Introdução: A rede lisossômica é um complexo de vias metabólicas que influenciam processos como degradação de organelas danificadas ou senescentes, processamento de antígenos, reutilização de aminoácidos essenciais e, em última instância, um sistema de fundamental importância para a fisiologia celular normal. Nesse contexto, os lisossomos possuem uma relevância muito grande, uma vez que é nessa organela que ocorre a destruição das moléculas envolvidas em todos os processos citados acima. Entre as unidades operacionais nos lisossomos estão as hidrolases lisossômicas, que são mais de 50 enzimas com capacidade, em ambiente ácido, de realizar a quebra de substratos específicos. A GlcNAc-fosfotransferase é um complexo hexamérico (J2K2L2) residente na porção cis do complexo de Golgi que realiza a adição de resíduos de manose-6- fosfato nas cadeias de oligossacarídeos das hidrolases lisossômicas. Com ação subsequente, a enzima descobridora realiza a remoção da manose, expõe os resíduos de fosfato e possibilita que as hidrolases sejam reconhecidas pelos receptores de manose-6- fosfato e direcionadas aos compartimentos lisossomais. As subunidades J e K da GlcNAc-fosfotransferase são codificadas pelo gene GNPTAB, localizado no cromossomo 12, constituído de 21 éxons, e a subunidade L pelo gene GNPTG, localizado no cromossomo 16, constituído de 11 éxons. Alterações patogênicas em GNPTAB podem causar as doenças Mucolipidose II ou III alfa/beta e alterações em GNPTG causam a doença Mucolipidose III gama. O defeito genético leva à atividade residual, ou nula, da enzima que acaba por gerar o extravasamento das hidrolases lisossômicas ao meio extracelular e o acúmulo de substratos nos lisossomos. Objetivos: (1) caracterizar as alterações patogênicas em GNPTAB em um grupo de pacientes brasileiros não relacionados com Mucolipidose II ou III alfa/beta, e (2) definir um protocolo de pesquisa molecular para os pacientes brasileiros. Metodologia: É um estudo transversal, com amostragem por conveniência, e inclui pacientes com diagnóstico clínico e bioquímico de Mucolipidose II ou III. Foi extraído DNA genômico dos pacientes a partir de sangue obtido por punção venosa periférica. O gene GNPTAB foi sequenciado através da técnica de Sanger. As alterações do tipo troca de sentido foram analisadas pelos programas de Bioinformática Polyphen2, Sift e Consurf, e as preditas como patogênicas foram pesquisadas em alelos controles brasileiros e analisadas por estudos funcionais, quando possível. A geração de construtos das alterações p.Ser385Leu e c.3503_3504delTC foi realizada por mutagênese sítio-dirigida e a atividade residual destes foi avaliada 24 horas após expressão em células HEK. Para a análise financeira, valores atuais de equipamentos, reagente de biologia molecular e materiais plásticos foram utilizados para estimar o custo de uma extração de DNA, reação de PCR, purificação com PEG8000 e sequenciamento. Resultados: Foram incluídos 13 pacientes (ML II= 8; ML III= 5) e, adicionalmente, de uma mãe de paciente com diagnóstico clínico e bioquímico de ML II. A análise molecular identificou seis alterações patogênicas novas, as c.831delT, c.1763insA, c.1927delAATT, p.Ser385Leu, p.(Asp76Gly) e p.Try1111*. A análise de bioinformática das alterações do tipo troca de sentido as caracterizaram como prejudiciais para a função da proteína e os resíduos 76 e 385 como estrutural e funcional, respectivamente, além de ambos como altamente conservados entre as espécies. A análise funcional dos mutantes p.Ser385Leu e c.3503_3504delTC identificaram atividades residuais de 1,5% e nula, respectivamente. Também foram identificadas outras seis alterações patogênicas previamente descritas. A alteração c.3503_3504delTC foi a que apresentou a maior frequência (40%, n= 10/25 alelos), seguido pela p.Ile403The (12%, n=3/25 alelos). Quanto às relações genótipo-fenótipo, sete pacientes com ML II possuem genótipos combinados de alterações do tipo mudança de fase de leitura e sem sentido, enquanto que os cincos pacientes com ML III alfa/beta apresentam pelo menos uma alteração do tipo troca de sentido, o que evidencia a relação entre alterações que impactam a funcionalidade da proteína e fenótipos mais graves. A análise retrospectiva definiu o protocolo 1.0 que finalizaria o diagnóstico com um custo médio de R$ 338,45, em uma amostra de 25 pacientes. A análise prospectiva do protocolo 2.0, sobre a mesma amostra de pacientes, indicou que o mesmo finalizaria o diagnóstico com o custo médio de R$ 299,80, uma economia de 25%. Discussão/Conclusão: As novas alterações patogênicas descritas nesse trabalho confirmam a alta heterogeneidade alélica do gene GNPTAB. A análise funcional da alteração p.Ser385Leu confirma sua patogenicidade, que está de acordo com o fenótipo ML II do paciente, e evidencia a necessidade de mais estudos a fim de constatar o motivo desse resíduo ser importante para a proteína. A síntese dos protocolos demonstrou ser uma estratégia interessante e economicamente importante, uma vez que diminui os gastos envolvidos para finalizar o diagnóstico molecular. / Introduction: The lysosomal network is a complex of metabolic ways that influence processes like damaged or senescent organelles degradation, antigen processing, essential amino acid reutilization, and, in the last instance, it is important for normal cell physiology. In this context, lysosomes have a great relevance since it is in this organelle that the destruction of the molecules involved in all the processes mentioned above occurs. The operational units in the lysosomes are the lysosomal hydrolases that are more than 50 enzymes with capacity, in an acid environment, to breakdown specific substrates. GlcNAc-phosphotransferase is a hexameric complex (J2K2L2) located in the cis portion of the Golgi complex that performs the addition of mannose-6-phosphate residues in oligosaccharides chains on lysosomal hydrolases. In a subsequent way, the uncovering enzyme removes the mannose residues, exposes the phosphate residues, and enables the recognition of hydrolases by mannose-6-phosphate receptors. The J and K subunits are codified by GNPTAB gene, which is located in chromosome 12 and consists of 21 exons, and the L subunit, encoded by GNPTG gene, that is located in chromosome 16 and consists of 11 exons. The consequences of pathogenic alterations in GNPTAB are Mucolipidosis II or III alpha/beta diseases and alterations in the GNPTG are Mucolipidosis III gamma disease. The genetic defect leads to residual or absent activity of enzyme which ultimately generates an overflow of lysosomal hydrolases to the extracellular environment and accumulation of substrates in lysosomes. Objectives: (1) to characterize, by sequencing of the GNPTAB gene, the pathogenic alterations in a group of unrelated Brazilian patients with Mucolipidosis II or III alpha/beta, and (2) to define a molecular research protocol for Brazilian patients. Methodology: It is a crosssectional study with convenience sampling, and it includes patients with biochemical and clinical diagnosis of Mucolipidosis II or III. The DNA was amplified by PCR technique and sequencing by Sanger technique. All patients in the present study had all exons amplified. The missense alterations were analyzed by Polyphen2, Sift, and ConSurf softwares, and the alterations predicted as pathogenic were studied through research in Brazilian control alleles. The p.Ser385Leu and c.3503_3504delTC were evaluated by site-direct mutagenesis and the residual activity was evaluated 24 hours after expression in HEK cells, through radioactive assays. For cost-price analysis, current values for equipment, molecular biology reagents, and plastic materials were utilized to estimate the cost of DNA extraction, PCR reaction, PEG8000 purification, and sequencing. Results: Of the 13 patients, 8 were clinically diagnosed with Mucolipidosis II and 5 with Mucolipidosis III alpha/beta and, additionally, a mother of one patient with biochemical and clinical diagnosis of Mucolipidosis II was also analyzed. The DNA analysis identified six novel pathogenic alterations in GNPTAB: c.831delT, c.1763insA, c.1927delAATT, p.Ser385Leu, p.(Asp76Gly), and p.Tyr1111*. The bioinformatics analysis of missense alterations were characterized as damaging for protein function, and residues 76 and 385 as structural and functional, respectively, and both as highly conserved among the species. The functional analysis of mutants p.Ser385Leu and c.3503_3504delTC showed the residual activity of GlcNAcphosphotransferase of 1.5% and 0%, respectively. Six others pathogenic alterations previously described were also identified. The alteration c.3503_3504delTC showed the highest frequency (40%, n=10/25 alleles) followed by p.Ile403The (12%, n=3/25 alleles). The retrospective analysis defined the 1.0 protocol that finalized the molecular diagnosis at the cost of R$ 338,45 per sample, in a group of 25 patients. The prospective analysis of 2.0 protocol, in the same patients, indicated that it would finalize diagnosis at the cost of R$ 299,80 per sample, a saving of 25%. Discussion/Conclusion: The novel pathogenic alterations described confirm the high allelic heterogeneity of GNPTAB gene. In the genotype-phenotype relationship, 7 patients with Mucolipidosis II have combined genotype of frameshift or nonsense alterations, or both, and 5 Mucolipidosis III alpha/beta patients have at least one missense alteration, that shows the correlation between alterations that cause impact on the protein function and severe phenotype. The functional analysis of alteration p.Ser385Leu confirms its pathogenicity and makes evident the need of more studies in order to determine the reason this residue is so important for protein function. Protocol synthesis proves to be an interesting and economically important strategy, once it decreases costs to conclude the molecular diagnosis.

Made available in DSpace on 2015-10-06T13:03:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-06-15. Added 1 bitstream(s) on 2015-10-06T13:18:31Z : No. of bitstreams: 1 000848350.pdf: 2552487 bytes, checksum: 834f8a43bf7d63a12d8041a4a5022654 (MD5) / Agentes das Ordens Rickettsiales, Haemosporida e Rhizobiales são causadores de enfermidades que acometem várias espécies animais, podendo representar um risco à saúde dos mesmos, inclusive de seres humanos. Aves carnívoras podem infestar-se e infectar-se com muitas espécies de parasitas, incluindose carrapatos e hemoparasitas, sendo os hábitos de predação fatores de favorecimento à transmissão e translocação de diversos agentes etiológicos. O objetivo deste estudo foi pesquisar, por meio de métodos indiretos (Reação de Imunofluorescência Indireta - RIFI) e diretos (esfregaços sanguíneos, PCR em Tempo Real e PCR Convencional) os agentes das Famílias Anaplasmataceae (Ehrlichia, Anaplasma, Neorickettsia), Bartonellaceae (Bartonella spp.) e Ordem Haemosporida (Plasmodium, Haemoproteus e Leucocytozoon) em ectoparasitas e amostras de sangue de aves carnívoras, realizando-se um estudo filogenético dos agentes encontrados. Para tanto, procedeu-se à colheita de 121 amostras de sangue total e 88 amostras de soro de aves pertencentes às Ordens Accipitriformes, Falconiformes, Strigiformes e Cathartiformes, capturadas nos estados de São Paulo e Rio de Janeiro. Em relação aos ectoparasitas, foram recolhidas três larvas e uma ninfa ingurgitada de carrapatos do gênero Amblyomma de um gavião carijó (Rupornis magnirostris) no Estado de São Paulo. Na RIFI para E. chaffeensis e A. phagocytophilum, 03 (3,41%) e 05 (5,68%) amostras apresentaram sororreatividade, respectivamente. Todas as amostras testadas na RIFI para E. canis mostraram-se negativas. Na avaliação de esfregaços sanguíneos corados pelo Giemsa, não foram encontradas estruturas compatíveis com hemoparasitas. Em relação a PCR em Tempo Real (qPCR), não foram encontrados animais PCR positivos para Ehrlichia chaffeensis (gene vlpt) e Anaplasma phagocytophilum (gene msp-2). Na qPCR Multiplex para Ehrlichia spp., Anaplasma spp. (gene groE) e... / Rickettsiales, Haemosporida and Rhizobiales agents cause diseases that affect various animal species, including humans. Carnivorous birds become infested and infected with many species of parasites, including ticks and hemoparasites, and the predation habits favoring transmission and translocation of various etiological agents. The aim of this study was to investigate, using indirect methods (Immunofluorescence - IFAT) and direct methods (blood smears, Real-Time PCR and Conventional PCR) agents of Families Anaplasmataceae (Ehrlichia, Anaplasma, Neorickettsia), Bartonellaceae (Bartonella spp.) and Haemosporida Order (Plasmodium, Haemoproteus and Leucocytozoon) in ectoparasites and blood samples carnivorous birds, performing a phylogenetic study of these agents. Therefore, we collected 121 blood samples and 88 serum samples from birds belonging to the Accipitriformes, Falconiformes, Strigiformes and Cathartiformes Orders, captured in the states of São Paulo and Rio de Janeiro. Regarding the ectoparasites, we collected three larvae and one engorged nymphal Amblyomma ticks of a Rupornis magnirostris in São Paulo. At IFAT for E. chaffeensis and A. phagocytophilum, 03 (3.41%) and 05 (5.68%) samples showed seroreactivity, respectively. Blood smears stained by Giemsa were analyzed and hemoparasites were not found. Regarding the Real-Time PCR (qPCR), in multiplex qPCR for Ehrlichia spp., Anaplasma spp. (groE gene) and Bartonella spp. (nuoG gene) observed 12 samples positive for Anaplasma spp. (9.91%). In conventional PCR-based 16SrRNA gene for Anaplasmataceae and cytochrome B gene for hemosporidia, eight birds were PCR positive for Ehrlichia spp (6.61%, five in PCR for E. chaffeensis and three in PCR for E. canis), three for Haemoproteus spp (2.48%) and Plasmodium spp (0.83%). In phylogenetic analysis, four samples of Ehrlichia spp. positioned on the same branch Ehrlichia identified in wild animals in Brazil and the US human isolate. The ...

Made available in DSpace on 2014-12-02T11:16:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-28Bitstream added on 2014-12-02T11:21:18Z : No. of bitstreams: 1 000784203.pdf: 2707587 bytes, checksum: 60463c95eda02952a5fde820ad4e0531 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-11-19T17:38:36Z : No. of bitstreams: 1 000784203_20160228.pdf: 79467 bytes, checksum: 21171e215aeff9c2ee4e0d2294237064 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-02-29T12:16:28Z: 000784203_20160228.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-02-29T12:17:26Z : No. of bitstreams: 1 000784203.pdf: 2707582 bytes, checksum: 3f7192c7784f1822d5d754fa4604956e (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2016-03-07T17:59:40Z : No. of bitstreams: 1 000784203_20180228.pdf: 109002 bytes, checksum: 424f5f1795170ba23918fbed01d7890b (MD5) Bitstreams deleted on 2018-03-02T12:40:00Z: 000784203_20180228.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2018-03-02T12:40:57Z : No. of bitstreams: 1 000784203.pdf: 2707585 bytes, checksum: 744cb15abdfa0446e7f2731acecf8660 (MD5) / Infecções por nematódeos gastrintestinais causam consideráveis perdas na pecuária. Haemonchus spp. é o principal nematódeo que acometem bovinos e ovinos principalmente em regiões tropicais e subtropicais. Portanto este estudo teve por objetivo avaliar metodologias de diagnóstico baseado em analises morfológicas e moleculares de larvas infectantes e adultos de Haemonchus spp. Foram utilizados 23 bezerros e 20 cordeiros naturalmente infectados por nematódeos gastrintestinais. Antes da necropsia dos animais, fezes foram coletadas para realização de coproculturas e obtenção de larvas infectantes, que foram morfometricamente analisadas. Logo após o sacrifício dos animais, os abomasos foram removidos e congelados, para posterior recuperação dos exemplares de Haemonchus spp. que foram armazenados em álcool 70º. No caso dos ovinos, os parasitas permaneceram estocados em alcool 70º por mais de um ano antes de serem analisados, enquanto que os parasitas dos bovinos foram armazenados por apenas quatro meses. O diagnóstico morfológico dos Haemonchus machos foi realizado por meio da análise de sínlofe e mensuração de espículos. Os mesmos parasitas utilizados na análise morfológica foram submetidos à análise molecular, com utilização da PCR, com os primers 52/154, 75/86 e Hplacbotu. A técnica padrão ouro para identificação de Haemonchus similis foi análise de espículos e para Haemonchus placei foi PCR com os primes HplacBotu. Todas as amostras de ovinos foram consideradas como sendo de Haemonchus contortus, devido à especificidade parasitária e nenhuma evidencia de outras espécies de Haemonchus nas análises moleculares. Os resultados demonstraram diferença estatística no comprimento da distância entre o final da L3 e o final da bainha das larvas infectantes das três espécies. Houve sobreposição de medidas de apenas 1,26% entre as espécies H. placei e H. contortus. Na análises moleculares o par ... / Nematodes gastrointestinal infection causes considerable losses in the livestock industry. Haemonchus spp. is major nematode that affects cattle and sheep mainly in tropical and subtropical region. Therefore, the aim of the present study was to assess diagnosis methodologies based in morphological and molecular analysis of infective larvae and adults of Haemonchus spp. Twenty-three calves and twenty lambs naturally infected with gastrointestinal nematodes were utilized. Before necropsy of animals, faecal samples were collated for preparing faecal cultures and obtaining infective larvae that were morphometrically analyzed. After the euthanasia of animals the abomasums were removed and frozen for posterior recovered Haemonchus specimens that were stored in alcohol 70º. In the case sheep, the parasites remained stored in alcohol 70º for more than one year before be analyzed, while the parasites of cattle were stored for only four months. The morphological diagnosis of males Haemonchus spp. was released by synlophe analysis and spicule measurements. The same parasites used in the morphological analysis were submitted in the molecular analysis, using PCR, with primers 52/159, 75/86 and HplacBotu. The “gold standard” method used to identify Haemonchus similis was spicules analysis and to identify Haemonchus placei was PCR with the primers HplacBotu. All Haemonchus specimens recovered from sheep were assumed to be Haemonchus contortus based on host specificity, and because the molecular analysis did not show any evidence of other Haemonchus species. The results presented statistic differences in the sheath tail length of infective larvae of three species. There was overlapping of measurements was only 1.26% between H.contortus and H. placei. In the espicule analysis also were observed same overlapping of measurements that caused misidentification of H. placei and H. contortus. In relation the synlophe most samples ...

Submitted by MAYARA LÚCIA DEL CISTIA null (mayara_ldc@hotmail.com) on 2016-06-22T17:02:08Z No. of bitstreams: 1 DissertaçãoMestrado2016_MAYARA_LUCIA_DEL_CISTIA.pdf: 6292986 bytes, checksum: 65cf54ead8c847cc5c6ad551395790c9 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-06-23T19:19:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 delcistia_ml_me_arafcf.pdf: 6292986 bytes, checksum: 65cf54ead8c847cc5c6ad551395790c9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-23T19:19:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 delcistia_ml_me_arafcf.pdf: 6292986 bytes, checksum: 65cf54ead8c847cc5c6ad551395790c9 (MD5) Previous issue date: 2016-05-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / As leishmanioses são um grupo de doenças causadas pelo gênero Leishmania e colocam em risco 350 milhões de pessoas no mundo. Após o sequenciamento do genoma de algumas espécies de Leishmania spp., estudos moleculares de suas formas celulares (amastigotas e promastigotas) trouxeram informações importantes sobre sua biologia e potencial aplicação no aperfeiçoamento ou desenvolvimento de técnicas diagnósticas e terapêuticas. Nesse contexto, este projeto visou avaliar o gene LinJ.36.419 de Leishmania infantum (syn. Leishmania chagasi) e seu produto quanto a potencial aplicação no dsenvolvimento de novas abordagens diagnósticas. Ensaios de PCR quantitativa mostraram que a expressão deste gene é maior em formas amastigotas, estágio responsável pela manifestação da doença, podendo corresponder a um potencial marcador diagnóstico. Um fragmento de 255 aminoácidos da proteína Lc36 foi caracterizado quanto ao seu potencial antigênico utilizando ensaio imunoenzimático (ELISA). Os resultados mostraram especificidade de 74% e sensibilidade de 78% (99% de confiança), com acurácia de 76%, em uma população escolhida randomicamente. Análises adicionais mostraram reação cruzada pouco significativa para soro de cães infectados com Leptospira interrogans e Toxoplasma gondii, e revelaram reação cruzada contra soro de cães infectados por Babesia canis e Ehrlichia canis, todos organismos infecciosos comuns em cães. Análises de bioinformática mostraram que a proteína Lc36 possui um domínio denominado DNA polimerase sigma (COG5260) comum a vários organismos, associado a atividades de replicação, recombinação e reparo de ácidos nucléicos, o qual pode ser responsável pelas reações cruzadas observadas. Dessa forma, outro fragmento (297 aminoácidos) da proteína Lc36, sem a região de domínio conservado, foi expresso para nova caracterização do potencial antigênico com o objetivo de melhorar a especificidade do teste em estudo para aplicação em diagnóstico sorológico de leishmaniose visceral canina. Adicionalmente, bons resultados foram obtidos com ensaios para avaliar a potencial aplicação do gene Lc36 em diagnóstico molecular de leishmaniose visceral por meio do par de oligonucleotídeos RT36 específicos para L.infantum. Os ensaios mostraram que a reação foi capaz de detectar cerca de 5 células do parasita, revelando elevada sensibilidade do teste. Dessa forma, ambos os testes avaliados neste trabalho se mostraram promissores e serão explorados em projetos futuros. / Leishmaniasis are diseases caused by Leishmania genus protozoan and endanger 350 million people worldwide. After genomic sequencing of Leishmania spp., molecular studies of their cycle forms (amastigotes and promastigotes) brought important information, which can contribute to the development of new diagnostic approaches and treatments. In this study we evaluated the potencial application of the Leishmania infantum (syn. Leishmania chagasi) gene Lc.36.4190 and its encoded protein for development of new diagnostic approaches. Quantitative PCR assays showed that the gene is more expressed in intracellular amastigotes, the stage related to the clinical manifestation of these diseases, thus presenting potential to be a diagnostical target. We evaluated antigenic features of a 255 aminoacids fragment of the Lc36 protein using immunoenzimatic assay (ELISA). The results showed specificity of 74% and sensibility of 78% (99% of confidence) and accuracy of 76%, in a randomically chosen population. Additional analysis showed low cross-reaction against Leptospira interrogans and Toxoplasma gondii, and showed cross-reaction against Babesia canis and Ehrlichia canis, all infective organisms common in dogs. Bioinformatics analysis showed that the protein Lc36 contains one DNA polymerase sigma domain (COG5260) found on several organisms, being related to nucleic acid replication, recombination and repair, and might be related to the crossreactions observed. Thus, another fragment (297 aminoacids) of the Lc36 protein, without the conserved domain region, was expressed for a new antigenic characterization to improve the specificity of the canine visceral leishmaniasis serological test. Moreover, good results were obtained on experiments performed to evaluate the potential application of the Lc36 gene on molecular diagnostics using a L. infantum specific pair of primers, RT36. The assays detected approximately 5 parasites, which displays a good sensibility result. Therefore, both serological and molecular tests evaluated in this study are promising and will be explored in future studies.

Submitted by NATHÁLIA BRANCATO JUNQUEIRA null (nbjunqueira@gmail.com) on 2017-08-08T18:23:55Z No. of bitstreams: 1 Defesa - Nathália FINAL.pdf: 993046 bytes, checksum: 72c9ada79f938498b772638050887a58 (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-08-10T20:32:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 junqueira_nb_me_bot.pdf: 993046 bytes, checksum: 72c9ada79f938498b772638050887a58 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-10T20:32:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 junqueira_nb_me_bot.pdf: 993046 bytes, checksum: 72c9ada79f938498b772638050887a58 (MD5) Previous issue date: 2017-08-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Mycoplasma spp., tem distribuição mundial e é um patógeno relevante em medicina veterinária. As mastites causadas por Mycoplasma spp. mais frequentes em grandes rebanhos leiteiros, porém este patógeno é subestimado no Brasil, onde se têm poucos relatos como agente causador de mastite, o que se deve possivelmente a quantidade reduzida de laboratórios que inclui a análise de M. bovis em sua rotina. Devido a necessidade de meios seletivos e de condições especiais para o seu isolamento. Diante disso um dos objetivos do presente estudo foi pesquisar a participação de Mycoplasma bovis na etiologia das mastites clínicas em amostras de leite de vacas de propriedades leiteiras de sete estados do Brasil, totalizando 561 amostras de leite, que foram cultivas em meio Hayflick adicionado de acetato de tálio a 0,01%, incubadas em ambiente de microaerofilia com 5% de CO2. Foram também submetidas a reação em cadeia da polimerase (PCR) para detecção de Mycoplasma spp. e Mycoplasma bovis. Pesquisouse também a microbiota aeróbica envolvida nas mastites, cultivando-se as mesmas amostras de leite em meios de ágar sangue bovino 5% e ágar MacConkey resultando 225 amostras positivas. Obtiveram-se 11 (1,96%) amostras positivas para Mycoplasma spp., no exame microbiológico, enquanto na detecção molecular obteve-se um total de 17 (3,03%) amostras positivas para Mycoplasma bovis. Pode-se concluir com os resultados obtidos pela presença e dispersão do Mycoplasma bovis nos rebanhos leiteiros avaliados, apesar de sua prevalência ser menor quando se compara com outros países, e ainda pela participação de outros patógenos aeróbicos com a associação de Staphylococcus coagulase negativa (17,6%) e Streptococcus dysgalactiae (11,7%) em 29% das amostras positivas para M. bovis. / Mycoplasma spp., has a worldwide occurrence and can cause severe pneumonia in calves and mastitis in lactating cows. The mastitis caused by Mycoplasma spp. are relatively common in large dairy herds. This pathogen, however, is still underestimated, especially in Brazil, with few reports of its occurrence as causative agent of mastitis due to small number of laboratories that include the M. bovis analysis as part of their routine. Such lack of analysis is due to the fact that such analysis requires selective means and special conditions for its isolation. Therefore, the aim of this study was to research the participation of Mycoplasma bovis in the etiology of clinical mastitis of dairy properties of the seven diferent states from Brazil. A total of 561 milk samples from animals with clinical mastitis were evaluated. The samples were grown on Hayflick broth added of thallium acetate 0.01%, incubated in microaerophilic atmosphere at 5% CO2. The samples were also subject to molecular evidence polymerase chain reaction (PCR) for the detection of Mycoplasma spp. and Mycoplasma bovis. The aerobic microbiota involved in the mastitis was also investigated, and the same milk samples were cultured in media of 5% bovine blood and MacConkey agar resulting in 225 positive samples. Colonies of Mycoplasma spp were isolated in 11 (1.96%) samples. The 561 milk samples included in this study were subjected to molecular detection for Mollicutes family, from which 17 (3.03%) samples were positive. All identified as positive were reassessed for the molecular diagnosis for Mycoplasma bovis. It can be concluded with the results of this research, the presence of Mycoplasma bovis in dairy herds evaluated, but with a lower incidence of this pathogen when compared to other countries, and 29% of the positive samples for M. bovis were also associated with other aerobic pathogens such as Staphylococcus coagulase negative (17.6%) and Streptococcus dysgalactiae (11.7%).

Orientador: Alessandro Francisco Talamini do Amarante / Banca: Kátia Denise Saraiva Bresciani / Banca: Lucia Helena O'Dwyer de Oliveira / Resumo: Infecções por nematódeos gastrintestinais causam consideráveis perdas na pecuária. Haemonchus spp. é o principal nematódeo que acometem bovinos e ovinos principalmente em regiões tropicais e subtropicais. Portanto este estudo teve por objetivo avaliar metodologias de diagnóstico baseado em analises morfológicas e moleculares de larvas infectantes e adultos de Haemonchus spp. Foram utilizados 23 bezerros e 20 cordeiros naturalmente infectados por nematódeos gastrintestinais. Antes da necropsia dos animais, fezes foram coletadas para realização de coproculturas e obtenção de larvas infectantes, que foram morfometricamente analisadas. Logo após o sacrifício dos animais, os abomasos foram removidos e congelados, para posterior recuperação dos exemplares de Haemonchus spp. que foram armazenados em álcool 70º. No caso dos ovinos, os parasitas permaneceram estocados em alcool 70º por mais de um ano antes de serem analisados, enquanto que os parasitas dos bovinos foram armazenados por apenas quatro meses. O diagnóstico morfológico dos Haemonchus machos foi realizado por meio da análise de sínlofe e mensuração de espículos. Os mesmos parasitas utilizados na análise morfológica foram submetidos à análise molecular, com utilização da PCR, com os primers 52/154, 75/86 e Hplacbotu. A técnica padrão ouro para identificação de Haemonchus similis foi análise de espículos e para Haemonchus placei foi PCR com os primes HplacBotu. Todas as amostras de ovinos foram consideradas como sendo de Haemonchus contortus, devido à especificidade parasitária e nenhuma evidencia de outras espécies de Haemonchus nas análises moleculares. Os resultados demonstraram diferença estatística no comprimento da distância entre o final da L3 e o final da bainha das larvas infectantes das três espécies. Houve sobreposição de medidas de apenas 1,26% entre as espécies H. placei e H. contortus. Na análises moleculares o par ... / Abstract: Nematodes gastrointestinal infection causes considerable losses in the livestock industry. Haemonchus spp. is major nematode that affects cattle and sheep mainly in tropical and subtropical region. Therefore, the aim of the present study was to assess diagnosis methodologies based in morphological and molecular analysis of infective larvae and adults of Haemonchus spp. Twenty-three calves and twenty lambs naturally infected with gastrointestinal nematodes were utilized. Before necropsy of animals, faecal samples were collated for preparing faecal cultures and obtaining infective larvae that were morphometrically analyzed. After the euthanasia of animals the abomasums were removed and frozen for posterior recovered Haemonchus specimens that were stored in alcohol 70º. In the case sheep, the parasites remained stored in alcohol 70º for more than one year before be analyzed, while the parasites of cattle were stored for only four months. The morphological diagnosis of males Haemonchus spp. was released by synlophe analysis and spicule measurements. The same parasites used in the morphological analysis were submitted in the molecular analysis, using PCR, with primers 52/159, 75/86 and HplacBotu. The "gold standard" method used to identify Haemonchus similis was spicules analysis and to identify Haemonchus placei was PCR with the primers HplacBotu. All Haemonchus specimens recovered from sheep were assumed to be Haemonchus contortus based on host specificity, and because the molecular analysis did not show any evidence of other Haemonchus species. The results presented statistic differences in the sheath tail length of infective larvae of three species. There was overlapping of measurements was only 1.26% between H.contortus and H. placei. In the espicule analysis also were observed same overlapping of measurements that caused misidentification of H. placei and H. contortus. In relation the synlophe most samples ... / Mestre

Submitted by JÚLIO HEBER SILVA (julioheber@yahoo.com.br) on 2018-06-05T17:44:09Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thiago Henrique Moreira da Fé - 2018.pdf: 1985149 bytes, checksum: 20d3ea58da14d653dfbb18d338dbb1b8 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-06-06T11:04:33Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thiago Henrique Moreira da Fé - 2018.pdf: 1985149 bytes, checksum: 20d3ea58da14d653dfbb18d338dbb1b8 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-06T11:04:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thiago Henrique Moreira da Fé - 2018.pdf: 1985149 bytes, checksum: 20d3ea58da14d653dfbb18d338dbb1b8 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-04-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Dengue and zika are viral infectious diseases occurring in countries with a tropical and subtropical climate in which around 3.6 billion people live. It is estimated that in 50 to 100 million new cases of dengue occur annually, generating economic, social and public health impacts. Dengue and zika have usually been diagnosed by serological methods which are generally of low confidence, as they can generate false-positive results, which are related to the presence of antibodies produced against previous infections of the virus. The molecular methods are more accurate, however the molecular method most commonly used (PCR) requires a long time of reaction and requires sophisticated instrumentation and high cost, making point of care applications difficult,, especially in developing countries. This work presents the development of a molecular diagnostic methodology in a paper-based platform that allowed the detection of the virus through the reverse transcription -loop mediated isothermal amplification (RT-LAMP). The reactions were carried out on 6 mm diameter FTA paper discs, confined in a multi-layered polyester-toner device, incubated at 65 ° C for 45 minutes in a dry bath and then performed visual detection using the SYBR Green intercalator. Positive reactions were identified by the green fluorescence emitted after the addition of the intercalator. The results were recorded through the capture of the images by a photodocumentator and/or by smartphone and later analyzed by the software ImageJ, allowing the comparison between negative and positive reactions. The methodology developed for the detection of the virus by RT-LAMP in paper substrate was sensitive, being able to detect the virus in initial concentrations of 0.1 pg μL -1 of RNA in the master mixture. In addition, it was possible to detect the virus directly in complex samples (serum of infected patients) without the need of previous viral RNA extraction step. Elimination of the RNA extraction step together with the visual detection on the paper produce the final result in 46 minutes. The results demonstrated that the detection of the virus by RT-LAMP in paper substrates is a valuable tool for the molecular diagnosis of infectious diseases, presenting great potential for point-of-care applications for both diagnostics and epidemiological studies, especially in developing countries. / A dengue e a zika são doenças infecciosas virais de ocorrência nos países de clima tropical e subtropical no qual vivem cerca de 3,6 bilhões de pessoas, estimando-se, no caso da dengue, que 50 a 100 milhões de novos casos da doença ocorram anualmente, gerando impactos econômicos, sociais e de saúde pública. A dengue e a zika têm sido usualmente diagnosticadas por métodos sorológicos que são em geral de baixa confiança, pois podem gerar resultados falso-positivos, que estão relacionados à presença de anticorpos produzidos contra infecções anteriores do vírus. Os métodos moleculares são mais precisos, porém o método molecular mais utilizado atualmente (PCR) requer longo tempo de realização e necessita de instrumentação sofisticada e de alto custo, dificultando sua aplicação no ponto de atendimento, especialmente em países em desenvolvimento. Este trabalho apresenta o desenvolvimento de uma metodologia de diagnóstico molecular em uma plataforma a base de papel que permitiu a detecção do vírus por meio da reação de transcrição reversa seguida pela amplificação isotérmica mediada por loop (RTLAMP). As reações foram realizadas em discos de papel FTA com 6 mm de diâmetro, confinado em dispositivo multicamadas de poliéster-toner, incubados à 65 °C por 45 minutos em banho seco e posteriormente realizado a detecção visual onchip, através da utilização do intercalador SYBR Green. As reações positivas foram identificadas pela fluorescência verde emitida após a adição do intercalador. Os resultados foram registrados por meio da captura das imagens por uma fotodocumentadora e/ou por câmera de celular e posteriormente analisados pelo software ImageJ, permitindo a comparação entre reações negativas e positivas. A metodologia desenvolvida para a detecção do vírus por RT-LAMP em substrato de papel apresentou-se sensível, sendo capaz de detectar o vírus em concentrações iniciais de 0,1 pg µL-1 de RNA na mistura reacional. Além disso, foi possível detectar o vírus diretamente em amostras complexas (soro de pacientes infectados) sem a necessidade da etapa prévia de extração do RNA viral. A eliminação da etapa de extração do RNA juntamente com a realização da detecção visual no próprio papel proporcionou a obtenção do resultado final em 46 minutos. Os resultados demonstraram que a detecção do vírus por RT-LAMP em substrato de papel é uma importante ferramenta para o diagnóstico molecular de doenças infecciosas, apresentando grande potencial para aplicações no ponto de atendimento tanto para diagnósticos quanto para estudos epidemiológicos, especialmente em países em desenvolvimento.

Os parasitas pertencentes ao gênero Leishmania têm distribuição ubíqua. Este táxon inclui Leishmania infantum chagasi, agente etiológico da leishmaniose visceral nas Américas, uma zoonose negligenciada cujas metodologias diagnósticas acumulam uma série de limitações, requerendo a validação e padronização de metodologias diagnósticas satisfatórias. Vários fatores estão relacionados à patogênese causada por este protozoário, entre eles a catepsina L-like, uma cisteíno protease envolvida em processos regulatórios metabólicos e infecciosos. Portanto, este trabalho teve como objetivo avaliar a eficácia do gene de catepsina L-like isoforma CPA como alvo de diagnóstico molecular e como marcador filogenético que permita a compreensão das variações intraespecíficas e elucidem a história evolutiva de L. infantum chagasi no Brasil. Foram utilizados 44 isolados de L. infantum chagasi de diferentes estados brasileiros. Os fragmentos do gene de catepsina L-like foram amplificados, purificados, sequenciados, alinhados manualmente e analisados por métodos filogenéticos de máxima parcimônia e inferência bayesiana. As sequências geradas foram usadas para pesquisar e sintetizar iniciadores a serem usados em reações específicas para o parasita alvo. O gene de catepsina L-like não mostrou variabilidade intraespecífica entre os isolados analisados, sugerindo um evento recente de introdução do mesmo nas Américas. O par de iniciadores propostos amplificou o DNA alvo de isolados de L. infantum chagasi, sendo efetivo na amplificação de DNA em concentrações de até 10-11g / µl. O marcador proposto não apresentou reações cruzadas com outros hemoparasitas de importância clínica. Quando utilizado para o diagnóstico em um painel de amostras clínicas de cães, obteve-se uma frequência de positividade de 49,03% (102/208), contrastando com o valor de 14,42% (30/208) obtido com o marcador para o gene do espaçador ribossomal interno ITS. Quando testado em amostras de flebotomíneos se obteve um valor de 6,25% e em amostras de pacientes humanos o valor foi de 14,28%. Os marcadores também foram eficazes em amplificar DNA extraído de amostras de urina, de sangue fixado em papel filtro e mesmo em amostras de swab de lesões conjuntivas. Este conjunto de parâmetros permite inferir que o CatLeish- PCR é sensível e específico para o diagnóstico de L. infantum chagasi podendo ser aplicado tanto em pesquisas clínicas quanto em inquéritos epidemiológicos de vigilância. / The parasites belonging to the Leishmania genus have a wide distribution. This taxon includes Leishmania infantum chagasi, the etiologic agent of Visceral Leishmaniasis in the Americas, a neglected zoonosis that requires the validation and standardization of satisfactory diagnostic methodologies. Several factors are related to the pathogenesis caused by this protozoan, as Catepsin L-like, a cysteine protease involved in regulatory and infectious processes. Given this information this work aimed to evaluate the effectiveness of Cathepsin L-like isoform CPA as a target for molecular diagnosis and as a phylogenetic marker that allows understanding the intraspecific variations and the evolutionary history of L. infantum chagasi in Brazil. We used 44 isolates of L. infantum chagasi from different Brazilian states. The cathepsin L-like gene fragments were amplified, purified, sequenced, manually aligned and analyzed by maximum parsimony and Bayesian inference methods. The sequences generated were researched to construction of oligonucleotide primers to be used in reactions specific to the target parasite. The Cathepsin L-like gene did not show intraspecific variability among the isolates analyzed, suggesting a recent event of introduction of the same in the Americas. The pair of proposed primers amplified the target DNA of L. infantum chagasi isolates, being effective in DNA amplification at concentrations of up to 10-11g/µl. The proposed marker did not present cross-reactions with other hemoparasites of clinical importance. When used for the diagnosis in a panel of clinical samples of dogs obtained a positive frequency of 49.03% (102/208), against the 14.42% (30/208) to ribosomal ITS marker. Samples of sandflies obtained a value of 6.25% and in humans the value was 14.28%. The markers were also effective in blood samples fixed on filter paper and even in samples from conjunctival lesion swabs. This set of parameters allows to infer that CatLeish-PCR is a sensitive and specific marker for the diagnosis of L. infantum chagasi in clinical and epidemiological surveys.

Submitted by Franciele Moreira (francielemoreyra@gmail.com) on 2017-10-20T15:45:20Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Marcia Carolina Mazzaro - 2017.pdf: 2663799 bytes, checksum: 4e703b3e54caaae256aa324970808c41 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-10-23T10:05:01Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Marcia Carolina Mazzaro - 2017.pdf: 2663799 bytes, checksum: 4e703b3e54caaae256aa324970808c41 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-23T10:05:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Marcia Carolina Mazzaro - 2017.pdf: 2663799 bytes, checksum: 4e703b3e54caaae256aa324970808c41 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-05-30 / Strongyloides stercoralis is an intestinal nematode that infects approximately 100 million people worldwide, mainly in tropical and subtropical regions. Most S. stercoralis carriers are asymptomatic or oligo-symptomatic, which does not mean absence of pathogenic action. Extra-intestinal manifestations can lead to severe and life-threatening conditions, especially in immunocompromised patients. The medical literature has case reports of disseminated strongyloidiasis in diabetic patients, but no studies have determined the relationship between diabetes and strongyloidiasis. The objective of this study aims to evaluate the parasitological and molecular profile of strongyloidiasis in patients with type 2 diabetes mellitus (DM2) and to analyze their value in the detection of chronic asymptomatic infection in these patients. The population for this research were patients from Diabetes Outpatient Clinic of Jataí -GO and other non - diabetic individuals living in the city. Fresh stool samples were obtained from 149 individuals, and were characterized in two groups: Group I (97) patients with DM2, Group II (52) individuals not carrying DM2. The fecal samples provided were submitted to parasitological methods of Hoffman, Rugai and agar plate culture, and subsequently, to molecular analysis by Polymerase Chain Reaction (PCR). The overall positivity of S. stercoralis by parasitological techniques was 2,6 % (4/149), and only one DM2 patient was positive for the infection. With PCR, the positivity was 16.1% (24/149), 9,3% (9/97) in the group I, and 28,8% (15/52) in the group II. DM2 showed to be a protective factor for strongyloidiasis (OR 0,252 IC95% 0,101 a 0,628 p=0,003). There was no agreement between the parasitological methods and PCR in the detection of S. stercoralis. Thus, the PCR technique using primer species-specific for S. stercoralis showed a greater ability to detect infection in asymptomatic diabetic and non-diabetic patients. / milhões de pessoas no mundo, principalmente em regiões tropicais e subtropicais. A maioria dos portadores de S. stercoralis são assintomáticos ou oligoassintomáticos, o que não significa ausência de ação patogênica. As manifestações extra-intestinais podem levar a quadros graves e potencialmente fatais principalmente em pacientes imunocomprometidos. Na literatura são descritos casos de estrongiloidíase disseminada em pacientes diabéticos, porém não há estudos que determinam a relação existente entre o diabetes e o desenvolvimento da estrongiloidíase. O Objetivo desse estudo foi avaliar o perfil parasitológico e molecular da estrongiloidíase em pacientes portadores Diabetes mellitus tipo 2 (DM2) e analisar sua performance na detecção de infecção crônica assintomática nesses pacientes. A pesquisa foi realizada com pacientes atendidos no ambulatório de diabetes da prefeitura de Jataí - GO e indivíduos não diabéticos residentes no município. Amostras fecais frescas foram obtidas de 149 indivíduos, sendo caracterizados em dois grupos: Grupo I (97) pacientes portadores de DM2, Grupo II (52) indivíduos não portadores de DM2. As amostras fecais fornecidas foram analisadas pelos métodos parasitológicos de Hoffman, Rugai e cultura em placa de ágar, e posteriormente submetidas à análise molecular por técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) utilizando primer específico. A positividade geral de S. stercoralis pelas técnicas parasitológicas foi de 2,6%(4/149), e apenas um paciente DM2 foi positivo. Com a utilização de técnica de PCR, a positividade geral foi de 16,1% (24/149), sendo 9,3% (9/97) no Grupo I, e 28,8% (15/52) no Grupo II. DM2 mostrou ser um fator de proteção para estrongiloidiase (OR 0,252 IC95% 0,101 a 0,628 p=0,003). Não houve concordância entre os métodos parasitológicos e PCR na detecção de S. stercoralis. Desta forma, a técnica de PCR utilizando primer espécie-especifico para S. stercoralis apresentou maior capacidade de detecção de infecção em portadores assintomáticos diabéticos e não diabéticos.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-11-08T10:14:33Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Nara Cristina Teixeira - 2016.pdf: 2553556 bytes, checksum: 4d26487aa9084ba304be81c862eb3ec0 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-11-08T10:14:58Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Nara Cristina Teixeira - 2016.pdf: 2553556 bytes, checksum: 4d26487aa9084ba304be81c862eb3ec0 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-08T10:14:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Nara Cristina Teixeira - 2016.pdf: 2553556 bytes, checksum: 4d26487aa9084ba304be81c862eb3ec0 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-02-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Considered the most destructive disease of rice (Oryza sativa), the blast caused by the fungus M. oryzae is of concern worldwide. Because the pathogen staying power in the soil and crop residues for long and indeterminate periods is essential monitoring before the pathogen's entry into new areas, due to the commitment of nearby plantations. The seeds are considered the main ways of spread of disease due to storage, transportation and introduction into harmless areas. The methodology currently recommended by the Ministry of Agriculture for fungi monitoring seed is the "Blotter test", however, the morphological characterization can often be uncertain due to the rapid growth of fungal invasion and the similarity between structures of some pathogens. Morphologically M. oryzae can be indistinguishable from some species, such as the causal agent of rice blast wheat and other grasses therefore the most adequate way for safe diagnosis is the molecular detection. In seeds percentage infestation is often low, which is nevertheless important because the seed of transmission capacity for the seedling, however small conidia concentrations may be insufficient for the molecular detection by techniques potentially used as PCR (Polymerase Chain Reaction). Technically a methodology for molecular amplification isothermal LAMP (Loop- Mediated Isothermal Amplification) simpler recently been developed, which allows to safely identify the target, due to the projection of specific primers based on exclusive regions of the genome of the organism. The technique has advantages as high sensitivity due to the recognition by the initiators of six regions of the target, in addition to specificity, speed and security in the diagnosis. It is important to consider the cost reduction compared with PCR, due to use of constant temperature and straightforward interpretation of results using turbidity generated in positive samples or color change if the addition of dyes, eliminating the use of devices, specialized professionals in handling high standard laboratories. The interpretation the results with the naked eye makes the seed control in environments such as laboratories, warehouses, cooperatives with minimal structure, reflecting positively on the proper targeting of lots, either for planting, consumption or disposal. Therefore, the aim of this study was to survey the main potentially destructive pathogenic fungi found in seeds, and develop a rapid detection kit by LAMP methodology for M. oryzae. / Considerada a doença mais destrutiva do arroz (Oryza sativa), a Brusone, causada pelo fungo Magnaporthe. oryzae é motivo de preocupação no mundo todo. Devido a capacidade de permanência do patógeno no solo e em restos culturais por longos e indeterminados períodos é essencial o monitoramento perante a entrada do patógeno em novas áreas, em razão do comprometimento dos próximos plantios. As sementes são consideradas as principais formas de disseminação da doença devido à capacidade de armazenamento, transporte e introdução em áreas indenes. A metodologia atualmente recomendada pelo Ministério da Agricultura para monitoramento de fungos em sementes é o “Blotter test”, entretanto, a caracterização morfológicapode muitas vezes ser incerta devido à invasão de fungos de crescimento rápido e a semelhança entre estruturas de alguns patógenos. Morfologicamente M. oryzae pode ser indistinguível de algumas espécies, como é o caso do agente causal da brusone de diversas gramíneas, portanto, a maneira mais adequada para diagnose segura é a detecção molecular. Em sementes, a porcentagem de infestação muitas vezes é baixa, o que não deixa de ser importante devido a capacidade de transmissibilidade da semente para a plântula, no entanto as pequenas concentrações de conídios podem ser insuficientes para a detecção molecular, por meio de técnicas potencialmente utilizadas como a PCR (Reação Polimerase em Cadeia). Tecnicamente mais simples, recentemente foi desenvolvida uma metodologia de amplificação molecular isotérmica LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification), que permite identificar de forma segura o alvo, em decorrência da projeção de iniciadores específicos, baseados em regiões exclusivas do genoma do organismo. A técnica apresenta vantagens como, alta sensibilidade devido ao reconhecimento pelos iniciadores de seis regiões do alvo, além da especificidade, agilidade e segurança no diagnostico. È importante considerar a redução de custos em comparação com a PCR, devido ao uso de temperaturas constantes, e interpretação direta dos resultados por meio da turbidez gerada em amostras positivas, ou mudança de coloração no caso da adição de corantes, dispensando o uso de aparelhos, profissionais especializados e manuseio em laboratórios de alto padrão. A intepretação dos resultados a olhos nus facilita o controle de sementes em ambientes como laboratórios, armazéns, cooperativas com estrutura mínima, refletindo positivamente sobre o direcionamento adequado de lotes, seja para o plantio, consumo ou descarte. Portanto, o objetivo deste trabalho foi realizar o levantamento dos principais fungos patogênicos potencialmente destrutivos encontrados em sementes, e desenvolver um kit de detecção rápida por meio da metodologia LAMP para M. oryzae.