Dans le contexte pathologique de l’athérosclérose, les cellules du muscle lisse vasculaire (CMLV) sont caractérisées par une prolifération et une migration accrue. La stimulation à l’Angiotensine II (Ang II) ou au facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) a tendance à promouvoir cette migration anormale. Cependant, ce phénomène seul n’est pas suffisant pour que les CMLV puissent migrer à travers le tissu environnant et envahir l’intima des vaisseaux sanguins. Les CMLV doivent alors dégrader la matrice extracellulaire et développer des structures nécessaires à l’invasion. Ce mouvement cellulaire est à l’origine d’une augmentation de la plaque athéromateuse responsable de nombreuses complications. Des données préliminaires ont montré que des facteurs de croissance ou hormones pouvaient induire l’invasion des CMLV. Dans notre laboratoire, il a été montré que les facteurs d’ADP-ribosylation (ARF) permettent la régulation du remodelage phénotypique des CMLV, et jouent un rôle dans la prolifération et la migration cellulaire. Au cours de cette étude, nous allons donc examiner le rôle de ARF6 dans la formation de structures importantes pour l’invasion et l’activation de métalloprotéinases de la matrice dans les CMLV humaines. En premier lieu, nous avons défini que la stimulation avec du PDGF ou de l’Ang II permet l’activation de la GTPase ARF6. En second lieu, nous avons mis en avant l’impact de la déplétion de ARF6 sur l’invasion cellulaire induite à la suite d’une stimulation avec le PDGF ou l’Ang II. Pour y parvenir, nous avons utilisé deux méthodes d’analyse de l’invasion, tout d’abord de la microscopie sur support gélatineux qui permet d’observer la dégradation de la matrice, ensuite des essais d’invasion sur du Matrigel dans des chambres de Boyden. Pour finir, nous avons voulu définir le mécanisme impliqué dans ce phénomène d’invasion cellulaire chez les CMLV humaines. En somme nous avons montré, l’importance d’ARF6 dans l’invasion induite par des facteurs de croissance ou hormone. Et nous avons soumis l’hypothèse que ce mécanisme passe par l’activation de la voie des MAPK ou PI3K. L’élucidation de ces mécanismes cellulaires pourrait avoir un intérêt quant à l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de l’athérosclérose. / In the pathological setting of atherosclerosis, vascular smooth muscle cells are characterized by an increased proliferation and migration. Stimulation of these cells with Angiotensin II (Ang II) or platelet-derived growth factor (PDGF) usually promotes this abnormal migration. However, this phenotype alone is not sufficient for VSMCs to migrate through surrounding tissues and infiltrate the blood vessels’ intima. VSMCs must also be able to degrade extracellular matrix components and acquire the cellular structures necessary for invasion. The migration of VSMCs to the intima is responsible for the growth of the atherosclerotic plaque which leads to numerous complications. Preliminary data has shown that growth factors and hormones can cause the invasive phenotype of VSMCs. Our group has demonstrated that the ADP-ribosylation factor (ARF) could regulate the phenotypic remodeling of VSMCs and, by extension, their proliferative and migrative capacities. During this study, we will examine the importance of ARF6 in the formation of important invasive cellular structures as well as matrix metalloproteinases activation in human VSMCs. First, we have discovered and defined the connection between agonist stimulation and the activation of the small GTPase ARF6. We have also studied the impact of ARF6 depletion on cellular invasion following PDGF or Ang II stimulation. We have accomplished this using two methods commonly employed to analyze cellular invasion: Gelatine-based matrix degradation assays analyzed by microscopy and invasion assays on Matrigel in Boyden chambers. Lastly, we have tried to uncover the mechanistic behind this invasive phenotype observed in human VSMCs. To summarize, we have demonstrated the importance of ARF6 in growth factors and hormone-induced cellular invasion and we have hypothesized that this activity is mediated by the activation of the MAPK or PI3K signaling pathways. The further characterization of these cellular mechanisms could lead to the discovery of novel therapeutic strategies in atherosclerosis.

Les antagonistes des récepteurs aux minéralocorticoïdes (MR) appartiennent à l'arsenal thérapeutique pour le traitement de diverses maladies cardiovasculaires, mais les mécanismes conférant leurs effets bénéfiques sont encore mal compris. Une partie de ces effets peuvent être liée à la régulation de l'expression du canal Ca2+ de type L Cav1.2, largement impliqué dans l'insuffisance cardiaque et l'hypertension. Nous montrons que MR fonctionne comme un facteur de transcription transformant le signal de l'aldostérone dans l'utilisation du 'cardiaque' promoteur alternatif P1, dirigeant l'expression du long N-terminal transcrit (Cav1.2-LNT. L'aldostérone augmente de façon concentration- et de temps dépendente l'expression de Cav1.2-LNT dans les cardiomyocytes en raison de l'activation du promoteur P1, par interactions des MR avec des séquences spécifiques de l'ADN sur le promoter P1. Ce mécanisme de cis-régulation induit l'activation de promoteur P1 dans les cellules vasculaires conduisant à une nouvelle signature moléculaire de Cav1.2-LNT associé à une sensibilité réduite aux bloqueurs des canaux Ca2+. Ces résultats révèlent Cav1.2-LNT comme une cible minéralocorticoïde spécifique qui pourrait influencer sur l'éfficacité thérapeutique dans les maladies cardiovasculaires. / The mineralocorticoid receptor (MR) antagonists belong to the current therapeutic armamentarium for the management of cardiovascular diseases, but the mechanisms conferring their beneficial effects are still poorly understood. Part of these MR effects might be related to the L-type Cav1.2 Ca2+ channel expression regulation, critically involved in heart failure and hypertension. Here, we show that MR acts as a transcription factor triggering aldosterone signal into specific alternative 'cardiac' P1-promoter usage, given rise to long (Cav1.2-LNT) N-terminal transcripts. Aldosterone increases Cav1.2-LNT expression in cardiomyocytes in a time- and dose-dependent manner due to MR-dependent P1-promoter activity, through specific DNA sequence-MR interactions. This cis-regulatory mechanism induced a MR-dependent P1-promoter switch in vascular cells leading to a new Cav1.2-LNT molecular signature with reduced Ca2+ channel blocker sensitivity. These findings uncover Cav1.2-LNT as a specific mineralocorticoid target that might influence the therapeutic outcome of cardiovascular diseases.

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Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’asthme bronchique est caractérisé par un remodelage et une inflammation des voies aériennes. La masse du muscle lisse ainsi que la déposition de matrice extracellulaire sont augmentées dans la paroi des bronches asthmatiques, ce qui contribue à l’obstruction respiratoire. Peu d’études ont évalué les effets des traitements utilisés dans l’asthme sur le remodelage bronchique, et surtout peu de données sont disponibles concernant les effets sur le muscle lisse. La combinaison de corticostéroïdes et de β2-agonistes à longue durée d’action administrée par inhalation permet de mieux contrôler les crises d’asthme par rapport à la monothérapie avec des médicaments corticostéroïdes. Cependant, l’action spécifique de la combinaison sur le remodelage et sur l’inflammation des bronches périphériques n’est pas décrite. Surtout, il reste à clarifier si l’administration de la combinaison est avantageuse par rapport à la monothérapie corticostéroïde. La plupart des études réalisées chez l’homme utilisent des tissus bronchiques obtenus par biopsie endobronchique, qui ne sont pas représentatifs du processus pathologique affectant les voies respiratoires périphériques. Leur inaccessibilité par des méthodes non invasives est la raison pour laquelle si peu de données existent sur la pathophysiologie des voies périphériques chez les patients asthmatiques. L’asthme équin, aussi connu comme « le souffle », est une pathologie obstructive des chevaux adultes considérée comme un modèle animal d’asthme humain. Elle est caractérisée par un remodelage des bronches périphériques et par une inflammation bronchoalvéolaire de type neutrophilique. En étudiant le modèle équin, cette thèse a évalué la contribution des médicaments corticostéroïdes et de β2-agonistes à longue durée d’action, administrée comme monothérapies ou en combinaison, sur la réversibilité du remodelage et de l’inflammation de voies aériennes dans l’asthme bronchique. A cette fin, nous avons d’abord optimisé et validé l’application de la biopsie endobronchique et de l’échographie endobronchique chez le cheval adulte. Nos résultats indiquent que les échantillons obtenus par biopsie endobronchique sont inadéquats pour l’évaluation quantitative de la masse du muscle lisse chez le cheval. Cependant, ils permettent d’étudier les changements quantitatifs des structures épithéliales et de la lamina propria, ainsi que les aspects qualitatifs du muscle lisse. L’échographie endobronchique, quant à elle, permet d'estimer la masse du muscle lisse bronchique, et ce, chez des chevaux sains et chez des chevaux asthmatiques. Cette thèse démontre aussi que qu’un traitement de 12 semaines avec des corticostéroïdes induit une diminution significative de la masse du muscle lisse périphérique, qui n’est pas amélioré davantage par l’administration concomitante d’un β2-agoniste à longue durée d’action. Cette diminution est toutefois incomplète. Un effet positif et synergique de la combinaison a également été observé au niveau de la déposition de matrice extracellulaire. La combinaison a produit une diminution significative de la quantité de matrices déposées dans la lamina propria et dans la couche du muscle lisse dans les bronches centrales, alors que l’effet été limité à la couche du muscle lisse dans les bronches périphériques. La combinaison n’améliore pas le contrôle de l’inflammation bronchique ni bronchiolaire par rapport aux monothérapies ; cependant, elle diminue la neutrophilie bronchoalvéolaire de façon synergique. / Airway remodeling and inflammation are the hallmarks of asthma. Both airway smooth muscle (ASM) mass and extracellular matrix (ECM) deposition are increased in the central and peripheral airways of asthmatic patients, which contribute to airway obstruction. Few studies have investigated the ability of current asthma medications to reverse airway remodeling, especially the increased ASM mass. Inhaled corticosteroids (ICS) and long-acting β2-agonist combinations (ICS/LABA) are more effective than ICS monotherapy to control asthma exacerbations. However, their efficacy at modifying bronchial inflammation and remodeling at the peripheral level of the lung is not well-described. In fact, most work has been performed using endobronchial biopsy samples obtained from asthmatic subjects, which completely disregard the alterations occurring in peripheral airways. Ethical considerations limit the possibility of biopsying the peripheral airways in humans due to the invasiveness of the procedure. Equine asthma, or heaves, is a naturally-occurring disease of adult horses and a recognized animal model of human asthma characterized by neutrophilic inflammation as well as ASM and ECM remodeling of peripheral airways. This thesis has assessed the contribution of ICS and LABA, alone or combined, to the reversal of remodeling and inflammation in central and peripheral airways using the equine asthma model. To attain this goal, we have first optimized and validated the application of endobronchial biopsy and endobronchial ultrasound (EBUS) in the equine species. EBUS reliably estimates the bronchial ASM. Subsequently, asthmatic horses with ongoing airway remodeling and inflammation were treated with ICS, LABA, ICS/LABA, or antigen avoidance. Lung function, airway remodeling and inflammation were then assessed weekly for 3 months. Our results demonstrated a 30% decrease of peripheral ASM remodeling attained with ICS and ICS/LABA pharmacological treatment. A decrease of a similar magnitude of peripheral ASM was previously reported after 6 and 12 months of ICS monotherapy and antigen avoidance, respectively. A synergistic effect of ICS/LABA was observed on ECM deposition and airway lumen neutrophils. ICS/LABA decreased the ECM fraction of the ASM layer both peripherally and centrally, while the same effect on the lamina propria was observed only in central airways. Both ICS/LABA and ICS monotherapy decreased submucosal inflammation in central airways, while only ICS/LABA and antigen avoidance decreased bronchoalveolar neutrophilia. In conclusion, our results suggest that the enhanced therapeutic effect of ICS/LABA over ICS monotherapy in asthmatic horses was associated with a reduction of ECM deposition, mainly observed within the large airways, and possibly also with a decreased airway neutrophilia. However, ICS/LABA did not provide additional benefit to ICS monotherapy in terms of peripheral ASM remodeling as both induce a 30% decrease of the ASM mass in 3 months.

L’athérosclérose est une pathologie cardiovasculaire chronique impliquant de nombreux acteurs. Les cellules du muscle lisse vasculaire (CMLV) jouent un important rôle dans la pathogénicité. Lors de la formation des plaques athérosclérotiques, ces cellules entraînent l’augmentation de la taille de l’athérome, accentuent la formation du chapeau fibreux et à long terme, contribuent à l’instabilité de la plaque. Dans cette étude, nous nous sommes intéressés à l’impact d’ARF6 sur les cellules du muscle lisse vasculaire et ses implications pathologiques dans l’athérosclérose. Les ARF sont des GTPases agissant comme interrupteurs moléculaires dans divers processus physiologiques tels que le trafic vésiculaire intracellulaire et le remodelage des lipides membranaires. ARF6 est importante pour la prolifération et la migration cellulaire des CMLV, deux phénomènes importants dans le développement de l’athérosclérose. Nous émettons donc l’hypothèse que la GTPase ARF6 est impliquée dans la progression de l’athérosclérose. En premier lieu, nous avons étudié l’effet de la GTPase dans le phénomène de l’invasion cellulaire. Dans l’athérosclérose, plusieurs facteurs environnementaux influencent l’invasion des CMLV. Nous avons voulu vérifier l’effet d’ARF6 sur l’invasion des CMLV médiée par le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-BB) et l’angiotensine II (Ang II). Dans un modèle humain, l’invasion était diminuée en l’absence d’ARF6. Nous avons démontré que ce mécanisme résultait d’un effet d’ARF6 sur l’activité de la métalloprotéinase matricielle MMP14. En second lieu, nous avons voulu évaluer l’effet d’ARF6 dans un modèle in vivo d’athérosclérose. En utilisant un modèle accéléré d’athérosclérose inductible, nous avons inhibé ARF6 dans les cellules du muscle lisse. Après dix semaines de diète riche en gras, nous avons observé une diminution de la taille des lésions athérosclérotiques dans les souris ARF6 KO, accompagnée d’une réduction de l’expression des facteurs pro-inflammatoires tels qu’IL-6. Dans un modèle in vitro, l’absence d’ARF6 réduisait l’absorption lipidique en agissant sur l’expression des transporteurs. De plus, ARF6 régulait des voies de signalisation impliquées dans l’inflammation. En somme, nous avons démontré l’importance d’ARF6 dans la modulation pathologique des CMLV dans l’athérosclérose. Ainsi, ARF6 contribue à la pathogénicité des CMLV en modulant leur invasion cellulaire tout en jouant un rôle pro-inflammatoire. / Atherosclerosis is a chronic cardiovascular disease characterized by an accumulation of lipids, followed by the infiltration of macrophages and vascular smooth muscle cells (VSMC). VSMC are responsible for the increase of lesion size, the formation of a fibrous cap, and eventually contributing to the plaque instability. In this study, we were interested in the role of ARF6 in the vascular smooth muscle cells and its pathological implications in atherosclerosis. ARF are a family of GTPases that act as molecular switches and are involved in diverse physiological mechanisms, such as vesicular traffic and membrane lipid transformation. In VSMC, ARF6 is important for cell proliferation and migration, two processes involved in atherosclerosis. We therefore hypothesize that the GTPase ARF6 is involved in the development of atherosclerosis through its impact on VSMC. First, we studied the role of ARF6 in the mechanism of cell invasion. In atherosclerosis, multiple environmental factors affect VSMC invasion. We verified the impact of ARF6 on platelet-derived growth factor (PDGF-BB) and angiotensin II (Ang II)-mediated invasion. Using a human model, we observed a reduction of invasion in the absence of ARF6. We have demonstrated that this mechanism is due to the effect of ARF6 on the activity of the matrix metalloproteinase MMP14. Second, we wanted to verify the role of ARF6 in atherosclerosis in an in vivo model. Using an accelerated inducible atherosclerosis model, we inhibited ARF6 in smooth muscle cells. After ten weeks of high-fat diet, we observed a reduction in the size of atherosclerotic lesions in ARF6 KO mice. This reduction was accompanied by a decrease in the expression of proinflammatory factors. In our in vitro model, ARF6 depletion reduced lipid uptake by downregulating the lipidic transporter expression. Also, ARF6 was responsible to activate inflammation signaling pathways. In summary, we have demonstrated the impact of ARF6 in the pathological modulation of VSMC in atherosclerosis. Indeed, ARF6 contributes to the pathogenicity of VSMC through its ability to modulate cell invasion and induce proinflammatory actions.

L’asthme est une des maladies chroniques les plus prévalentes, affectant environ 300 millions d’individus dans le monde et causant plus de 400 000 décès annuellement. La condition se caractérise par une hyperréactivité bronchique, de l’inflammation pulmonaire et des changements structuraux (remodelage) des voies respiratoires. Bien que l’inflammation soit le plus souvent de type éosinophilique dans l’asthme, une proportion importante des patients affectés par la forme sévère de la maladie présente plutôt une infiltration des voies respiratoires par les neutrophiles. Cette inflammation neutrophilique a été associée à plusieurs issues cliniques négatives, notamment à une mauvaise réponse aux traitements, à une obstruction respiratoire permanente et à la mortalité. Malgré l’importance de ces conséquences cliniques pour les patients affectés, le rôle de l’inflammation neutrophilique dans la pathophysiologie de l’asthme, dont ses effets sur le remodelage bronchique, demeure peu exploré. Dans toutes les formes d’asthme, les traitements usuels de la maladie (glucocorticoïdes et bronchodilatateurs) ne permettent pas de renverser entièrement les lésions de remodelage bronchique, dont l’augmentation de la masse du muscle lisse, et ne contrôlent pas adéquatement la neutrophilie pulmonaire. L’augmentation de la masse musculaire lisse bronchique représente pourtant une cible thérapeutique importante vu son implication dans le rétrécissement de la lumière bronchique et le bronchospasme. Les objectifs de cette thèse ont donc été d’étudier les mécanismes potentiellement impliqués dans l’association entre l’inflammation neutrophilique et la sévérité de la maladie, et d’investiguer les effets de thérapies anti-neutrophiliques sur le remodelage bronchique dans le modèle de l’asthme équin sévère. Similairement à la condition humaine, l’asthme équin sévère est caractérisé par une obstruction respiratoire fluctuante, de l’inflammation pulmonaire et un remodelage bronchique, notamment une augmentation de la masse du muscle lisse. Cette maladie se prête particulièrement bien à l’étude du phénotype neutrophilique puisque c’est cette cellule granulocytaire qui infiltre le milieu pulmonaire lors des exacerbations cliniques. Les études réalisées dans ce projet doctoral ont permis de déterminer que l’azithromycine, un macrolide possédant des propriétés immunomodulatrices, réduit l’inflammation neutrophilique dans le modèle de l’asthme équin. Toutefois, ce traitement n’a pas diminué l’obstruction bronchique ni les lésions de remodelage lorsqu’utilisé en monothérapie, et n’a pas potentialisé les effets des corticostéroïdes inhalés. Ces résultats suggèrent que l’atténuation de l’inflammation pulmonaire ne suffit pas à rétablir l’homéostasie tissulaire dans la phase chronique de la maladie. Toutefois, l’hétérogénéité phénotypique des neutrophiles pourrait rendre leur simple quantification dans les sécrétions respiratoires insuffisante pour élucider leurs répercussions dans l’asthme. Par exemple, les neutrophiles pourraient contribuer au remodelage bronchique par la relâche de vésicules extracellulaires, des nanoparticules qui peuvent modifier la biologie des cellules locales et distantes. Ainsi, les caractéristiques des vésicules neutrophiliques et leur effet prolifératif sur le muscle lisse bronchique ont été examinés. Les résultats obtenus indiquent que les vésicules produites par les neutrophiles augmentent la prolifération du muscle lisse bronchique lorsqu’elles proviennent de cellules exposées au lipopolysaccharide, un fragment bactérien omniprésent dans l’environnement et incriminé dans l’infiltration neutrophilique et le développement de l’obstruction bronchique dans l’asthme humain et équin. / Asthma is one of the most prevalent chronic diseases, affecting approximately 300 million people worldwide and causing over 400,000 deaths annually. The condition is characterized by the combination of bronchial hyperreactivity, lung inflammation, and structural changes in the airways (remodeling). Although an eosinophilic inflammation is common in asthma, a significant proportion of patients affected by the severe form of the disease have a neutrophilic airway infiltration. The neutrophilic phenotype has been associated with several negative outcomes in human asthma, including poor response to therapy, permanent airway obstruction and mortality. Despite these associations, the role of neutrophils in asthma, including its effects on airway remodeling, remains insufficiently explored. Unfortunately, standard asthma therapies (glucocorticoids and bronchodilators) do not adequately control neutrophilic inflammation and reverse only partially, if at all, bronchial remodeling lesions, including the increased airway smooth muscle mass. This structural modification is however an important therapeutic target because of its involvement in bronchial lumen narrowing and bronchospasm. The main objectives of this thesis were therefore to study mechanisms potentially involved in the association between neutrophilic inflammation and asthma severity, and to investigate the effects of anti-neutrophilic therapies on bronchial remodeling reversibility in the severe equine asthma model. Similar to the human disease, severe equine asthma is characterized by fluctuating airflow obstruction, pulmonary inflammation, and remodeling lesions, including a large increase in airway smooth muscle mass. Clinical exacerbations are characterized by a marked pulmonary neutrophilic influx, making this disease particularly suitable to study the neutrophilic phenotype. Studies conducted during this doctoral program revealed that azithromycin, a macrolide with immunomodulatory properties, reduces neutrophilic inflammation in the equine asthma model, but fails to alleviate bronchial obstruction and remodeling lesions, suggesting that the control of neutrophilic inflammation is not sufficient to restore tissue homeostasis when the disease reaches its chronic phase. However, the simple quantification of neutrophils within respiratory secretions might not elucidate comprehensively the possible functional consequences of this cell in the pathophysiology of asthma. For instance, neutrophils could lead and sustain bronchial structural lesions through the release of extracellular vesicles. Those nanoparticles can modify the biology of local and distant cells and are involved in the pathophysiology of several inflammatory diseases. Thus, the characteristics and the effect of neutrophil extracellular vesicles on airway smooth muscle proliferation were studied in horses with severe asthma. The results obtained indicate that extracellular vesicles increase bronchial smooth muscle cell proliferation when they are produced by neutrophils exposed to lipopolysaccharide, a ubiquitous environmental contaminant incriminated in the development of neutrophilic infiltration and bronchial obstruction in human and equine asthma.

L’asthme équin est une condition inflammatoire fréquente affectant les voies respiratoires inférieures. Cette maladie est caractérisée par une bronchoconstriction, une hyperréactivité bronchique, ainsi que des changements des différentes couches tissulaires des voies respiratoires que l’on regroupe sous le terme de remodelage pulmonaire. Le remodelage du muscle lisse bronchique dans l’asthme comprend une hyperplasie, une hypertrophie, ainsi qu’une altération des propriétés contractiles des myocytes. Bien que ces changements aient été décrits dans la forme sévère de l’asthme équin, la présence de telles altérations chez les chevaux atteints des formes légères à modérées de l’asthme demeure incertaine. L’objectif de notre étude est donc de déterminer si le muscle lisse bronchique présente un remodelage chez les chevaux asthmatiques légers à modérés. Des biopsies endobronchiques provenant de 18 chevaux asthmatiques et de 7 chevaux contrôles ont été étudiées. Le diagnostic était basé sur les signes cliniques et confirmé par cytologie du lavage bronchoalvéolaire. La prolifération des cellules du muscle lisse bronchique était évaluée par l’expression du proliferating cell nuclear antigen marqué par immunohistochimie, et l’expression génique de l’isoforme rapide de la myosine, une protéine hypercontractile, a été mesurée par RT-qPCR. Cette étude a permis de mettre en évidence une surexpression de l’isoforme rapide de la myosine chez les chevaux asthmatiques légers à modérés. Malgré l’absence de différence dans le taux de prolifération cellulaire du muscle lisse bronchique entre les groupes, le pourcentage de myocytes en prolifération était corrélé à l’inflammation pulmonaire neutrophilique ainsi qu’à l’expression de l’isoforme rapide de la myosine chez les chevaux asthmatiques. Cette première étude évaluant le remodelage du muscle lisse bronchique chez les chevaux asthmatiques légers à modérés a démontré une altération fonctionnelle du muscle lisse bronchique dans les formes légères de l’asthme équin, une possible influence de la neutrophilie pulmonaire sur la prolifération du muscle lisse, ainsi qu’une association entre les phénotypes prolifératifs et contractiles. Les altérations identifiées pourraient servir de biomarqueurs potentiels dans l’évolution de la maladie et de la réponse aux traitements. / Equine asthma is a common inflammatory condition affecting the lower airways. This disease is characterised by bronchoconstriction, airway hyperreactivity, and changes in the different tissue layers of the airways, which are referred to as airway remodelling. Remodelling of the smooth muscle in asthma includes hyperplasia, hypertrophy, and altered contractile properties of the myocytes. Although these changes have been described in severe equine asthma, their presence in horses with milder forms of asthma remains unclear. The aim of our study was therefore to determine whether airway smooth muscle remodelling occurs in horses with mild to moderate asthma. Endobronchial biopsies from 18 asthmatic horses and 7 control horses were studied. The diagnosis was based on clinical signs and confirmed by bronchoalveolar lavage cytology results. Airway smooth muscle cell proliferation was assessed by the expression of immunohistochemically labelled proliferating cell nuclear antigen, and the gene expression of the fast contracting myosin isoform, a hypercontractile protein, was measured by RT-qPCR. This study showed overexpression of the fast contracting myosin isoform in horses with mild to moderate asthma. Although there was no difference in the proliferation rate of airway smooth muscle myocyte between groups, it was correlated with neutrophilic lung inflammation as well as with the expression of the fast myosin isoform in asthmatic horses. This first study evaluating airway smooth muscle remodelling in mild to moderate asthmatic horses has demonstrated a functional alteration of airway smooth muscle in mild equine asthma, as well as a possible influence of pulmonary neutrophilia on smooth muscle proliferation, and an association between proliferative and contractile phenotypes. The identified alterations could eventually serve as biomarkers in the evolution of the disease and the response to treatments.

Les complications vasculaires telles que l’augmentation de la contractilité et la prolifération cellulaire sont les complications les plus communes observées dans le diabète et l’hyperglycémie chronique est un facteur important dans ces processus. La voie de signalisation de Gαq joue un rôle important dans la régulation du tonus vasculaire et l’altération de celle-ci peut contribuer aux complications vasculaires observées dans les cas de diabète et d’hyperglycémie. Il a été observé que les taux et l’activité des protéines kinase C (PKC) et du diacylglycérol (DAG) sont augmentés dans ces conditions. Cependant, aucune étude n’a démontré l’implication de Gαq/11 et des PLCβ, molécules de signalisation en amont de PKC/DAG. Plusieurs études révèlent que l’augmentation des taux et de l’activité des PKC et du DAG induite par l’hyperglycémie dans des cellules du muscle lisse vasculaire (CMLV) est attribuée à l’augmentation du stress oxydatif. De plus, les niveaux de certains peptides vasoactifs, tels que l’angiotensine II et l’endothéline-1, augmentés dans les conditions de diabète/d’hyperglycémie, peuvent contribuer à l’augmentation du stress oxydatif observée. Le travail présenté dans cette thèse avait pour but d’examiner les effets de l’hyperglycémie sur les niveaux d’expression protéique de Gαq/11 et de ses molécules associées, ainsi que d’étudier le mécanisme moléculaire par lequel l’hyperglycémie module la voie de signalisation de Gαq dans les CMLV. Dans la première étude, nous avons examiné si l’hyperglycémie pouvait moduler l’expression des protéines Gαq, Gα11, PLCβ1 et PLCβ2. Le prétraitement des CMLV A10 avec 26 mM de glucose durant 72 heures augmente l’expression des protéines Gαq, Gα11, PLCβ-1 et PLCβ-2 en comparaison avec les CMLV témoins. Le traitement avec des antagonistes aux récepteurs AT1 de l’Ang II, et ETA/ETB de l’ET-1, atténue la hausse de Gαq, de Gα11, de PLCβ1 et de PLCβ2 induite par l’hyperglycémie. De plus, la formation d’IP3 stimulée par l’ET-1 était plus élevée dans les CMLV exposée à 26 mM de glucose. Le traitement des CMLV A10 avec l’Ang II et l’ET-1 augmente également les niveaux d’expression des protéines Gα q/11 et PLCβ. Cette augmentation de l’expression est restaurée au niveau des CMLV témoins par les antagonistes des récepteurs AT1, ETA et ETB. Ces résultats suggèrent que l’augmentation de l’expression des protéines Gαq/11 et PLCβ dans les CMLV induite par l’hyperglycémie est attribuée à l’activation des récepteurs AT1, ETA et ETB. Dans la seconde étude, nous avons examiné l’implication du stress oxydatif dans l’augmentation des niveaux d’expression des protéines Gαq/11 et PLCβ et de leur signalisation induite par l’hyperglycémie. Nous avons également déterminé le mécanisme responsable de l’augmentation du stress oxydatif induite par l’hyperglycémie. L’augmentation de l’expression des protéines Gαq/11 et PLCβ des CMLV A10 exposées à 26 mM de glucose est revenue au niveau basal après un traitement avec l’antioxydant diphenyleneiodonium (DPI), et la catalase, un chélateur du peroxyde d’hydrogène, mais pas par le 111Mn-tetralis(benzoic acid porphyrin) (MnTBAP) ni par l’acide urique, des chélateurs du peroxynitrite. De plus, l’augmentation de la formation d’IP3 stimulée par l’ET-1 dans les CMLV exposées à 26 mM de glucose est revenue au niveau basal après un traitement avec le DPI et la catalase. Ces résultats suggèrent que l’augmentation du stress oxydatif induite par l’hyperglycémie contribue à l’augmentation de l’expression des protéines Gαq/11 et les molécules associées à la voie de signalisation de Gq. De plus, l’augmentation de la production d’anion superoxyde (O2-), de l’activité de la NADPH oxydase et de l’expression des protéines p22(phox) et p47(phox) induite par l’hyperglycémie est revenue à un niveau basal après un traitement avec les antagonistes des récepteurs AT1, ETA et ETB. Ces résultats suggèrent que l’hyperglycémie augmente les niveaux endogènes de l’Ang II et de l’ET-1, ce qui augmente le stress oxydatif par la formation d’O2- et de H2O2 et peut contribuer à l’augmentation des niveaux de Gq/11α et de leurs molécules de signalisation. Puisqu’il a été observé que l’hyperglycémie transactive les récepteurs aux facteurs de croissance tels que le récepteur au facteur de croissance épidermique (EGF-R) et le récepteur au facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-R), nous avons entrepris d’examiner, dans la troisième étude, l’implication d’EGF-R et de PDGF-R dans l’augmentation des niveaux de Gαq/11, de PLCβ et de leur signalisation induite par l’hyperglycémie. L’augmentation des niveaux d’expression des protéines Gαq, Gα11, PLCβ-1 et PLCβ-2 induite par l’hyperglycémie est revenue au niveau basal après un traitement avec les inhibiteurs d’EGF-R (AG1478) et de PDGF-R (AG1295) et par l’inhibiteur de c-Src, PP2. L’augmentation de la phosphorylation d’EGF-R et de PDGF-R induite par l’hyperglycémie a été abolie par AG1478, AG1295 et PP2. De plus, l’augmentation des niveaux de Gαq/11, et de PLCβ induite par l’hyperglycémie est atténuée par l’inhibiteur des MAPK, le PD98059, et par l’inhibiteur d’AKT, le wortmannin. L’augmentation de la phosphorylation d’ERK et d’AKT était également atténuée par AG1478 et AG1295. Ces résultats suggèrent que la transactivation des récepteurs aux facteurs de croissance induite par c-Src peut contribuer à l’augmentation des niveaux de Gα q/11/PLC et de leur signalisation par la voie des MAPK/PI3K. En conclusion, les études présentées dans cette thèse indiquent que l’hyperglycémie augmente les niveaux de Gαq/11 et de PLCβ. Nous avons émis des évidences qui démontrent que l’augmentation endogène de l’Ang II et de l’ET-1 par l’hyperglycémie peut contribuer à l’augmentation de la production d’O2- et de H2O2 résultant ainsi en une augmentation du stress oxydatif qui pourrait être responsable de l’augmentation de Gαq/11/PLC et de leur signalisation dans les conditions d’hyperglycémie. Finalement, nous avons démontré que la transactivation des récepteurs aux facteurs de croissance induite par l’hyperglycémie peut être responsable de l’augmentation de Gαq/11/PLC et les molécules associées à la voie de signalisation de Gq dans les cas de diabète et d’hyperglycémie. / Vascular complications including increased contractility and cell proliferation are most common complications in diabetes, and chronic hyperglycemia seem to be an important contributing factor in this process. Gqα signaling pathway plays an important role in the regulation of vascular tone and aberration of these mechanisms may contribute to vascular complications in hyperglycemia/diabetes. The levels and activity of protein kinase C (PKC) and diacylglycerol (DAG) were shown to be up-regulated in diabeteshyperglycemia. In addition, studies on the expression of upstream signaling molecules of phosphatidyl inositol (PI) turnover were lacking. The enhanced activity/levels of protein PKC and DAG induced by high glucose in VSMC have been shown to be attributed to the increased oxidative stress. Furthermore, the levels of various vasoactive peptides including Ang II and ET-1 which are augmented in diabetes and under hyperglycemic conditions, may also contribute to the enhanced oxidative stress in diabetes/hyperglycemia. The work presented in this thesis was therefore undertaken to examine if hyperglycemia/diabetes could also modulate the expression of Gqα and phospholipase Cb (PLCβ) proteins and associated PI turnover signaling in A10 VSMC exposed to high glucose and to explore the molecular mechanisms by which high glucose modulates Gqα/PLC signaling. The first study was undertaken to investigate if hyperglycemia can modulate the expression of Gqα, G11α, PLCβ-1 and PLCβ-2 and associated signaling. Pre-treatment of A10 VSMC with high glucose (26 mM) for 3 days augmented the levels of Gqα, G11α, PLCβ-1 and β-2 proteins as compared to control cells which were restored to control levels by endothelin-1 (ET-1) ETA and ETB and angiotensin II (Ang II) AT1 receptor antagonists. In addition, ET-1-stimulated IP3 formation was also significantly higher in VSMC exposed to high glucose. Furthermore, treatment of A10 VSMC with Ang II and ET-1 also increased significantly the levels of Gq/11α and PLCβ proteins which were restored towards control levels by ETA/ETB and AT1 receptor antagonists. These results suggest that high glucose augmented the expression of Gq/11α, PLCβ and -mediated signaling in VSMC which may be attributed to activation of AT1, ETA and ETB receptors. The second study was undertaken to investigate the implication of oxidative stress in high glucose-induced enhanced expression of Gq/11α and PLCβ1/2 proteins and associated signaling in A10 VSMC and to explore the mechanism responsible for high glucose induced enhanced oxidative stress. We showed that the increased levels of Gqα, G11α, PLCβ-1 and PLCβ-2 proteins in A10 VSMCs exposed to high glucose were restored to control levels by the antioxidant diphenyleneiodonium (DPI), and catalase, a scavenger of hydrogen peroxide, but not by 111Mn-tetralis(benzoic acid porphyrin) (MnTBAP) and uric acid, scavengers of peroxynitrite. In addition, endothelin-1 (ET-1)-stimulated production of IP3 that was enhanced by high glucose was also restored towards control levels by DPI and catalase. These results suggest that high glucose-induced enhanced oxidative stress that contributes to the enhanced expression of Gq/11α and PLCβ protein and signaling. Furthermore, the enhanced production of superoxide anion (O2-), NADPH oxidase activity and enhanced expression of p22(phox) and p47(phox) proteins induced by high glucose was restored to control levels by losartan, BQ123 and BQ788, the antagonists of angiotensin AT1 and endothelin-1 ETA/ETB receptors respectively. These results suggest that high glucose-induced enhanced levels of endogenous Ang II and ET-1, by increasing oxidative stress may contribute to the increased levels of Gq/11α and-mediated signaling in A10 VSMC. Since high glucose has been shown to increase growth factor receptor activation, we investigated, in the third study, the role of epidermal growth factor receptor (EGF-R) and platelet-derived growth factor receptor (PDGF-R) transactivation in high glucose-induced enhanced expression of Gq/11α and PLCβ. The increased levels of Gqα, G11α, PLCβ-1 and PLCβ-2 proteins induced by high glucose were restored to control levels by AG1478, an inhibitor of EGF-R, and AG1295, an inhibitor of PDGF-R as well as by PP2, an inhibitor of c-Src. High glucose-induced increased phosphorylation of EGF-R and PDGF-R which were abolished by AG1478, AG1295 and PP2. High glucose-induced enhanced levels of Gq, G11α and PLCβ were also attenuated by PD98059, an inhibitor of mitogen-activated protein kinase (MAPK), and wortmannin, an inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K). In addition, high glucose-induced enhanced phosphorylation of ERK1/2 and AKT was also attenuated by AG1478 and AG1295. These results suggest that c-Src-induced transactivation of growth factor receptor contributes to the high glucose-induced enhanced expression of Gq/11α/PLC and-mediated cell signaling through MAPK/PI3K pathway. In conclusion, the studies presented in this thesis indicate that hyperglycemia increased the levels of Gq/11α and PLCβ1/2 proteins and mediated signaling. We provided evidence that high glucose-induced increased levels of Ang II and ET-1 may contribute to the enhanced production of O2- and H2O2 and results in enhanced oxidative stress which may be responsible for the high glucose-induced enhanced expression of Gq/11α and PLCβ. Finally, we demonstrated that high glucose-induced transactivation of growth factor receptors may also be responsible for the high glucose-induced enhanced expression of Gq/11α and PLCβ1/2.

Le stress oxydatif est impliqué dans l’expression du récepteur B1 des kinines (RB1) dans différents modèles de diabète et d'hypertension. Puisque l'angiotensine II (Ang II) et l'endothéline-1 (ET-1) sont des peptides prooxydants impliqués dans les maladies cardiovasculaires, leur contribution dans l'augmentation de l'expression du RB1 a été étudiée dans des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV). Le QRT-PCR et l’immunobuvardage de type Western ont été utilisés pour mesurer l’expression du RB1 dans des CMLV dérivées de la lignée A10 et de l’aorte de rats Sprague-Dawley. Cette étude montre que l’Ang II augmente l’expression du RB1 (ARNm et protéine) en fonction de la concentration et du temps (maximum 1 μM entre 3-6 h). Cette augmentation implique le récepteur AT1, la PI3K et le NF-κB, mais non le récepteur AT2 et ERK1/2. Aussi, le récepteur ETA de l’ET-1 est impliqué dans la réponse à l’Ang II à 6-8 h et non à 1-4 h. Par contre, l’ET-1 augmente l’expression du RB1 (maximum 2-4 h) via la stimulation des récepteurs ETA et ETB. L’augmentation du RB1 causée par l’Ang II et l’ET-1 est bloquée par les antioxydants (N-acétyl-cystéine et diphénylèneiodonium). Ces résultats suggèrent que l’Ang II induit le RB1 dans les CMLV par le récepteur AT1 dans la première phase, et par la libération d’ET-1 (majoritairement par ETA) dans la phase tardive, via le stress oxydatif et l’activation de la PI3K et du NF-κB. Ces résultats précisent le mécanisme impliqué dans la surexpression du RB1 ayant des effets néfastes dans le diabète et l'hypertension. / Oxidative stress is involved in the overexpression of kinin B1 receptor (B1R) in various models of diabetes and hypertension. Since angiotensin II (Ang II) and endothelin-1 (ET-1) are pro-oxidative peptides involved in cardiovascular diseases, their contribution in increasing the expression of B1R was examined in vascular smooth muscle cells (VSMC). QRT-PCR and Western blot analysis were used to measure the expression of B1R in VSMC derived from A10 cell line and the aorta of Sprague-Dawley rats. This study shows that Ang II increases the expression of B1R (mRNA and protein) in a concentration- and time-dependent manner (maximum 1 μM between 3-6 h). This increase involves AT1 receptor, PI3K and NF-κB, but not AT2 receptor and ERK1/2. Moreover, ETA receptor is involved in the effect of Ang II at 6-8 h but not at 1-4 h. However, ET-1 increases expression of B1R (maximum 2-4 h) via stimulation of ETA and ETB receptors. Ang II and ET-1-induced increase expression of B1R is blocked by antioxidants (N-acetyl-L-cysteine and diphenyleneiodonium). These results suggest that Ang II induces B1R in VSMC by AT1 receptor in the first phase and by releasing ET-1 (predominantly by ETA receptor) in the late phase, via oxidative stress and activation of PI3K and NF-κB. These results clarify the mechanism involved in the overexpression of B1R which has adverse effects in diabetes and hypertension.