Die Mucositis enoralis ist eine häufige und dosislimitierende Nebenwirkung der Strahlentherapie von Kopf-Hals-Tumoren. Die zugrunde liegenden Pathomechanismen sind komplex und beinhalten die Reaktionen und Interaktionen von Epithelzellen, Fibroblasten, Makrophagen und Gef¨aßendothelzellen. Dies schließt die vermehrte Bildung von Stickstoff-Monoxid (NO) in Folge einer Stimulation der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) ein. Ziele der Untersuchungen: Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Wirkung von L-NAME (nitro-L-Arginin-Methyl-Ester), einem unselektiven Inhibitor der NOS, auf die Strahlenreaktion der oralen Mukosa im etablierten Tiermodell der Schleimhaut der Zungenunterseite der Maus zu untersuchen. Materialien und Methoden: Die Untersuchungen erfolgen mit Mäusen des InzuchtWildtypstammes C3H/Neu. Als Bestrahlungstechniken kommen die perkutane Schnauzenbestrahlung (200 kV Röntgenstrahlung) und/oder die lokale Bestrahlung (25 kV Röntgenstrahlung) eines 3·3 mm2 großen Testfeldes der Zungenunterseite der Maus zum Einsatz. In Fraktionierungsprotokollen werden 5x3 Gy/Woche über 1 (Tage 04) sowie 2 Wochen (Tage 0-4, 7-11) auf die gesamte Schnauze der Tiere appliziert. Anschließend erfolgt eine lokale Aufsättigungsbestrahlung mit gestaffelten Dosen (5 Dosisgruppen, je 10 Tiere) zur Generierung kompletter Dosis-Effekt-Kurven (Tag 7 bzw. 14). Einzeitbestrahlungen des lokalen Testfeldes finden ebenfalls mit gestaffelten Dosen statt. L-NAME (täglich 0,2 mg/kg i.p.) wird an den Bestrahlungstagen 30 Minuten vor der Bestrahlung appliziert. Bei Einzeitbestrahlung werden 2 verschiedene Behandlungszeiträume getestet: 3 Tage vor der Bestrahlung bis zur Erstdiagnose (-3/D) oder Ausheilung der Ulzerationen (-3/H). In Kombination mit fraktionierter Bestrahlung über 1 Woche werden 3 Zeiträume untersucht (-3/7, -3/D oder -3/H). Bei 2 Wochen fraktionierter Bestrahlung erfolgt die L-NAME-Gabe in folgenden Intervallen: -3/7, -3/D, -3/H, -3/14 oder 7/14. Als quantaler Endpunkt für Dosis-EffektAnalysen dient die Ulzeration der Schleimhaut im Testfeld. Mittels Logit-Analyse werden Dosis-Effekt-Beziehungen ermittelt. Der ED50-Wert und dessen Standardabweichung σ dienen der Charakterisierung der Dosis-Effekt-Kurven. In histologischen Untersuchungen werden maximal 10 Fraktionen zu 3 Gy über 2 Wochen appliziert, mit/ohne Gabe von L-NAME von Tag -3 bis zur Tötung. Die Zungenentnahme erfolgt bei je 5 Tieren in zweitägigen Abständen (Tag 1 bis 25). Ergebnisse: Für die alleinige Einzeitbestrahlung ergibt sich eine signifikante Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz mit einer ED50 von 13,6±1,0 Gy. Die mittlere Latenzzeit beträgt 10,6±1,1 Tage, die durchschnittliche Ulkusdauer 3,5±1,0 Tage. Nach alleiniger einwöchig fraktionierter Bestrahlung beträgt die ED50 der Testbestrahlung 12,3±0,8 Gy. L-NAME von Tag -3 bis Tag 6 bzw. -3/D hat keinen signifikanten Einfluss (ED50 13,3±1,2 Gy bzw. 12,8±1,0 Gy). Lediglich für den Applikationszeitraum Tag -3/H kann eine signifikante Erhöhung der ED50 auf 14,7±1,7 Gy (p=0,0298) nachgewiesen werden. Die Testbestrahlung nach 2-wöchiger Fraktionierung ohne L-NAME ergibt eine ED50 von 13,0±0,1 Gy. L-NAME hat wiederum keinen signifikanten Einfluss auf die Strahlenempfindlichkeit der Mundschleimhaut (ED50-Werte: -3/6 - 12,9±0,1 Gy, -3/14 - 13,0±0,1 Gy, -3/H - 13,8±1,4 Gy und 7/14 - 13,1±0,8 Gy). Während alleiniger fraktionierter Bestrahlung nimmt die Zellzahl zunächst ab (Tag 11: 70 %). Im Anschluss steigt sie über das Ausgangsniveau (Tag 19: 126 %). F¨ur die L-NAME-behandelte Schleimhaut findet sich ein qualitativ vergleichbarer Verlauf; es zeigt sich lediglich eine geringfügige Erhöhung der Zellzahl in der funktionellen Schicht (150 % statt 140 %). Die Epitheldicke nimmt unter L-NAME-Behandlung in den ersten Tagen der Nachbeobachtungszeit deutlich zu. Schlußfolgerungen: Zusammenfassend erweist sich in der vorliegenden Arbeit nur die L-NAME-Applikation -3/H bei einwöchig fraktionierter Bestrahlung als wirksam, wobei der Grund f¨ur diese selektive Wirkung unklar bleibt. Offensichtlich sind NOvermittelte Prozesse ohne substanzielle Relevanz f¨ur die epitheliale Strahlenreaktion der Mundschleimhaut. Auf der Basis dieser Ergebnisse ist die Hemmung von iNOS durch L-NAME keine aussichtsreiche Strategie zur Reduktion der radiogenen Mucositis enoralis, und sollte deshalb auch nicht in klinischen Studien verfolgt werden. Die Frage, ob andere (i)NOS-Hemmstoffe ein mukoprotektives Potential besitzen, sollte in weiteren, translationalen strahlenbiologischen Studien geklärt werden.

Die Mucositis enoralis ist eine häufige und dosislimitierende Nebenwirkung der Strahlentherapie von Kopf-Hals-Tumoren. Die zugrunde liegenden Pathomechanismen sind komplex und beinhalten die Reaktionen und Interaktionen von Epithelzellen, Fibroblasten, Makrophagen und Gef¨aßendothelzellen. Dies schließt die vermehrte Bildung von Stickstoff-Monoxid (NO) in Folge einer Stimulation der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) ein. Ziele der Untersuchungen: Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Wirkung von L-NAME (nitro-L-Arginin-Methyl-Ester), einem unselektiven Inhibitor der NOS, auf die Strahlenreaktion der oralen Mukosa im etablierten Tiermodell der Schleimhaut der Zungenunterseite der Maus zu untersuchen. Materialien und Methoden: Die Untersuchungen erfolgen mit Mäusen des InzuchtWildtypstammes C3H/Neu. Als Bestrahlungstechniken kommen die perkutane Schnauzenbestrahlung (200 kV Röntgenstrahlung) und/oder die lokale Bestrahlung (25 kV Röntgenstrahlung) eines 3·3 mm2 großen Testfeldes der Zungenunterseite der Maus zum Einsatz. In Fraktionierungsprotokollen werden 5x3 Gy/Woche über 1 (Tage 04) sowie 2 Wochen (Tage 0-4, 7-11) auf die gesamte Schnauze der Tiere appliziert. Anschließend erfolgt eine lokale Aufsättigungsbestrahlung mit gestaffelten Dosen (5 Dosisgruppen, je 10 Tiere) zur Generierung kompletter Dosis-Effekt-Kurven (Tag 7 bzw. 14). Einzeitbestrahlungen des lokalen Testfeldes finden ebenfalls mit gestaffelten Dosen statt. L-NAME (täglich 0,2 mg/kg i.p.) wird an den Bestrahlungstagen 30 Minuten vor der Bestrahlung appliziert. Bei Einzeitbestrahlung werden 2 verschiedene Behandlungszeiträume getestet: 3 Tage vor der Bestrahlung bis zur Erstdiagnose (-3/D) oder Ausheilung der Ulzerationen (-3/H). In Kombination mit fraktionierter Bestrahlung über 1 Woche werden 3 Zeiträume untersucht (-3/7, -3/D oder -3/H). Bei 2 Wochen fraktionierter Bestrahlung erfolgt die L-NAME-Gabe in folgenden Intervallen: -3/7, -3/D, -3/H, -3/14 oder 7/14. Als quantaler Endpunkt für Dosis-EffektAnalysen dient die Ulzeration der Schleimhaut im Testfeld. Mittels Logit-Analyse werden Dosis-Effekt-Beziehungen ermittelt. Der ED50-Wert und dessen Standardabweichung σ dienen der Charakterisierung der Dosis-Effekt-Kurven. In histologischen Untersuchungen werden maximal 10 Fraktionen zu 3 Gy über 2 Wochen appliziert, mit/ohne Gabe von L-NAME von Tag -3 bis zur Tötung. Die Zungenentnahme erfolgt bei je 5 Tieren in zweitägigen Abständen (Tag 1 bis 25). Ergebnisse: Für die alleinige Einzeitbestrahlung ergibt sich eine signifikante Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz mit einer ED50 von 13,6±1,0 Gy. Die mittlere Latenzzeit beträgt 10,6±1,1 Tage, die durchschnittliche Ulkusdauer 3,5±1,0 Tage. Nach alleiniger einwöchig fraktionierter Bestrahlung beträgt die ED50 der Testbestrahlung 12,3±0,8 Gy. L-NAME von Tag -3 bis Tag 6 bzw. -3/D hat keinen signifikanten Einfluss (ED50 13,3±1,2 Gy bzw. 12,8±1,0 Gy). Lediglich für den Applikationszeitraum Tag -3/H kann eine signifikante Erhöhung der ED50 auf 14,7±1,7 Gy (p=0,0298) nachgewiesen werden. Die Testbestrahlung nach 2-wöchiger Fraktionierung ohne L-NAME ergibt eine ED50 von 13,0±0,1 Gy. L-NAME hat wiederum keinen signifikanten Einfluss auf die Strahlenempfindlichkeit der Mundschleimhaut (ED50-Werte: -3/6 - 12,9±0,1 Gy, -3/14 - 13,0±0,1 Gy, -3/H - 13,8±1,4 Gy und 7/14 - 13,1±0,8 Gy). Während alleiniger fraktionierter Bestrahlung nimmt die Zellzahl zunächst ab (Tag 11: 70 %). Im Anschluss steigt sie über das Ausgangsniveau (Tag 19: 126 %). F¨ur die L-NAME-behandelte Schleimhaut findet sich ein qualitativ vergleichbarer Verlauf; es zeigt sich lediglich eine geringfügige Erhöhung der Zellzahl in der funktionellen Schicht (150 % statt 140 %). Die Epitheldicke nimmt unter L-NAME-Behandlung in den ersten Tagen der Nachbeobachtungszeit deutlich zu. Schlußfolgerungen: Zusammenfassend erweist sich in der vorliegenden Arbeit nur die L-NAME-Applikation -3/H bei einwöchig fraktionierter Bestrahlung als wirksam, wobei der Grund f¨ur diese selektive Wirkung unklar bleibt. Offensichtlich sind NOvermittelte Prozesse ohne substanzielle Relevanz f¨ur die epitheliale Strahlenreaktion der Mundschleimhaut. Auf der Basis dieser Ergebnisse ist die Hemmung von iNOS durch L-NAME keine aussichtsreiche Strategie zur Reduktion der radiogenen Mucositis enoralis, und sollte deshalb auch nicht in klinischen Studien verfolgt werden. Die Frage, ob andere (i)NOS-Hemmstoffe ein mukoprotektives Potential besitzen, sollte in weiteren, translationalen strahlenbiologischen Studien geklärt werden.

Bei der Bestrahlung von Kopf-Hals-Tumoren tritt die orale Mukositis als wichtigste und dosislimitierende frühe Nebenwirkung auf. Verschiedene prophylaktische und therapeutische Maßnahmen wurden untersucht, jedoch konnte bisher keine Methode in der klinischen Routine etabliert werden. Ein neuer Ansatz ist die Verwendung des Cholesterinsynthese-hemmers Lovastatin. Für diesen Wirkstoff konnte in vorhergehenden Untersuchungen ein mukoprotektiver Effekt nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde der Zusammenhang zwischen diesem schleimhaut-schützenden Effekt und der Expression von induzierbarer Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS), Nitrotyrosin (NT) und CD105 betrachtet. Das Enzym iNOS ist an Entzündungsreaktionen beteiligt; NT stellt ein Folgeprodukt des durch iNOS gebildeten Stickstoffmonoxids dar. CD105 wird von aktivierten Monozyten und Makrophagen exprimiert. Ausgangsmaterial für die vorliegende Studie waren 174 Präparate aus dem vorangegangenen Tierversuch. In diesem wurde bei Mäusen eine fraktionierte Schnauzenbestrahlung zum Teil mit einer Lovastatingabe kombiniert. Zusätzlich wurden Tiere alleinig mit Lovastatin behandelt. Für diesen Versuch wurden Mäuse des Stammes C3H/Neu verwendet. Die Bestrahlung erfolgte mit 5 x 3 Gy über zwei Wochen. Lovastatin wurde in einer Dosis von 16 mg/kg oral verabreicht. Gegenstand der aktuellen Untersuchung war - neben der allgemeinen histologischen Charakterisierung - die immunhistochemische Darstellung von iNOS, NT und CD105 im Epithel der Zungenunterseite sowie im subepithelialen Gewebe. Ausgewertet wurden die Gesamtzellzahl im Epithel, die Zahl iNOS- und NT-positiver Zellkerne in Germinativ- und funktioneller Schicht sowie jeweils die Farbintensität der positiven Epithelzellen. In der L. propria und L. muscularis wurden die CD105-, iNOS-, und NT-positiven Makrophagen sowie die weiteren iNOS- und NT-positiven Immunzellen erfasst und ihre Farbintensität bestimmt. Weiterhin wurde die Homogenität und Intensität der Expression von iNOS im Endothel bewertet. Die Auswertung umfasst die deskriptive Darstellung der Werteverläufe dieser Parameter. Aufgrund der geringen Anzahl von drei Versuchstieren je Tag und Gruppe wurde auf die Berechnung der statistischen Signifikanz der Ergebnisse verzichtet. Die Gesamtzellzahl im Zungenepithel zeigte bei Bestrahlung eine deutliche Reduktion auf 65 % des Ausgangswertes. Mit Beendigung der Behandlung war eine entsprechende Erholung zu sehen. Die alleinige Lovastatinbehandlung bewirkte dagegen eine Steigerung der Gesamtzell-zahl auf ca. 110 %. Während iNOS sowohl im unbehandelten als auch im behandelten Epithelgewebe nachweisbar war, war NT im unbehandelten Epithel kaum vorhanden. Die Ausgangswerte betrugen 22 % iNOS-positive Kerne in der Germinativschicht und 8 % in der funktionellen Schicht, sowie 2 % und 1 % für die NT-Färbung. In der Germinativschicht waren sowohl bei alleiniger Bestrahlung als auch bei alleiniger Lovastatintherapie 30 - 50 % der Zell-kerne iNOS-positiv. Bei zweiwöchiger Kombinationstherapie lagen die Werte teils darunter; bei Lovastatingabe ab Tag 7 lagen sie vornehmlich in dem oberen Bereich. In der funktionellen Schicht spiegelten sich diese Verteilungsmuster wider, allerdings lag die Anzahl positiver Kerne insgesamt überwiegend unter 30 %. Die Zahl NT-positiver Zellkerne stieg in beiden Schichten infolge der Bestrahlung auf ca. 50 - 60 %. Unter alleiniger Lovastatintherapie lag sie unter 30 %. Die zweiwöchige Kombination zeigte ebenfalls eine Tendenz zum niederen Bereich. Bei Lovastatingabe ab Tag 7 lagen die Werte geringgradig vermehrt im höheren Bereich. Die Anfärbung der Makrophagen gegen CD105 verdeutlichte bei allen Gruppen eine Reduktion der Makrophagenzahl auf ca. 50 % des Ausgangswertes. Auch die Zahl iNOS-positiver Makrophagen reduzierte sich in allen Behandlungsgruppen einheitlich auf unter 80 % der Norm. Die Zahl NT-positiver Makrophagen lag näher am Ausgangswert. Im Gegensatz dazu waren die restlichen Immunzellen unter Behandlung vermehrt iNOS-positiv. Die Werte lagen häufig weit oberhalb des Referenzbereichs. Dabei zeigte im Vergleich die alleinige Bestrahlung die niedrigsten Werte mit maximal 136 % der Norm. Bei der Färbung gegen NT konnten nur bei alleiniger Lovastatinverabreichung konstant Werte oberhalb des Ausgangswertes festgestellt werden. Innerhalb der Untersuchungen konnte das Endothel nur mit iNOS-AK auswertbar angefärbt werden. Es zeigte in allen Gruppen eine durchgängig homogene Färbung. Die Farbintensität war mittelmäßig und wurde in allen Behandlungsgruppen zum Ende des Untersuchungszeitraums kräftiger. Als Resultat dieser Arbeit ist festzuhalten, dass bei allen vier Behandlungsvarianten iNOS und NT in hohem Maße in der Germinativschicht des Epithels exprimiert wurden. In der funktionellen Schicht war die Expression von iNOS schwächer, während die NT-expression nahezu gleich blieb. Damit muss NT eine längere Halbwertszeit haben. Des Weiteren waren nicht alle aktivierten (CD105-positiven) Makrophagen iNOS-positiv und wiederum produzierte iNOS nicht in allen Zellen NT. Dies wurde auch durch die deutlich höhere Zahl iNOS-positiver Immunzellen in den Ll. propriae und musculares deutlich. Die biochemischen Abläufe, durch welche Lovastatin zur Reduktion der radiogenen Mucositis enoralis führt, bleiben daher weiterhin zu erforschen. In der durchgeführten Untersuchung zeigte sich kein eindeutiger Hinweis auf einen Zusammenhang mit dem iNOS-NT-Signaltransduktionsweg.:Abkürzungsverzeichnis VIII 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Bedeutung von Tumorerkrankungen bei Mensch und Tier 3 2.2 Kopf-Hals-Tumoren 4 2.2.1 Tumorvorkommen beim Menschen 4 2.2.2 Tumorvorkommen bei Hund und Katze 4 2.2.3 Symptome beim Kleintier 5 2.2.4 Behandlungsmethoden 5 2.2.4.1 Chirurgie 5 2.2.4.2 Chemotherapie 5 2.2.4.3 Radiotherapie 6 2.2.4.4 Radiochemotherapie 7 2.2.5 Nebenwirkungen der Tumorbehandlung 7 2.2.5.1 Nebenwirkungen der Chemotherapie 7 2.2.5.2 Nebenwirkungen der Radiotherapie 8 2.3 Mucositis enoralis 8 2.3.1 Aufbau von Zunge und Zungenepithel 8 2.3.2 Pathogenese und zeitlicher Verlauf der radiogenen oralen Mukositis 10 2.3.2.1 Stadien der Mukositis und klinisches Erscheinungsbild 10 2.3.2.2 Reaktionskette der Strahlenwirkung 11 2.3.3 Einteilung des Schweregrades der Mukositis 12 2.3.3.1 Einteilung für die Humanmedizin 12 2.3.3.2 Einteilung für die Veterinärmedizin 13 2.3.4 Aktuelle Herangehensweise an die radiogene orale Mukositis 13 2.4 Lovastatin 14 2.4.1 Struktur und Anwendung 14 2.4.2 Weitere Wirkmechanismen von Statinen 14 2.4.2.1 Die apoptotische Wirkung der Statine 15 2.4.3 Eigenschaften im Tiereinsatz 15 2.5 Induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase und Nitrotyrosin 16 2.5.1 Die NOS und Nitrotyrosinbildung 16 2.5.2 Vorkommen von iNOS und Nitrotyrosin 17 3 Zielstellung der Arbeit 19 4 Material und Methoden 20 4.1 Versuchstiere 20 4.2 Perkutane Schnauzenbestrahlung 20 4.3 Applikation von Lovastatin 22 4.4 Versuchsprotokoll 22 4.5 Histologische Aufbereitung 23 4.5.1 Antikörper 23 4.5.1.1 Induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) 23 4.5.1.2 Nitrotyrosin 23 4.5.1.3 CD105 ... 23 4.5.1.4 Kontroll-Antikörper 23 4.5.2 Färbeprotokolle 24 4.5.2.1 iNOS und CD105 24 4.5.2.2 Nitrotyrosin 26 4.5.2.3 Optimierung der Konzentration der primären Antikörper 27 4.5.3 Histologische Auswertung 29 4.5.3.1 Epithel .. 29 4.5.3.2 L. propria und L. muscularis 30 4.5.3.3 Endothel 31 4.6 Analyse 31 5 Ergebnisse 32 5.1 Zellzahlen im Epithel 32 5.1.1 Kontrollgruppe 32 5.1.2 Alleinige Bestrahlung 32 5.1.3 Alleinige Lovastatinbehandlung 33 5.1.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 34 5.1.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 34 5.2 Expression von iNOS 36 5.2.1 Kontrollgruppe 36 5.2.2 Alleinige Bestrahlung 36 5.2.3 Alleinige Lovastatingabe 38 5.2.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 41 5.2.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 43 5.3 Expression von Nitrotyrosin 45 5.3.1 Kontrollgruppe 45 5.3.2 Alleinige Bestrahlung 45 5.3.3 Alleinige Lovastatinbehandlung 47 5.3.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 49 5.3.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 51 5.4 Expression von CD105 54 5.4.1 Alleinige Bestrahlung 54 5.4.2 Alleinige Lovastatinbehandlung 54 5.4.3 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 55 5.4.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 55 6 Diskussion 57 6.1 Klinischer Hintergrund 57 6.2 Tiermodelle für die radiogene orale Mukositis 58 6.2.1 Maus 58 6.2.2 Ratte 58 6.2.3 Hamster 58 6.3 Eigenschaften des unbehandelten Zungengewebes 59 6.3.1 Epithel der Zungenunterseite 59 6.3.1.1 Zellzahl . .59 6.3.1.2 Nachweis von iNOS 59 6.3.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 60 6.3.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 60 6.3.2.1 Nachweis von iNOS 60 6.3.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 60 6.3.2.3 Nachweis von CD105 60 6.3.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 60 6.4 Veränderungen bei konventioneller fraktionierter Bestrahlung 61 6.4.1 Epithel der Zungenunterseite 61 6.4.1.1 Zellzahl . 61 6.4.1.2 Nachweis von iNOS 61 6.4.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 62 6.4.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 62 6.4.2.1 Nachweis von iNOS 62 6.4.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 62 6.4.2.3 Nachweis von CD105 63 6.4.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 63 6.5 Veränderungen bei alleiniger Lovastatinbehandlung 63 6.5.1 Epithel der Zungenunterseite 63 6.5.1.1 Zellzahl . 63 6.5.1.2 Nachweis von iNOS 63 6.5.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 64 6.5.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 64 6.5.2.1 Nachweis von iNOS 64 6.5.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 64 6.5.2.3 Nachweis von CD105 64 6.5.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 65 6.6 Veränderungen bei fraktionierter Bestrahlung mit zusätzlicher Lovastatinbehandlung über 2 Wochen 65 6.6.1 Epithel der Zungenunterseite 65 6.6.1.1 Zellzahl . 65 6.6.1.2 Nachweis von iNOS 65 6.6.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 66 6.6.2 Immunzellen in den L. propria und L. muscularis 66 6.6.2.1 Nachweis von iNOS 66 6.6.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 67 6.6.2.3 Nachweis von CD105 67 6.6.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 67 6.7 Veränderungen bei fraktionierter Bestrahlung mit zusätzlicher Lovastatinbehandlung ab Tag 7 68 6.7.1 Epithel der Zungenunterseite 68 6.7.1.1 Zellzahl . 68 6.7.1.2 Nachweis von iNOS 68 6.7.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 68 6.7.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 69 6.7.2.1 Nachweis von iNOS 69 6.7.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 69 6.7.2.3 Nachweis von CD105 69 6.7.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 70 6.8 Zusammenfassende Einschätzung der Ergebnisse 70 7 Ausblick 72 8 Zusammenfassung 73 9 Summary 75 10 Abbildungsverzeichnis 77 11 Tabellenverzeichnis 80 12 Literatur 81 13 Anhang 92 14 Danksagung 100 / During radiation of head-and-neck-cancer oral mucositis is the most important and dose-limiting early side effect. Different preventive and theoretical procedures were investigated, but so far there has been no method established in clinical routine. A new approach is the application of the cholesterol synthesis inhibitor lovastatin. Previous investigtions proved a mucoprotective effect of this agent. In this investigation the correlation between this mucoprotective effect and the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS), nitrotyrosine (NT) and CD105 was observed. The enzyme iNOS takes part in inflammtory reactions; NT is a secondary product of the nitric oxide produced by iNOS. CD105 is expressed by activated monocytes and macrophages. The source material for this study were 174 preparations from previous animal examinations. In this investigation a daily fractionated radiation of the snout was partly combined with lovastatin applications. In addition some mice were treated with lovastatin only. For this research mice of the line C3H/Neu were used. Radiation was performed with 5 x 3Gy over two weeks. Lovastatin was used at an oral dose of 16mg/kg. The matter of the research was - next to general histological characterisation - the immunohistochemical exposure of iNOS, NT and CD105 in the epithelial layer of the undersurface of the tongue and in the subepithelial tissue. The total cell count in the epithelium, the number of iNOS- and NT-positive nuclei in the germinal and the functional layer, as well as the intensity of the staining were evaluated. In the l. propria and l. muscularis CD105-, iNOS-, and NT-positive macrophages and other iNOS- and NT-positive immune cells were identified and the intensity of their staining was determined. Furthermore the homogeneity and intensity of the expression of iNOS in the endothelium were rated. The analysis contains the descriptive presentation of the value patterns of these parameters. Because of the small number of three test animals per day and group the statistical significance of the results was not determined. In consequence of radiotherapy the total cell count in the epithelium decreased to 65% of origin. Recovery was visible after termination of the treatment. With lovastatin medication only, the cell count increased to approximately 110%. While iNOS was present in the untreated as well as in the treated tissue, NT was hardly visible in the untreated one. The basic values were 22% of iNOS-positive nuclei in the germinal layer and 8% in the functional layer, and 2% and 1% for the NT-staining. Both, sole radiation and sole lovastatin therapy, showed 30-50% iNOS-positive nuclei in the germinal layer. With combined therapy for two weeks the values were partially lower, with lovastatin treatment from day 7 they were in the upper range. This group distribution was reflected in the functional layer, although altogether the quantity of positive nuclei was mostly under 30%. Due to radiation the number of NT-positive nuclei increased to 50-60% in both layers. With sole lovastatin therapy it was under 30%. Combined therapy over two weeks showed a tendency to the lower range too. With lovastatin treatment from day 7 the values were situated a little bit more in the upper range. The macrophage staining against CD105 revealed a reduction of macrophage cell count to approximately 50% of origin in all groups. Likewise the number of iNOS-positive macrophages decreased in all groups consistently to less than 80% of normal. The number of NT-positive macrophages was closer to the origin. In contrast to this, the other immunocompetent cells were increasingly iNOS-positive under treatment. Often values were high above the reference range. In comparison sole radiation therapy showed the lowest values with a maximum of 136% of normal. Regarding the staining against NT only sole lovastatin treatment showed values constantly above origin. Within this study the only evaluable staining for the endothelium was with iNOS-antibody. It showed a constant homogeneous staining in all groups. The intensity of the staining was moderate and increased in all treatment groups towards the end of the examination. Therefore it can be concluded that under treatment iNOS and NT were both highly expressed in the germinal layer. In the functional layer the expression of iNOS was reduced whereas the expression of NT remained about the same. So NT must have a longer half-life. In addition not all activated (CD105-positive) macrophages were also iNOS-positive and again iNOS did not produce NT in all cells. This was also proven by the distinct higher number of iNOS-positive immunocompetent cells in the ll. propriae and musculares. Therefore the biochemical processes, because of which lovastatin leads to the reduction of the radiogenic mucositis enoralis, remain to be investigated. During the present investigation there was no distinct hint for a correlation with the iNOS-NT-pathway.:Abkürzungsverzeichnis VIII 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Bedeutung von Tumorerkrankungen bei Mensch und Tier 3 2.2 Kopf-Hals-Tumoren 4 2.2.1 Tumorvorkommen beim Menschen 4 2.2.2 Tumorvorkommen bei Hund und Katze 4 2.2.3 Symptome beim Kleintier 5 2.2.4 Behandlungsmethoden 5 2.2.4.1 Chirurgie 5 2.2.4.2 Chemotherapie 5 2.2.4.3 Radiotherapie 6 2.2.4.4 Radiochemotherapie 7 2.2.5 Nebenwirkungen der Tumorbehandlung 7 2.2.5.1 Nebenwirkungen der Chemotherapie 7 2.2.5.2 Nebenwirkungen der Radiotherapie 8 2.3 Mucositis enoralis 8 2.3.1 Aufbau von Zunge und Zungenepithel 8 2.3.2 Pathogenese und zeitlicher Verlauf der radiogenen oralen Mukositis 10 2.3.2.1 Stadien der Mukositis und klinisches Erscheinungsbild 10 2.3.2.2 Reaktionskette der Strahlenwirkung 11 2.3.3 Einteilung des Schweregrades der Mukositis 12 2.3.3.1 Einteilung für die Humanmedizin 12 2.3.3.2 Einteilung für die Veterinärmedizin 13 2.3.4 Aktuelle Herangehensweise an die radiogene orale Mukositis 13 2.4 Lovastatin 14 2.4.1 Struktur und Anwendung 14 2.4.2 Weitere Wirkmechanismen von Statinen 14 2.4.2.1 Die apoptotische Wirkung der Statine 15 2.4.3 Eigenschaften im Tiereinsatz 15 2.5 Induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase und Nitrotyrosin 16 2.5.1 Die NOS und Nitrotyrosinbildung 16 2.5.2 Vorkommen von iNOS und Nitrotyrosin 17 3 Zielstellung der Arbeit 19 4 Material und Methoden 20 4.1 Versuchstiere 20 4.2 Perkutane Schnauzenbestrahlung 20 4.3 Applikation von Lovastatin 22 4.4 Versuchsprotokoll 22 4.5 Histologische Aufbereitung 23 4.5.1 Antikörper 23 4.5.1.1 Induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) 23 4.5.1.2 Nitrotyrosin 23 4.5.1.3 CD105 ... 23 4.5.1.4 Kontroll-Antikörper 23 4.5.2 Färbeprotokolle 24 4.5.2.1 iNOS und CD105 24 4.5.2.2 Nitrotyrosin 26 4.5.2.3 Optimierung der Konzentration der primären Antikörper 27 4.5.3 Histologische Auswertung 29 4.5.3.1 Epithel .. 29 4.5.3.2 L. propria und L. muscularis 30 4.5.3.3 Endothel 31 4.6 Analyse 31 5 Ergebnisse 32 5.1 Zellzahlen im Epithel 32 5.1.1 Kontrollgruppe 32 5.1.2 Alleinige Bestrahlung 32 5.1.3 Alleinige Lovastatinbehandlung 33 5.1.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 34 5.1.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 34 5.2 Expression von iNOS 36 5.2.1 Kontrollgruppe 36 5.2.2 Alleinige Bestrahlung 36 5.2.3 Alleinige Lovastatingabe 38 5.2.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 41 5.2.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 43 5.3 Expression von Nitrotyrosin 45 5.3.1 Kontrollgruppe 45 5.3.2 Alleinige Bestrahlung 45 5.3.3 Alleinige Lovastatinbehandlung 47 5.3.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 49 5.3.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 51 5.4 Expression von CD105 54 5.4.1 Alleinige Bestrahlung 54 5.4.2 Alleinige Lovastatinbehandlung 54 5.4.3 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 55 5.4.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 55 6 Diskussion 57 6.1 Klinischer Hintergrund 57 6.2 Tiermodelle für die radiogene orale Mukositis 58 6.2.1 Maus 58 6.2.2 Ratte 58 6.2.3 Hamster 58 6.3 Eigenschaften des unbehandelten Zungengewebes 59 6.3.1 Epithel der Zungenunterseite 59 6.3.1.1 Zellzahl . .59 6.3.1.2 Nachweis von iNOS 59 6.3.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 60 6.3.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 60 6.3.2.1 Nachweis von iNOS 60 6.3.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 60 6.3.2.3 Nachweis von CD105 60 6.3.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 60 6.4 Veränderungen bei konventioneller fraktionierter Bestrahlung 61 6.4.1 Epithel der Zungenunterseite 61 6.4.1.1 Zellzahl . 61 6.4.1.2 Nachweis von iNOS 61 6.4.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 62 6.4.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 62 6.4.2.1 Nachweis von iNOS 62 6.4.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 62 6.4.2.3 Nachweis von CD105 63 6.4.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 63 6.5 Veränderungen bei alleiniger Lovastatinbehandlung 63 6.5.1 Epithel der Zungenunterseite 63 6.5.1.1 Zellzahl . 63 6.5.1.2 Nachweis von iNOS 63 6.5.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 64 6.5.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 64 6.5.2.1 Nachweis von iNOS 64 6.5.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 64 6.5.2.3 Nachweis von CD105 64 6.5.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 65 6.6 Veränderungen bei fraktionierter Bestrahlung mit zusätzlicher Lovastatinbehandlung über 2 Wochen 65 6.6.1 Epithel der Zungenunterseite 65 6.6.1.1 Zellzahl . 65 6.6.1.2 Nachweis von iNOS 65 6.6.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 66 6.6.2 Immunzellen in den L. propria und L. muscularis 66 6.6.2.1 Nachweis von iNOS 66 6.6.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 67 6.6.2.3 Nachweis von CD105 67 6.6.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 67 6.7 Veränderungen bei fraktionierter Bestrahlung mit zusätzlicher Lovastatinbehandlung ab Tag 7 68 6.7.1 Epithel der Zungenunterseite 68 6.7.1.1 Zellzahl . 68 6.7.1.2 Nachweis von iNOS 68 6.7.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 68 6.7.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 69 6.7.2.1 Nachweis von iNOS 69 6.7.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 69 6.7.2.3 Nachweis von CD105 69 6.7.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 70 6.8 Zusammenfassende Einschätzung der Ergebnisse 70 7 Ausblick 72 8 Zusammenfassung 73 9 Summary 75 10 Abbildungsverzeichnis 77 11 Tabellenverzeichnis 80 12 Literatur 81 13 Anhang 92 14 Danksagung 100

A radioterapia para tratamento das neoplasias malignas em região de cabeça e pescoço é acompanhada de diversas complicações, decorrentes do comprometimento dos tecidos radiossensíveis localizados próximos ao tumor. Entre essas complicações a mucosite é a que merece maior destaque. A mucosite é uma reação tóxica inflamatória da mucosa oral causada pelo tratamento citorredutivo induzido pela radioterapia (RT) ou pela quimioterapia (QT). Ela manifesta-se com sinais de edema, eritema, úlcera e formação pseudomembrana, resultando em sintomas de ardência, que pode progredir para dor intensa e consequente prejuízo na alimentação e comunicação verbal. Infecções bacterianas, fúngicas ou virais podem acometer a mucosa bucal irradiada e exacerbar a manifestação da mucosite oral por meio da ativação de fatores de transcrição da resposta inflamatória. Existem poucos dados na literatura sobre a participação dos herpesvirus humanos na mucosite oral induzida pela radioterapia. A proposta desse trabalho foi avaliar a excreção oral dos herpesvirus humanos (HSV-1, HSV-2, EBV, CMV, VZV, HHV6, HHV7 e HHV8) e sua possível associação com o desenvolvimento e agravamento da mucosite oral, em pacientes diagnosticados com carcinoma epidermoide (CEC) de boca e orofaringe, submetidos à radioterapia associado à quimioterapia. Nesse estudo foram analisadas 158 amostras de lavado bucal, de 20 pacientes, submetidos à radioterapia para CEC em região de cabeça e pescoço, coletadas semanalmente, durante todo o tratamento. Foi realizada a extração do DNA dessas amostras e em seguida sua amplificação através da PCR utilizando dois conjuntos de primers: HSVP1/P2 para os subtipos HSV-1, HSV-2, EBV, CMV e HHV-8 e o VZVP1/P2 para os subtipos VZV, HHV-6 e HHV-7. As amostras positivas foram submetidas à digestão enzimática com enzimas de restrição BamHI e BstUI para determinação específica de cada um dos oito herpesvirus. Foi também avaliada clinicamente, a mucosite oral, em cada uma das coletas, seguindo os critérios da OMS e NCIC. As análises da amostra mostraram a excreção do EBV, HHV-6 e HHV-7, em todas as semanas de tratamento radioterápico, enquanto que a excreção do HSV1 não pode ser observada no momento da triagem. Considerando-se todos os períodos em conjunto (Triagem, semanas de radioterapia e Controle), a maior frequência foi de pacientes que excretaram EBV (55,0%), seguida daqueles que excretaram HHV-7 (20,5%). A frequência de excreção de EBV foi significativamente maior do que a dos demais vírus (Teste ?2, p<0.001 para todos os cruzamentos). A frequência de excreção de HHV-7 foi significativamente maior do que a de HSV-1 (5,9%) e HHV-6 (5,5%) (Teste ?2, p=0.001 para ambos os cruzamentos). Não houve diferenças estatísticas significantes entre as frequências de HSV-1 e HHV-6. Como conclusão, verificou-se uma correlação positiva entre a excreção oral do EBV e a presença de mucosite induzida pela associação de radioterapia e quimioterapia com graus >=2, sobretudo se considerarmos as três últimas semanas de radioterapia, período este em que a severidade da mucosite foi estatisticamente maior. Esses achados nos possibilitam inferir que o ambiente inflamatório local de mucosites com grau >=2 seja mais favorável para excreção oral do EBV. / The radiotherapy (RT) treatment for head and neck tumors is accompanied by various complications resulting from the damage of the radiosensitive tissues located close to the tumor. Among these complications, mucositis is the one that deserves a special attention. Mucositis is an inflammatory toxic reaction of the oral mucosa caused by cytoreductive treatment induced by radiotherapy (RT) or chemotherapy (QT). The clinical manifestations of mucositis are: edema, erythema, ulcers and pseudo membrane formation, resulting in symptoms of burning, which may progress to severe pain and consequent loss in deglutition and verbal communication. The development of bacterial, fungal or viral infections, may affect the oral mucosa that has been irradiated, exacerbating the manifestation of oral mucositis through the activation of transcription factors of the inflammatory response. There are few data in the literature on the participation of human herpesvirus in oral mucositis caused by radiotherapy treatment. The aim of this study is to evaluate the oral excretion of human herpesvirus (HSV-1, HSV-2, EBV, CMV, VZV, HHV6, HHV7 and HHV-8) and its possible association with the development and aggravation of oral mucositis, in patients diagnosed with squamous cell carcinoma (CEC) of oral cavity and oropharynx, undergoing radiotherapy treatment associated with chemotherapy. On our study, we analyzed 158 oral rinsing samples, collected weekly, from 20 patients during the whole radiotherapy treatment for squamous cell carcinoma in head and neck. From these samples, we extracted the DNA and afterwards we amplified them with PCR using two sets of primers: HSVP1/P2 for the subtypes HSV-1, HSV-2, EBV, CMV, and HHV-8 and VZVP1/P2 for the subtypes VZV, HHV 6, and HHV-7. The positive samples were subjected to enzymatic digestion with BamHI and BstUI restriction enzymes for specific determination of each one, of the eight\'s herpesvirus. It has also been clinically evaluated in each time, the oral mucositis, following the WHO and NCIC criteria. The analysis of the sample showed the excretion of EBV, HHV-6 and HHV-7, in all the weeks of radiotherapy, whereas the excretion of HSV-1 could not be observed during screening. Considering all periods together (Screening, weeks of radiotherapy and Follow up), the highest frequency was of patients with EBV excretion (55.0%), followed by those with HHV-7 excretion (20.5%). EBV shedding frequency was significantly higher than the other viruses (?2 test, p <0.001 for all junctions). The frequency of HHV-7 excretion was significantly higher than the HSV-1 excretion (5.9%), and HHV-6 excretion (5.5%) (?2 Test, p = 0.001 for both junctions). There were no statistically significant differences between the frequencies of HSV-1 and HHV- 6. In conclusion, there was a positive correlation between oral EBV excretion and the presence of grade >=2 of mucositis caused by radiotherapy associated with chemotherapy, particularly if we consider the last three weeks of radiotherapy, a period in which the severity of mucositis was statistically higher. These findings allow us to infer that the local inflammatory environment of mucositis grade >=2, is more favorable for oral excretion of EBV.

A mucosite bucal está entre as principais complicações decorrentes do tratamento antineoplásico em pacientes com leucemia linfóide aguda (LLA). Entre os fatores de risco para sua ocorrência destacam-se a idade, o gênero e a leucometria inicial, além das drogas quimioterápicas com comprovada ação estomatotóxicas. O objetivo deste estudo foi investigar a prevalência e os fatores de risco para a mucosite bucal em pacientes com LLA submetidos a diferentes protocolos de tratamento quimioterápicos. Um total de 169 prontuários clínicos de pacientes oncológicos pediátricos submetidos a diferentes protocolos de tratamento para LLA no Setor de Oncologia Pediátrica do Hospital Infantil Darcy Vargas, na cidade de São Paulo, no período compreendido entre 1994 a 2005 foram, retrospectivamente, avaliados. Os dados demográficos (idade e gênero) e clínicos (leucometria inicial, protocolo de tratamento a que foi submetido, evolução, ocorrência de mucosite e outras lesões bucais) foram registrados. A associação da mucosite bucal com as variáveis clínicas e demográficas foi obtida pelos testes do qui-quadrado e análise de regressão logística multivariada. Os resultados demonstraram uma freqüência de mucosite bucal em 46% dos pacientes oncológicos pediátricos com LLA sem correlação estatisticamente significativa entre sua ocorrência e o gênero (p=0,08), a idade (p=0,33) e a leucometria inicial (p=0,34). Na análise multivariada o protocolo de tratamento do grupo Berlim- Frankfurt-Munique de 1995 (ALL-BFM 95), de acordo com as variáveis avaliadas neste estudo, mostrou ser o fator mais significativo (p=0,009) para a ocorrência da mucosite bucal. Esses resultados fortemente sugerem uma maior estomatotoxicidade do protocolo ALL-BFM 95 comprovadas pela maior freqüência de mucosite bucal nos pacientes ontológicos pediátricos com LLA. Portanto, concluímos que a mucosite bucal deveria ser sistematicamente analisada nos centros especializados no tratamento da LLA que adotam diferentes protocolos de tratamento, visando não somente contribuir com a análise do grau de toxicidade das drogas quimioterápicas, mas principalmente, melhorar a qualidade de vida do paciente com base em condutas terapêuticas e profiláticas mais efetivas na prevenção de sua ocorrência. / Oral mucositis is one of the main complications secondary to antineoplastic treatment in patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL). The risk factors for its occurrence include age, gender and initial leukocyte count, besides chemotherapeutic drugs with known stomatotoxic action. This study investigated the prevalence and risk factors to oral mucositis in patients with ALL submitted to different chemotherapeutic treatment protocols. A total of 169 clinical records of pediatric oncology patients submitted to different treatment protocols for ALL at the Pediatric Oncology Sector of the Child Hospital Darcy Vargas, in the city of São Paulo, in the period 1994 to 2005 were retrospectively evaluated. Demographic (age and gender) and clinical data (initial leukocyte count, treatment protocol adopted, evolution, occurrence of mucositis and other oral lesions) were recorded. The association of oral mucositis with the clinical and demographic variables was assessed by the chi-square test and multivariate logistic regression analysis. The results demonstrated occurrence of oral mucositis in 46% of pediatric oncology patients with ALL, without statistically significant correlation between its occurrence and gender (p=0.08), age (p=0.33) and initial leukocyte count (p=0.34). Multivariate analysis revealed that the Berlin-Frankfurt-Munich protocol of 1995 (ALL-BFM 95) was the most significant factor (p=0.009) to the occurrence of oral mucositis according to the variables evaluated in this study. These results strongly suggest the greater stomatotoxic effect of the ALL-BFM 95 protocol, as demonstrated by the higher frequency of oral mucositis in pediatric oncology patients with ALL. Thus, it may be concluded that oral mucositis should be systematically analyzed in centers specialized in the treatment of ALL adopting different treatment protocols, with a view to contribute to analysis of the degree of toxicity of chemotherapeutic drugs and mainly to improve the quality of life of patients on the basis of more effective therapeutic and prophylactic approaches for prevention of its occurrence.

A ocorrência de leveduras do gênero Candida spp. constitui uma ameaça a saúde bucal de pacientes oncológicos submetidos ao tratamento antineoplásico. Diante do exposto,objetivou-se no estudo avaliar as variáveis clínicas de pacientes oncológicos portadores ou não de Candida spp. na saliva; estimar a prevalência dessas cepas, avaliar a atividade antimicrobiana dos antissépticos bucais e, determinar o perfil de sensibilidade aos antifúngicos. Foram coletadas amostras de salivas de pacientes oncológicos, com e sem mucosite. A saliva foi submetida a diluição decimal seriada até 10-3 e semeada em meio de cultura (CHROMagarTM Candida) para quantificação das unidades formadoras de colônias por mililitro de saliva (UFC/mL). Também, realizaram-se provas bioquímicas específicas para identificação das espécies. Na avaliação da atividade antimicrobiana dos antissépticos bucais (Periogard®, Cepacol® Cool Ice e Clorexidina a 0,12%) utilizouse a Diluição Inibitória Máxima (DIM). O perfil de sensibilidade destas cepas a anfotericina B e fluconazol foi realizado pela Concentração Inibitória Mínima (CIM) por meio das fitas Etest®. Na análise estatística utilizou-se os testes não paramétricos de McNemar e Wilcoxon, com nível de significância (=0,05). Totalizou-se 34 pacientes dos quais 79,4% eram masculinos e 19(55,9%) estavam com mucosite. Das amostras de saliva 9(26,5%) eram positivas para Candida spp.. Evidenciou-se 12 cepas distintas de Candida spp., sendo 7(20,6%) C. albicans, 3(8,8%) C. glabrata e 2(5,9%) C.tropicalis. A mucosite foi mais freqüente 66,7% nos portadores de Candida. Comparando os resultados da DIM foi possível verificar que o Cepacol® Cool Ice apresentou os melhores resultados. A Clorexidina a 0,12% teve a pior atividade, sendo que 4 (11,8%) das cepas não foram inibidas na diluição de 1:10. Com relação ao perfil de sensibilidade, todas cepas foram sensíveis a anfotericina B e 2 (5,9%) das cepas de Candida glabrata apresentaram sensibilidade dose dependente ao fluconazol. Pesquisas adicionais são necessárias sobre o uso de antissépticos na manutenção da saúde bucal desses pacientes, especialmente, considerando o elevado risco de mucosite. / The occurrence of Candida spp. is a threat to the oral health of cancer patients undergoing antineoplastic treatment. This study described the clinical variables of cancer patients with or without Candida spp. in the saliva; determined the prevalence of these strains, and assessed mouthwashes antimicrobial activity and the sensitivity profile to antifungals. Saliva samples of cancer patients, with or without mucositis, were collected. Saliva was subject to serial decimal dilution up to 10-3 and sowed in culture (CHROMagarTM Candida) to quantify the number of colony forming units per milliliter of saliva (CFU/mL). Specific biochemical tests were also done to identify the species. The Maximum Inhibitory Dilution (MID) was used to assess the antimicrobial activity of the mouthwashes (Periogard®, Cepacol® Cool Ice and 0.12% Chlorhexidine). The sensitivity profile of the strains as to amphotericin B and fluconazole was done by the Minimum Inhibitory Concentration (MIC), using Etest® strips. Non-parametric McNemar and Wilcoxon tests were used for statistical analysis, with level of significance (= 0.05). Of the 34 patients, 79.4% were male and 19 (55.9%) had mucositis. 9(26.5%) tested positive for Candida spp. in the saliva. Regarding the diversity of species, the study evidenced 12 different strains of Candida spp., 7 (20.6%) C. albicans, 3(8.8%) C. glabrata and 2 (5.9%) C. tropicalis. Mucositis was more common in patients with Candida, 66.7%. Comparing the MID results, it was verified that Cepacol® Cool Ice presented better results than other products. The worst activity was presented by 0.12% Chlorhexidine, 4(11.8%) of the strains were not inhibited at 1:10 dilution. As to the sensitivity profile, all strains were sensitive to amphotericin B and 2 (5.9%) strains of Candida glabrata were Dose-Dependent Sensitive to fluconazole. Additional research is needed to broaden the scientific evidences of the use of antiseptics in the maintenance of these patients oral heath, especially considering the high risk of mucositis.

Neste estudo clínico verificaram-se os efeitos do laser em baixa intensidade na prevenção e tratamento da mucosite oral radio e/ou radioquimioinduzida. Foram selecionados 31 pacientes portadores de câncer em cabeça e pescoço a serem submetidos à radioterapia ou a radioterapia em associação a quimioterapia, os quais foram distribuídos aleatoriamente em três grupos: grupo 1 (controle) tratamento medicamentoso; grupo 2 tratamento medicamentoso e laserterapia diária, a partir do início da ulceração referente à mucosite grau 2 e grupo 3 tratamento medicamentoso e laserterapia diária a ser iniciada imediatamente antes do início da radioterapia. Os parâmetros de irradiação foram: comprimento de onda de 660nm, potência de 100mW, modo de operação contínuo, aplicação pontual, energia de 2J por ponto em 30 pontos pré-determinados, sendo o tempo utilizado de 20s por ponto. O grupo controle recebeu tratamento medicamentoso que consistia no uso de um conjunto de medidas preventivas e terapêuticas para abordagem dos efeitos adversos agudos radioinduzidos. Os resultados foram avaliados, quanto à ocorrência, graus e escore de dor associados à mucosite oral, perda de massa corpórea, uso de sonda nasogástrica, necessidade de internação e interrupção do tratamento oncológico decorrentes da mucosite oral. Os resultados indicam que o protocolo de aplicação do laser em sua forma preventiva é o mais efetivo na prevenção e tratamento da mucosite oral e que seu uso diário contribuiu para o alívio da sintomatologia dolorosa colaborando para melhora da qualidade de vida do paciente oncológico. / In this clinical study verified the effects of low intensity laser in the prevention and treatment of oral mucositis radio and/or chemical induced. Thirty one patients with head and neck cancer were selected before being submitted to cancer exclusive radiotherapy or radio and associated chemotherapy. The patients were distributed into three randomly groups as follows: group 1- (control) conventional medicine treatment; group 2 conventional medicine treatment and daily lasertherapy as soon as grade two oral mucositis appeared; group 3 conventional medicine treatment and daily lasertherapy to be initiated immediately before radiotherapy sessions.The irradiation parameters were: wavelength of 660nm, potency of 100mW, continuous mode, punctual application, 2J energy on thirty pre-determined 30 points, with 20s of exposure per point. The control group received medical treatment which consisted in using a set of preventive and therapeutic approach for acute radiation-induced adverse effects. Results were evaluated observing occurrence and grade of oral mucositis, score of pain, loss of body mass, use of nasogastric sound line, internment and interruption of oncologic treatment due to oral mucositis. The results showed that the preventive protocol as used was the most effective in prevention and treatment of oral mucositis and that its daily application contributed in relieving the painful symptomatology so collaborating to maintain and/or bettering the life quality of oncologic patients.

Um dos maiores desafios da Implantodontia é manter a osseointegração e a saúde dos tecidos peri-implantares após a instalação da prótese. Para que uma reabilitação sobre implantes tenha longevidade é necessário que se realize a manutenção da saúde dos tecidos peri-implantares. Existe uma relação direta entre o acúmulo de biofilme e a presença da inflamação desses tecidos, denominada mucosite. Essa condição pode evoluir para uma peri-implantite. A proposta deste estudo foi encontrar uma solução preventiva às doenças peri-implantares, através do controle do biofilme. Avaliou-se a ação antibacteriana de três tipos de revestimentos nanoestruturados com prata aplicados à superfície de discos de titânio frente a cepas de microrganismos peri-implanto-patogênicos. Após determinado o melhor revestimento, analisou-se, também, se a quantidade de prata (3 ou 6 camadas) melhorava sua ação antimicrobiana. Foram confeccionados discos de titânio divididos em 4 grupos: titânio sem deposição (controle), titânio com deposição de solução coloidais de prata e sílica (Si02), titânio com deposição de solução coloidal hidrotermalizada de prata e dióxido de titânio (TiAg) e titânio com deposição de solução hidrotermalizada somente com dióxido de titânio (TiAa). Testou se a efetividade da atividade antimicrobiana dos revestimentos estudados por meio da contagem das colônias bacterianas, encontradas na superfície das placas de ágar sangue. Para permitir uma contagem correta do crescimento das colônias, realizou se diluição seriada e, após incubação a 37°C em anaerobiose, a contagem do número de colônias e, posteriormente, o cálculo das unidades formadoras de colônia (UFC/mL). Após determinação do melhor revestimento, foram desenvolvidos biofilmes monoespécie sobre discos de titânio com 3 e 6 camadas do revestimento SiO2, além dos grupos controle positivo (C.positivo) e negativo (C.negativo), utilizando as cepas Streptococcus gordonii. A atividade microbiana nos biofilmes foi determinada pelo método de XTT. Utilizou-se três discos de cada grupo por teste (triplicata) e realizado a leitura em espectrofotômetro à 450 nm e 492 nm. Os resultados obtidos com cepa de A. actinomycetemcomitans, apresentaram diferença estatística (p<= 0,01) entre o grupo controle (branco) e os grupos teste. Observou-se um maior número de bactérias A.a na superfície branca quando comparado com as superfícies nanoestruturadas com prata, sendo que o grupo SiO2 foi o que apresentou melhor resultado. Notou-se, também, que houve uma maior quantidade da bactéria P.gingivalis na superfície dos discos brancos quando comparado com os grupos com revestimentos nanoestruturados com prata. As bactérias S.aureus e F.nucleatum , porém, não apresentaram redução nos discos com filmes nanoestruturados quando comparados ao disco sem revestimento. Os discos com 6 camadas do revestimento SiO2 apresentaram eficiência semelhante a clorexidina 0,12%, na redução do biofilme da S.gordonii. Conclui-se que os revestimentos nanoestruturados com partículas de prata foram efetivos na redução de UFC/ml das bactérias A. actinomycetemcomitans e P.gingivalis, com o melhor resultado observado com revestimento SiO2. A concentração da prata interferiu positivamente nos resultados com a bactéria S.gordonii. / One of implantology\'s major challenge is to maintain the osseointegration and health of the peri-implant tissues after the installation of the prosthesis. To ensure implant rehabilitation\'s longevity it is necessary to maintain the health of the peri-implant tissues. There is a direct relationship between the accumulation of biofilm and the presence of inflammation of these tissues, called mucositis. This condition can progress to peri-implantitis. The purpose of this study was to find a preventive solution to peri-implant diseases through biofilm control. For this, the antibacterial action against strains of peri-implant-pathogenic of three types of nanostructured coatings with silver applied to the surface of titanium discs microorganisms was evaluated. After determining the best coating, it was also analyzed whether the amount of silver (3 or 6 layers) improved its antimicrobial action. Titanium disks were divided into 4 groups: titanium without deposition (control), titanium with deposition of colloidal solution of silver and silica (SiO2), titanium with deposition of colloidal hydrothermalized solution of silver and titanium dioxide (TiAg) and titanium with deposition of a hydrothermal solution only with titanium dioxide (TiAa). The effectiveness of the coatings was tested by counting the bacterial colonies found on the surface of the blood agar plates. In order to allow a correct colony count, a serial dilution was performed and, after incubation at 37 ° C in anaerobiosis, counting the number of colonies and, later, calculating the colony forming units (CFU / mL). After determination of the best coating, monospecies biofilms were prepared on 3 and 6 layer titanium discs of the SiO2 coating, in addition to the positive control (C.positive) and negative (negative) groups, using Streptococcus gordonii strains. The microbial activity in biofilms was determined by the XTT method. Three disks of each group were used per test (triplicate) and the spectrophotometer read at 450 nm and 492 nm. The results obtained with A. actinomycetemcomitans strain presented a statistical difference (p<=0.01) between the control group (blank) and the test groups. A higher number of A.a bacteria was observed on the blank surface when compared to the nanostructured surfaces with silver, and the SiO2 group showed the best results. It was also noted that there was a greater amount of P.gingivalis bacteria on the surface of the blank discs when compared to the groups with nanostructured coatings with silver. The bacteria S. aureus and F. nucleatum, however, did not present reduction in the discs with nanostructured films when compared to the disc without coating. The 6- layer discs of the SiO2 coating presented similar efficiency to 0.12% chlorhexidine in reducing the S. gordonii biofilm. We concluded that nanostructured coatings with silver particles were effective in reducing CFU/ml of A. actinomycetemcomitans and P.gingivalis bacteria and the best result was observed with SiO2 coating. The concentration of silver interfered positively decreasing S.gordonii bacteria number.

A mucosite bucal (MB) é uma complicação inflamatória frequente manifestada pelos pacientes submetidos ao transplante de células-tronco hematopoéticas (TCTH), em decorrência do agressivo regime terapêutico empregado. Entretanto, sua prevenção e tratamento ainda são controversos na literatura. A Chamomilla recutita tem sido utilizada com propósitos terapêuticos há séculos, e alguns centros de TCTH a empregam tanto para a prevenção como para o tratamento da MB. Contudo, não se identificaram estudos que investigassem sua ação nessa clientela. Assim, o presente estudo tem por finalidade comparar a incidência, intensidade e os dias de mucosite bucal de pacientes adultos submetidos ao TCTH segundo as doses (0,5; 1 ou 2%) de Chamomilla recutita em enxaguatório bucal. Para tanto, este estudo foi conduzido em quatro etapas. Primeiramente, realizou-se revisão integrativa da literatura, com o intuito de identificar as evidências científicas disponíveis, em relação ao uso da Chamomilla recutita para redução da ocorrência e intensidade de processos inflamatórios. Evidenciou-se que a Chamomilla recutita possui provável ação antiinflamatória tópica, para diversas alterações inflamatórias. Considerando os resultados desta revisão e os obtidos nos estudos in vitro e em animais, julgou-se oportuno desenvolver o estudo clínico. Na segunda etapa, procedeu-se à seleção da droga vegetal, análise físicoquímica, microbiológica e à quantificação da apigenina-7-glucosídeo. Os testes realizados identificaram a excelente qualidade dos capítulos florais da amostra selecionada. Em seguida, na terceira fase, obteve-se o extrato fluido, cujas análises evidenciaram a manutenção da qualidade e do teor do princípio ativo. Posteriormente, incorporou-se o extrato com sucesso em três formulações de enxaguatório bucal, de acordo com as dosagens propostas para o estudo clínico (0,5; 1 e 2%). Finalmente, foi realizado o estudo clínico com 23 pacientes submetidos ao TCTH alogênico, randomizados em quatro grupos. Em relação à incidência de mucosite 5 (83,3%) pacientes do grupo B que receberam o enxaguatório com Chamomilla recutita, na dose de 1%, não apresentaram manifestações da mucosite bucal, enquanto 4 (80%) pacientes do grupo D (controle) apresentaram manifestações da MB. Destaca-se também que no grupo C, 3 (50%) pacientes não manifestaram MB. Quanto à intensidade, nenhum grupo apresentou o grau máximo (IV). Contudo, 66,6% dos pacientes do grupo A, 16,7% do B, 50% do C e 60% do D apresentaram mucosite graus II e III. Em relação ao sabor, aroma e cor a maioria dos pacientes os classificaram como sendo muito agradável ou agradável. A náusea foi a única manifestação relatada por dois pacientes durante a realização do bochecho. Dessa forma, os resultados evidenciaram uma possível ação do enxaguatório contendo Chamomilla recutita na redução da incidência da mucosite, na dose de 1%, em pacientes submetidos ao TCTH, bem como uma menor intensidade de mucosite graus II e III nos grupos que receberam as doses de 1 e 2%. Contudo, para confirmar estes achados faz-se necessário ampliar a amostra deste estudo empregando o método aqui desenvolvido. O enxaguatório bucal de Chamomilla recutita nas dosagens de 0,5; 1 e 2% foi bem tolerado pelos pacientes e demonstrou ser seguro, uma vez que nenhum efeito adverso moderado ou severo foi identificado. / Oral mucositis (OM) is an inflammatory complication frequently manifested by patients undergoing Hematopoietic Stem Cell Transplantation (HSCT), as a result of aggressive treatment regimen employed. However, prevention and treatment are still controversial in literature. Chamomile has been used for therapeutic purposes for centuries and has been employed in some HSCT services for both prevention and treatment of OM. However, no studies that investigate its action in this clientele have been identified. Thus, this study aimed to compare the incidence, intensity and duration of oral mucositis in adult patients undergoing HSCT according to the doses (0.5; 1 or 2%) of Chamomilla recutita in mouthwash. The study was carried out in four stages. First an integrative literature review was conducted, in order to identify the scientific evidence available regarding the use of Chamomilla recutita to reduce the occurrence and intensity of inflammatory processes. It was evidenced that Chamomilla recutita is likely to have topic anti-inflammatory action, for several inflammatory disorders. Considering the results of this review and those obtained with studies in vitro and in animals, it was deemed appropriate to develop the clinical study. At the second stage, the plant drug was selected, physical-chemical and microbiological analysis were carried out and quantification of apigenin-7-glucoside was determined. Tests identified the excellent quality of capitula from the selected sample. In sequence, at the third phase, the fluid extract was obtained, whose analysis showed the maintenance of quality and content of active principle. Subsequently, the extract was successfully incorporated in three formulations of mouthwash, according to the dosages proposed for the clinical study (0.5; 1 and 2%). At last, a clinical study with 23 patients who underwent allogeneic HSCT was performed, randomized into four groups. Regarding the incidence of mucositis, 5 (83.3%) patients in group B who received the mouthwash with Chamomilla recutita, at the 1% dose, did not show manifestations of oral mucositis, while 4 (80%) patients in group D (control) presented signs of oral mucositis. It is highlighted that in group C 3 (50%) patients did not present mucositis. As for intensity, no group showed the highest degree (IV). However, 66.6% of patients in group A, 16.7% in B, 50% of C and 60% of D had mucositis grades II and III. Regarding the taste, flavor and color, most patients rated them as being very pleasant or pleasant. Nausea was the only manifestation reported by patients during the course of mouthwash, registered by 1 (25%) patient in group B and 1 (16.7%) in group C. Thus, results evidenced a possible action of the mouthwash containing Chamomilla recutita in reducing the incidence of mucositis at a dose of 1% in HSCT patients, as well as a lower intensity of mucositis grades II and III in groups that received 1 and 2% doses. However, to confirm these findings it is necessary to enlarge the sample using the method developed by this study. The mouthwash with Chamomilla recutita in dosages of 0.5; 1 and 2% was well tolerated by patients and demonstrated to be safe, since no moderate or severe adverse effect was identified.

A Mucosite Oral (MO) é uma consequência debilitante do tratamento oncológico, que pode ser tratada com o uso do laser de baixa potência (LBP). Entretanto, ainda não há consenso na literatura a respeito de parâmetros dosimétricos para o reparo da mucosa oral. Dessa forma, o objetivo do estudo foi comparar diferentes protocolos com laser de baixa potência (FLBP) para o tratamento da MO, através de análises clínicas e histológicas. Quinze hamsters foram usados, em um modelo de indução de MO por 5-Fluorouracil (5-FU) e ranhuras superficiais na mucosa oral, com 7 dias de acompanhamento clínico. Os animais foram divididos em cinco grupos: Controle (C), que recebeu apenas anestesia e o veículo do quimioterápico, Controle-Quimioterapia (CQ) que recebeu anestesia, 5-FU e ranhuras, Laser Protocolo 1 (L1) que recebeu o mesmo do grupo CQ + FLBP 6 J/cm²/0,24 J (um ponto), Laser Protocolo 2 (L2) o mesmo do grupo CQ + FLBP 25 J/cm²/1 J (um ponto) e Laser Protocolo 3 (L3), o mesmo do grupo CQ + FLBP 6 J/cm²/0,96 J (4 pontos de 0,24J). O laser foi utilizado em ?=660 nm, com área do spot de 0,04 cm² e 40 mW de potência. O melhor protocolo de FLBP para manter os graus de MO mais baixos, em relação ao grupo CQ, foi o L1, seguido dos protocolos L2 e L3. Os resultados histológicos demonstraram padrão semelhante entre os grupos L1, L2 e C, com alguns vasos sanguíneos e a presença de um fino epitélio de aspecto contínuo no dia 7. Nossos resultados sugerem que o modo de aplicação do LBP e a energia entregue por área pode interferir na reparação da MO. / Oral mucositis (OM) is a dose-limited debilitating consequence from cancer treatment that could be treated with low level laser therapy (LLLT); however, there is no consensus about its dosimetric parameters for oral mucosa healing. Thus, the aim of this study is to compare different LLLT protocols on the treatment of OM, through clinical and histological analysis. Fifteen hamsters were used, in an induced model of OM by 5-Fluorouracil (5-FU) and superficial scratching in oral mucosa, in seven days of follow-up. The animals were divided into 5 groups: Control (C) which received only anesthesia and chemotherapic vehicle; Control-Chemotherapy (Ch) which received anesthesia, 5-FU and scratches; Laser Protocol 1 (L1) the same as Ch group + LLLT 6 J/cm²/0.24J (one point); Laser Protocol 2 (L2) the same as Ch group + LLLT 25J/cm²/1J (one point); and Laser Protocol 3 (L3) the same as Ch group + LLLT 6 J/cm²/0.96 J (4 points of 0.24J). The laser that was used has ?=660 nm, 0.04 cm² of spot area and 40 mW of power. The best LLLT protocol to maintain lowest OM levels compared to Ch group was L1, followed by L2 and L3. Histological results demonstrated a similar pattern among L1, L2 and C groups, with some blood vessels presence and continuous aspect of a thin epithelium, on day 7. Our results suggest that the application mode of LLLT and the energy delivered per area could interfere in the oral mucositis healing.