As Hsp60 acham-se conservadas em todos os organismos, participando da estruturação de proteínas e em processos crônico-degenerativos. Foi avaliada a ação das Hsp65r WT e sua mutante K409A de M. leprae no envelhecimento. Análises do Tempo Médio de Sobrevida (TMS), titulação dos isótipos, ensaios de avidez e análises histopatológicas foram realizadas em camundongos das linhagens HIII e LIII inoculados intraperitonealmente aos 120 ou 270 dias de vida com 2.5µg/mL das Hsp65r. Verificou-se redução no TMS de fêmeas HIII, envelhecidas e adultas, inoculadas com WT. A inoculação da Hsp65r WT em fêmeas LIII envelhecidas resultou no aumento do TMS. A dosagem dos anticorpos não revelou alterações marcantes na produção dos isótipos, e a avidez de IgG foi menor nas fêmeas HIII envelhecidas inoculadas com WT. A análise histopatológica mostrou inflamação nos rins de fêmeas HIII velhas tratadas com Hsp65r WT. Os resultados indicaram a interferência da Hsp65r WT na imunidade durante o processo de senescência de fêmeas envelhecidas constitutivamente boas produtoras de anticorpos. / The Hsp60 are conserved in all organisms, involved in proteins folding and chronic-degenerative processes. We evaluated the action of M. leprae rHsp65 WT and its mutant K409A in aging. Analyses of mean survival time (MST), antibody titration, avidity assays and histopathological examinations were performed in mice from HIII and LIII lines intraperitoneally inoculated at 120 or 270 days of life with 2.5µg/mL of rHsp65. There was a decrease in MST in adult and aged HIII females mice inoculated with WT protein. WT rHsp65 treatment in aged LIII females resulted in the increase of MST. The antibodies titration showed no marked changes in the production of isotypes and IgG avidity was lower in aged HIII females inoculated with WT. Histopathology showed inflammation in the kidneys of old HIII females treated with WT rHsp65. The results indicated the interference of WT rHsp65 in immunity during the senescence of aged females from HIII line constitutively producing good antibodies.

Submitted by Johnny Rodrigues (johnnyrodrigues@ufcg.edu.br) on 2018-09-04T23:45:22Z No. of bitstreams: 1 JOSÉ RÔMULO SOARES DOS SANTOS - TESE PPGMV 2012..pdf: 499950 bytes, checksum: a58df169790a0820def666327bad8f42 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-04T23:45:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JOSÉ RÔMULO SOARES DOS SANTOS - TESE PPGMV 2012..pdf: 499950 bytes, checksum: a58df169790a0820def666327bad8f42 (MD5) Previous issue date: 2012-12-20 / Esta tese inclui uma revisão de literatura e dois artigos. O primeiro capítulo é uma revisão que abrange princípios gerais da teratologia, a epidemiologia, o diagnóstico, a clínica e a patologia das malformações em pequenos ruminantes. No artigo que corresponde ao segundo capítulo, foi estudado a teratogenicidade de Mimosa tenuiflora. Quinze ovelhas, distribuídas em dois grupos foram introduzidas em área invadida pela planta. O Grupo 1, com seis ovelhas prenhes, foi introduzido na área experimental 20 dias após o acasalamento. O Grupo 2, formado por nove ovelhas não prenhes e um carneiro, foi introduzido na área experimental no início do experimento. A cada 15 dias eram realizados exames ultrassonográficos para acompanhamento da gestação. No Grupo 1, três ovelhas abortaram, cada uma um feto sem malformações. Outra ovelha pariu dois cordeiros, um com hiperflexão na articulação interfalangeana proximal no membro torácico direito e outro sem malformações. Outra ovelha pariu um cordeiro com hiperflexão dos dois membros pélvicos na região da articulação tarsometatársica. No grupo 2, uma ovelha abortou um feto sem malformações e cinco pariram cordeiros normais. Três das ovelhas desse grupo não emprenharam durante todo o período experimental, mostrando retornos repetidos ao cio, sugerindo perda embrionária. Concluiu-se que M. tenuiflora, além de causar malformações causa, também, mortalidade embrionária e abortos em ovelhas. No terceiro capitulo, o artigo relata os achados clínicos e patológicos de um caprino com lisencefalia e hipoplasia cerebelar. No exame físico, esse caprino de 30 dias, apresentava incoordenação e incapacidade de ficar em pé, decúbito esternal permanente, ataxia, ausência do reflexo de ameaça, tremores de intenção e nistagmo. Após 11 dias de internamento o caprino foi eutanasiado e necropsiado. Na necropsia, o cérebro não apresentava giros e sulcos e o cerebelo estava reduzido de tamanho. Histologicamente, em todo o córtex cerebral, a substância cinzenta estava mais espessa e a substância branca mais fina que o normal. Os neurônios estavam distribuídos de forma aleatória na substância cinzenta. No cerebelo, as camadas estavam desorganizadas, com localização heterotópica das células. Os achados macroscópicos e histológicos são característicos de lisencefalia e hipoplasia cerebelar. Lisencefalia é uma doença rara na medicina veterinária e não tinha sido descrita em caprinos. / This thesis includes a review and two papers. The first chapter is a review about general principles of teratology and epidemiology, diagnosis, clinical signs and pathology of malformations in small ruminants. The second chapter is a paper that studied the teratogenicity of Mimosa tenuiflora. Fifteen sheep, divided into two groups, were introduced into an area invaded by the plant. Group 1 consisted of six pregnant ewes that were introduced into the experimental area 20 days after mating. Group 2 consisted of nine non pregnant sheep and a ram introduced into the area at the start of the experiment. Every 15 days each sheep was examined by ultrasound to control pregnancy. In Group 1, three sheep aborted single fetuses without malformations. One sheep delivered two lambs, one with hyperflexion of the proximal inter-phalangeal joint of the right forelimb and another without malformations. Another sheep delivered a lamb with a hyperflexion of both hindlimbs in the region of the tarsal-metatarsal joint. Only one sheep delivered a normal lamb. In Group 2, one sheep aborted a fetus without malformations and five delivered normal lambs. Three sheep of this group returned to estrus repeatedly and did not get pregnant during the mating period, suggesting embryonic loss. It is concluded that M. tenuiflora cause malformations, embryonic mortality and abortion in sheep. In the third chapter, the paper relates a case of lissencephaly and cerebellar hypoplasia in a goat. The goat presented sternal recumbence, absent menace response, intention tremors, ataxia, and nystagmus. It was euthanized and necropsied after been hospitalized during eleven days. At necropsy, the surface of the brain was smooth, cerebral sulci and gyri were absent, and the cerebellum was reduced in size. Histologically, in all cerebral cortex, the grey matter was thicker and the white matter was thinner than normal. The neurons were arranged randomly in the grey matter. In the cerebellum, the layers were disorganized and there was heterotopy of the cells. The histologic and gross lesions are characteristic of lissencephaly associated with cerebellar hypoplasia. Lissencephaly is a rare disease in veterinary medicine and had not been reported previously in goats.

A doença hepática associada a sobrecarga de ferro pode ocorrer devido a causas genéticas ou secundárias. Esse estudo avaliou pacientes com hepatopatia crônica com sobrecarga de ferro submetidos à pesquisa das mutações HFE no período de 2007-2009 e classificou como portadores de hemocromatose hereditária HFE (HH-HFE) aqueles que apresentavam as mutações C282Y/C282Y ou C282Y/H63D e como sobrecarga de ferro não HFE aqueles que apresentavam outras mutações no gene HFE como C282Y/-, H63D/- e H63D/H63D ou pacientes sem qualquer uma dessas mutações mencionadas. Os objetivos do estudo foram 1) analisar e correlacionar os aspectos fenotípicos e genotípicos de grupo de indivíduos com doença hepática crônica e sobrecarga de ferro; 2) caracterizar o quadro clínico, laboratorial e anatomopatológico, em busca de achados compatíveis com o fenótipo de hemocromatose; 3) Correlacionar o quadro clínico com as mutações no gene HFE. Foram analisados 108 indivíduos portadores de hepatopatia crônica selecionados a partir de saturação de transferrina (ST) > 45% e ferritina sérica > 350 ng/mL. Foram estudados e comparados 16 pacientes no grupo HH-HFE com 92 no grupo sobrecarga de ferro não HFE. Da casuística geral, a idade média ao diagnóstico da doença foi de 46,69 anos (16-77), com 70,73% constituída por indivíduos de cor branca, 77,57% do sexo masculino e 64,8% tinham cirrose hepática. A frequência de cirrose hepática não diferiu entre os grupos, entretanto, artropatia, carcinoma hepatocelular, diabetes e osteoporose foram mais frequentes no grupo HH- HFE (53,8% x 15,9%, 31,2% x 7,06%, 56,2% x 30%, 72,7% x 32,1%, respectivamente, p < 0,05). Os pacientes com mutações HFE diagnósticas de HH apresentaram maior chance de ter carcinoma hepatocelular (OR= 5,0, p= 0,032) quando comparados com os portadores de outros genótipos HFE e aqueles sem mutação. Os níveis de ST, ferro e ferritina também foram maiores naquele grupo, bem como os graus de siderose 3 e 4 (p= 0,026). A ST foi a variável que se correlacionou independentemente com o diagnóstico das mutações C282Y/C282Y e C282Y/H63D. A frequência de fatores de risco para sobrecarga de ferro não diferiu entre os grupos. Observou-se, entretanto, que no grupo HH-HFE havia maior número de pacientes sem qualquer fator de risco detectado (p= 0,019). Níveis de ST > 82% apresentaram maior valor preditivo negativo para o diagnóstico de HH-HFE do que os de ferritina, ferro, capacidade total de ligação de ferro e de transferrina. Concluímos que os portadores de HH-HFE têm maiores graus de sobrecarga de ferro quando comparados ao grupo de sobrecarga de ferro não-HFE; em indivíduos com doença hepática crônica. ST > 82% tem maior acurácia para diagnóstico de HH-HFE; portadores de mutações C282Y em homozigose ou em heterozigose composta com H63D têm maior chance de apresentar carcinoma hepatocelular do que os portadores de outras mutações no gene HFE e pacientes sem mutação / Chronic liver disease related to iron overload may occur due to genetic or secondary causes. This study analyzed patients with chronic liver diseases and iron overload who were tested for HFE mutations from 2007 to 2009. Patients with C282Y/C282Y or C282Y/H63D mutations were diagnosed with HFE hereditary hemochromatosis (HFE-HH) and those with other HFE genotypes (C282Y/-, H63D/- or H63D/H63D) or individuals without HFE mutations (wild type) were designed as non-HFE iron overload. The aims of this study were: 1) to analyze and to establish correlations between phenotypic and genotypic aspects of individuals with chronic liver disease and with iron overload; 2) to charachterize the clinical manifestations, laboratory and histological findings consistent with the phenotype of hemochromatosis; 3) to verify associations between clinical manifestations and HFE mutations. One hundred and eight patients with chronic liver diseases and with iron overload, defined as transferrin saturation (TS) > 45% and serum ferritin levels > 350 ng/mL were included. Sixteen patients had HH-HFE and were compared with 92 patients with non-HFE iron overload group. The average of age at diagnosis was 46.69 years (16-77), 70.73% were Caucasians, 77.57% were male and 64.8% had hepatic cirrhosis. The proportion of hepatic cirrhosis was similar in both groups, nevertheless arthropathy, hepatocellular carcinoma, diabetes and osteoporosis were more frequent in the HFE-HH group (53,8% x 15,9%, 31,2% x 7,06%, 56,2% x 30%, 72,7% x 32,1%, respectively, p < 0,05). The HFE C282Y/C282Y or C282Y/ H63D genotypes had a higher chance to develop hepatocellular carcinoma (OR= 5.0, p= 0.032) when compared with the other HFE genotypes and with those wild type. The levels of TS, serum iron and ferritin were greater in HFE-HH group, as well as hepatic siderosis grade 3 and 4 (p= 0.026). TS was the biochemical marker of iron overload with the higher independent correlation with the presence of C282Y/C282Y and C282Y/H63D mutations. The frequency of risk factors for iron overload was not different between the groups, however, in HFE-HH group a greater number of patients without any risk factor was detected (p= 0.019). TS > 82% had a higher predictive negative value for diagnosing HFE-HH when compared to the levels of ferritin, serum iron, total iron binding capacity and transferrin. We concluded that the HFE-HH patients had a greater iron overload than patients with chronic liver diseases with non-HFE iron overload. TS > 82% had more accuracy to diagnose HFE-HH. The carriers of C282Y/C282Y or C282Y/H63D mutations had a higher probability to develop hepatocellular carcinoma, when compared to the patients with HFE genotypes and patients wild type

As doenças que comprometem o crescimento humano apresentam uma forte influência genética. O objetivo geral do projeto atual é desenvolver e aplicar a tecnologia de sequenciamento paralelo em larga escala para compreensão desses distúrbios de crescimento, com foco principal em crianças nascidas pequenas para idade gestacional (PIG), definida como criança com Escore-Z de comprimento e/ou peso ao nascimento menor ou igual a -2. PIG é uma condição heterogênea, que inclui como causa fatores maternos, placentários e fetal, dentre o qual, destacam-se as alterações genéticas. Crianças nascidas PIG e que não recuperaram seu déficit estatural espontaneamente nos primeiros anos de vida apresentam uma alta probabilidade de serem adultos baixos e costumam evoluir com quadros clínicos complexos, envolvendo retardo de crescimento persistente na vida pós-natal, dismorfismos, anomalias congênitas e distúrbios de desenvolvimento neuropsicomotor. Foi utilizada a tecnologia de sequenciamento Sure Select (Agilent Technologies, CA, USA) para estudar aproximadamente 390 genes escolhidos por pertencerem à via IGFs/IGF1R, principal eixo regulador hormonal do crescimento, genes sabidamente envolvidos em doenças associadas com distúrbio de crescimento, além de genes candidatos identificados em estudos prévios do laboratório, associados à regulação do crescimento, em um grande número de pacientes. Foram sequenciados 80 pacientes, obtendo uma cobertura média de 354 vezes e com mais de 99% da região alvo com cobertura > 10 reads. Nestas amostras foram identificadas 58 variantes, 18 consideradas patogênicas ou provavelmente patogênicas em 19 pacientes, 32 de significado incerto, 7 provavelmente benigna e 1 provavelmente patogênica para condição não associada a distúrbio de crescimento (\"achado acidental\"). Dentre as variantes consideradas patogênicas ou provavelmente patogênicas houve uma grande heterogeneidade entre os genes, sendo identificadas variantes nos genes PTPN11 (x3), BLM (x3), NPR2 (x2), ANKRD11 (x2), SRCAP (x2), FGFR3 (x2), IGF1R, SHOC2, SHOX, NIPBL e deleção 22q11. Podemos concluir que a técnica de sequenciamento paralelo em larga escala de genes alvo é eficiente em estabelecer o diagnóstico molecular de crianças nascidas PIG. Foi possível identificar a etiologia genética em 23,75% da casuística estudada, em sua maior parte, de pacientes com síndromes reconhecidas clinicamente. Contudo, defeitos no sistema IGFs/IGF1R não foram frequentes nesta condição / Diseases affecting human growth are most likely caused by genetic factors. The main goal of this project is to apply the technology of massive parallel sequencing to comprehend growth disturbs in children born small for gestational age (SGA), known as the children with Z-score of height and/or weight at birth less or equal -2. SGA is a heterogeneous condition, and as its causes we can find maternal, placental and fetal factors, of which, the most important are the genetic alterations. Children born SGA that do not have catch-up growth spontaneously up to the second year of life may remain with short stature when adults and they usually present other clinical features, such as dimorphisms, congenital anomalies and neuropsychomotor developmental delay. We used the Sure Select technology (Agilent Technologies, CA, USA) to study approximately 390 genes chosen by participate of the IGFs/IGF1R system, or genes already associated with growth disorders, or candidate genes found in previous studies of aCGH (Array Comparative Genomic Hybridization) or exome sequencing. We sequenced 80 patients, and had a mean coverage of 354x, with more than 99% of the target region with > 10 reads. We found 58 variants, 18 classified as pathogenic or probably pathogenic in 19 patients, 32 variants of unknown significance and 7 probably benign and 1 probably pathogenic for a condition non associated to short stature (``incidental finding``) Among the probably pathogenic and pathogenic we found a great heterogeneity in genes, with variants identified in 10 different genes PTPN11 (x3), BLM (x3), NPR2 (x2), ANKRD11 (x2), SRCAP (x2), FGFR3 (x2), IGF1R, SHOC2, SHOX, NIPBL and a 22q11 deletion. In conclusion, the technique of targeted gene panel sequencing is a useful tool to establish the molecular diagnose in children SGA. We could identify the molecular cause in 23.75% of the casuistic, mostly patients with clinically recognized syndromes. However, variants at IGFs/IGF1R system are not frequently associated with the studied condition

Introdução: Distrofia muscular progressiva nas formas de Duchenne (DMD) e Becker (DMB) são doenças caracterizadas por progressiva degeneração musculoesquelética e substituição por tecido fibrogorduroso. O envolvimento cardíaco está presente em 80% dos pacientes, apresenta curso clínico silencioso e é diagnosticado tardiamente pelos métodos tradicionais. Objetivos: 1. Investigar a progressão da fibrose miocárdica pela ressonância magnética cardíaca (RMC), em ensaio clínico randomizado para tratamento ou não com IECA, de pacientes com DMD e DMB e fração de ejeção ventricular esquerda (FEVE) preservada, por um período de 02 anos. 2. Investigar se há mutações genéticas específicas que sejam preditoras do acometimento miocárdico diagnosticado pela RMC. 3. Comparar os achados do ECG, radiografia de tórax e ecocardiograma com os da RMC. Métodos: Entre 1/6/2009 e 1/6/2012 foram incluídos 76 pacientes com diagnóstico de DMD e DMB. Todos os pacientes realizaram duas RMCs com intervalo médio de 2,05±0,11 anos, com técnicas de cine ressonância para avaliação da função ventricular e realce tardio miocárdico para avaliação da fibrose miocárdica. A fibrose miocárdica foi quantificada por software específico para obtenção do percentual da massa de fibrose do VE com análise semi automática, utilizando os desvios padrões da média dos valores de intensidade do sinal do miocárdio normal. Os valores acima de 5 desvios padrões da média do miocárdio normal foram considerados como fibrose miocárdica. Os 42 pacientes com fibrose miocárdica e FEVE normal foram randomizado em 2 grupos, com 21 deles recebendo tratamento com IECA e 21 sem qualquer tratamento para cardiomiopatia. Após 2 anos, novas RMCs foram realizadas para avaliar a evolução da fibrose e a FEVE. Resultados: Notou-se fibrose miocárdica em 72,3% dos pacientes, sendo que 55,6 % não apresentavam disfunção sistólica. Verificou-se uma correlação positiva significativa entre idade e percentual de fibrose na RMC basal (r=0,338, p=0,014) e seguimento (r=0,315, p=0,006). Os pacientes randomizados e tratados com IECA apresentaram menor evolução do percentual de fibrose do que os randomizados não tratados (3,1±7,4% versus 10,0±6,2% respectivamente, p=0,001). Na análise linear multivariada, verificamos que pertencer ao grupo tratado diminui a progressão do percentual de fibrose (y=-4,51x+29,63 ajustado por idade, CK e percentual de fibrose basal, p=0,039) e indica uma tendência de menor probabilidade de apresentar fração de ejeção do VE < 50% na RMC seguimento (OR= 3,18, p= 0,102, por regressão logística). Os pacientes com mutação nos exons menores que 45 do gene da distrofina apresentaram maior percentual de fibrose que os com mutação dos exons maiores ou iguais ao 45 na RMC basal (27,9±18,4% versus 12,1±13,4%, respectivamente, p=0,006) e seguimento (33,1±21,1% versus 18,8±16,9%, respectivamente, p=0,024). A avaliação conjunta por métodos tradicionais (radiografia de tórax, ECG e ecocardiografia) apresentou baixa sensibilidade de 47,3% e valor preditivo negativo de 34,1% para o diagnóstico do envolvimento cardíaco na DMD e DMB, em pacientes com FEVE normal e fibrose miocárdica na RMC. Conclusões: O ensaio clínico randomizado, por um período de 2 anos, em pacientes com DMD e DMB, com fibrose miocárdica diagnosticada pela RMC e FEVE preservada, demonstrou significativa maior progressão da fibrose miocárdica nos pacientes que não fizerem uso de IECA. Existe uma correlação significativa entre o local de mutação no gene da distrofina e o acometimento cardíaco. O ECG, o eco e radiografia de tórax apresentaram baixa sensibilidade e baixo valor preditivo negativo para detecção do envolvimento cardíaco precoce nos pacientes com DMD e DMB / Introduction: Duchenne and Becker muscular dystrophies (DMD and BMD) are diseases characterized by progressive skeletal muscle degeneration and replacement by fibro fatty tissue. Cardiac involvement is frequent, as high as 70 - 80% of patients, and often develops clinically silent, without any evident early clinical signs. Traditional diagnostic methods (ECG, chest x-ray and echocardiography) are only able to diagnose cardiac involvement at a later stage. Objectives: 1. To investigate the progression of myocardial fibrosis by cardiac magnetic resonance (CMR), in a randomized clinical trial for treatment with ACE inhibitors, in patients with DMD or BMD and preserved left ventricular ejection fraction (LVEF), for a period of 02 years. 2. To investigate whether there are specific genetic mutations that are predictive of myocardial involvement detected by CMR. 3. To compare the findings of ECG, chest radiography and echocardiography with those found by CMR. Methods: Between 01/06/2009 and 01/06/2012 76 patients with DMD and BMD were included. All patients underwent two CMRs with a mean interval of 2.05±0.11 years, using cine resonance for function evaluation and myocardial delayed enhancement technique for myocardial fibrosis detection. Myocardial fibrosis was quantified by specific software for obtaining fibrosis mass, as percentage of LV mass, using semi-automatic fibrosis analysis and standard deviations of the mean values of signal intensity of the normal myocardium. A value of five standard deviations above the mean of a normal myocardium were considered myocardial fibrosis. The 42 patients with myocardial fibrosis and normal LVEF were randomized into 2 groups, with 21 of them receiving ACE inhibitor treatment and 21 no treatment for cardiomyopathy. After 2 years, new CMRs were performed to evaluate fibrosis extent and LVEF. Results: Myocardial fibrosis was noted in 72.3% of the patients, 55.6% showed no systolic dysfunction. There was a significant positive correlation between age and myocardial fibrosis at the CMR baseline (r=0.338, p=0.014) and follow-up (r=0.315, p=0.006). Patients randomized and treated with ACE inhibitors had lower evolution of myocardial fibrosis than those who were randomized and untreated (3.1±7.4% vs.10.0±6.2%, respectively, p=0.001). Using multivariate regression analysis, we found that belonging to the treated group decreases the progression of myocardial fibrosis (y=-4.51x+29.63 adjusted for age, CK and baseline myocardial fibrosis, p=0.039) and indicated a trend for lower probability of presenting LVEF<50% at follow-up CMR (OR= 3.18, p= 0.102, by logistic regression). Patients with mutations in exons less than 45 had greater extent of myocardial fibrosis than patients with mutations in exons greater than or equal to 45 in CMR at baseline (27.9±18.4% vs. 12.1±13.4%, respectively, p=0.006) and at follow-up (33.1±21.1% vs. 18.8±16.9%, respectively, p=0.024). Conclusions: In this 2-year follow-up randomized clinical trial in patients with DMD and BMD with preserved LVEF, myocardial fibrosis diagnosed by CMR, showed significantly greater progression in patients not receiving ACE inhibitors therapy. There was a significant correlation between the site of mutation in the dystrophin gene and cardiac involvement. ECG, echocardiography and chest radiography showed low sensitivity and low negative predictive value for early detection of cardiac involvement (myocardial fibrosis by CMR) in patients with DMD and BMD

A doença de Wilson é um distúrbio da excreção biliar de cobre devido a um defeito na proteína ATP7B. Em caráter pioneiro na América do Sul, seqüenciou-se o gene ATP7B em 60 pacientes brasileiros pertencentes a 46 famílias; os resultados foram relacionados com aspectos demográficos e fenotípicos. Detectaram-se 25 mutações, 12 das quais novas. A 3402delC (34,8%) e a L708P (14,1%) ocorreu em 58,3% das famílias de São Paulo e em 44,4% das de Minas Gerais, respectivamente. As substituições novas, pesquisadas por RFLP ou PCR alelo-específica, não ocorreram em 60 indivíduos controle; portanto, não são polimorfismos comuns. O estudo comparativo de haplótipos dos portadores da L708P da coorte atual e de Gran Canaria sugeriu um efeito-fundador comum para ambos os grupos. O fenótipo variou amplamente para genótipos idênticos / ATP7B protein. As the first study of its kind in South America, the ATP7B gene was sequenced and the results were related to demographic and phenotypic aspects of 60 Brazilian patients, from 46 distinct families. Twenty-five mutations were detected, 12 of which are novel. The 3402delC (34.8%) and the L708P (14.1%) occurred in 58.3% of the families from Sao Paulo and in 44.4% of those from Minas Gerais, respectively. The novel substitutions were shown not to be common polymorphisms by RFLP or allele-specific PCR studies performed in 60 control subjects. Haplotype analysis comparing carriers of the L708P from this cohort study with patients from Gran Canary suggests the same founder-effect for both groups. Phenotype varied widely for identic genotypes.

As doenças que comprometem o crescimento humano apresentam uma forte influência genética. O objetivo geral do projeto atual é desenvolver e aplicar a tecnologia de sequenciamento paralelo em larga escala para compreensão desses distúrbios de crescimento, com foco principal em crianças nascidas pequenas para idade gestacional (PIG), definida como criança com Escore-Z de comprimento e/ou peso ao nascimento menor ou igual a -2. PIG é uma condição heterogênea, que inclui como causa fatores maternos, placentários e fetal, dentre o qual, destacam-se as alterações genéticas. Crianças nascidas PIG e que não recuperaram seu déficit estatural espontaneamente nos primeiros anos de vida apresentam uma alta probabilidade de serem adultos baixos e costumam evoluir com quadros clínicos complexos, envolvendo retardo de crescimento persistente na vida pós-natal, dismorfismos, anomalias congênitas e distúrbios de desenvolvimento neuropsicomotor. Foi utilizada a tecnologia de sequenciamento Sure Select (Agilent Technologies, CA, USA) para estudar aproximadamente 390 genes escolhidos por pertencerem à via IGFs/IGF1R, principal eixo regulador hormonal do crescimento, genes sabidamente envolvidos em doenças associadas com distúrbio de crescimento, além de genes candidatos identificados em estudos prévios do laboratório, associados à regulação do crescimento, em um grande número de pacientes. Foram sequenciados 80 pacientes, obtendo uma cobertura média de 354 vezes e com mais de 99% da região alvo com cobertura > 10 reads. Nestas amostras foram identificadas 58 variantes, 18 consideradas patogênicas ou provavelmente patogênicas em 19 pacientes, 32 de significado incerto, 7 provavelmente benigna e 1 provavelmente patogênica para condição não associada a distúrbio de crescimento (\"achado acidental\"). Dentre as variantes consideradas patogênicas ou provavelmente patogênicas houve uma grande heterogeneidade entre os genes, sendo identificadas variantes nos genes PTPN11 (x3), BLM (x3), NPR2 (x2), ANKRD11 (x2), SRCAP (x2), FGFR3 (x2), IGF1R, SHOC2, SHOX, NIPBL e deleção 22q11. Podemos concluir que a técnica de sequenciamento paralelo em larga escala de genes alvo é eficiente em estabelecer o diagnóstico molecular de crianças nascidas PIG. Foi possível identificar a etiologia genética em 23,75% da casuística estudada, em sua maior parte, de pacientes com síndromes reconhecidas clinicamente. Contudo, defeitos no sistema IGFs/IGF1R não foram frequentes nesta condição / Diseases affecting human growth are most likely caused by genetic factors. The main goal of this project is to apply the technology of massive parallel sequencing to comprehend growth disturbs in children born small for gestational age (SGA), known as the children with Z-score of height and/or weight at birth less or equal -2. SGA is a heterogeneous condition, and as its causes we can find maternal, placental and fetal factors, of which, the most important are the genetic alterations. Children born SGA that do not have catch-up growth spontaneously up to the second year of life may remain with short stature when adults and they usually present other clinical features, such as dimorphisms, congenital anomalies and neuropsychomotor developmental delay. We used the Sure Select technology (Agilent Technologies, CA, USA) to study approximately 390 genes chosen by participate of the IGFs/IGF1R system, or genes already associated with growth disorders, or candidate genes found in previous studies of aCGH (Array Comparative Genomic Hybridization) or exome sequencing. We sequenced 80 patients, and had a mean coverage of 354x, with more than 99% of the target region with > 10 reads. We found 58 variants, 18 classified as pathogenic or probably pathogenic in 19 patients, 32 variants of unknown significance and 7 probably benign and 1 probably pathogenic for a condition non associated to short stature (``incidental finding``) Among the probably pathogenic and pathogenic we found a great heterogeneity in genes, with variants identified in 10 different genes PTPN11 (x3), BLM (x3), NPR2 (x2), ANKRD11 (x2), SRCAP (x2), FGFR3 (x2), IGF1R, SHOC2, SHOX, NIPBL and a 22q11 deletion. In conclusion, the technique of targeted gene panel sequencing is a useful tool to establish the molecular diagnose in children SGA. We could identify the molecular cause in 23.75% of the casuistic, mostly patients with clinically recognized syndromes. However, variants at IGFs/IGF1R system are not frequently associated with the studied condition

Introdução: Distrofia muscular progressiva nas formas de Duchenne (DMD) e Becker (DMB) são doenças caracterizadas por progressiva degeneração musculoesquelética e substituição por tecido fibrogorduroso. O envolvimento cardíaco está presente em 80% dos pacientes, apresenta curso clínico silencioso e é diagnosticado tardiamente pelos métodos tradicionais. Objetivos: 1. Investigar a progressão da fibrose miocárdica pela ressonância magnética cardíaca (RMC), em ensaio clínico randomizado para tratamento ou não com IECA, de pacientes com DMD e DMB e fração de ejeção ventricular esquerda (FEVE) preservada, por um período de 02 anos. 2. Investigar se há mutações genéticas específicas que sejam preditoras do acometimento miocárdico diagnosticado pela RMC. 3. Comparar os achados do ECG, radiografia de tórax e ecocardiograma com os da RMC. Métodos: Entre 1/6/2009 e 1/6/2012 foram incluídos 76 pacientes com diagnóstico de DMD e DMB. Todos os pacientes realizaram duas RMCs com intervalo médio de 2,05±0,11 anos, com técnicas de cine ressonância para avaliação da função ventricular e realce tardio miocárdico para avaliação da fibrose miocárdica. A fibrose miocárdica foi quantificada por software específico para obtenção do percentual da massa de fibrose do VE com análise semi automática, utilizando os desvios padrões da média dos valores de intensidade do sinal do miocárdio normal. Os valores acima de 5 desvios padrões da média do miocárdio normal foram considerados como fibrose miocárdica. Os 42 pacientes com fibrose miocárdica e FEVE normal foram randomizado em 2 grupos, com 21 deles recebendo tratamento com IECA e 21 sem qualquer tratamento para cardiomiopatia. Após 2 anos, novas RMCs foram realizadas para avaliar a evolução da fibrose e a FEVE. Resultados: Notou-se fibrose miocárdica em 72,3% dos pacientes, sendo que 55,6 % não apresentavam disfunção sistólica. Verificou-se uma correlação positiva significativa entre idade e percentual de fibrose na RMC basal (r=0,338, p=0,014) e seguimento (r=0,315, p=0,006). Os pacientes randomizados e tratados com IECA apresentaram menor evolução do percentual de fibrose do que os randomizados não tratados (3,1±7,4% versus 10,0±6,2% respectivamente, p=0,001). Na análise linear multivariada, verificamos que pertencer ao grupo tratado diminui a progressão do percentual de fibrose (y=-4,51x+29,63 ajustado por idade, CK e percentual de fibrose basal, p=0,039) e indica uma tendência de menor probabilidade de apresentar fração de ejeção do VE < 50% na RMC seguimento (OR= 3,18, p= 0,102, por regressão logística). Os pacientes com mutação nos exons menores que 45 do gene da distrofina apresentaram maior percentual de fibrose que os com mutação dos exons maiores ou iguais ao 45 na RMC basal (27,9±18,4% versus 12,1±13,4%, respectivamente, p=0,006) e seguimento (33,1±21,1% versus 18,8±16,9%, respectivamente, p=0,024). A avaliação conjunta por métodos tradicionais (radiografia de tórax, ECG e ecocardiografia) apresentou baixa sensibilidade de 47,3% e valor preditivo negativo de 34,1% para o diagnóstico do envolvimento cardíaco na DMD e DMB, em pacientes com FEVE normal e fibrose miocárdica na RMC. Conclusões: O ensaio clínico randomizado, por um período de 2 anos, em pacientes com DMD e DMB, com fibrose miocárdica diagnosticada pela RMC e FEVE preservada, demonstrou significativa maior progressão da fibrose miocárdica nos pacientes que não fizerem uso de IECA. Existe uma correlação significativa entre o local de mutação no gene da distrofina e o acometimento cardíaco. O ECG, o eco e radiografia de tórax apresentaram baixa sensibilidade e baixo valor preditivo negativo para detecção do envolvimento cardíaco precoce nos pacientes com DMD e DMB / Introduction: Duchenne and Becker muscular dystrophies (DMD and BMD) are diseases characterized by progressive skeletal muscle degeneration and replacement by fibro fatty tissue. Cardiac involvement is frequent, as high as 70 - 80% of patients, and often develops clinically silent, without any evident early clinical signs. Traditional diagnostic methods (ECG, chest x-ray and echocardiography) are only able to diagnose cardiac involvement at a later stage. Objectives: 1. To investigate the progression of myocardial fibrosis by cardiac magnetic resonance (CMR), in a randomized clinical trial for treatment with ACE inhibitors, in patients with DMD or BMD and preserved left ventricular ejection fraction (LVEF), for a period of 02 years. 2. To investigate whether there are specific genetic mutations that are predictive of myocardial involvement detected by CMR. 3. To compare the findings of ECG, chest radiography and echocardiography with those found by CMR. Methods: Between 01/06/2009 and 01/06/2012 76 patients with DMD and BMD were included. All patients underwent two CMRs with a mean interval of 2.05±0.11 years, using cine resonance for function evaluation and myocardial delayed enhancement technique for myocardial fibrosis detection. Myocardial fibrosis was quantified by specific software for obtaining fibrosis mass, as percentage of LV mass, using semi-automatic fibrosis analysis and standard deviations of the mean values of signal intensity of the normal myocardium. A value of five standard deviations above the mean of a normal myocardium were considered myocardial fibrosis. The 42 patients with myocardial fibrosis and normal LVEF were randomized into 2 groups, with 21 of them receiving ACE inhibitor treatment and 21 no treatment for cardiomyopathy. After 2 years, new CMRs were performed to evaluate fibrosis extent and LVEF. Results: Myocardial fibrosis was noted in 72.3% of the patients, 55.6% showed no systolic dysfunction. There was a significant positive correlation between age and myocardial fibrosis at the CMR baseline (r=0.338, p=0.014) and follow-up (r=0.315, p=0.006). Patients randomized and treated with ACE inhibitors had lower evolution of myocardial fibrosis than those who were randomized and untreated (3.1±7.4% vs.10.0±6.2%, respectively, p=0.001). Using multivariate regression analysis, we found that belonging to the treated group decreases the progression of myocardial fibrosis (y=-4.51x+29.63 adjusted for age, CK and baseline myocardial fibrosis, p=0.039) and indicated a trend for lower probability of presenting LVEF<50% at follow-up CMR (OR= 3.18, p= 0.102, by logistic regression). Patients with mutations in exons less than 45 had greater extent of myocardial fibrosis than patients with mutations in exons greater than or equal to 45 in CMR at baseline (27.9±18.4% vs. 12.1±13.4%, respectively, p=0.006) and at follow-up (33.1±21.1% vs. 18.8±16.9%, respectively, p=0.024). Conclusions: In this 2-year follow-up randomized clinical trial in patients with DMD and BMD with preserved LVEF, myocardial fibrosis diagnosed by CMR, showed significantly greater progression in patients not receiving ACE inhibitors therapy. There was a significant correlation between the site of mutation in the dystrophin gene and cardiac involvement. ECG, echocardiography and chest radiography showed low sensitivity and low negative predictive value for early detection of cardiac involvement (myocardial fibrosis by CMR) in patients with DMD and BMD

A doença de Wilson é um distúrbio da excreção biliar de cobre devido a um defeito na proteína ATP7B. Em caráter pioneiro na América do Sul, seqüenciou-se o gene ATP7B em 60 pacientes brasileiros pertencentes a 46 famílias; os resultados foram relacionados com aspectos demográficos e fenotípicos. Detectaram-se 25 mutações, 12 das quais novas. A 3402delC (34,8%) e a L708P (14,1%) ocorreu em 58,3% das famílias de São Paulo e em 44,4% das de Minas Gerais, respectivamente. As substituições novas, pesquisadas por RFLP ou PCR alelo-específica, não ocorreram em 60 indivíduos controle; portanto, não são polimorfismos comuns. O estudo comparativo de haplótipos dos portadores da L708P da coorte atual e de Gran Canaria sugeriu um efeito-fundador comum para ambos os grupos. O fenótipo variou amplamente para genótipos idênticos / ATP7B protein. As the first study of its kind in South America, the ATP7B gene was sequenced and the results were related to demographic and phenotypic aspects of 60 Brazilian patients, from 46 distinct families. Twenty-five mutations were detected, 12 of which are novel. The 3402delC (34.8%) and the L708P (14.1%) occurred in 58.3% of the families from Sao Paulo and in 44.4% of those from Minas Gerais, respectively. The novel substitutions were shown not to be common polymorphisms by RFLP or allele-specific PCR studies performed in 60 control subjects. Haplotype analysis comparing carriers of the L708P from this cohort study with patients from Gran Canary suggests the same founder-effect for both groups. Phenotype varied widely for identic genotypes.

A neoplasia endócrina múltipla tipo 2 (NEM-2) é uma síndrome tumoral herdada por mutações germinativas no proto-oncogene RET (RET) e transmitida por herança autossômica dominante. Atualmente, a indicação de tireoidectomia total preventiva é recomendada a indivíduos portadores de mutações no RET. Analisamos a aplicação do método Eletroforese em Gel Sensível à Conformação (CSGE) no rastreamento de mutações hot-spots do RET. Sete famílias com NEM-2 foram rastreadas pelo CSGE, seqüenciamento gênico e análise do Polimorfismo Conformacional de Cadeia Simples (SSCP). Usando o CSGE e SSCP, identificamos cinco das seis (83,3%) mutações verificadas pelo seqüenciamento: Cys620Arg, Cys634Arg, Cys634Tyr, Val648Ile e Met918Thr. Foram analisados 128 amplicons englobando mutações hot-spots do RET e 116 dentre 128 (90.6%) concordaram com o seqüenciamento genético. Os polimorfismos 691 e 769 também foram documentados pelo CSGE e SSCP. Os dados obtidos por CSGE e SSCP foram totalmente (100%) concordantes. O CSGE revelou ser metodologia sensível, rápida, fácil de ser executada e de baixo custo na detecção de mutações nos códons 620, 634, 648, e 918, as quais constituem grande maioria (~95%) dos pacientes com NEM-2. Quanto à mutação Val804Met (prevalência na população inferior a 3%), o método necessita ser otimizado. Concluímos que o CSGE é uma metodologia efetiva para o rastreamento de mutações que mais freqüentemente ocorrem no RET como causadora de NEM-2. / Multiple endocrine neoplasia type 2 (MEN2) is an autosomal dominant inherited tumor syndrome caused by activating germline mutations in RET proto-oncogene (RET). Presently, the prophylactic total thyroidectomy is recommended to all RET mutations carriers. Here we tested the Conformation Sensitive Gel Electrophoresis (CSGE) as a screening method for the RET hot-spot mutations. Seven MEN2 families were studied by CSGE, as well as by Single Strand Conformational Polymorphism (SSCP) and direct sequencing analysis. Using CSGE and SSCP, we were able to detect five out of the six (83.3%) RET mutations verified by direct sequencing analysis: Cys620Arg, Cys634Arg, Cys634Tyr, Val648Ile and Met918Thr. RET polymorphisms 691 and 769 were verified by CSGE and SSCP. In our sample, data obtained using CSGE were fully concordant (100%) with SSCP findings. Thus, CSGE showed to be a sensitive, fast, low-cost, and ease procedure to detect RET mutations in codons 620, 634, 648, and 918 which are reported as the most prevalent RET variants (~95%) in large MEN2 series. As to the Val804Met mutation (prevalence in the population lower than 3%), this method still needs to be optimized. We concluded that CSGE is an effective screening method for the most frequent RET hot-spot disease-causing mutations.