Made available in DSpace on 2016-08-11T14:41:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 KalidiaFLC_DISSERT.pdf: 856483 bytes, checksum: e43d2e204d51ed594479cbaaac37b82f (MD5) Previous issue date: 2014-03-21 / Visceral Leishmaniasis (VL) is a zoonosis in which dogs are reservoir in the urban environment and its diagnosis consists in one of the main strategies to control the disease in Brazil. Nevertheless, another important approach for the control and prevention of VL is through the awareness of the population about the disease, which could be promoted with health education practices by health professionals like Agentes Comunitários de Saúde (ACS) (Health Agents for the Community). Thus, the research study aim is to evaluate the population in the riverside areas that are susceptible to VL, likewise the residents that own dogs in their homes and the ACS that work in these areas. The study also aims to evaluate if the Agents includes measures to prevent the disease in their work duty and if the administration of the city of Mossoró, Rio Grande do Norte enables them with vocational training activities and if they facilitate these professionals with good work condition. For that, a research study was made with 79 riverside residents and 42 ACS. For both riverside residents and ACS, a semi-structured interview about the disease and prevention of VL were performed, the ACS were also questioned about surveillance and control activities developed and about professional training. Additionally, 88 dogs residing in households were included in the survey and were tested for canine VL (CVL) by Polymerase Chain Reaction. The data was analyzed by Qui-quadrado e Exato de Fisher tests (p <0.05). 59% of the riverine population which were interviewed knew how the disease was transmitted, but were unaware that sand-fly was a vector of VL and 58% were unaware of the preventive measures of VL. Regarding human VL, was concluded that they were unaware about the symptoms and treatment; and, there were doubts about whether a vaccine and a cure for the disease existed. About the canine VL was noticed a greater knowledge about the symptoms, cure and euthanasia, but they were unaware about whether a vaccine existed or not. From among the dogs, 32% were positive for Leishmania. When the canine diagnostic test was correlated with the answers of the local population, there was an association with the educational level of the population and the awareness of VL (p<0,05). Regarding the ACS, most of them knew some kind of symptoms of the disease, the cure, and the type of diagnosis, but they were unaware about the treatment and whether a vaccine for VL existed; they also received training about the matter. There was an association of the ACS profile and their participation in vocational training activities, with their knowledge about epidemiological surveillance and the implementation of prevention activities (p <0.05). We have come to the conclusion that both the local population interviewed, as well as the ACS have insufficient knowledge about the VL, constituting in a reflection of the lack of investment in vocational training activities, by the government, undermining the development of health education activities. Furthermore, with the identification of reagents dogs for VL in riverside areas we confirmed the existence of the disease cycle in these areas, leaving both the human population as well as the canine susceptible to the VL / A leishmaniose visceral (LV) é uma zoonose que tem o cão como reservatório no ambiente urbano e cujo diagnóstico constitui uma das principais estratégias de controle da doença no Brasil. Contudo, outra medida importante para o controle e prevenção da LV diz respeito ao conhecimento da população sobre a doença, que pode ser estimulado a partir de práticas de educação em saúde de profissionais como os Agentes Comunitários de Saúde (ACS). Assim, o presente estudo buscou avaliar o conhecimento das populações ribeirinhas que residem em áreas favoráveis a LV e que possuem cães no domicílio e dos ACS que trabalham nessas áreas, o trabalho se propõe também avaliar se os agentes incluem medidas de prevenção da doença em seu trabalho e se a gestão do Município de Mossoró, Rio Grande do Norte capacita e fornece condições de trabalho para esses profissionais. Para isso, foi realizado um estudo com 79 ribeirinhos e 42 ACS. Tanto para os ribeirinhos quanto para os ACS foram realizadas entrevistas semiestruturadas sobre a doença e a prevenção da LV, sendo que os ACS também foram questionados sobre as atividades de vigilância e controle desenvolvidas e a participação em atividades de capacitação profissional. Adicionalmente, 88 cães domiciliados nas residências incluídas na pesquisa foram testados para LV canina (LVC) por Polimerase Chain Reaction. Os dados foram analisados pelos testes Qui-quadrado e Exato de Fisher (p<0,05). Da população ribeirinha entrevistada 59% conheciam a forma de transmissão da doença, mas não souberam identificar o flebotomíneo como vetor da LV e 58% desconheciam as medidas preventivas da LV. Sobre a LV humana constatou-se desconhecimento quanto à sintomatologia e ao tratamento; houve dúvida quanto a existência da vacina e a cura para a doença. Sobre a LVC percebeu-se maior conhecimento sobre os sintomas, cura e a eutanásia, mas houve desconhecimento sobre a existência ou não de vacina. Dos cães, 32% foram reagentes para Leishmania. Quando correlacionou-se o teste de diagnóstico canino com as respostas da população ribeirinha, houve associação com a escolaridade da população e conhecimento sobre a LV (p<0,05). Sobre os ACS, a maioria conhece algum sintoma da doença, a cura, o tipo de diagnóstico, mas desconhece o tratamento e a existência vacinas e receberam capacitação sobre o tema. Houve associação do perfil dos ACS com sua participação em atividades de capacitação profissional, com seu conhecimento sobre a vigilância epidemiológica e realização de atividades de prevenção (p<0,05). Conclui-se que tanto a população ribeirinha entrevistada quanto os ACS apresentam conhecimento insuficiente sobre a LV, constituindo um reflexo da carência de investimento em atividades de capacitação profissional, por parte do poder público, comprometendo o desenvolvimento de atividades de educação em saúde. Além disso, com a identificação de cães reagentes para LV nas áreas ribeirinhas reforçamos a existência do ciclo da doença nessas áreas, deixando tanto a população humana quanto a canina suscetível à LV

Introdução: A tuberculose (TB) é uma doença infectocontagiosa causada pelo Mycobacterium tuberculosis (MTb) que apresenta cerca de 80% predileção pelo acometimento pulmonar. Amostras de escarro são necessárias para identificar este microrganismo e o escarro induzido (EI) tem sido um método alternativo de obtenção destas amostras, porém tem apresentado, frequentemente, resultados negativos. A cultura, considerada padrão áureo, é mais morosa em seus resultados, portanto menos útil para guiar o diagnóstico. A reação em cadeia da polimerase (PCR) é a metodologia mais comum para o diagnóstico rápido da TB e poucos estudos avaliaram seu papel nas amostras de EI. Objetivo: Determinar acurácia diagnóstica do PCR para microbactéria no EI de pacientes com suspeita de TB pulmonar e descrever características sócio demográficas, dados clínicos, radiológicos, comorbidades e hábitos comportamentais. Métodos: Estudo prospectivo. Pacientes internados e ambulatoriais maiores de 18 anos com sintomas respiratórios sugestivos de tuberculose pulmonar (PTB) foram convidados a participar. Os sujeitos foram entrevistados utilizando-se um questionário padronizado e o EI foi coletado. Foram obtidas três amostras para baciloscopia direta e cultura. Obteve-se uma quarta amostra para o teste de PCR. Resultados: Foram avaliadas 116 amostras de escarro induzido. A sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo da PCR foram de 95,2%, 48,4%, 29,0% e 97,9%, respectivamente. A área sob a curva ROC foi de 0,72 para o teste de PCR (P <0,0001). Conclusões: Embora a especificidade da PCR possa ser subestimada, se considerarmos a PCR mais sensível do que os métodos de cultura utilizados pensaram que esses testes positivos para PCR significam falsos positivos. Os resultados de PCR devem ser sempre interpretados cuidadosamente em conjunto com informações clínicas. / Introduction: Induced sputum (IS) is an alternative method of obtaining sputum, but IS smears are frequently negative. Culture is more time-consuming in its results, and less useful to guide the diagnosis. Polymerase chain reaction (PCR) is the most common methodology for rapid diagnosis of tuberculosis and few studies evaluated its role in IS samples. Objective: The objective of this study is to determine the diagnostic yield of PCR for TB compared with culture in IS samples. Methods: Prospective study. Inpatients and outpatients > 18 years with respiratory symptoms suggestive of PTB were invited to participate. Subjects were interviewed using a standardized questionnaire, and collected IS. Three samples were obtained for AFB smear and culture. A fourth sample was obtained for PCR test. Results: A total of 116 induced sputum samples were evaluated. The sensitivity, specificity, positive predictive value, and negative predictive value of PCR were 95.2%, 48.4%, 29.0%, and 97.9%, respectively. The area under the ROC curve was 0.72 for the PCR test (P<0.0001). Conclusions: Although the PCR specificity could be underestimated, if we consider PCR to be more sensitive than the culture method used, we thought that these PCR positive tests means false-positives. PCR results should always be interpreted carefully in conjunction with clinical information.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The study concerning the lifelong dynamic of undifferentiated cell populations present in the organism expanded the therapeutics frontiers aiming to healing several kinds of wounds and diseases. Different cell populations have been used for this purpose, as those derived from pre-implantation embryos, called embryonic stem cells (ESC); those derived from pluripotent somatic cells niches, responsible for organic regeneration throughout life, named adult stem cells (ASC); and cells derived from the bone marrow mononuclear fraction (BMNC), which has ASC and hematopoietic lineage cells at different stages of differentiation. Important barriers have been overcome aiming to elucidate benefits and risks inherent to cell therapy. However, the knowledge derives from an evolution process fraught with doubts, and there are many things to be unveiled for safe exploration of different kinds of cell therapy, mainly when allogeneic cells are used. Toxoplasmosis is an opportunistic zoonosis caused by the protozoan Toxoplasma gondii, which has a worldwide distribution and affects about a third of the human population. In the acute infection, T. gondii tachyzoites spread up and multiply themselves into host cells. Immune response leads to evasion of the protozoan in tissue cysts of (semi-latent) bradyzoites, mantaining the chronic infection of the host. Immunosuppression, as used in conditioning for allogeneic cells transplantation, is a risk factor for toxoplasmosis reactivation in chronically infected hosts. The studies presented in this thesis were performed aiming to contribute with: a. methods used for molecular detection of allogeneic cells after systemic transplantation by endovenous injection, allowing to mapping the organic distribution and the fate of these cells in recipient body; and b. understanding about interrelationships among conditioning (pharmacological immunosuppression) for transplantation, allogeneic cell therapy with BMNC and toxoplasmosis reactivation in chronically infected hosts. The study described in the Chapter 1 shows a nested-PCR test with increased sensitivity and assurance for molecular diagnosis of presence or absence of male mice cells in body fluids and tissues of female recipients after intravenous transplantation. This method, based on detection of specific DNA fragment from the Y chromosome, was effective for cells from two distinct populations: BMNC and in vitro cultured cells derived from adipose tissue. Therefore, this method can be suitable for other cell types. The study presented in the Chapter 2 shows the effects caused by an immunosuppressive pharmacological regimen with high doses of busulfan and cyclophosphamide (PCT), followed by allogeneic BMNC transplantation in a model of chronic toxoplasmosis in mice. This study was divided in three subsequent steps: I. experimental infection with type II cystogenic strain of T. gondii (ME-49) and characterization of acute and chronic toxoplasmosis; II. evaluation of the pharmacological immunosuppression effects in female Balb/c; and III. evaluation of the effects resulting from transplantation of male mice BMNC to recipient females. The pharmacological immunosuppression caused worsening of the general clinical condition of the animals and high mortality rates. This effect occurred remarkably earlier in animals chronically infected with T. gondii, showing the high risk of the combination between persistent toxoplasmosis and pharmacological immunosuppression in conditioning for allogeneic transplantation. This study showed the safety of the allogeneic BMNC transplantation in female Balb/c independently of the infection by T. gondii, provided that they have not been subjected to conditioning regimen before transplantation. In the Chapter 3, a pharmacological immunosuppressive regimen, with reduced doses of busulfan and cyclophosphamide (PCTrd), was tested as an alternative to minimize conditioning regimen inherent risks in mice chronically infected with T. gondii and submitted to allogeneic transplantation of BMNC. This study was also divided in three sequential steps: I. oral infection of female Balb/c with tissue cysts of T. gondii (cystogenic VEG strain) and monitoring over a 120 days period (chronic toxoplasmosis); II. evaluation of conditioning regimen effects using reduced doses of busulfan and cyclophosphamide (PCTrd); III. endovenous transplantation of allogeneic BMNC from male donors to the female Balb/c. The results showed the safety of the PCTrd for use in female Balb/c chronically infected with T. gondii. Reduced doses of busulfan and cyclophosphamide (PCTrd) resulted in lower incidence and intensity of clinical signs and absence of mortality, in contrast to results that were observed with high doses (PCT) recommended for myeloablation. Transplantation of allogeneic bone marrow-derived mononuclear cells from male donors was safe in the short term for female Balb/c mice submitted to PCTrd regardless of persistent infection by T. gondii. / O estudo da dinâmica das populações celulares indiferenciadas, presentes no organismo ao longo da vida, ampliou a fronteira de alternativas para o tratamento de vários tipos de lesões e de doenças. Diversas populações celulares têm sido usadas para isso, como as derivadas de embriões em fase de pré-implantação, denominadas células-tronco embrionárias (CTE); as derivadas de nichos de células somáticas pluripotentes, responsáveis pela regeneração dos tecidos orgânicos ao longo da vida, chamadas de células-tronco adultas (CTA); e as células da fração mononuclear da medula óssea (CFMO), que conta com CTA e células da linhagem hematopoiética em variados estágios de diferenciação. Importantes obstáculos têm sido superados no que se refere ao conhecimento de benefícios e de riscos inerentes à terapia celular. Contudo, a construção do conhecimento é permeada de dúvidas e há muito a ser desvendado para que se possam explorar com segurança as potencialidades das terapias celulares, especialmente usando células alogênicas. A toxoplasmose é uma zoonose oportunista causada pelo protozoário Toxoplasma gondii, que apresenta distribuição mundial e acomete cerca de um terço da população humana. Na fase aguda da infecção, taquizoítos de T. gondii disseminam-se e multiplicam-se nas células hospedeiras. A resposta imune induz a evasão do protozoário em cistos teciduais de bradizoítos (forma de semilatência), mantendo o hospedeiro cronicamente infectado. A imunossupressão, como a utilizada no pré-condicionamento para transplante de células alogênicas, é um fator de risco de reativação da toxoplasmose em portadores crônicos. Na presente tese, são apresentados estudos realizados com objetivo de contribuir com: a. métodos de detecção molecular de células alogênicas após o transplante sistêmico pela via endovenosa, permitindo o mapeamento da distribuição e do destino destas células no organismo receptor; e b. compreensão das inter-relações envolvendo pré-condicionamento (imunossupressão farmacológica) para o transplante, terapia celular alogênica com CFMO e reativação da toxoplasmose em portadores crônicos. No Capítulo 1 demonstra-se uma nested-PCR que aumenta a sensibilidade e a segurança do diagnóstico molecular de presença ou ausência de células de camundongos machos em fluidos e tecidos de receptoras fêmeas após transplante endovenoso. O método, que envolve a detecção de fragmento de DNA específico do cromossomo Y, foi eficaz para células de duas populações distintas: CFMO e células cultivadas in vitro derivadas do tecido adiposo. Portanto, o método pode ser útil para outros tipos celulares. O estudo apresentado no Capítulo 2 demonstra os efeitos de um protocolo de imunossupressão farmacológica com altas doses de busulfan e ciclofosfamida (PCT), seguido do transplante alogênico de CFMO em um modelo de toxoplasmose crônica em camundongos. Esse estudo foi dividido em três etapas subsequentes: I. infecção experimental com cepa cistogênica do tipo II de T. gondii (ME-49) e caracterização da toxoplasmose aguda e crônica; II. avaliação dos efeitos da imunossupressão farmacológica nas fêmeas Balb/c; e III. avaliação dos efeitos do transplante de CFMO de camundongos machos para as fêmeas receptoras. A imunossupressão farmacológica provocou agravamento do quadro clínico geral dos animais e altas taxas de mortalidade. Esse efeito foi notavelmente precoce nos animais cronicamente infectados por T. gondii, demonstrando o alto risco da combinação entre toxoplasmose persistente e imunossupressão farmacológica na preparação para o transplante alogênico. Demonstrou-se a segurança do transplante alogênico de CFMO em fêmeas Balb/c infectadas ou livres de infecção por T. gondii, desde que não tenham sido submetidas ao protocolo de pré-condicionamento para o transplante. No Capítulo 3, um regime de imunossupressão farmacológica com doses reduzidas de busulfan e ciclofosfamida (PCTdr) foi testado como alternativa para minimizar os riscos inerentes ao pré-condicionamento em camundongos cronicamente infectados com T. gondii e submetidos ao transplante alogênico de CFMO. Esse estudo também foi dividido em três etapas sequenciais: I. infecção oral de fêmeas Balb/c com cistos teciduais de T. gondii (cepa VEG, cistogênica) e monitoramento durante um período de 120 dias (toxoplasmose crônica); II. avaliação dos efeitos do regime de pré-condicionamento, com doses reduzidas de busulfan e ciclofosfamida (PCTdr); III. transplante alogênico endovenoso de CFMO de doadores machos para as fêmeas Balb/c. Os resultados demonstraram a segurança do PCTdr para uso em Balb/c fêmeas cronicamente infectadas com T. gondii. Doses reduzidas de busulfan e ciclofosfamida (PCTdr) resultaram em menor incidência e intensidade de sinais clínicos e ausência de mortalidade, em oposição ao ocorrido com as altas doses (PCT) recomendadas para mieloablação. O transplante alogênico de células mononucleares da medula óssea de doadores machos foi seguro no curto prazo em fêmeas Balb/c submetidas ao PCTdr, independentemente de infecção persistente pelo T. gondii.

A identificação de constituições genéticas de feijão (Phaseolus vulgaris L.) tolerantes à deficiência hídrica (DH) é de grande importância para os programas de melhoramento genético. O objetivo deste trabalho foi caracterizar genótipos de feijão em resposta à DH no estádio reprodutivo por meio de análises fisiológicas, agronômicas e moleculares. O experimento foi conduzido em casa de vegetação, em delineamento de blocos ao acaso com quatro repetições, utilizando 10 cultivares: ANFC 9, ANFP 110, BRS Esplendor, BRSMG Realce, IPR Siriri, IPR Tangará, IPR Tuiuiú, IPR Uirapuru, IAC Imperador e IAC Milênio em duas condições de irrigação: plantas irrigadas durante todo o ciclo, e plantas submetidas a supressão de irrigação no estádio reprodutivo (R7), até o solo atingir 16% da capacidade de campo, quando a irrigação foi reestabelecida. Nos últimos quatro dias de estresse foram analisadas as trocas gasosas. No último dia de estresse foi analisado percentual de estômatos fechados na face abaxial das folhas durante o dia, e coletadas plantas para as seguintes análises: massa fresca e massa seca das folhas, hastes e legumes, e conteúdo de prolina em folhas e raízes. Na maturidade fisiológica foi realizada a colheita e avaliados os componentes do rendimento e estimada a produtividade de grãos. Adicionalmente, visando identificar polimorfismo sequencias gênicas a promotoras relacionadas com a tolerância à DH, foram testados sete pares de primers no grupo de genótipos estudado. O índice de suscetibilidade à seca (ISS) variou de 0,65 a 1,10 no grupo de genótipos, sendo os menores valores observados para IAC Imperador (0,65) e BRS Esplendor (0,87) indicando a capacidade destes dois genótipos em manter a produtividade de grãos na condição de estresse. Todos os genótipos avaliados apresentaram redução nos componentes do rendimento quando estressados pela DH. IAC Imperador (43,4%) e BRS Esplendor (60,6%) apresentaram as menores reduções na produtividade e mantiveram cerca de 50% dos estômatos fechados em todos os horários analisados no último dia de DH. IAC Imperador apresentou maior eficiência no uso da água e taxa de assimilação de CO2 na DH. IPR Tuiuiú, IPR Tangará e IAC Imperador apresentaram as maiores concentrações de prolina nas raízes. Na condição de DH, houve forte correlação positiva significativa entre percentual de estômatos fechados com número de grãos por legume (0,696) e massa fresca da folha (0,731), sendo o percentual máximo de estômatos fechados 73,71% em DH. O caractere acúmulo de prolina na raiz foi o que mais contribuiu para a divergência entre os genótipos na DH, porém, nem sempre os genótipos que mais acumularam prolina foram os mais tolerantes. Os polimorfismos no DNA de sequências codificadoras e promotoras dos fatores de transcrição estudados neste experimento não discriminaram os genótipos tolerantes dos sensíveis à DH. / The identification of genotypes for drought tolerance has a great importance in breeding programs. The aim of this study was to characterize genotypes of beans in response to drought tolerance in different reproductive stages through physiologic, agronomic and molecular analysis. The experiment was conducted in greenhouse, using a randomized block design with four replicates; 10 cultivars: ANFC 9, ANFP 110, BRS Esplendor, BRSMG Realce, IPR Siriri, IPR Tangará, IPR Tuiuiu, IPR Uirapuru, IAC Imperador and IAC Milênio under two conditions of irrigation: plants irrigated during their entire life cycle, and plants under irrigation suppression in the reproductive stage (R7) until 16% of field capacity, when the irrigation was restored. In the last four days of stress, the gas exchanges were analyzed, and in the last day of stress was analyzed the percentage of closed stomata in the abaxial surface of the leaves, collected in different times of the day (9h, 12h, 15h and 18h). Additionally, plant samples were collected for the following analysis: fresh and dry mass of leaves, stems and legumes, and proline content in leaves and roots. The plants were harvested at the physiological maturity and the yield components and grain yield were determined. In addition, in order to identify polymorphisms in the sequences of promoters and genes related to drought, seven pairs of primers were tested on the group of genotypes. The drought susceptibility indexes (ISS) ranged from 0.65 to 1.10 in the group of genotypes, which the lowest values observed were for IAC Imperador (0.65) and BRS Esplendor (0.87), indicating the ability of these two genotypes to maintain grain yield under water stress condition. All genotypes showed reduction in yield components under water stress. IAC Imperador (43.4%) and BRS Esplendor (60.6%) had the lowest reductions in productivity and kept about 50% of the stomata closed during all the different times evaluated at last day of irrigation suppression. IAC Imperador showed greater water use efficiency and CO2 assimilation rate under drought stress. IPR Tuiuiú, IPR Tangará and IAC Imperador had the highest proline concentrations in the roots. Under water stress condition, there was a strong positive correlation (0.696) between the percentage of stomata closed with the number of grains per plant (0.696) and the fresh mass of leaves (0.731), the maximum percentage of stomata closed 73.71% in water stress. The accumulation of proline in the root was the character that most contributed to the divergence between the genotypes under water deficit, but not always the genotypes that have accumulated more proline were the most tolerant. The polymorphisms in DNA of coding and promoting sequences of transcription factors studied in this experiment did not discriminate tolerant genotypes from the sensitive ones to water stress.

CAPES / Programas de controle de qualidade de alimentos baseados na detecção de patógenos incluem técnicas que apresentam desvantagens, como longo tempo de análise, alto custo de implementação, alto risco de interpretação errônea e a não detecção de certos micro-organismos, pois características podem não ser expressas e ainda pode haver a presença de células viáveis, mas não cultiváveis. Desta forma, surge a necessidade de alternativas às técnicas tradicionais. As técnicas moleculares representam uma inovação tecnológica de importância, mas enfrentam dificuldades na sua implantação. Assim, o objetivo desta pesquisa foi caracterizar os fatores limitantes da adoção de técnicas moleculares nos laboratórios de microbiologia de alimentos da região dos Campos Gerais, Paraná. Para isso, foi desenvolvido questionário semi-estruturado, o qual foi avaliado e posteriormente aplicado em laboratórios de microbiologia de seis empresas do ramo alimentício da região dos Campos Gerais. Além disso, ensaios experimentais foram realizados para o desenvolvimento de diagnóstico molecular para detecção de Staphylococcus aureus em alimentos. Extrações de DNA por diferentes métodos foram aplicadas, reações para a detecção dos genes coa e nuc A foram padronizadas e fez-se a aplicação da detecção molecular em amostras de alimentos naturalmente contaminadas. A partir dos resultados, o Bax® System foi indicado como a técnica molecular aplicável na rotina laboratorial da indústria de alimentos. Por outro lado, os resultados dos levantamentos, da padronização de PCR e da aplicação da técnica em amostra alimentícia apontaram alguns fatores limitantes à adoção de técnicas moleculares. Esses fatores são: a falta de conhecimento dos gestores em relação a informações científicas; a legislação brasileira, que se detém a métodos convencionais abrindo a necessidade de trabalhos como este; a falta de recursos financeiros para adquirir equipamentos específicos requeridos pela tecnologia; a necessidade de suporte profissional especializado em diagnóstico molecular, pois na padronização a experiência é necessária para o aperfeiçoamento da técnica às condições do laboratório bem como no treinamento dos analistas; e por fim o tempo gasto para os ajustes dos protocolos. Espera-se com estes resultados que os limitantes sejam suplantados e a inovação tecnológica proposta seja adotada, assim as empresas e os consumidores serão beneficiados com a aplicação de ferramentas analíticas de alto desempenho. / Food Quality control programs based on pathogens detection have techniques that exhibit disadvantages, which are long periods of analysis time, high cost of implementation, high risk of misinterpretation and failure to detect specifics microorganisms because its characteristics cannot be expressed and still they can be present viable cells, but not cultivable. Therefore, emerge the need for alternatives to traditional techniques. Molecular techniques represent an important technological innovation, but face difficulties in its insertion. So, the objective of this research was to characterize the factors limiting the adoption of molecular techniques in food microbiology laboratories in the region of Campos Gerais, Paraná State. For this, it was developed semi-structured questionnaire. This questionnaire was evaluated and applied in microbiology laboratories of six companies of the food sector from Campos Gerais region. Furthermore, experimental trials were carrying out to development of molecular diagnostics for detecting Staphylococcus aureus in food. DNA extractions by different methods was applied, reactions for the detection of coa and nuc A genes was standardized and application of molecular detection in food naturally contaminated samples was realized. As the results, the Bax ® System was indicated as the molecular techniques applicable in laboratory routine of food industry. In other hands, the results of surveys, standardization and development of PCR technique in food sample showed some factors limiting for the adoption of molecular techniques. The factors are: the lack of managers knowledge about scientific information; the Brazilian law that presents conventional methods, opening the need for research like this; the lack of financial resources for specific equipment that are required by the technology; the need of support of the expertise in molecular diagnostics, because in the standardization the experience is required for the improvement of technical adjustment in according with laboratory conditions and analysts training; and finally the time taken for the adjustments in the protocols. It is hoped with these results overcome the limiting factors and that technological innovation proposal will be adopted, so businesses and consumers can be benefit with apply of analytical tools of high performance.

Introdução: A tuberculose (TB) é uma doença infectocontagiosa causada pelo Mycobacterium tuberculosis (MTb) que apresenta cerca de 80% predileção pelo acometimento pulmonar. Amostras de escarro são necessárias para identificar este microrganismo e o escarro induzido (EI) tem sido um método alternativo de obtenção destas amostras, porém tem apresentado, frequentemente, resultados negativos. A cultura, considerada padrão áureo, é mais morosa em seus resultados, portanto menos útil para guiar o diagnóstico. A reação em cadeia da polimerase (PCR) é a metodologia mais comum para o diagnóstico rápido da TB e poucos estudos avaliaram seu papel nas amostras de EI. Objetivo: Determinar acurácia diagnóstica do PCR para microbactéria no EI de pacientes com suspeita de TB pulmonar e descrever características sócio demográficas, dados clínicos, radiológicos, comorbidades e hábitos comportamentais. Métodos: Estudo prospectivo. Pacientes internados e ambulatoriais maiores de 18 anos com sintomas respiratórios sugestivos de tuberculose pulmonar (PTB) foram convidados a participar. Os sujeitos foram entrevistados utilizando-se um questionário padronizado e o EI foi coletado. Foram obtidas três amostras para baciloscopia direta e cultura. Obteve-se uma quarta amostra para o teste de PCR. Resultados: Foram avaliadas 116 amostras de escarro induzido. A sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo da PCR foram de 95,2%, 48,4%, 29,0% e 97,9%, respectivamente. A área sob a curva ROC foi de 0,72 para o teste de PCR (P <0,0001). Conclusões: Embora a especificidade da PCR possa ser subestimada, se considerarmos a PCR mais sensível do que os métodos de cultura utilizados pensaram que esses testes positivos para PCR significam falsos positivos. Os resultados de PCR devem ser sempre interpretados cuidadosamente em conjunto com informações clínicas. / Introduction: Induced sputum (IS) is an alternative method of obtaining sputum, but IS smears are frequently negative. Culture is more time-consuming in its results, and less useful to guide the diagnosis. Polymerase chain reaction (PCR) is the most common methodology for rapid diagnosis of tuberculosis and few studies evaluated its role in IS samples. Objective: The objective of this study is to determine the diagnostic yield of PCR for TB compared with culture in IS samples. Methods: Prospective study. Inpatients and outpatients > 18 years with respiratory symptoms suggestive of PTB were invited to participate. Subjects were interviewed using a standardized questionnaire, and collected IS. Three samples were obtained for AFB smear and culture. A fourth sample was obtained for PCR test. Results: A total of 116 induced sputum samples were evaluated. The sensitivity, specificity, positive predictive value, and negative predictive value of PCR were 95.2%, 48.4%, 29.0%, and 97.9%, respectively. The area under the ROC curve was 0.72 for the PCR test (P<0.0001). Conclusions: Although the PCR specificity could be underestimated, if we consider PCR to be more sensitive than the culture method used, we thought that these PCR positive tests means false-positives. PCR results should always be interpreted carefully in conjunction with clinical information.

Submitted by Alisson Mota (alisson.davidbeckam@gmail.com) on 2015-07-07T20:52:04Z No. of bitstreams: 1 Danielle Albuquerque Pires Rocha.pdf: 1640322 bytes, checksum: 517abde36a5e28961792c6d782a3d48b (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-09T13:44:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Danielle Albuquerque Pires Rocha.pdf: 1640322 bytes, checksum: 517abde36a5e28961792c6d782a3d48b (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-09T13:49:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Danielle Albuquerque Pires Rocha.pdf: 1640322 bytes, checksum: 517abde36a5e28961792c6d782a3d48b (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-09T13:49:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Danielle Albuquerque Pires Rocha.pdf: 1640322 bytes, checksum: 517abde36a5e28961792c6d782a3d48b (MD5) Previous issue date: 2012-06-25 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / The lack of precision and speed in the laboratory diagnosis of some sexually transmitted infections (STI) are commom problems faced by professionals working in this area. Additionally, the lack of some of them in the public health system become more difficult to elucidate the diagnosis. Because of these difficulties, the STI are underdiagnosed, being treated indiscriminately, using only clinical diagnosis. The molecular diagnostic methods have arisen in recent years as an excellent alternative to fill some of the gaps left by traditional methods. The aim of this research was to study the epidemiology of some sexually transmitted pathogens at molecular level, using molecular biology techniques in women attended in public health system in the city of Coari, Amazonas, Brazil. Samples were collected from 361 women for cervical cytology (Pap Smear) and molecular examination. We carried out molecular diagnosis using the technique of Polymerase Chain Reaction (PCR) and real-time PCR for some sexually transmitted pathogens, which were: Human Papillomavirus, Herpes Simplex Virus 2, Human Cytomegalovirus, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae and Thichomonas vaginalis. The results showed that 47.8% of these women were infected by any of the pathogens. There was a high prevalence of infection with Human Papilomavirus (29.1%), followed by T. vaginalis (12.7%), Human Cytomegalovirus (8.3%), C. trachomatis (6.4%), N. gonorrhoeae (1.4%) and Herpes Simplex Vírus 2 (0.6%). The prevalence of HPV type in the infected women was HPV 16 (58.1%), followed by HPV 58 (20.0%). The satisfactory slides for cytological diagnosis (n=321) showed that 7 women (2.1%) showed abnormal cytology (ASCUS, LSIL and HSIL), 5 of them being infected by HPV. There were no statistically significant associations between sexually transmitted infections and the variables related to socio-demographics, medical history and sexual behavior. / A falta de precisão e rapidez no diagnóstico laboratorial de algumas doenças sexualmente transmissíveis (DST) são problemas enfrentados pelos profissionais que atuam nesta área. Além dessas dificuldades inerentes aos testes, a falta de alguns deles na rede pública de saúde dificultam ainda mais a elucidação de diagnósticos. Por causa dessas dificuldades, as DST são subdiagnosticadas, sendo tratadas indiscriminadamente, valendo-se apenas do diagnóstico clínico. Os métodos moleculares de diagnóstico têm surgidos nos últimos anos como uma excelente alternativa para preencher algumas dessas lacunas deixadas pelos métodos tradicionais. Esta pesquisa teve como finalidade estudar a epidemiologia de alguns patógenos sexualmente transmissíveis a nível molecular, valendo-se para isso de técnicas de biologia molecular, em mulheres atendidas na Atenção Primária à Saúde do Município de Coari, Amazonas (AM). Foram colhidas amostras cervicais de 361 mulheres para exame citológico (Papanicolaou) e exame molecular. Foi realizado o diagnóstico molecular através da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e PCR em tempo real para alguns patógenos sexualmente transmissíveis, que foram: Papilomavírus Humano, Herpes Vírus Simples 2, Citomegalovírus Humano, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae e Trichomonas vaginalis. Os resultados obtidos mostraram que 47,8% dessas mulheres estavam infectadas por algum dos patógenos estudados. Constatou-se alta prevalência de infecção por Papilomavírus Humano (29,1%), seguida pelo T. vaginalis (12,7%), Citomegalovírus Humano (8,3%), C. trachomatis (6,4%), N. gonorrhoeae (1,4%) e Herpes vírus Simples 2 (0,6%). O tipo prevalente de HPV nas mulheres infectadas foi o HPV 16 (58,1%), seguido pelo HPV 58 (20,0%). As lâminas citológicas satisfatórias para diagnóstico (n=321) mostraram que 7 mulheres (2,1%) exibiram alterações citológicas (ASCUS, LSIL e HSIL), estando 5 delas contaminadas pelo HPV. Não foram encontradas associações estatisticamente significativas entre as infecções por patógenos sexualmente transmissíveis e variáveis relacionadas à condições sócio-demográficas, história clínica e comportamento sexual.

Made available in DSpace on 2014-07-29T16:24:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Vanessa D Dias.pdf: 1360523 bytes, checksum: 2c315f161f69d4ede2c7375a35216403 (MD5) Previous issue date: 2012-03-02 / The sugarcane production areas are increasing in Brazil due to increased ethanol consumption by flex fuel cars. The planted area is growing, but productivity has been declining in recent years, and factors such as incidence of diseases in the crop may be contributing to this situation. Among the diseases, bacteria such as scald of the leaves and ratoon stunting disease, are of great importance to the crop because they can reduce productivity by up to 30% and the symptoms are not always displayed in the field, thus requiring advanced techniques to detect such bacterial diseases. Among the most used techniques for diagnosis serological tests are quite common, which has as main advantage the capacity of quantitative detection of the presence of bacteria in the culms. However, this detection is only possible if the bacterial title is relatively high. The PCR technique method is more sensitive for detecting low levels of bacteria in stems, but the DNA extractions should be performed in order to purify the DNA to reduce the presence of inhibitory substances in the extract. Thus in this study five different methods of DNA extraction of Xanthomonas albilineans and Leifsonia xyli subsp. xyli were tested and performed in three steps: pure bacteria, bacteria inoculated directly in the extract from five different varieties of sugarcane, and extract from a stem knowingly infected with these bacteria. The results indicate that the amplifications occur more frequently when the products and repeatability of the extractions are diluted by 10-4 in the Leaf Scald. Without this diluition steps, the amplification does not occur, even with the method of DNA extraction considered as a standard. Thus, it is concluded that the detection does not happen if the DNA extraction product is not diluted at least 1000 times, which should prevent the action of inhibitory factors that can hinder the PCR reactions. As for the ratoon stunting disease additional studies are needed to enable its detection by PCR. / O cultivo de cana-de-açúcar está em expansão no Brasil, devido ao crescente consumo de etanol por carros bicombustíveis. A área plantada está em crescimento, mas a produtividade nos últimos anos vem decrescendo, e fatores como incidência de doenças podem estar contribuindo para tal situação. Dentre as doenças, as bacterianas, como o Raquitismo das Soqueiras e a Escaldadura das Folhas, possuem grande importância para a cultura, pois podem reduzir a produtividade em até 30% e nem sempre os sintomas são visualizados em campo, necessitando assim de técnicas avançadas de detecção. Dentre as técnicas para diagnose, a mais utilizada por laboratórios são os testes sorológicos, que tem como vantagem detectar quantitativamente a presença das bactérias nos colmos mas, no entanto, possui a desvantagem de detectar somente quando a população bacteriana está relativamente alta. A técnica de PCR é mais sensível, detectando níveis baixos da população dessa bactéria nos colmos, e as etapas de extrações de DNA devem purificar o DNA para a redução da presença de substâncias inibidoras presentes no extrato. Assim, neste trabalho foram testadas cinco diferentes metodologias de extração de DNA para Xanthomonas albilineans e Leifsonia xyli subsp. xyli realizadas em três fontes: bactérias puras, bactérias adicionadas diretamente no caldo de cinco diferentes variedades de cana-de-açúcar, e caldo de colmos infectados com as bacterioses. Os resultados demonstram que as amplificações acontecem com maior freqüência e repetibilidade quando os produtos das extrações são diluídos em uma proporção de 10-4 para Escaldadura das folhas. Sem diluições as amplificações não ocorrem, mesmo com o método de extração de DNA com elevado grau de pureza, tal como CTAB. Assim, conclui-se que a detecção não ocorre se o produto das extrações de DNA não for diluído ao menos 1000 vezes, provavelmente reduzindo-se desta forma, o nível de inibidores presentes, proporcionando resultados positivos na técnica de amplificação via PCR. Para Raquitismo das soqueiras não conseguimos detectar Leifonia xyli subsp. xyli através de métodos rápidos de extração de DNA.

La PCR universelle ciblant le gène codant pour l'ARNr 16S à l'aide d'amorces universelles, a d'abord été développée pour des études phylogénétiques. En effet ce gène est universellement retrouvé chez les bactéries et sa fonction est conservée. Ainsi, il peut servir d'« horloge moléculaire » pour mesurer les distances phylogénétiques entre les différentes espèces bactériennes. La PCR universelle a ensuite été appliquée en microbiologie clinique dans deux domaines distincts : la détection et l'identification bactériennes. Dans ce travail, nous avons évalué l'applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil diagnostique dans un centre hospitalier universitaire (hôpital la Timone, Marseille, France). Tout d'abord, nous avons décrit comment la PCR universelle permet l'identification de souches bactériennes mal identifiées par les techniques phénotypiques conventionnelles. Puis, nous avons montré que la PCR universelle peut être utilisée pour détecter l'ADN bactérien dans des prélèvements à culture négative, soit parce que le patient a reçu une antibiothérapie préalable, soit parce que le microorganisme responsable est de croissance difficile. Enfin, nous avons montré que la PCR 16S utilisée pour l'identification permet de mettre en évidence des souches susceptibles de représenter de nouvelles espèces et/ou de nouveaux genres bactériens. Ainsi, la PCR universelle est applicable dans un laboratoire de bactériologie de routine dans les trois objectifs ci-dessus. Elle permet une identification précise des souches bactériennes et l'amélioration du diagnostic des infections associées à des cultures négatives et, par là-même, l'amélioration de la prise en charge des patients. / Broad-range 16S rDNA PCR using universal primers was first developed for phylogenetic purpose since 16S rRNA gene is found in every bacterial species with a conserved function; consequently 16S rRNA gene can be used as a molecular clock for assessing bacterial phylogeny. Broad-range PCR was then applied to medical microbiological diagnosis in two distinct fields: molecular detection and bacteria identification. In the present work, we evaluated the applicability of broad-range PCR as a diagnostic tool in a teaching hospital (Timone Hospital, Marseilles, France). First, we showed that broad-range PCR allows identification of bacteria obtained in culture but misidentified by conventional phenotypic methods. Second, we showed that universal PCR permits bacterial detection in culture-negative infection. Third, we exemplified that using broad-range PCR is a valuable tool to identify new bacterial species and/or genera. Consequently, universal PCR is applicable in routine laboratories in the three above fields; it allows a more accurate identification of bacterial strains and permits to diagnose culture-negative bacterial infections, thus improving patient's management. It also improves our knowledge of infectious diseases together with bacterial diversity and phylogeny. Although universal PCR presents certain limitations (discussed in this work), it remains today the gold-standard for molecular identification and detection in routine laboratories.

Bacillus cereus is a group of ubiquitous facultative anaerobic spore forming Gram-positive rods commonly found in soil. It has been detected and implicated in several contaminated food products and raw milk in dairy farms and it causes foodborne gastroenteritis by producing several toxins. This study is aimed at characterizing virulence determinants of B. cereus from cow‟s raw milk. A total of 400 raw milk samples were collected in Fort Hare Dairy Trust and Middledrift Dairy Farm; and cultured on Polymyxin pyruvate Egg-Yolk Mannitol Bromothymol Agar (PEMBA) for 48 hours at 37°C. DNA was isolated from the isolates and 16S rDNA was amplified and sent to Central Analytical Laboratory for sequencing. The gyrB gene of B. cereus was also used to confirm the identity of the isolates. Antibiotic susceptibility profiles of the isolates together with virulence genes were investigated. Multilocus Sequence typing was used to investigate the genetic relatedness of some selected isolates. Furthermore, spores of the isolates were produced, harvested and their concentrations determined. All (100%) of the isolates were identified as having a 96-99% similarity to B. cereus, B. thuringiensis and B. anthracis using sequencing; while gyrB gene was observed in all (100%) of the isolates. Three virulence genes nheA, nheB, nheC encoding for non haemolysin enterotoxin were amplified in all (100%) the isolates. All (100%) of the isolates were susceptible to doxycycline, gentamycin, tetracycline, ciprofloxacin, chloramphenicol and streptomycin. Resistance to rifampicin and penicillin G was predominant with equal rate of 100%, while susceptibility to erythromycin, clindamycin and doxycycline ranged from 60% to 100%. The selected isolates were related and are descendants of the same ancestor. All (100%) the isolates produced spores. The B. cereus isolates contain virulence genes, has multiple antibiotic drug resistance and produce spores, which poses a health risk to the public and cannot be used as probiotics.