA zeigten mit der Literatur vergleichbare Prävalenzen und betonten die Validität der Methode. Die aufgetretenen Copy Number Variations belegten sowohl auf chromosomaler (Chromosom 7-Amplifikation und Chromosom 10-Deletion), als auch auf genspezifischer Ebene (EGFR-, CDK6-, MET-, PDGFRA-Amplifikation und CDKN2A/B-, und PTEN-Deletion) die molekulargenetischen Charakteristika des IDH-Wildtyp Glioblastoms. Über eine Clusterung dieser Alterationen und Gegenüberstellung mit klinischen Eigenschaften konnten die typischen, publizierten Glioblastomsignaturen (proneural, klassisch, mesenchymal) beschrieben und mit dem Erkrankungsalter in Verbindung gebracht werden. Besonders eindrücklich zeigten unsere Daten, übereinstimmend mit der Literatur, dass eine proneurale Signatur mit einem jungen Erkrankungsalter und günstiger Prognose assoziiert war. Unerwartet zeigte ein Patient mit pädiatrischer Signatur und hohem Erkrankungsalter dennoch ein überdurchschnittlich vorteilhaftes Überleben, verglichen mit seiner Altersgruppe. Unabhängig von molekulargenetischen Alterationen, war ein junges Erkrankungsalter alleinstehend mit einer günstigeren Prognose verknüpft. Für einzelne molekulargenetische Alterationen konnte kein Zusammenhang mit dem Erkrankungsalter oder dem (Progressionsfreien-) Überleben hergestellt werden. Ein alterspezifisches, prognosebeeinflussendes Mutationsmuster konnte demnach nicht identifiziert werden. Limitierend muss dabei die geringe Kohortengröße (n=55) angemerkt werden. Eine Vergrößerung der Studienpopulation war aufgrund der geringen Inzidenz von jungen Patienten mit IDH-Wildtyp Glioblastomen in diesem Studiendesign nicht möglich und könnte perspektivisch in einem multizentrischen Ansatz oder einer langen Akquirierungsphase verwirklicht werden. Die Fülle an identifizierten Treibermutationen verdeutlichte nichtsdestotrotz die große intratumorale Heterogenität des Glioblastoms. Zusätzlich ermöglichte die enorme diagnostische Tiefe der verwendeten Methode die Identifikation der bisher nicht im Zusammenhang mit dem IDH-Wildtyp Glioblastom beschriebenen TET1-Deletion. Obwohl die detaillierte Rolle der TET1-Deletion für das Glioblastom nicht verstanden ist, liefern unsere Daten einen vielversprechenden Hinweis, dass ein Funktionsverlust des TET1-Enzyms, in Kombination mit EGFR-Amplifikation oder Deletion von PTEN oder CDKN2A/B, eine Auswirkung auf die Pathogenese des IDH-Wildtyp Glioblastoms besitzt und die Prognose negativ beeinflusst. Zukünftige molekulargenetische Sequenzierungen sind indiziert, um die Rolle der TET1- Deletion zu bestätigen und darüber hinaus die Pathogenese des Glioblastoms auf molekulargenetischer Ebene noch besser zu verstehen und weitere individualisierte Therapieansätze abzuleiten.:Abkürzungsverzeichnis 5 1 Einleitung 8 1.1 Klinische Grundlagen des Glioblastoms 8 1.1.1 Epidemiologie/Ätiologie 8 1.1.2 Symptomatik und Diagnostik 9 1.1.3 Therapie 10 1.1.4 Prognose 12 1.2 Pathologie und Molekulargenetische Veränderungen des Glioblastoms 12 1.2.1 Treibergene 13 1.2.2 Subgruppen 17 1.3 Fragestellung 18 2 Materialien 19 3 Methoden 23 3.1 Patientenrekrutierung 23 3.1.1 Erweiterte Einschlusskriterien 25 3.1.2 Ausschlusskriterien 25 3.2 Kohortendesign 25 3.3 Klinische Daten 26 3.4 Materialgewinnung 27 3.4.1 Proben-Lagerung 27 3.4.2 DNA-Extraktion 27 3.5 Sanger Sequenzierung Prä-WES 29 3.5.1 Primer-Design 29 3.5.2 Polymerase Kettenreaktion 29 3.5.3 Elektrophorese 31 3.5.4 Aufreinigung PCR-Produkt 33 3.5.5 Sequenzierreaktion 35 3.6 WES 38 3.6.1 Datensatz 41 3.6.2 CNV-Analyse 42 3.7 Sanger Sequenzierung Validierung 42 3.8 Statistische Auswertung 45 4 Ergebnisse 47 4.1 Deskriptive klinisch-pathologische Beschreibung der Kohorte 47 4.1.1 Klinisch-pathologische Zusammenhänge 54 4.2 TERTp-Sequenzierung 58 4.3 Datensatz WES 58 4.3.1 Somatische Mutationen 59 4.3.2 CNV-Analyse 67 4.4 Altersbezogene molekulargenetische Unterschiede 74 4.5 Zusammenhang zwischen Genotyp und OS sowie PFS 77 4.5.1 Somatische Mutationen 77 4.5.2 CNV-Analyse 78 5 Diskussion 82 5.1 Klinische Charakteristika von Patienten mit IDH-Wildtyp Glioblastom 82 5.2 Der prognostische Stellenwert von Tumoreigenschaften 84 5.3 Molekulargenetisches Profil des IDH-Wildtyp Glioblastoms 85 5.3.1 Somatische Mutationen und Copy Number Variations 85 5.3.2 Chromosomale Aberrationen 94 5.4 10q21.3-Deletion 95 6 Zusammenfassung 97 6.1 Deutsch 97 6.2 Englisch 99 Anlagen 101 Darstellung zur Geschlechtsneutralität im geschriebenen Wort 101 Erklärung zur Eröffnung des Promotionsverfahren 102 Erklärung zur Einhaltung der gesetzlichen Vorgaben 104 Anhang 105 Literaturverzeichnis 113 Abbildungsverzeichnis 125 Tabellenverzeichnis 127 Danksagung 128 / Glioblastomas account for approximately 47% of all intrinsic central nervous tumors. They are characterized by an aggressive and invasive growth pattern. Early and, if possible, complete resection followed by simultaneous radiochemotherapy is crucial for treatment success. However, tumor recurrence within a few months are very frequent. Despite intensive research, there are still hardly any alternative treatment options. The understanding of the pathogenesis of glioblastomas underwent profound changes in recent years. After considering molecular markers in the WHO classification, glioblastomas have been divided into two molecular groups: IDH-wild-type (95% of cases) and IDH-mutated glioblastomas. IDH-wild-type glioblastomas occur in patients with a median age of 64 years and are associated with an unfavorable prognosis (median survival 14.2 months). On the other hand, IDH-mutated glioblastomas are mainly associated with young patients with a median age of 45 years and have a rather good prognosis with a median survival of 4-5 years. In IDH- wild-type glioblastomas, TERTp-, and PTEN-mutations as well as EGFR-amplifications have been described most frequently. Among them, TERTp-mutation represents the most frequent somatic alteration in the genome of IDH-wild-type glioblastomas. The above molecular markers provide a solid basis for molecular diagnosis of IDH-wild-type glioblastomas. To date, however, the reason why IDH-wild-type glioblastomas appear primarily in older patients with younger patients having a better prognosis remains unclear. Assuming that IDH-wild-type glioblastomas have an age-specific molecular signature with possible impact on the outcome, we analyzed tumor and corresponding blood samples from 55 patients by whole exome sequencing. After filtering the raw data, various mutations and copy number variations were identified. To validate the method, a literature review as well as Sanger Sequencing of selected candidate genes was performed. A total of 1841 mutations on 1544 different genes were detected. Although many mutations appeared to be background mutations with no relevance to pathogenesis, an enormous number of different driver mutations remained. The manually sequenced TERTp-mutation was the most abundant at 76.4%. Other driver mutations, for example EGFR, TP53, PTEN, PI3K group, NF1 and PDGFRA showed prevalence comparable to published data and emphasized the validity of the method. The copy number variations that occurred concurred previously described molecular genetic characteristics of IDH wild-type glioblastoma at both chromosomal (chromosome 7 amplification and chromosome 10 deletion) and gene-specific levels (EGFR-, CDK6-, MET-, PDGFRA-amplification and CDKN2A/B-, and PTEN-deletion). Via clustering of these alterations and juxtaposition with clinical features, the typical glioblastoma signatures (proneural, classic, mesenchymal) could be described and related to age of diagnosis. In line with the literature, our data showed that a proneural signature was associated with younger patients and favorable prognosis. Unexpectedly, a patient with a pediatric signature and high age of diagnosis, showed a survival above average compared with his age group. Regardless of molecular alterations, young age was an independent characteristic of favorable prognosis. For individual genetic alterations, no association with age of diagnosis or (progression-free) survival could be established. Thus, an age-specific mutational pattern could not be identified. The relatively small cohort size (n=55) must be noted as a limiting factor. An increase of the study population was not possible in this study design due to the low incidence of young patients with IDH wild-type glioblastoma and could be realized in a multicenter approach or a long acquisition phase in the future. Nevertheless, the abundance of identified driver mutations highlighted the large intratumoral heterogeneity of glioblastoma. In addition, the tremendous diagnostic depth of the method used enabled the identification of the TET1-deletion not previously described in the context of IDH wild-type glioblastoma. Although the detailed role of TET1-deletion in glioblastoma is not yet understood, our data provides promising evidence that loss of function of the TET1-enzyme in combination with EGFR-amplification or deletion of PTEN or CDKN2A/B has an impact on the pathogenesis of IDH wild-type glioblastoma and negatively affects prognosis. Future genetic sequencing is indicated to confirm the role of TET1-deletion and moreover to get further understanding of the genomic pathogenesis of glioblastoma with the aim to derive individualized therapeutic approaches.:Abkürzungsverzeichnis 5 1 Einleitung 8 1.1 Klinische Grundlagen des Glioblastoms 8 1.1.1 Epidemiologie/Ätiologie 8 1.1.2 Symptomatik und Diagnostik 9 1.1.3 Therapie 10 1.1.4 Prognose 12 1.2 Pathologie und Molekulargenetische Veränderungen des Glioblastoms 12 1.2.1 Treibergene 13 1.2.2 Subgruppen 17 1.3 Fragestellung 18 2 Materialien 19 3 Methoden 23 3.1 Patientenrekrutierung 23 3.1.1 Erweiterte Einschlusskriterien 25 3.1.2 Ausschlusskriterien 25 3.2 Kohortendesign 25 3.3 Klinische Daten 26 3.4 Materialgewinnung 27 3.4.1 Proben-Lagerung 27 3.4.2 DNA-Extraktion 27 3.5 Sanger Sequenzierung Prä-WES 29 3.5.1 Primer-Design 29 3.5.2 Polymerase Kettenreaktion 29 3.5.3 Elektrophorese 31 3.5.4 Aufreinigung PCR-Produkt 33 3.5.5 Sequenzierreaktion 35 3.6 WES 38 3.6.1 Datensatz 41 3.6.2 CNV-Analyse 42 3.7 Sanger Sequenzierung Validierung 42 3.8 Statistische Auswertung 45 4 Ergebnisse 47 4.1 Deskriptive klinisch-pathologische Beschreibung der Kohorte 47 4.1.1 Klinisch-pathologische Zusammenhänge 54 4.2 TERTp-Sequenzierung 58 4.3 Datensatz WES 58 4.3.1 Somatische Mutationen 59 4.3.2 CNV-Analyse 67 4.4 Altersbezogene molekulargenetische Unterschiede 74 4.5 Zusammenhang zwischen Genotyp und OS sowie PFS 77 4.5.1 Somatische Mutationen 77 4.5.2 CNV-Analyse 78 5 Diskussion 82 5.1 Klinische Charakteristika von Patienten mit IDH-Wildtyp Glioblastom 82 5.2 Der prognostische Stellenwert von Tumoreigenschaften 84 5.3 Molekulargenetisches Profil des IDH-Wildtyp Glioblastoms 85 5.3.1 Somatische Mutationen und Copy Number Variations 85 5.3.2 Chromosomale Aberrationen 94 5.4 10q21.3-Deletion 95 6 Zusammenfassung 97 6.1 Deutsch 97 6.2 Englisch 99 Anlagen 101 Darstellung zur Geschlechtsneutralität im geschriebenen Wort 101 Erklärung zur Eröffnung des Promotionsverfahren 102 Erklärung zur Einhaltung der gesetzlichen Vorgaben 104 Anhang 105 Literaturverzeichnis 113 Abbildungsverzeichnis 125 Tabellenverzeichnis 127 Danksagung 128

Acute leukemias (AL) comprise a heterogeneous group of hematologic malignancies, and individual patient responses to treatment can be difficult to predict. Monitoring of minimal residual disease (MRD) is thus very important and holds great potential for improving treatment strategies. Common MRD targets include immunoglobulin heavy chain or T-cell receptor gene rearrangements, recurrent cytogenetic abnormalities and mutations in important hematological genes. Whereas in the majority of adult acute lymphoblastic leukemia patients a suitable MRD target can be identified, in adult acute myeloid leukemia patients well-characterized targets are found in only half of cases. The identification of new specific molecular markers of leukemic blasts for MRD assessment, particularly in AML patients, is therefore highly desirable. Our aim was to develop a flexible strategy for mapping of cytogenetically identified unique clone-specific abnormalities down to the single nucleotide level and, based on the sequence, design a specific real-time PCR assay for MRD assessment in AL patients without any previously described MRD marker. Using a combination of cytogenetic (chromosome banding, chromosome microdissection), molecular cytogenetic (mFISH, mBAND) and molecular biological (next- generation sequencing, long-range...

Um componente considerado crítico para o manejo bem sucedido de populações silvestres é a manutenção da variação genética. No intuito de avaliar a magnitude e a distribuição da variabilidade genética existente em populações de Caiman latirostris, nove populações distribuídas ao longo do eixo latitudinal da distribuição da espécie no Brasil e uma população em cativeiro foram estudadas com auxílio de onze locos microssatélites. A diversidade gênica média (He=h) e a heterozigosidade média observada (Ho) apresentaram valores elevados, 0,628 e 0,567, respectivamente, denotando existência de elevada variabilidade genética para esta espécie nas regiões de estudo. A população paulista mesmo estando na zona intermediária de distribuição geográfica no Brasil não possui a maior variabilidade genética. O valor FST estimado foi 0,270 e o RST foi 0,342. Ambas as medidas de diferenciação entre as populações foram significativas (P<0,05). As altas estimativas de FST e RST sugerem a ausência ou fluxo gênico restrito entre essas populações, exceção feita entre as populações de Natal (RN) e João Pessoa (PB), onde não houve diferenciação significativa entre as populações, sugerindo assim que há fluxo gênico entre elas, fato confirmado pelo coeficiente de parentesco. Pôde-se concluir neste trabalho que a distância genética entre a população do litoral é afetada pela existência da Serra do Mar como barreira geográfica pelo fato desta população apresentar as maiores diferenciações genéticas e não se agrupar a nenhuma população pelo método de agrupamento UPGMA, mesmo estando próxima das populações paulista. A distância genética entre as populações parece não acompanhar a distância geográfica, em termos de gradiente latitudinal (r=0,206). Entretanto quando retiramos a população da Ilha do Cardoso esta correlação aumenta significativamente (r=0,540), indicando haver um certo padrão espacial da variabilidade genética entre as populações. O coeficiente médio de parentesco foi baixo entre e dentro das populações estudadas. Com estes resultados podemos começar a entender a dinâmica e estrutura social de populações de Caiman latirostris, e quanto mais se compreende sobre a biologia destes animais mais precisa serão decisões visando condições que permitam a existência continua da espécie. / A component considered critical for the managment well succeed of wild populations it is the maintenance of genetic variation. In the intention of evaluating the extend and the distribution of the existent genetic variability in populations of Caiman latirostris, nine populations distributed along the latitudinal axis of the distribution of the species in Brazil and a population in captivity they were studied with aid of eleven locos microsatellite. The genic mean diversity (He=h) and the observed mean heterozygosity (Ho) across all loci for all populations ranged from 0,628 and 0,567, respectively, denoting existence high genetic variability. The population from São Paulo being in the intermediate zone of geographical distribution in Brazil doesn't possess the largest genetic variability. The value dear FST was 0,270 and RST it was 0,342. Both differentiation measures among the populations were significant (P < 0,05). The higher estimates of FST and RST suggested a absence or low gene flow among those populations, exception done between the populations of Natal (RN) and João Pessoa (PB), where there was not significant differentiation among the populations, suggesting a gene flow pattern among them, fact confirmed by the related coefficient. It could be concluded in this work that the genetic distance among the population of the coast is affected by the existence of the Mountain of the Sea as geographical barrier for the fact of this population to present the largest genetic differentiations and not to group the any population for the grouping method UPGMA, same being close of the populations from São Paulo. The genetic distance among the populations seems not to accompany the geographical distance, in terms of latitudinal gradient (r=0,206). However when we removed the population of Cardoso's Island this correlation it increases significantly (r= 0,540), indicating there to be a certain space pattern of the genetic variability among the populations. The medium coefficient of related was low among and inside of the studied populations. With these results we can begin to understand the dynamics and it structures social of populations of Caiman latirostris.

Dados coletados de experimentos de melhoramento geralmente contêm observações fenotípicas para vários caracteres avaliados em múltiplos ambientes. Especificamente para cana-de-açúcar, medidas repetidas são obtidas para cana-planta e uma ou mais socas. Tal cenário presta-se naturalmente ao uso de modelos mistos para modelagem de variâncias genéticas heterogêneas e correlações entre caracteres, locais e cortes. Essa abordagem também nos permite incluir informações de marcadores moleculares, auxiliando no entendimento da arquitetura genética dos caracteres quantitativos através do mapeamento de QTLs. Este trabalho teve como objetivo detectar QTLs e interação QTL por ambiente pelo método do Mapeamento de Múltiplos Intervalos, o qual também permite a inclusão de epistasia no processo de busca. Nossa população de mapeamento foi composta por 100 indivíduos oriundos de um cruzamento biparental entre os cultivares brasileiros pré-comerciais SP80-180 e SP80-4966, avaliados em duas localidades (Piracicaba e Jaú, SP, Brasil) e três anos (2004 a 2006) para percentual de fibra, conteúdo de sacarose (POL) e toneladas de cana por hectare (TCH). Um mapa genético com 96 grupos de ligação cobrindo 2468,14 cM já estava disponível para esse cruzamento. O modelo fenotípico selecionado conteve matrizes de covariância separadas para caracteres e ambientes, o que resultou em um modelo mais parcimonioso com bom ajuste aos dados. Foram detectados 13 QTLs com efeitos principais e 8 interações epistáticas, cada um deles exibindo interação QTL por local, QTL por corte ou a interação tripla. Assim, nenhum QTL apresentou efeitos estáveis ao longo de todas as combinações de ambientes. No total, 13 dos 21 efeitos apresentaram algum grau de pleiotropia, afetando pelo menos dois dos três caracteres. Além disso, esses QTLs sempre afetaram os caracteres fibra e TCH na mesma direção, enquanto que POL foi afetado no sentido oposto. Não foi observada evidência em favor da hipótese de QTLs ligados em detrimento da hipótese de QTL pleiotrópico para qualquer das posições genômicas detectadas. Esses resultados fornecem valiosas informações sobre a base genética da variação quantitativa em cana-de-açúcar e sobre a relação genética entre caracteres. / Data collected from breeding trials usually comprise phenotypic observations for various traits evaluated at multiple test environments. Specifically for sugarcane, repeated measures are obtained for plant crop and one or more ratoons. Such scenario naturally lends itself to the use of mixed models for modeling heterogeneous genetic variances and correlations between traits, locations and harvests. This modeling approach also enables us to include molecular marker information, aiding in understanding the genetic architecture of quantitative traits through QTL mapping. Our work was aimed at detecting QTL and QTL by environment interaction by the Multiple Interval Mapping method, which also allows the inclusion of epistasis in the search process. Our mapping population was composed of 100 individuals derived from a biparental cross between the Brazilian pre-commercial cultivars SP80-180 and SP80-4966, evaluated at two locations (Piracicaba and Jaú, SP, Brazil) and three harvest years (2004 through 2006) for fiber content, sugar content (POL) and tonnes of cane per hectare (TCH). A genetic linkage map with 96 linkage groups covering 2468.14 cM was already available for this cross. The selected phenotypic model contained separate covariance matrices for traits and environments, which resulted in a more parsimonious model with good fit to the data. We detected 13 QTL with main effects and 8 epistatic interactions, each exhibiting QTL by location, QTL by harvest or the three-way interaction. Thus, no QTL displayed stable effects across all environment combinations. Overall, 13 of the 21 effects presented some degree of pleiotropy, affecting at least two of the three traits. Furthermore, these QTL always affected fiber and TCH in the same direction, while POL was affected in the opposite way. There was no evidence in favor of the linked QTL over the pleiotropic QTL hypothesis for any of the detected genome positions. These results give valuable insights about the genetic basis of quantitative variation in sugarcane and about the genetic relation between traits.

Dando continuidade aos trabalhos realizados no Departamento de Genética da ESALQ/USP, referentes aos estudos de mapeamento de genes de resistência à bacteriose em maracujá-amarelo, foram realizados dois novos experimentos de inoculação envolvendo uma população obtida a partir do cruzamento entre ‘IAPAR-06’ e ‘IAPAR- 123’, ambos acessos pertencentes ao Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR). Essa população F1, composta de 160 indivíduos, foi utilizada para a construção dos mapas de ligação com base em marcadores AFLP, utilizando tanto marcas com segregação 1:1 quanto marcas bi-parentais 3:1, as quais serviram de ponte para a integração dos mapas construídos para cada genitor. Para a avaliação fenotípica, 104 indivíduos, além dos genitores, foram inoculados por dois isolados de Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae, em dois experimentos distintos. Foi constatado que a resistência à bacteriose é poligênica e há, pelo menos, três locos quantitativos (QRL) envolvidos. Testes quanto à metodologia de mensuração das lesões foliares também foram realizados. Foi verificado que, independente da metodologia de avaliação fenotípica, os resultados foram equivalentes quanto ao mapeamento de QRL. De acordo com as diferentes datas de avaliação e/ou idades das folhas, QRL com diferentes efeitos foram detectados ou, até mesmo, QRL foram alocados em diferentes grupos de ligação. Os dados oriundos do presente estudo corroboram resultados obtidos em trabalho anterior envolvendo a mesma população de mapeamento. A utilização de um segundo isolado bacteriano possibilitou a detecção de um novo QRL. As limitações do uso de marcadores dominantes para fins de mapeamento de locos quantitativos são discutidas. / Continuing the studies carried out in the Genetics Department at ESALQ/USP concerning the mapping of resistance genes for the bacterial disease in yellow passion fruit, two new assays were conducted involving a population derived from a cross between ‘IAPAR-06’ and ‘IAPAR-123’, both accessions belonging to Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR). This F1 population, composed of 160 individuals, was used for constructing genetic maps based on AFLP markers, using both markers with segregation 1:1 and with biparental 3:1, which act as a bridge to integrate the maps constructed for each of the parents. For phenotypic evaluation, 104 individuals plus the parents were inoculated with two isolates of Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae in two different assays. It was seen that the resistance to bacterial disease is polygenic, and there are at least three quantitative loci (QRL) involved. Tests regarding methods for measuring leaf lesions were also carried out. It was seen that, irrespective of the methodology used for phenotypic evaluation, the results were identical for QRL mapping. Different evaluation times and/or leaf ages resulted in detection of QRL with different effects, and even QRL allocated on different linkage groups. Data derived from the present study corroborate results obtained previously involving the same mapping population. The use of a second bacterial isolate did allow a new QRL to be detected. The limitations of using of dominant markers for mapping quantitative loci are discussed.

Reprodutibilidade, sensibilidade e controle de qualidade são essenciais em identificação humana pelos ácidos nucléicos exigindo uma referência que seja estável a temperatura ambiente e que monitore todo procedimento de manipulação da amostra. O estudo se propõe a construção de referências alélicas com plasmídeos recombinantes de 13 loci de STRs recomendados pelo CODIS-CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51 e D21S11. Os ácidos nucléicos foram extraídos de amostras de sangue ou saliva, com caracterização das STRs pela PCR e análise de fragmento. Os fragmentos dos diferentes alelos foram clonados em plasmídeos pGEM-T. Estes clones foram avaliados, utilizando-se dois sistemas comerciais. Obteve-se amplificações dos alelos das STRs D3S1358, TH01, D21S11, D5S818, D13S317 e VWA pelo PowerPlex&#174;16 e D18S51, D21S11, D3S1358, D5S8181, D8S1179, TH01 e TPOX pelo AmpFLSTR&#174;IdentifilerTM. A referência alélica com plasmídeos recombinantes foi construída e devidamente caracterizada demonstrando o seu potencial de aplicação como controle positivo. / Reproducibility, sensibility and quality control are essentials in DNA human identification, requiring a stabile ambient temperature reference that monitors all procedures of samples manipulation. This study propose allelic reference construction, that will be useful as externai positive control for 13 CODIS STRs - CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, e D21S11. The nucleic acid was extracted from saliva or blood samples and enabling PCR-based typing and fragment analysis. Differents alleles founded were cloned into pGEM-T easy vector plasmids. The clones were analyzed using two commercial systems. The STRs D3S1358, TH01, D21S11, D5S818, D13S317 and VWA were amplified by PowerPlex&#174;16, and D18S51, D21S11, D3S1358, D5S8181, D8S1179, TH01 and TPOX by AmpFLSTR&#174;IdentifilerTM. The allelic reference with recombinants plasmids was constructed and. duly characterized, and the positive control potential application was demonstrated.

Há tempos os melhoristas tentam prever as performances de híbridos a partir de informações das suas linhagens parentais. A aplicação mais promissora dos marcadores moleculares no melhoramento de plantas é sua utilização na seleção. A produção de grãos é o caráter de maior interesse para os melhoristas e caracteriza-se por ser controlado por grande número de locos, sofrendo acentuado efeito ambiental. Ela é função direta dos seus componentes e, como esses caracteres são correlacionados com a produção, eles podem ser utilizados na seleção indireta para aumentar a produção. Os objetivos desse estudo foram: estimar coeficientes de correlação entre linhagens S1 de milho e seus testecrosses; mapear QTL e verificar a congruência destes nas linhagens e nos testecrosses; obter médias preditas das linhagens com base em informações de marcadores moleculares; e verificar a possibilidade de selecionar testecrosses com base nas médias preditas das linhagens, para diversos caracteres. Foram avaliadas 256 linhagens S1 e 512 testecrosses dessas linhagens com dois testadores, em experimentos em látices simples 16x16 em seis ambientes. Foram avaliados os caracteres produção de grãos, acamamento e quebramento, florescimento masculino e feminino, intervalo entre florescimentos, altura da planta e da espiga, posição relativa da espiga, e os componentes da produção nas linhagens. Para o mapeamento de QTL nas linhagens e nos testecrosses foi utilizado um mapa genético com 177 marcadores microssatélites e o modelo de mapeamento por intervalo composto expandido para múltiplos ambientes. Além das médias fenotípicas das duas gerações, foram obtidas médias preditas das linhagens com base nos efeitos dos QTL e também com base em todos os marcadores do genoma. Os coeficientes de correlação entre as médias fenotípicas das linhagens e dos testecrosses variaram de reduzidos para produção de grãos até moderados para os caracteres de ciclo e estatura. Considerando os componentes da produção das linhagens e a produção dos testecrosses, a maioria das correlações não foram significativas e, quando foram, as magnitudes destas foram baixas. A congruência de QTL detectados nas linhagens e nos testecrosses foi pequena para todos os caracteres considerados. As correlações entre as médias preditas das linhagens e as médias fenotípicas dos testecrosses apresentaram resultados semelhantes àqueles obtidos considerando as médias fenotípicas das linhagens. As maiores coincidências de linhagens S1 e testecrosses superiores selecionados foram observadas para os caracteres de ciclo e estatura e, as menores, ocorreram para produção de grãos e seus componentes. Portanto, mesmo utilizando-se informações de marcadores moleculares, só é possível prever a performance de testecrosses a partir de informações das linhagens para os caracteres menos complexos e com reduzido efeito de dominância, além de não ser possível praticar seleção indireta para a produção dos testecrosses baseada nos componentes das linhagens. Nestes casos, as informações dos marcadores devem ser obtidas diretamente nos testecrosses. Mesmo utilizando informações de marcadores, a seleção pode ser iniciada durante a obtenção das linhagens para alguns caracteres mas, para outros, a seleção deve ser realizada pela avaliação das linhagens em cruzamentos. / For a long time breeders have been trying to predict the performance of hybrids based on the performance from their parental lines. The most promising application of molecular markers in plant breeding is their use in selection. Grain yield is the most important trait to breeders and it is controlled by a large number of loci undergoing accentuated environmental effect. It is a direct function of its components and as these traits are correlated with yield, they can be used for indirect selection to increase grain yield. The objectives of this research were to estimate correlations between S1 maize lines and their testcrosses; map QTL and verify its congruence in lines and testcrosses; predict means of the lines by using information from molecular markers; and verify the possibility to select testecrosses from the predict means of the lines for several traits. Two-hundred and fifty six S1 lines and five-hundred and twelve testcrosses of these lines with two testers were evaluated in simple lattice 16x16 design in six environments. The traits analyzed were grain yield, plant lodging, days to anthesis, days to silking, anthesis-silking interval, plant and ear height, ear placement, and the yield components in the lines. A genetic map with 177 microsatellite markers and the multiple-environmental composite interval mapping model were used to map QTL in the lines and in their testcrosses. In addition to the phenotypic means of the two generations, the predicted means of the lines based on QTL effects and based in all markers were obtained. The correlation coefficients between the phenotypic means of the lines and of the testcrosses ranged from low to grain yield to moderate for cycle and stature traits. Considering the grain yield components of the lines and yield of the testcrosses, most of the correlations were not significant and, when they were, their magnitudes were low. The congruence of QTL detected in the lines and testcrosses were small for all traits. The correlations between the predict means of the lines and the phenotypic means of the testcrosses showed similar results with those obtained by the lines phenotypic means. The highest coincidences of selected superior S1 lines and testcrosses were observed for cycle and stature traits and the lowest for grain yield and its components. Therefore, even by using molecular markers information, it is only possible to predict the testcrosses performance from the lines information to less complex traits and with small dominance effects, as well as not being possible to carry out indirect selection to testcrosses yield based on the components of the lines. For these cases, the markers information must be obtained directly from the testcrosses. Even by using markers information, selection may be initiated during lines development for some traits, but to others, the selection must be made by evaluation of the lines in crosses.

A couve-flor está entre as folhosas mais produzidas na região do Cinturão Verde de São Paulo. A planta apresenta alto valor nutricional para os consumidores e relevante importância econômica e social para os agricultores. Em campos comerciais, têm sido observadas plantas exibindo sintomas de enfezamento e deformação da inflorescência, além da necrose dos vasos condutores. A doença foi denominada de enfezamento e a sua incidência e severidade têm se tornado mais intensas nos últimos anos, afetando a produção e levando ao abandono do cultivo. O quadro sintomatológico levantou a suspeita de que a doença pudesse estar sendo causada por fitoplasmas. Desta forma, este trabalho teve como objetivos detectar e identificar os fitoplasmas associados às plantas doentes de couve-flor, demonstrar a sua patogenicidade, buscar possíveis insetos vetores do agente patogênico e analisar a distribuição espacial da doença no campo. Amostras de plantas coletadas na região do Cinturão Verde ou enviadas de outras localidades tiveram o DNA total extraído e submetido a reações de PCR. A amplificação de fragmentos genômicos de 1,2 kb evidenciaram a presença de fitoplasmas nos tecidos de 66% das plantas sintomáticas. A detecção de fitoplasmas em plantas assintomáticas revelou a ocorrência de infecção latente e que plantas sem sintomas aparentes podem ser portadoras do patógeno. O emprego de PCR com primers específicos, análises convencionais e virtuais de RFLP e análise filogenética permitiram a identificação de fitoplasmas afiliados aos grupos 16SrIII-J, 16SrXIII e 16SrXV-A, com predominância para a ocorrência do grupo 16SrIII. Secções histológicas feitas à mão da região vascular de plantas de couve-flor doentes observadas em microscópio de luz revelaram que a região do floema apresentava-se escurecido e com início de degeneração celular. Fitoplasmas do grupo 16SrXIII foram encontrados em cigarrinhas da espécie Balclutha hebe coletadas em campo cultivado com couve-flor. Estes insetos foram utilizados em experimentos de transmissão e foram capazes de inocular fitoplasmas em plantas sadias de couve-flor e vinca. A transmissão também ocorreu a partir de plantas doentes de couve-flor para plantas sadias de vinca, através do emprego da planta parasita cuscuta. Análise epidemiológica da doença foi feita em dez campos de cultivo de couve-flor, localizados no município de Sorocaba-SP. Análises do índice de dispersão, lei de Taylor modificada e áreas isopatas evidenciaram que plantas de couveflor com sintomas de enfezamento encontraram-se agregadas no campo, e que os focos da doença tinham início nos bordos da cultura. O presente trabalho demonstrou que o enfezamento da couve-flor está associado aos fitoplasmas, os quais podem estar sendo transmitidos por cigarrinhas, sendo que, em termos epidemiológicos, a doença tem padrão agregado de distribuição no campo. / Cauliflower is among the most produced vegetable in the region of the Green Belt of Sao Paulo State. It has high nutritional value and relevant social and economic importance for farmers. In commercial fields, it has been observed plants exhibiting symptoms of stunting, deformation of the inflorescence and conductive vessel necrosis. The disease was named cauliflower stunt and its incidence and severity have become more intense in the past years, the production is being affected and the field is abandoned by the growers. The symptomatology raised the suspect that the disease could be caused by phytoplasmas. Thus, this study aimed to detect and identify phytoplasmas associated to diseased cauliflowers, demonstrate its pathogenicity, look for possible insect vectors of the pathogen and analyse the spatial distributions of disease in the field. Plant samples collected in the region of the green belt or sent from other locations had the total DNA extracted and subjected to PCR reactions. Amplification of genomic fragments of 1.2 kb revealed the presence of phytoplasmas in 66% of the symptomatic plants. The detection of phytoplasmas in asymptomatic plants revealed the occurrence of latent infection and that plants without visible symptoms may be infected. The use of specific primers, conventional and virtual RFLP analysis and phylogenetic analysis allowed the identification of phytoplasmas affiliated to 16SrIII-J, 16SrXIII and 16SrXV-A groups, and predominantly the occurrence of 16SrIII group. Histological sections made by hand of the vascular region of symptomatic cauliflower were observed under light microscope and revealed that the phloem was darkened and with beginning of cellular degeneration. The 16SrXIII phytoplasma was found in Balclutha hebe from cauliflower field. These insects were used in experiments and were able to transmit phytoplasmas to healthy cauliflower and periwinkle. The transmission also occurred from diseased cauliflower to healthy periwinkle through the parasitic plant dodder. Epidemiological analysis of the disease was made in ten plots of cauliflower, located in Sorocaba, SP. Dispersion index, modified Taylors law and isopath areas analysis showed that cauliflower plants with symptoms of stunting were aggregated in field and initial foci were at the edge of the plot. This study demonstrated that cauliflower stunt is associated with phytoplasmas, that may be being transmitted by insects (Homoptera) and, in epidemiological terms, the diseased plants show aggregated pattern of distribution in the field.

Os programas de melhoramento da cana-de-açúcar demandam aproximadamente 12 anos para a obtenção de um novo cultivar. Assim, os marcadores moleculares podem ser usados como uma ferramenta valiosa, uma vez que possibilitamo estudo da arquitetura genética de caracteres quantitativos, ajudando a reduzir este tempo. Embora a cana-de-açúcar seja uma cultura perene, para a qual o desempenho genotípico é avaliado através de ensaios estabelecidos ao longo de diferentes locais e cortes, a maior parte dos estudos de mapeamento de QTLs ignora a existência de interação entre QTLs, corte e local (QTL × H × L). Neste contexto, o presente trabalho apresenta uma estratégia que foi desenvolvida para a detecção de QTLs em cana-de-açúcar, com base em modelos mistos e mapeamento por intervalo, considerando diferentes estruturas de (co)variância que permitem supor heterogeneidade de variâncias genéticas e existência de correlações genéticas entre cortes e locais. A metodologia de modelos mistos foi aplicada aos dados de uma população segregante obtida a partir do cruzamento entre dois cultivares pré-comerciais de cana-de-açúcar, constituída por 100 indivíduos avaliados em dois locais (Piracicaba e Jaú, SP, Brasil) e em três cortes para produção (toneladas de cana por hectare, TCH), produção de açúcar (toneladas de Pol por hectare, TPH), porcentagem de fibra e Pol (teor de sacarose). A análise fenotípica resultou na seleção do modelo não-estruturado, que assume heterogeneidade de variâncias e existência de correlação genética específica para cada combinação de corte e local, para todos os caracteres avaliados. Na análise de mapeamento, foram detectados 50 QTLs, incluindo 14 QTLs para TCH, 15 para TSH, 10 para Pol e 11 para Fibra. Além disso, os resultados mostram que os efeitos das interações entre QTL e corte (QTL × H), QTL e local (QTL × L) e QTL, corte e local (QTL × H × L) foram importantes para todos os caracteres avaliados. Do total de QTLs identificados, 33 (66 %) apresentaram algum tipo de interação e apenas 17 (34 %) mostraram mesmo efeito entre as diferentes combinações de corte e local. Estes resultados fornecem informações importantes para o entendimento da base genética de caracteres quantitativos relacionados com produção e teor de sacarose em cana-de-açúcar. / Sugarcane breeding programs take at least twelve years to develop new commercial cultivars. Thus, molecular markers can be used as a valuable tool since they offer the possibility to study the genetic architecture of quantitative traits, helping to reduce this time. Although the performance of genotypes in sugarcane breeding programs has been evaluated across a range of locations and harvest years, since sugarcane is a perennial crop, many of the QTL detection methods ignore QTL by harvest by location interaction (QTL × H × L). In this work, a strategy for QTL detection in sugarcane was developed, based on mixed models and interval mapping, considering different (co)variance structures for the modeling of heterogeneous genetic variances and genetic correlations between harvests and locations. The mixed model approach was applied to a data set provided by a segregating population developed from a cross between two pre-commercial Brazilian cultivars, consisted of 100 individuals planted in two locations in 2003 (Piracicaba and Jaú, SP, Brazil) and evaluated in the first, second and third subsequent harvest years for cane yield (tonnes of cane per hectare, TCH), sugar yield (tonnes of sugar per hectare, TSH), fiber percent and Pol (sucrose content). Phenotypic analysis provided the selection of the unstructured model, which allows the assumption of heterogeneity of variance and presence of a specific genetic correlation for each combination of harvest and location. In the QTL mapping procedure, 50 QTLs were detected, including 14 QTLs for TCH, 15 for TSH, 10 for Pol and 11 for Fiber. In addition, the results show that QTL by harvest (QTL × H), QTL by location (QTL × L) and QTL by harvest by location (QTL × H × L) interaction effects were important for all evaluated traits. From the total of QTLs identified, 33 (66%) had some interaction and only 17 (34%) showed stable effects across the different combinations of harvest and location. These results can provide useful information to understand the genetic control of complex traits related with sugarcane production and sucrose content.

Infecção do Trato Urinário (ITU) é o segundo tipo de infecção bacteriana mais comum em crianças. Nesse estudo amostras de urina de 6012 pacientes pediátricos foram analisadas, a prevalência de ITU foi determinada, os uropatógenos foram identificados e o perfil antimicrobiano dos mesmos foi determinado. Os resultados mostraram que a prevalência de ITU varia de acordo com o sexo e a idade do paciente. Bactérias Gram-negativas foram responsáveis por 89 % de todos os casos de ITU e Escherichia coli foi a espécie mais prevalente. Os uropatógenos foram resistentes a ampicilina 63 %, a nitrofurantoina 37 % e ao trimethoprim-sulfamethoxazole 28 %. Todavia, 99 % deles foram sensíveis a cefalexina e 96 % ao cloranfenicol. Resultados obtidos com a caracterização de 90 isolados de E. coli, mostraram que todas as amostras foram positivas para os marcadores fimA e fimH, 53 % para pap, 32 % para sfa, 10 % para o marcador genético da toxina pic e 29 % foram capazes de produzir hemolisina-a. Esses isolados se distribuíram entre os grupos filogenéticos da seguinte maneira: B2 42 %, D 25 %, A 21 % e B1 11 %. Dessas amostras 19 % não foram tipáveis (ONT), 15,56 % pertenceram ao sorogrupo O2 e 12,22 % aos sorogrupos O6 e OR. A maioria dos isolados de E. coli aderiu às células epiteliais, poliestireno e PVC. / Urinary Tract Infection (UTI) is the second most common type of bacterial infection in children. In this study, 6012 urine samples from pediatric patients were analyzed, the prevalence of UTI was determined, the uropathogens were identified and their antimicrobial profile was determined. The results have shown that the prevalence of UTI varies according to the sex and age of the patient. Gram negative bacteria were responsible for 89 % of all cases of UTI and E. coli was the most prevalent species. The uropathogens were resistant to: ampicillin 63 %, nitrofurantoin 37 % and trimethoprim-sulfamethoxazole 28 %. However, 99 % of them were sensitive to cephalexin and 96 % to chloramphenicol. Results obtained with the characterization of 90 isolates of E. coli showed that all of them were positive for fimA and fimH, 53 % were positive for pap, 32 % were positive for sfa, 10 % were positive for the genetic marker of pic and 29 % were able to produce hemolysin-a. These isolates were distributed between the phylogenetic groups as follows: B2 42 %, D 25 %, A 21 % and B1 11 %. Nineteen percent of these samples were untypeable (ONT), 15.56 % belonged to O2 serogroup and 12,22 % belonged to the O6 and OR serogroups. Most E. coli isolates were able to adhere to epithelial cells, polystyrene and PVC.