Memoria para optar al Título de Bioquímico / Se ha descrito que los ésteres derivados del ácido gálico poseen efecto citotóxico sobre las células tumorales. En este trabajo se analizaron los mecanismos de muerte celular, inducidos por los compuestos catiónicos lipofílicos derivados del ácido gálico: galato de octil trifenilfosfonio, galato de decil trifenilfosfonio, undecil galato de trifenilfosfonio y lauril galato de trifenilfosfonio [C8TPP+, C10TPP+, C11TPP+ y C12TPP+, respectivamente]. Para ello se utilizaron las líneas celulares de adenocarcinoma mamario de ratón TA3 y de leucemia linfoblástica aguda humana CCRF/CEM, con sus respectivas variantes multiresistentes TA3-MTX-R y CEM/C2. Estas células fueron tratadas con distintas concentraciones (0,5, 15, 30 y 50 μM) de los cationes lipofílicos, durante 2 y 4 horas y al cabo de estos periodos se determinó la viabilidad celular. El tratamiento con los cationes C10TPP+ y C12TPP+ produjo una disminución significativa de la viabilidad de las células tumorales; sin embargo, los cationes C8TPP+ y C11TPP+ no produjeron efectos significativos. Las microfotografías obtenidas por microscopía electrónica de transmisión evidenciaron alteraciones profundas en la ultraestrucutura mitocondrial de las células TA3 provocadas por el catión C12TPP+. Más aún, el tratamiento con los cationes C10TPP+ y C12TPP+ produjo la sobrexpresión del gen pro-apoptótico gadd45α, en todas las líneas celulares y en la mayoría de las condiciones ensayadas; la expresión del gen bax no fue afectada; el gen gabarap se sobrexpresó sólo en las líneas celulares CCRF/CEM y CEM/C2, y en dos de las condiciones ensayadas. Estos resultados en conjunto muestran que tanto C10TPP+ como C12TPP+ son los compuestos citotóxicos más potentes, y que la muerte celular ocurriría principalmente a través de la inducción de la vía intrínseca de apoptosis, y en menor porcentaje estaría dada por autofagia / It has been reported that esters of Gallic acid have cytotoxic effects on cancer cells. In this work we analyzed the mechanisms of cell death induced by lipophilic cation derivatives of Gallic acid: octyl triphenylphosphonium gallate decyl triphenylphosphonium gallate, undecyl triphenylphosphonium gallate, and dodecyl triphenylphosphonium gallate [C8TPP+, C10TPP+, C11TPP+ and C12TPP+, respectively]. Cell lines used in this study were: TA3 (mouse mammary adenocarcinoma) and CCRF/CEM (human acute lymphocytic leukemia) and their multiresistant variants TA3 MTX-R and CEM/C2, respectively. These cell lines were treated with increasing cations concentrations (0,5, 15, 30 and 50 μM) of lipophilic compounds during 2 and 4 h and then screened for viability. The treatment of cells with C10TPP+ and C12TPP+ decreased the cell viability, whereas that C8TPP+ and C11TPP+ did not affect it. Hence, we investigated the mitochondrial toxicity of the lipophilic cation using Transmission Electron Microscopy. Our results indicated changes in the mitochondrial ultrastructure provoked by C12TPP+ treatment in TA3 cells. Moreover, Real Time RT-PCR analysis for cell death related genes (gabarap, bax and gadd45α) expression, revealed that C10TPP+ and C12TPP+ up-regulated pro-apoptotic gene gadd45α in all cell lines and in almost all assay conditions, while Bax gene expression was not affected. Gabarap was up-regulated but not in all cell lines and only in a few assay conditions. Taking account these results, we may conclude that C10TPP+ and C12TPP+ were the most potent cytotoxic compounds. The principal mechanism of cell death seems to be through the induction of the intrinsic route of the apoptosis, but also a percentage of autophagy occurs.

Memoria para optar el título de Bioquímico / Los organismos regulan su número de células a través de un balance entre la división y muerte celular. Con respecto a este último, existen diversos mecanismos de muerte celular, como la apoptosis, autofagia y necrosis, presentando cada uno características morfológicas y moleculares diferentes. Se ha considerado a la necrosis como un mecanismo de muerte celular “accidental” y, por tanto, menos regulado. Sin embargo existen evidencias de que la necrosis también puede ser considerada un tipo de muerte celular programada. Es así que las ceramidas, precursores de los esfingolípidos eucariontes, han sido reconocidas como importantes segundos mensajeros implicados en el gatillamiento de procesos apoptótico/necróticos en diversos tipos celulares. Recientemente se ha descrito que células de linfoma B humano (línea celular A20) al ser estimuladas con ligando de Fas en presencia de ceramidas van a un destino de muerte necrótico. Además de esto, se ha descrito una relación entre estrés oxidativo y la generación de ceramidas, relación que se encontraría íntimamente ligada a procesos de señalización de muerte celular. Con estos datos se postuló que las ceramidas intervienen en la decisión apoptóticonecrótica en células epiteliales. Utilizando métodos de citometría de flujo y ensayos enzimáticos se encontró que las ceramidas aumentaron la muerte por necrosis en el tiempo tanto para células HeLa como para HTC, este aumento es dosis dependiente. Ácido flufenámico, un inhibidor inespecífico de canales catiónicos no selectivos involucrados en regulación del volumen celular por estrés oxidativo, en conjunto con ceramidas no cambió el porcentaje de muerte por necrosis y aumentó la población apoptótica. Al reemplazar el Na+ extracelular por el catión monovalente NMDG+ no se observó diferencia entre los porcentajes de las distintas poblaciones celulares. La aplicación en conjunto de H2O2 con ceramidas aumentó la muerte celular, pero sólo a altas concentraciones (10 mM). El efecto de ceramidas sobre la apoptosis se ensayó utilizando el inhibidor genérico de caspasas zVAD-fmk. No hubo cambios significativos en los porcentajes de muerte celular. Efectos similares se observaron al depletar los depósitos intracelulares de calcio. Estos resultados permiten concluir que las ceramidas inducen muerte celular necrótica de manera tiempo y dosis dependiente / Organisms regulate their number of cells through fine a balance between cell division and cell death. In respect to cell death, diverse mechanisms exist, such as apoptosis, autophagia and necrosis, presenting each one different morphologic and molecular characteristics. Necrosis has been considered as a mechanism of "accidental" cell death and therefore, less regulated. Nevertheless, evidences exist of which necrosis can be also considered as a type of programmed cell death. For example, ceramides, precursors of sphingolipids in euchariotic cells, have been recognized as important second messengers implicated in the development of apoptotic/necrotic processes in diverse cell types. It has been recentely described that human lymphoma B cells (A20 cell line),upon stimulation with Fas ligand in the presence of ceramides, induce necrotic cell death. Also, it has been described a relationship between oxidative stress and the generation of ceramides which are intimately linked to cell death signaling processes. Based on this information, it was postulated that ceramides take part in the apoptotic-necrotic decision in epithelial cells. Using flow citometry and enzymatic assays we found that ceramides increased cell death by necrosis in HeLa and HTC cells in a dose-dependent manner. Flufenamic acid, a non specific inhibitor of nonselective cation channels involved in regulation of the oxidative stress-dependent cell volume, used in conjunction with ceramides did not produce changes in the percentage of necrotic cell death and increased the population of apoptotic cells. Upon replacement of external Na+ by the monovalent cation NMDG+, the percentage of different cell populations was not altered. The application of ceramides with H2O2 produced an increase in the cell death, but only at high concentrations of H2O2 (10 mM). The effect of ceramides upon apoptosis was assayed using the generic caspase inhibitor zVAD- fmk. No significant changes were observed in the percentage of cell death. Similar effects were observed when depleting the intracellular calcium stores. These results allow us to conclude that ceramides induces necrotic cell death in a time and dose-dependent manner

Entre los receptores de muerte celular, se describe al receptor Fas en células linfoides como un receptor que activa tanto apoptosis como necrosis. Recientemente se ha asociado la inducción de apoptosis con la salida de ATP vía hemicanales formados por panexina-1 en linfocitos. Por otra parte, muchas evidencias señalan al ATP extracelular como mediador de muerte celular, tanto por necrosis como por apoptosis, identificándose al receptor purinérgico P2X7 como receptor de muerte, el que tiene como único ligando biológico al ATP. En este contexto, en esta Tesis, se determinó que las células A20 (derivadas de linfocitos B de ratón) y Jurkat (derivadas de linfocitos T humanos), pero no Ramos, Raji (derivadas de linfocitos B humanos) y A20R (derivadas de linfocitos B de ratón) son sensibles a FasL. En células Jurkat el tipo de muerte celular que predominó fue la apoptosis, en cambio en A20 fue la necrosis. Solo las células Jurkat liberaron ATP en forma significativa de manera tiempo dependiente en respuesta a estimulación con FasL y no se obtuvo evidencia de daño en la membrana plasmática. En estas células la liberación de ATP fue inhibida por zVAD (inhibidor general de caspasas) y z-IETD (inhibidor de caspasa 8), pero no por zDEVD (inhibidor de caspasa 3). Además, la pre-incubación con inhibidores de hemicanales formados por panexinas (carbenoxolona y probenecid), pero no de hemicanales formados por conexinas (heptanol) también inhibió la liberación de ATP en respuesta a FasL. Por otra parte, en las células Jurkat los inhibidores de los receptores P2X7, oATP y BBG, inhibieron la muerte celular por apoptosis, en cambio los inhibidores de esfingomielinasas (miriocina, imipramina y GW4869) no protegieron a estas células al estimularlas con FasL. En células A20, oATP y el inhibidor de esfingomielinasa neutra (GW4869) mostraron un efecto protector al inhibir la muerte por necrosis inducida por FasL. Además, se apreció un efecto protector en la muerte por apoptosis al pre-tratar estas células con suramina. En ambos tipos celulares el tratamiento con N-acetilcisteína bloqueó la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) inducidas por FasL. Estos resultados representan la primera evidencia de que se produce una cooperación entre dos receptores de muerte celular, Fas y P2X7, en la ejecución de la muerte celular en células linfoides. Frente al mismo estímulo en células A20 y Jurkat, el tipo de muerte celular y los mecanismos involucrados son en parte distintos. En células A20, FasL gatilla muerte celular por necrosis, que podría involucrar la participación de otros receptores P2X distintos a P2X7. En cambio, en las células Jurkat la activación del receptor Fas por FasL lleva, por una parte a la activación de caspasa-8 y posteriormente, a la activación de la caspasa-3. Por otro lado, la liberación de ATP activada por caspasa-8 sería mediada por hemicanales formados por panexina-1. Esto a su vez llevaría a la activación del receptor P2X7, que gatillaría la muerte celular por apoptosis en un mecanismo que podría involucrar la participación de ROS. Esto es un hallazgo importante, ya que en las células Jurkat, que son células tipo II, además de tBID, liberan ATP vía hemicanales formados por panexina-1 lo que también contribuiría a la amplificación de la vía intrínseca de la apoptosis mediante la activación del receptor P2X7.

TonEBP, la proteína que se une al elemento regulatorio que responde a tonicidad “TonE” es el único factor transcripcional conocido de eucariontes que responde a cambios de la osmolaridad extracelular. Este factor transcripcional pertenece a la familia Rel, al igual que NFAT1-5 y NFκB. TonEBP también se conoce como NFAT5 y se ha asociado al mecanismo de adaptación celular a condiciones de hiperosmolaridad, regulando la expresión de genes que codifican para aldosa reductasa y para los transportadores de taurina, mio-inositol y betaina. Todas estas proteínas regulan los niveles de osmolitos intracelulares compatibles asociados al control del volumen celular. El corazón es un órgano que normalmente no está sujeto a cambios osmóticos excepto durante isquemia-reperfusión, coma diabético y shock séptico. La capacidad de regular el volumen celular se ha vinculado a la sobrevida celular en condiciones de estrés hiperosmótico. Por lo tanto, la capacidad de las células cardíacas de regular el volumen celular, podría ser un factor de sobrevida en patologías como el infarto al miocardio. En nuestro Laboratorio, se describió previamente que TonEBP está presente en los cardiomiocitos y que responde al estrés hiperosmótico. Además, se demostró que el estrés hiperosmótico induce la masa y la actividad de aldosa reductasa con acumulación intracelular de sorbitol, y que la muerte inducida por estrés hiperosmótico es mediada por esta enzima. La activación de TonEBP induce un aumento de los niveles y actividad de aldosa reductasa que mediaría la muerte de los cardiomiocitos inducida por estrés hiperosmótico. Sin embargo, ratones knock out para TonEBP muestran una severa atrofia de su médula renal, incremento de la sensibilidad de sus timocitos al estrés hiperosmótico e incremento de la fragmentación del DNA en células de la fibra del lente, indicando que TonEBP tendría un efecto protector frente al daño inducido por estrés hiperosmótico. Por lo tanto, de estos resultados se deduce que existiría una contradicción entre los datos descritos en la literatura y nuestros hallazgos sobre el papel de TonEBP en la sobrevida celular. La hipótesis de la presente tesis es “TonEBP media la adaptación del cardiomiocito a la hiperosmolaridad generada por isquemia cardiaca”. Los objetivos específicos son: • Caracterizar el mecanismo de muerte inducida por estrés osmótico. • Determinar si el factor de transcripción TonEBP se activa bajo condiciones de isquemia cardiaca in vivo e in vitro. • Determinar el efecto directo de TonEBP en la viabilidad del cardiomiocito. • Evaluar si TonEBP protege a los cardiomiocitos de la muerte inducida por hiperosmolaridad Como modelo experimental se utilizaron cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas expuestos a estrés hiperosmótico en presencia y en ausencia de la sobreexpresión adenoviral de TonEBP tipo silvestre (wtTonEBP) o TonEBP dominante negativo (dnTonEBP). Además se utilizaron modelos experimentales de infarto al miocardio por ligación de la arteria coronaria descendente anterior y de sobreexpresión in vivo de wtTonEBP y dnTonEBP por transducción intracardíaca de adenovirus. El estrés hiperosmótico indujo muerte de los cardiomiocitos por un mecanismo que involucra aumento entrada de Ca2+ a través de un canal de Ca2+ tipo L, aumento de los niveles citoplasmáticos y mitocondriales de Ca2+, depolarización de la mitocondria y reducción de los niveles intracelulares de ATP. Además se detectó liberación de citocromo c pero no del factor inductor de apoptosis (AIF), desde la mitocondria, con activación secuencial de procaspasa 9 y procaspasa 3. Sin embargo, se determinó que la muerte de los cardiomiocitos inducida por sorbitol 600 mOsm correspondía a una apoptosis independiente de caspasas, ya que el pretratamiento con el inhibidor general de caspasas Z VAD fmk, no previno la muerte inducida por estrés hiperosmótico. En un modelo de infarto al miocardio se detectó un aumento de los niveles proteicos de TonEBP en el sitio vecino al infarto a los 2 días post cirugía. Este mismo aumento se detectó en cultivos in vitro de cardiomiocitos sometidos a 30 o 60 min de isquemia simulada seguida de 4 u 8 h de reperfusión. Estos resultados sugieren que la isquemia induce a TonEBP. Debido a que no existen inhibidores y/o activadores farmacológicos para TonEBP se construyeron adenovirus que sobrexpresaban wtTonEBP (Ad wtTonEBP) y dnTonEBP (Ad dnTonEBP). Determinando los niveles proteicos de aldosa reductasa, un blanco transcripcional de TonEBP, se demostró que ambos adenovirus eran funcionales en cardiomiocitos. Estos experimentos demostraron que la sobreexpresión de wtTonEBP aumentó los niveles proteicos de â-actina en forma dependiente de la dosis viral mientras que disminuyó los niveles de la cadena pesada de la β-miosina (β-MHC). La sobreexpresión del dnTonEBP tuvo un efecto contrario al wtTonEBP en los niveles proteicos de β-actina y β-MHC. El aumento de los niveles proteicos de βctina inducida por la sobreexpresión de wtTonEBP se acompañó de una reorganización del citoesqueleto de actina, visualizada por inmunocitoquímica usando faloidina-rodamina. La sobreexpresión de wtTonEBP, pero no de dnTonEBP, indujo muerte de los cardiomiocitos, principalmente por necrosis. Los niveles de necrosis dependieron del nivel de sobreexpresión de wtTonEBP y del tiempo de transducción adenoviral. La transducción adenoviral por inoculación intracardíaca de Ad wtTonEBP y Ad dnTonEBP mostró que Ad dnTonEBP indujo mortalidad en 3 de los 8 animales transducidos, efecto que no se detectó en ratas transducidas con Ad wtTonEBP y Ad LacZ (control). Este resultado sugiere que TonEBP cumpliría alguna función importante en el corazón. Utilizando una multiplicidad de infección de 1000, dosis viral que no inducía muerte celular, se mostró que la sobreexpresión de tanto de wtTonEBP como del dnTonEBP no protegieron a los cardiomiocitos de la muerte inducida por estrés hiperosmótico. La sobreexpresión de ambas proteínas tampoco indujo un cambio en el mecanismo de muerte, apoptosis o necrosis, inducida por estrés hiperosmótico. Se determinó que la muerte inducida por sobreexpresión de wtTonEBP no dependía de la sobreactivación de aldosa reductasa, ya que un inhibidor específico de aldosa reductasa, zopolrestat, no atenuó la muerte inducida por Ad wtTonEBP. Esta muerte tampoco se asemejó al colapso metabólico detectado al someter a los cardiomiocitos a sorbitol 600 mOsm, ya que no se observó disminución de los niveles intracelulares de ATP. Finalmente, los datos obtenidos en esta tesis permiten concluir que el infarto o la isquemia/reperfusión in vitro induce a TonEBP, pero la sobreexpresión de este factor transcripción no está asociada con la protección de los cardiomiocitos al estrés hiperosmótico, sino más bien es un inductor de muerte celular por necrosis.

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Fibroblastos y miofibroblastos cardiacos son elementos claves en el desarrollo del remodelamiento cardiaco después de un infarto agudo al miocardio. Una regulación controlada en el crecimiento de la población de fibroblastos y miofibroblastos es importante para una correcta cicatrización y mantención de la función cardiaca. Distintas evidencias muestran que los niveles de angiotensina II (Ang II) y del receptor de angiotensina II tipo 1 (AT1R) aumentan después de un infarto agudo al miocardio. Por ésto, Ang II puede tener un papel central en la regulación del número y función de estas células post-infarto al miocardio. En esta memoria se realizaron ensayos de unión de radioligando, viabilidad y funcionalidad celular, en fibroblastos (FCN) y miofibroblastos cardiacos neonatos (MCN) con y sin expresión ectópica de AT1R o AT2R. Los ensayos de unión de radioligando mostraron que miofibroblastos y fibroblastos cardiacos neonatos expresaban solo AT1R. En ambas condiciones (con y sin expresión ectópica de AT1R o AT2R), los miofibroblastos mostraron mayor unión total de radioligando que los fibroblastos. Ang II (100 nM), estimuló la migración de los fibroblastos controles, y en los que expresaban ectópicamente AT1R disminuyó la viabilidad. Por otra parte, no se observaron efectos en miofibroblastos controles o que expresaban ectópicamente AT1R o AT2R. La muerte de los fibroblastos estimulados con Ang II se previno con losartán e inhibidores de fosfolipasa C (PLC) y proteína kinasa C (PKC), indicando la participación de estas vías de señales intracelulares. Los resultados obtenidos demuestran que Ang II actúa de manera selectiva sobre fibroblastos y miofibroblastos cardiacos neonatos, controlando la función celular en nuestro modelo de estudio / Cardiac fibroblasts and myofibroblasts are key elements of the development of cardiac remodeling after myocardial infarction. A tight regulation of fibroblast and myofibroblast growth is important to correct wound healing and maintain cardiac function. Several lines of evidence have showed an increase in angiotensin II and AT1R levels after myocardial infarction. Thus angiotensin II may play a pivotal role in the regulation of number and function of theses cells. Cell viability and function, and radioligand binding studies, were performed in neonate cardiac fibroblast and myofibroblast with/without ectopically expressed AT1R or AT2R. Radioligand binding studies demonstrated that neonate cardiac fibroblast and myofibroblasts expressed a single class of high affinity angiotensin II AT1R. In both conditions, myofibroblasts revealed a higher maximal binding capacity, compared to fibroblast. Angiotensin II (100 nM) increased the migration in normal fibroblast, and in ectopically expressed AT1R fibroblast reduced the cell viability. No effects were observed in normal or ectopically expressed AT1R or AT2R myofibroblast. Cardiac fibroblast cell death angiotensin II triggered was was prevented by losartan and by phospholipase C (PLC) and protein kinase C (PKC) inhibitors, indicating the participation of that intracellular signaling pathways. The data demonstrate that Angiotensin II acted in a selective manner on cardiac fibroblast and myofibroblast, controlling the cellular number and function

Objetivos: El objetivo de la presente investigación fue hallar la mortalidad del adenocarcinoma de páncreas e identificar los factores relacionados a esta en un hospital especializado en Lima – Perú. Materiales y métodos: Es un estudio de cohorte retrospectivo. Se revisaron todas las historias clínicas desde octubre del 2008 hasta abril del 2015 en un hospital nacional de referencia de Lima-Perú. Incluyó a todos los mayores de 18 años con diagnóstico de adenocarcinoma de páncreas confirmado por anatomía patológica. Las variables independientes fueron la edad, el sexo, el consumo de alcohol y tabaco, los antecedentes de Diabetes Mellitus tipo 2 e Hipertensión arterial, la presencia de metástasis, la localización del tumor y el nivel plasmático de Ca 19.9 previo al diagnóstico; y la variable dependiente fue la mortalidad definida por el tiempo entre el diagnóstico y la fecha de muerte o la fecha que se revisó el RENIEC, 25 de octubre del 2015. Todos los datos fueron procesados en Microsoft Excel 2016 y el análisis estadístico realizado mediante STATA 12.0. En el análisis bivariado se empleó log-Rank para las variables categóricas y el análisis de Kaplan-Meier para la sobrevida. En el análisis multivariado se trabajó con la regresión de Cox ajustándola por un modelo estadístico. Resultados: El 48,8% fueron varones; la edad media fue de 66 años, el 21,1% consumían tabaco, el 25,9% alcohol y el 22,9% tenía el antecedente de DM2. La ubicación más frecuente fue en la cabeza del páncreas, el 75,8% fueron diagnosticados en estadio IV y en el 31,3% se evidenció metástasis. El 64,8% de pacientes presentaban Ca19.9 ≥37 UI/ml y el 71,5% fue sometido a intervención quirúrgica. La mortalidad a 1 año fue 65% En el análisis bivariado la presencia de metástasis, el manejo recibido y el nivel plasmático de Ca19.9 mostraron asociación con la mortalidad a 1 año. Sin embargo, en el modelo final multivariado solo permaneció la presencia de metástasis (HR: 2,38; p=0,001) asociado. Conclusiones: La mortalidad del adenocarcinoma de páncreas en el Perú a 1 año es 65% y la presencia de metástasis se asocia a mayor mortalidad a l año. / Objectives: The objective of the present investigation, was, to find the mortality of the pancreatic adenocarcinoma, and to identify the factors related to this, in a specialized hospital in Lima, Peru. Materials and methods: This is a retrospective cohort field study. All medical records, from October 2008 to April 2015, were reviewed at a national reference hospital in Lima, Peru. This study included all the 18 –year- olds, with a diagnosis of pancreatic adenocarcinoma, confirmed by a pathological anatomy. The independent variables were, age, sex, alcohol and tobacco consumption, history of type 2 Diabetes Mellitus, arterial hypertension, presence of metastases, tumor location and plasma level of Ca 19.9; And the dependent variable was the mortality defined by the time since the diagnosis, to the time of death, or the date when the RENIEC was revised, October 25. Data was processed in Microsoft Excel 2016, and the statistical analysis was performed using STATA 12.0. In the bivariate analysis, we used Log-Rank for categorical variables, and the Kaplan Meier analysis for survival. For the multivariate analysis, we worked with the Cox regression, adjusting it by a statistic model. Results: 48.8% were male, the mean age was 66 years, 21.1% used tobacco, 25.9% used alcohol and 22.9% had a history of DM2. The most frequent location was in the head of the pancreas, 75.8% was diagnosed in stage IV and metastasis was evident in the 31.1%. The 64.8% of patients presented Ca 19.9 ≥ 37 IU/mL and 71.5% underwent surgical operation. Mortality at one year was 65%. In the bivariate analysis, the presence of metastasis, the handling received and the plasma level of Ca 19.9, showed an association with mortality at one year. However, in the final multivariate model, only the presence of metastases (HR: 2,38; p=0,001), remained associated. Conclusions: The mortality of adenocarcinoma of the pancreas in Peru, at one year is 65 %, and the presence of metastases is associated with greater mortality, at one year. / Tesis

Magíster en fisiología / Introducción: La muerte de los cardiomiocitos induce la pérdida de función del corazón y el desarrollo de diferentes patologías, sin embargo, se desconoce a cabalidad los mecanismos implicados. La policistina-1 (PC1) es un mecanosensor presente en los cardiomiocitos, clave en la función cardiaca, por lo que su presencia en los cardiomiocitos podría implicar la protección de los mismos ante un estrés celular. La necrosis y la apoptosis son dos principales tipos de muerte celular. Durante la apoptosis diferentes vías de señalización son reguladas, donde BCL-2 es una proteína clave como anti-apoptótica mientras NIX es pro-apoptótica. Las variaciones entre ellas son importantes para determinar las vías implicadas en la apoptosis. Debido a que la PC1 es un mecanosensor, en este proyecto se propuso estudiar el papel de la PC1 en la protección de los cardiomiocitos ante procesos de muerte celular, especialmente el ligado a la apoptosis inducida por estrés hiposmótico. Hipótesis: La ausencia de la policistina-1 induce la muerte del tejido cardiaco en condiciones basales y predispone a la muerte de los cardiomiocitos en cultivo sometidos a estrés mecánico, asociado a una disminución de la relación BCL-2/NIX.Materiales y métodos: Se utilizaron cardiomiocitos de ventrículo de ratas neonatas en cultivo, silenciadas para la PC1 (siPC1), en condiciones basales y sometidas a estrés mecánico con un medio hipo-osmótico (HS) y muestras de tejido cardiaco de ratones jóvenes y seniles, controles y knockout para la PC1 (PC1 KO) en los cardiomiocitos. Resultados: La deficiencia de PC1 en los cardiomiocitos (siPC1) induce la muerte por apoptosis de los mismos mientras aumenta la muerte posterior a un estrés hiposmótico. La relación BCL-2/NIX disminuye en los cardiomiocitos siPC1 sometidos a estrés mecánico, debido principalmente a la disminución del contenido de BCL-2 en condiciones basales. Por otro lado, los animales PC1 KO no muestran diferencias en el contenido de BCL-2 o NIX, pero sí muestran un aumento del contenido de Bax, otra proteína pro-apoptótica. Conclusión: Nuestros datos indican que la PC1 tiene un papel regulador de la apoptosis en los cardiomiocitos, aún en condiciones basales y, al menos en parte, por evitar la disminución del contenido de proteínas pro-apoptóticas como BCL-2 y el aumento de NIX ante un estrés hiposmótico. / Background: Cardiomyocyte death leads to the loss of the heart function and the development of different pathologies; however, the implied mechanisms are poorly understood. Polycystin-1 (PC1) is a mechanosensor present in the cardiomyocytes, key in the heart function, so its presence in cardiomyocytes may involve the protection of them against a cellular stress. Necrosis and apoptosis are the two major classes of cellular death. During apoptosis, different signaling pathways are regulated, where BCL-2 is a key anti-apoptotic protein whereas NIX is pro-apoptotic. The variations between them are relevant to determinate the implied pathways in the apoptosis. Since PC1 is a mechanosensor, this project aims to study the role of PC1 in the protection of the cardiomyocytes against the processes of cellular death, especially the one linked to apoptosis induced by hiposmotic stress. Hypothesis: The absence of Polycystin-1 induces the death of the cardiac tissue in basal conditions and predisposes to the death the cardiomyocytes in culture subjected to mechanical stress, associated with a decrease in the BCL-2/NIX ratio.Materials and methods: Neonatal rat ventricular cardiomyocytes, PC-1 silenced (siPC1), where used, in basal conditions and subjected to mechanical stress with a hypo-osmotic medium (HS), and samples of young and senile rat cardiac tissue, control and knockout for PC1 (PC1 KO) in the cardiomyocyte. Results: PC1 deficiency in cardiomyocytes (siPC1) induces death by apoptosis of them while increasing death following hypo-osmotic stress. The BCL-2/NIX ratio decreases in siPC1 cardiomyocytes subjected to mechanical stress, mainly due to the decrease in BCL-2 content at baseline conditions. Conversely, PC1 KO animals do not show differences in BCL-2 or NIX content, but they do show an increase in the content of Bax, another pro-apoptotic protein. Conclusion: Our data suggest that PC1 has a regulatory role for apoptosis in the cardiomyocytes, even under basal conditions and, at least in part, to avoiding the reduction of the pro-apoptotic protein content as BCL-2, and the increase in NIX content to a hypo-osmotic stress.

In the present work we study the metabolic adaptation in response to stress in the yeast model, and more specifically we investigate the regulation of peroxisomal activity and the metabolism of sphingolipids. Peroxisomes are dynamic organelles and the sole location for fatty acid ß-oxidation in yeast cells. Here we find that peroxisomal function is crucial for the adaptation to salt stress, especially upon sugar limitation. Multiple layers of control regulate both peroxisomal activity and number upon stress. Activated Hog1 MAP kinase triggers the induction of genes encoding enzymes for fatty acid activation, peroxisomal import and ß-oxidation through the Adr1 transcriptional activator, which transiently associates with genes encoding fatty acid metabolic enzymes in a stress- and Hog1-dependent manner. Moreover, Na+ and Li+ stress induces an increase in peroxisomal number per cell in a Hog1-independent manner, which depends instead of the retrograde pathway and the dynamin related GTPases Dnm1 and Vps1. The strong activation of the Faa1 fatty acyl-CoA synthetase, which specifically localizes to lipid particles and peroxisomes, indicates that adaptation to salt stress requires the enhanced mobilization of fatty acids from internal lipid stores. Taken together, these results suggest that stress-induced peroxisomal ß-oxidation triggers enhanced respiration upon salt shock. Sphingolipids are regulators of mitochondria-mediated cell death in higher eukaryotes. However, how changes in sphingolipid metabolism and downstream intermediates impinge on mitochondrial function is unknown. Here we found in yeast that within the sphingolipid degradation pathway, the production via Dpl1 and degradation via Hfd1 of hexadecenal is critical for mitochondrial function and cell death. Genetic interventions, which favor hexadecenal accumulation, diminish oxygen consumption rates and increase ROS production and mitochondrial fragmentation and viceversa. The location of the hexadecenal degrading enzyme Hfd1 in punctuate structures all along the mitochondrial network depends on a functional ERMES complex, indicating that modulation of hexadecenal levels at specific ER-mitochondria contact sites might be an important trigger of cell death. This is further supported by the finding that externally added hexadecenal or the absence of Hfd1 enhance cell death caused by human Bax protein. Finally, the induction of the sphingolipid degradation pathway upon stress is controlled by the Hog1 MAP kinase. Therefore the stressregulated modulation of sphingolipid degradation might be a conserved way to induce cell death in eukaryotic organisms. / En el presente trabajo se estudia la adaptación metabólica en respuesta a estrés en el modelo de levadura, y de forma más concreta se investiga la regulación de la actividad peroxisomal y el metabolismo de esfingolípidos. Los peroxisomas son orgánulos dinámicos, encargados de forma específica de la ß-oxidación de ácidos grasos en células de levadura. Aquí se muestra cómo la función peroxisomal es crucial para la adaptación al estrés salino, especialmente en condiciones de ayuno de glucosa. Se regula a múltiples niveles tanto la actividad peroxisomal como su número ante condiciones de estrés. La activación de la MAP quinasa Hog1 desencadena la inducción de genes que codifican enzimas para la activación, importación peroxisomal y ß-oxidación de los ácidos grasos. Esta regulación génica ocurre a través del activador transcripcional Adr1, que se asocia transitoriamente con los genes que codifican enzimas metabólicas de ácidos grasos de una manera dependiente del estrés y de Hog1. Además, el estrés causado por Na+ y Li+, provoca un aumento en el número de peroxisomas por célula de manera independiente de Hog1, que depende a su vez de la ruta retrógrada y de las dinaminas GTPasas Dnm1 y Vps1. La fuerte activación de la acil-CoA sintetasa Faa1, que se localiza específicamente en las partículas lipídicas y los peroxisomas, indica que la adaptación a estrés salino requiere una mayor movilización de ácidos grasos de los almacenes de lípidos internos. Estos resultados indican que la ß-oxidación peroxisomal inducida por estrés desencadena un aumento de la respiración ante el choque salino. Los esfingolípidos son reguladores de la muerte celular mediada por la mitocondria en eucariotas superiores. Sin embargo, se desconoce cómo, cambios en el metabolismo de los esfingolípidos y en intermediarios aguas abajo, afectan a las funciones mitocondriales. En este trabajo se describe cómo en la ruta de degradación de esfingolípidos de levadura, la producción de hexadecenal a través de Dpl1 y su degradación a través de Hfd1, es crítica para la función mitocondrial y la muerte celular. Intervenciones genéticas que favorecen la acumulación de hexadecenal, disminuyen el consumo de oxígeno de las células e incrementan la producción de ROS y la fragmentación mitocondrial, y a la inversa. La localización de Hfd1, que es la enzima que degrada el hexadecenal, es puntual en lugares cercanos a la red mitocondrial. Y esta localización depende de un complejo ERMES funcional, lo que indica que la modulación de los niveles de hexadecenal en lugares específicos de contacto entre el retículo endoplasmático y la mitocondria, podría ser un importante desencadenante de la muerte celular. Estos datos son apoyados por el hecho de que el hexadecenal añadido de forma externa o la ausencia de Hfd1, promueve la muerte celular inducida por la proteína Bax humana. Finalmente, la inducción de la ruta de degradación de esfingolípidos en condiciones de estrés, está controlada por la MAP quinasa Hog1. Por lo tanto, la modulación de la degradación de esfingolípidos regulada por estrés, podría ser una vía conservada para inducir la muerte celular en organismos eucariotas. / Al present treball s'estudia l'adaptació metabòlica en resposta a estrés al model de llevat, i de forma més concreta s'investiga la regulació de l'activitat peroxisomal i el metabolisme d'esfingolípids. Els peroxisomes són orgànuls dinàmics, encarregats de forma específica de la ß-oxidació dels àcids grassos en cèl·lules de llevat. Ací es mostra com la funció peroxisomal es crucial per a l'adaptació a l'estrés salí, especialment en condicions de dejuni de glucosa. Es regula a múltiples nivells tant l'activitat peroxisomal com el seu número, davant de condicions d'estrés. L'activació de la MAP quinasa Hog1 desencadena la inducció de gens que codifiquen enzims per a l'activació, importació peroxisomal i ß-oxidació dels àcids grassos. Aquesta regulació génica té lloc mitjançant l'activador transcripcional Adr1, que s'assòcia transitoriamente amb els gens que codifiquen enzims metabòliques d'àcids grassos d'una manera dependent de l'estrés i de Hog1. A més, l'estrés causat per Na+ i Li+, provoca un augment en el número de peroxisomes per cèl·lula de manera independent de Hog1, que depén a la vegada de la ruta retrògrada i de les dinamines GTPases Dnm1 i Vps1. La forta activació de la acil-CoA sintetasa Faa1, que es localitza específicament a les partícules lipídiques i als peroxisomes, indica que l'adaptació a estrés salí necesita d'una major movilització d'àcids grassos dels magatzems de lípids interns. Estos resultats indiquen que la ß-oxidació peroxisomal induïda per estrés desencadena un augment de la respiració davant el xoc salí. Els esfingolípids són reguladors de la mort cel·lular mitjada per la mitocóndria en eucariotes superiors. No obstant, es desconeix cóm, canvis al metabolisme dels esfingolípids i en intermediaris aigües baix, afecten a les funcions mitocondrials. En aquest treball es descriu cóm en la ruta de degradació de esfingolípids de llevat, la producció d'hexadecenal mitjançant Dpl1 i la seua degradació mitjançant Hfd1, és crítica per a la funció mitocondrial i la mort cel·lular. Intervencions genètiques que afavorixen l'acumulació d'hexadecenal, disminuixen el consum d'oxigen de les cèl·lules i incrementen la producció de ROS i la fragmentació mitocondrial, i a la inversa. La localització de Hfd1, que es l'enzim que degrada l'hexadecenal, és puntual en llocs propers a la red mitocondrial. I esta localització depén d'un complex ERMES funcional, el que indica que la modulació dels nivells d'hexadecenal en llocs específics de contacte entre el reticle endoplasmàtic i la mitocòndria, podria ser un important desencadenant de la mort cel·lular. Estes dades son recolzades pel fet de que l'hexadecenal afegit de forma externa o l'absència de Hfd1, promou la mort celul¿lar induïda per la proteïna Bax humana. Finalment, la inducció de la ruta de degradació d'esfingolípids en condicions d'estrés, está controlada por la MAP quinasa Hog1. Por tant, la modulació de la degradació d'esfingolípids regulada per estrés, podria ser una via conservada per a induïr la mort cel·lular en organismes eucariotes. / Manzanares Estreder, S. (2017). Estudio de la adaptación metabólica en respuesta a estrés: Regulación de la actividad peroxisomal y del metabolismo de esfingolípidos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/79083

título de Ingeniería en Biotecnología Molecular / El virus Andes (ANDV) pertenece al género Orthohantavirus (familia Hantaviridae, orden Bunyavirales). En humanos la infección por ANDV produce el síndrome pulmonar asociado a hantavirus, el cual presenta una tasa de mortalidad de alrededor de un 35%. Estos virus se caracterizan por poseer una envoltura lipídica y un genoma de ARN de hebra simple tri-segmentado, de polaridad negativa que codifica para al menos 4 proteínas, entre ellas la proteína de nucleocápside (N) multifuncional y un precursor proteico denominado GPC, que tras ser procesado resulta en las glicoproteínas Gn y Gc que se encuentran ancladas en la envoltura viral. La apoptosis es una respuesta celular común frente a una infección viral. Sin embargo, en el ciclo replicativo de los hantavirus aún es controversial si inducen o inhiben apoptosis. La apoptosis celular puede ser inducida extrínsecamente mediante receptores de muerte específicos, que pueden ser activados por un ligando de la familia del factor de necrosis tumoral, como TRAIL (ligando inductor de apoptosis relacionado al factor de necrosis tumoral, por sus siglas en inglés) a través de una cascada de señalización, mediante un dominio de muerte. En este seminario de título, se buscó determinar si la expresión o localización del receptor de TRAIL, específicamente DR5 (receptor de muerte 5, por sus siglas en inglés) se ve alterada por la expresión de proteínas Gn, Gc y N de ANDV en células humanas, y si una posible variación podría afectar la tasa de apoptosis mediada por TRAIL. En primer lugar, se analizó la expresión de DR5 en distintos tipos celulares, y se determinó que éste receptor se expresa en mayor medida en células A549, por lo que para el resto de los análisis se continuó con esta línea celular. A continuación, se midió la expresión, tanto a nivel transcripcional como traduccional de DR5 en dependencia de ANDV Gn, Gc y N, frente a lo cual, no hubo una variación significativa en la expresión general de este receptor; sin embargo, en donde sí se encontró un incremento significativo fue en la localización de DR5 en la superficie de las células A549 en presencia de ANDV N. De todas formas, no se logró detectar inducción de apoptosis en células humanas transfectadas con ANDV N, lo cual no es posible interpretar debido a la carencia de un control positivo de apoptosis celular. En resumen, estos datos en conjunto muestran que a pesar de que la expresión de ANDV N indujo un aumento en la localización de DR5 en la superficie de células A549, sin embargo, queda por determinar si este aumento podría inducir apoptosis mediada por TRAIL. / Andes virus (ANDV) belongs to the Orthohantavirus genus (Hantaviridae family, Bunyavirales order). In humans ANDV infection causes hantavirus pulmonary syndrome, which has a fatality rate around 35%. These viruses are featured by a lipid envelope and a tri-segmented, single stranded, negative sense RNA genome, that encodes at least four proteins, among them, the multifunctional nucleocapsid protein (N) and a glycoprotein precursor termed GPC, which after being proteolytically cleaved, results in the mature glycoproteins Gn and Gc, which are anchored to the viral envelope. Apoptosis is a common cellular response against a viral infection. However, in the hantavirus replicative cycle, there is still controversy whether these viruses induce or rather block apoptosis. Apoptosis can be triggered extrinsically, through specific death receptors, that can be activated by a ligand belonging to the tumor necrosis factor family, such as TRAIL (tumor necrosis factor–related apoptosis inducing ligand), through a death domain mediated signaling cascade. During this degree seminary, we aimed to determine whether the expression or location of the TRAIL receptor DR5 (death receptor 5), is altered by ANDV Gc, Gn and N expression in human cells, and if any possible variation could affect TRAIL mediated apoptosis. First, we analyzed DR5 expression in different cell types and found that there is a higher extent of DR5 expression in A549 cells, that is why, for the rest of this seminary, we continued the work with this cell line. Next, we measured DR5 expression in these cells at a transcriptional and translational level, after being transfected with plasmids encoding ANDV Gc, Gn or N. We did not find any significant variation in the total amount of DR5 expression; nevertheless, we detected a significant increase in the location of DR5 on the surface of A549 cells in the presence of ANDV N. Although, we were unable to detect apoptosis in human cells transfected with ANDV N due to the lack of a positive control of apoptosis. Finally, all together, our results show that the expression of ANDV N induces an increase in DR5 on the surface of A549 cells, however, it has yet to be determined whether or not, this is enough to induce apoptosis mediated by TRAIL.

"Origen y función de las espermidina aminopropil transferasas en Arabidopsis thaliana " Las poliaminas son pequeñas moléculas con carga positiva a pH fisiológico. Las más abundantes y más ampliamente distribuidas entre todos los seres vivos son la putrescina y la espermidina con dos y tres grupos amino, respectivamente. La espermidina se forma a partir de la putrescina por adición de un grupo aminopropilo. La espermina, con cuatro grupos amino y presente sólo en eucariotas, se forma a partir de la espermidina por adición de un segundo grupo aminopropilo. Las poliaminas han sido relacionadas con procesos fundamentales para la vida, como son la división, el crecimiento, la diferenciación y la muerte celular, habiéndose demostrado en todos los organismos en los que se han conseguido mutantes deficientes en su síntesis que las poliaminas son esenciales. En plantas se han encontrado múltiples correlaciones entre la variación en la concentración de las poliaminas y procesos tales como la germinación, la embriogénesis, la formación de raíces, la iniciación floral o el desarrollo de flores y frutos. Al inicio de esta tesis se publicó la identificación de la primera putativa espermina sintasa en plantas (ACL5), cuya pérdida de función da lugar a un defecto en la elongación del tallo y alteración del patrón normal de los haces vasculares; sin embargo, nuestro análisis del mutante acl5 nos ha revelado que no había perdido la capacidad de sintetizar espermina. Nuestro rastreo del genoma de Arabidopsis thaliana nos permitió identificar y caracterizar el gen SPM, otra putativa espermina sintasa regulada por ácido abscísico. Los mutantes nulos para este gen no muestran diferencias fenotípicas respecto del silvestre pero el doble mutante spm/acl5 nos ha permitido confirmar que no hay más genes responsables de la síntesis de espermina. No obstante, la sobreexpresión de SPM en el mutante acl5 no ha sido capaz de aliviar su fenotipo. / Gómez Minguet, E. (2008). Origen y función de las espermidina aminopropil transferasas en Arabidopsis thaliana [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/8311