Polifosfato inorgânico (PPi) é um polímero linear formado por diversas moléculas de ortofosfato (Pi) unidas por ligações fosfoanidridas de alta energia. Bactérias da espécie Pseudomonas aeruginosa acumulam grandes quantidades de PPi. Moléculas de Pi são captadas do meio através de dois sistemas de transporte. O principal deles é o sistema Pst, que possui alta afinidade por seu substrato. Pst é codificado por um operon de mesmo nome, formado por cinco genes. Os quatro primeiro genes codificam para as proteínas envolvidas no transporte de Pi, sendo que o último gene do operon, phoU, codifica para uma proteína cuja exata função é desconhecida. Com o objetivo de elucidar o papel deste gene e avaliar a sua relação com o acúmulo de PPi, foi construída uma mutação phoU na cepa PA14 de P. aeruginosa. O mutante não só apresentou uma maior capacidade de acumular PPi mas também se mostrou mais sensível a estresses ambientais e a antibióticos. Os resultados obtidos indicam que o gene phoU possui uma função regulatória sobre o acúmulo de PPi. O mutante phoU também apresentou níveis mais altos da molécula de alarme guanosina tetrafosfato (ppGpp). Foi proposto um modelo que explica a relação entre o gene phoU, o acúmulo de polifosfato e ppGpp. O mutante phoU foi também cultivado em cultura contínua em um quimiostato limitado em Pi por 13 dias. Diversos ensaios fenotípicos foram realizados com bactérias isoladas do quimiostato. Estes apresentaram algumas características fisiológicas distintas da cepa ancestral. / Inorganic polyphosphate (PPi) is a linear polymer composed of several molecules of orthophosphate (Pi) linked by energy-rich phosphoanhydride bonds. Bacteria of the species Pseudomonas aeruginosa accumulate large amounts of PPi. Pi molecules are captured via two trasport systems. The main one is the Pst system, which has high affinity for its substrate. Pst is encoded by an operon of the same name, consisting of five gene. The first four genes encode proteins involved in the transport of Pi and the last gene of the operon, phoU, encodes a protein whose exact function is unknown. To elucidate the role of phoU and its relation to PPi accumulation, a phoU mutant was constructed in strain PA14 of P. aeruginosa. The mutant accumulated high levels of PPi but was more sensitive to environmental stresses and antibiotics. The results indicate that phoU plays a regulatory role in the accumulation of PPi. The phoU mutant also displays high levels of the alarmone guanosine tetraphosphate (ppGpp). A model that explains the relation between phoU, ppGpp and polyphosphate accumulation is proposed. The phoU mutant was grown under steady-state conditions in a chemostat limited Pi for 13 days. Phenotypic assays performed with the bacteria isolated from the chemostat showed they acquired some distinct physiological characteristics.

Caulobacter crescentus pertence ao grupo das proteobactérias e apresenta a característica distinta de diferenciação celular a cada divisão. Este trabalho visou desvendar os mecanismos de reparo de DNA em C. crescentus. Identificamos 44 genes pertecentes ao regulon SOS através da construção de um mutante para o repressor deste, LexA. Caracterizamos funcionalmente alguns dos genes do regulon, como CC_2272 (que codifica uma proteína da família das endonucleases III) e CC_2433. A cepa deficiente em LexA apresentou morfologia filamentosa, e por esse motivo, buscamos também desvendar quais seriam os fatores genéticos responsáveis por esta morfologia. Investigamos também os processos de controle do ciclo celular após a introdução de danos na molécula de DNA pela luz UVC, em mutantes deficientes para diferentes vias de reparo. Estes experimentos nos mostraram que as células procariontes possuem mecanismos para acoplar a progressão do ciclo celular a integridade do material genético. Este trabalho abre novas e excitantes possibilidades no campo da biologia bacteriana. / Caulobacter crescentus belongs to the proteobacteria group and exhibts the distinctive feature of cellular differentiation after each division. This work aimed to reveal the DNA repair mechanisms in C. crescentus. We have identified 44 genes belonging to the SOS regulon through the construction of a mutant strain to its repressor. We have functionally characterized some of its genes, like CC_2272 (that encodes an endonuclease III family protein) and CC_2433. The lexA strain showed filamentous morphology, e because of that, we have tried to discover which the genetic factors responsible for this morphology were. We have also investigated the cell cycle control processes after the introduction of damages in the DNA by the UVC light, in mutant strains deficient in different repair pathways. These experiments showed us that prokaryotic cells possess mechanisms to couple the cell cycle progression to the integrity of the genetic material. This work opens new and exciting possibilities in the field of bacterial biology.

A principal fonte de proteínas para alimentação humana e animal é fornecida pelas sementes de cereais e leguminosas. O conteúdo de aminoácidos solúveis em endospermas de milho normal e mutantes opaco-2 e floury foram determinadas por HPLC. A análise indicou que a concentração total de aminoácidos solúveis variou entre os mutantes e seus tipos selvagens. Nos mutantes o10, o11 e o13, as concentrações foram aumentadas significativamente quando comparadas ao tipo selvagem W22, enquanto os mutantes o1, o2, o13, fl1 e fl2 exibiram baixas concentrações em relação ao seu respectivo tipo selvagem Oh43. Resultados similares foram obtidos para os mutantes o5, o7 e fl3 em relação aos seus tipos selvagens (B79, B37 e WT3, respectivamente). Para metionina, o mutante o2 e o tipo selvagem Oh43 apresentaram as mais altas concentrações deste aminoácido. Diferenças significativas não foram observadas para os outros aminoácidos analisados, tais como lisina e treonina. Os resultados sugerem que as altas concentrações sugeridas originalmente para estes mutantes devem ser devidas aos níveis destes aminoácidos incorporados nas proteínas de reserva, mas não na forma solúvel. / For human nutrition the main source of vegetable proteins are cereal and legume seeds. The content of total soluble amino acids in mature endosperms of wildtype and maize opaque and floury mutants have been determined by HPLC. The total absolute concentration of soluble amino acids among the mutants and their wild-type counterparts varied depending on the mutant. In the o10, o11 and o13 mutants the concentrations were significantly increased when compared to their wild-type counterpart W22, whereas the mutants o1, o2, o13, fl1 and fl2 exhibited lower concentrations when compared to the wild-type Oh43, Similar results were observed for o5, o7 and fl3 in relation to their specific wild-type counterparts (B79, B37 and WT3, respectively). For soluble methionine content, o2 and Oh43 exhibited the highest concentrations. Significant differences were not observed for other amino acids such as lysine and threonine. The results suggest that the high-lysine concentrations indicated originally for these mutants must be due to the amino acids incorporated into storage proteins, but not in the soluble form.

Sabe-se que dentre os principais contaminantes ambientais estão os metais pesados, decorrentes da intensa atividade agroindustrial das últimas décadas. Em especial, o cádmio (Cd) é um elemento não essencial que está entre os poluentes ambientais mais tóxicos a humanos, animais e plantas, mesmo em baixas concentrações. Considerando a relevância da problemática da toxicidade por Cd, a caracterização da resposta de um sistema modelo largamente usado como o Micro-Tom, é essencial para o maior conhecimento dos processos fisiológicos, bioquímicos e genéticos envolvendo a toxicidade e a resistência ao Cd. Outro fator a ser considerado é a importância econômica do tomate para a agricultura mundial, aliando as perdas de produtividade à falta de conhecimento sobre os mecanismos de toxicidade. A proposta do projeto foi o estudo do comportamento de plantas de Micro-Tom expostas ao Cd, através do processo de estresse oxidativo decorrente da exposição ao metal. Por meio de todos os parâmetros analisados ao longo do projeto, foi possível caracterizar o modelo Micro-Tom quanto à toxicidade por Cd. Após toda esta parte exploratória de caracterização dos níveis de atividade antioxidativa, foi possível a inclusão de mutantes hormonais (auxina, etileno) já introduzidos nesse cultivar, tornando o estudo mais investigativo com novas perspectivas da relação hormonal com os mecanismos de toxicidade e resistência a fatores de estresse em geral. / It is known that among the main environmental contaminants are included the heavy metals, a result of the intense industrialized activity. Cadmium (Cd) is a non essential element that is among the most dangerous heavy metals, leading to considerable losses in plant productivity and hazardous health effects, even in low concentrations. Considering the high Cd toxicity, the characterization of the responses by a model system like Micro-Tom may be essential to understanding about physiological, biochemistry and genetic processes involved with the toxicity and resistance to Cd. Another major aspect to be considered is the economical importance of tomato in world agriculture and the possible losses of productivity caused by Cd. The main objective of this part of the work was to study Cd-induced oxidative stress in Micro- Tom plants. Through the parameters analysed, it was possible to characterize the Micro-Tom model related to Cd toxicity. After this initial characterization based mainly on antioxidative activities, it was possible to include in the study hormonal mutants (auxin, ethylene, introduced into the Micro-Tom line), in order to investigate whether these mutants respond differently from the wild-type when Cd-induced oxidative stress is concerned.

O câncer de mama é um dos mais incidentes no mundo e mais comum na população feminina. Algumas populações possuem maior risco para o câncer de mama e ovário devido a presença de mutações fundadoras nos genes BRCA1 e BRCA2 como ocorre nos Judeus Ashkenazi (JA). Os testes genéticos para detecção de mutações de ponto nos genes BRCA1 e BRCA2 foram realizados em 106 indivíduos com e sem origem judaica (IOA) através do rastreamento por dHPLC e sequenciamento. A distribuição das mutações fundadoras no gene BRCA1 foi de cerca de 55 % para 185delAG e 5382isnC no gene BRCA1 e 12 % para 6174delT, no gene BRCA2. Estas mutações também foram detectadas em 7,4 % dos casos no grupo IOA e 84,2% no grupo JA (p< 0,001). Mutações fundadoras espanholas e portuguesas, 330 A>G (11,11 %) e 7966C>T (7,4 %), foram detectadas no IOA. Os carcinomas de mama e ovário foram mais frequentes nos dois grupos, cerca de 70 % e 20 %, respectivamente. No grupo IOA foram diagnosticados carcinomas de mama masculino (9,5 %) e trompa uterina (2,9 %), e carcinoma endometrióide em 11,8 % no grupo JA. / Breast cancer is one of the most commun tumors in women. Some populations shows higher risks for breast and ovarian cancers due to founder mutations in the BRCA1 and BRCA2 genes, as well as Ashkenazi Jewish (AJ) population. Genetic tests to detect point mutations in the BRCA1 and BRCA2 genes were made in 106 individuals: Ashkenazi Jewish and non-Ashkenazi Jews (NAJ) using dHPLC screening and sequencing. The distribution of founder mutations in the BRCA1 and BRCA2. genes was about 55 % for 185delAG and 5382isnC in BRCA1 gene and 12 % for 6174delT in BRCA2 gene. Those mutations were also detected in 7,4 % of NAJ group and 84,2 % in AJ group (p<0,001). Spanish and portuguese founder mutations 330 A>G (11,11 %) and 7966C>T (7,4 %) were also detected in NAJ group. Breast and ovarian carcinomas were detected in higher frequencies in both groups, about 70 % and 20 %, respectively. Male breast carcinomas (9,5 %) and uterine tube carcinomas ( 2,9 %) were diagnosed in NAJ group, and endometrioid carcinoma in AJ group (11, 8 %).

NHE3 reabsorve a maior parte de Na+ em túbulos proximais e é agudamente modulado por Ang II de forma bimodal. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos crônicos da Ang II sobre a atividade, expressão e atividade promotora de NHE3. A atividade de NHE3 foi avaliada na presença de veículo, inibidor de NHE1, 2 e 3 e H+ ATPase. Houve redução da recuperação do pHi na presença do inibidor de NHE3. Células foram expostas por 24h a Ang II de 10-7M a 10-12 M e houve aumento de atividade com Ang II 10-11 M. Houve aumento na expressão de NHE3 e no seu RNAm. Actinomicina D não mostrou diferença entre os tempos de ½ vida do RNAm. Transfecções transitórias de fragmentos do promotor de NHE3 de rato mostraram que a atividade do fragmento -65/+31 aumentou na presença de Ang II. Mutações em sítios para a ligação de Sp1/Egr-1 e AP2 mostraram que o sítio Sp1/Egr-1 é fundamental para esse efeito. As vias que envolvem o citocromo P450, PI3K, PKA e MAPK são ativadas, porém, as vias da PLC e JAK/STAT não. Losartan aboliu os efeitos observados. Conclui-se que a exposição crônica à baixa concentração de Ang II promoveu aumento na atividade, expressão, nível de RNAm e atividade promotora do gene NHE3 via AT1R. O sítio de ligação para os fatores de transcrição Sp1/Egr-1 está envolvido nessa resposta. / NHE3 is the major responsible for the sodium reabsorption in proximal tubules and it is Ang II acutely modulated in a bimodal fashion. The aim of this study was to evaluate the chronic effects of Ang II on NHE3 activity, transcription and expression. The NHE3 activity was evaluated in the presence of vehicle, NHE1, 2 and 3 and H+ ATPase inhibitors. Presence of NHE3 inhibitor reduced the rate of pHi recovery. Cells were treated with Ang II 10-7M to 10-12 M for 24h and Ang II 10-11 M increased the pHi recovery rate. NHE3 protein and mRNA were increased in Ang II presence. NHE3 mRNA ½ life in Actinomycin D incubated cells was not affected by Ang II treatment. Transient transfections of fragments of rat NHE3 promoter showed that the activity of -65/+31 was increased in Ang II presence. Mutation at Sp1/Egr-1 and AP2 sites in the -60/+31 fragment showed that Sp1/Egr-1 integrity is required. Cytochrome P450, PI3K, PKA and MAPK signaling pathways are related with this effect, while PLC and JAK/STAT are not. Losartan abolished the observed effects. In conclusion, chronic treatment with low concentration of Ang II resulted in increase of NHE3 activity, protein expression, mRNA levels and promoter activity of NHE3 gene through AT1R. Sp1/Egr-1 site seems to be involved in this effect.

A maioria dos casos de puberdade precoce central (PPC) em meninas permanece idiopática. A hipótese de uma causa genética vem se fortalecendo após a descoberta de alguns genes associados a este fenótipo, sobretudo aqueles implicados com o sistema kisspeptina (KISS1 e KISS1R). Entretanto, apenas casos isolados de PPC foram relacionados à mutação na kisspeptina ou em seu receptor. Até recentemente, a maioria dos estudos genéticos em PPC buscava genes candidatos selecionados com base em modelos animais, análise genética de pacientes com hipogonadismo hipogonadotrófico, ou ainda, nos estudos de associação ampla do genoma. Neste trabalho, foi utilizado o sequenciamento exômico global, uma metodologia mais moderna de sequenciamento, para identificar variantes associadas ao fenótipo de PPC. Trinta e seis indivíduos com a forma de PPC familial (19 famílias) e 213 casos aparentemente esporádicos foram inicialmente selecionados. A forma familial foi definida pela presença de mais de um membro afetado na família. DNA genômico foi extraído dos leucócitos do sangue periférico de todos os pacientes. O estudo de sequenciamento exômico global realizado pela técnica ILLUMINA, em 40 membros de 15 famílias com PPC, identificou mutações inativadoras em um único gene, MKRN3, em cinco dessas famílias. Pesquisa de mutação no MKRN3 realizada por sequenciamento direto em duas famílias adicionais (quatro pacientes) identificou duas novas variantes nesse gene. O MKRN3 é um gene de um único éxon, localizado no cromossomo 15 em uma região crítica para a síndrome de Prader Willi. O gene MKRN3 sofre imprinting materno, sendo expresso apenas pelo alelo paterno. A descoberta de mutações em pacientes com PPC familial despertou o interesse para a pesquisa de mutações nesse gene em 213 pacientes com PPC aparentemente esporádica por meio de reação em cadeia de polimerase seguida de purificação enzimática e sequenciamento automático direto (Sanger). Três novas mutações e duas já anteriormente identificadas, incluindo quatro frameshifts e uma variante missense, foram encontradas, em heterozigose, em seis meninas não relacionadas. Todas as novas variantes identificadas estavam ausentes nos bancos de dados (1000 Genomes e Exome Variant Server). O estudo de segregação familial em três dessas meninas com PPC aparentemente esporádica e mutação no MKRN3 confirmou o padrão de herança autossômica dominante com penetrância completa e transmissão exclusiva pelo alelo paterno, demonstrando que esses casos eram, na verdade, também familiares. A maioria das mutações encontradas no MKRN3 era do tipo frameshift ou nonsense, levando a stop códons prematuros e proteínas truncadas e, portanto, confirmando a associação com o fenótipo. As duas mutações missenses (p.Arg365Ser e p.Phe417Ile) identificadas estavam localizadas em regiões de dedo ou anel de zinco, importantes para a função da proteína. Além disso, os estudos in silico dessas duas variantes demonstraram patogenicidade. Todos os pacientes com mutação no MKRN3 apresentavam características clínicas e hormonais típicas de ativação prematura do eixo reprodutivo. A mediana de idade de início da puberdade foi de 6 anos nas meninas (variando de 3 a 6,5) e 8 anos nos meninos (variando de 5,9 a 8,5). Tendo em vista o fenômeno de imprinting, análise de metilação foi também realizada em um subgrupo de 52 pacientes com PPC pela técnica de MS-MLPA, mas não foram encontradas alterações no padrão de metilação. Em conclusão, este trabalho identificou um novo gene associado ao fenótipo de PPC. Atualmente, mutações inativadoras no MKRN3 representam a causa genética mais comum de PPC familial (33%). O MKRN3 é o primeiro gene imprintado associado a distúrbios puberais em humanos. O mecanismo preciso de ação desse gene na regulação da secreção de GnRH necessita de estudos adicionais / Most cases of central precocious puberty (CPP) in girls remain idiopathic. The hypothesis of a genetic cause has been strengthened after the discovery of some genes associated with this phenotype, particularly those involved with the kisspeptin system (KISS1 and KISS1R). However, genetic defects in KISS1 and its receptor are rare and have been identified in only a few patients with CPP.over the past years. To date, most genetic studies in CPP was based mainly on a candidate gene approach, including genes selected in animal studies, human models of patients with hypogonadotropic hypogonadism or in genome wide association studies. In the present study, we used whole exome sequencing, a more advanced method of sequencing, to identify variants associated with CPP. Thirty-six patients with the familial form of CPP (19 families) and 213 apparently sporadic cases were initially selected. The familial form was defined by the presence of more than one member affected in the family. Genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocytes in all patients. Whole exome sequencing performed by ILLUMINA technique in 40 members of 15 families with CPP, identified inactivating mutations in a single gene, MKRN3, in five out of these families. Analysis of MKRN3 mutations performed by automatic sequencing in two additional families (four patients) identified two novel mutations. MKRN3 is an introless gene located on chromosome 15, in the Prader Willi syndrome critical region, and it is expressed only by the paternal allele due to the maternal imprinting. Following the initial findings, we searched for MKRN3 mutations in 213 patients with apparently sporadic CPP using polymerase chain reaction followed by direct enzymatic purification and automated sequencing (Sanger). Three new mutations and two previously reported, including four frameshifts and one missense variant was identified in six unrelated girls with CPP. All variants were not described in the two databases (1000 Genomes and Exome Variant Server). The familial segregation analysis performed in three out of these girls with apparently sporadic CPP and MKRN3 mutations confirmed the autosomal dominant inheritance with complete penetrance and exclusive transmission through the paternal allele, revealing familial inheritance in apparently sporadic cases. Most of these MKRN3 mutations were frameshifts or nonsense, leading to premature stop codons and truncated proteins, thus demonstrating positive genotype- phenotype correlation. The two missense mutations (p.Arg365Ser and p.Phe417Ile) identified were located within zinc finger motifs, regions predicted to be essential for the protein function. Besides that, all missense mutations were predicted to be pathogenic by in silico analysis. All patients carrying MKRN3 mutations exhibited typical clinical and hormonal features of premature activation of the reproductive axis. The median age of puberty onset was 6.0 years in girls (ranging from 3.0 to 6.5) and 8.0 years in boys (ranging from 5.9 to 8.5). In view of the imprinting phenomenon, methylation analysis was also performed in a subgroup of 52 patients with CPP by MSMLPA technique, but no methylation abnormalities were detected. In conclusion, our work has identified a new gene associated with CPP. Currently, inactivating mutations in MKRN3 represent the most common genetic cause of familial CPP (33%). MKRN3 is the first imprinted gene associated with pubertal disorders in humans. However, its precise mechanism of action in the regulation of GnRH secretion needs further studies

A mutagênese química utilizando o agente mutagênico N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) seguida da observação do fenótipo deu origem a um mutante Anêmico. O tipo de herança é autossômica dominante, com morte intra útero dos mutantes homozigotos. O mapeamento genético foi feito utilizando-se marcadores microssatélites, sendo selecionados marcadores polimórficos entre as linhagens BALB/c e C57BL/6 envolvidas no mapeamento. Estabeleceu-se um painel de microssatélites distribuídos por todo o genoma do camundongo, que permitisse a localização do cromossomo portador da mutação. O gene mutante foi localizado no cromossomo 7 entre os marcadores D7Mit301 e D7Mit131 delimitando um intervalo entre 46,5cM e 51cM de 4,5cM. Através das análises fenotípicas do mutante Anêmico e estudo dos genes candidatos neste intervalo, foi selecionado o gene Hbb responsável pela síntese das globinas b-major e b-minor , sendo o gene que mais se identifica com as características do mutante, localizado a 50cM. A deficiência deste gene leva a uma das mais severas anemias humana, a b-Talassemia major. / Chemical mutagenesis, using the mutagenic agent N-ethyl-N-nitrosourea (ENU), and followed by observation of the phenotype, originated in an Anaemic mutant. The inheritance-type is dominant auto-somic, with intra-uterus death of the homozygotic mutants. Genetic mapping was undertaken by means of micro-satellite markers, polymorphic markers being selected from among the BALB/c and C57BL/6 lineages involved in the mapping itself. A panel was established of the micro-satellites distributed throughout the whole mouse genome, thereby permitting localization of the mutation bearing chromosome. The mutant gene was located in chromosome 7 between markers D7Mit301 and D7Mit131, these delimiting an interval between 46,5cM and 51cM of 4,5cM. Selection of the Hbb gene responsible for synthesis of the b-major and b-minor globins came about through phenotypic analysis of the Anaemic mutant and a study of candidate genes within this interval, the selected gene being that which was most identified with the mutants characteristics and located at 50cM. A deficiency in this gene leads to one of the most severe forms of human anaemia, b-Talhassemia major.

Os hormônios vegetais etileno e ABA são possíveis reguladores chave do desenvolvimento das micorrizas arbusculares (MAs). O primeiro objetivo deste trabalho foi avaliar o desenvolvimento da MA em mutantes superprodutores e insensíveis ao etileno (epinastic e Never ripe, respectivamente) e verificar se enzimas relacionadas ao sistema de defesa vegetal são reguladas diferencialmente pelo etileno durante o desenvolvimento da simbiose A colonização de raízes de epinastic (epi) por G. clarum foi significativamente reduzida quando comparada com Micro-Tom (MT), além disso, a funcionalidade da simbiose, demonstrada pelo acúmulo de transcritos de LePT4, foi fortemente reduzida quando comparada com MT. Por outro lado, o padrão de colonização e funcionalidade da simbiose no mutante Nr não diferiu de MT. Indução no acúmulo de transcritos de genes que codificam quitinases e enzimas relacionadas ao estresse oxidativo foi observada no mutante epi, enquanto o acúmulo de transcritos de uma -1,3-glucanase foi fortemente induzido no mutante Nr. O segundo objetivo foi verificar se a colonização reduzida observada em mutantes deficientes em ABA é dependente da produção do etileno. Para tanto, mutantes que diferem na deficiência de ABA e produzem diferentes quantidades de etileno (notabilis e sitiens) e o mutante epi foram inoculados com G. clarum e tratados com aminoethoxivinilglicina (AVG), um inibidor de etileno. A colonização intrarradicular de G. clarum nos mutantes epi e notabilis (not) foi significativamente reduzida quando comparada com MT, sendo que o mutante sitiens (sit) foi o menos susceptível à colonização em relação aos demais genótipos. A aplicação de AVG a 10 µM restaurou completamente a colonização em epi, mas não nos mutantes deficientes em ABA. O acúmulo de transcritos de LePT4 confirmou os resultados de colonização. Os genes que codificam enzimas chave na biossíntese do etileno, LeACS2 e LeACO4, foram regulados positivamente pela inoculação com G. clarum, e a restauração do desenvolvimento da MA observada em epi que recebeu AVG, provavelmente envolveu ACC oxidase (LeACO4). O acúmulo de transcritos dos genes que codificam ACC oxidase (LeACO1 e LeACO4) foi induzido significativamente em sit, mostrando que a superprodução de etileno observada neste mutante pode envolver a regulação da ACC oxidase. Por fim, indução no acúmulo de transcritos do gene LeNCED foi observada em todos os genótipos micorrizados e em raízes de epi que receberam AVG, demonstrando que LeNCED é regulado positivamente pela inoculação com G. clarum e que o etileno regula a expressão deste gene. Os resultados demonstram que etileno e ABA estão envolvidos na regulação do desenvolvimento de MA e que etileno modula a expressão de genes relacionados ao sistema de defesa vegetal permitindo o estabelecimento de uma simbiose funcional. / The plant hormones ethylene and ABA are probably key developmental regulators of arbuscular mycorrhizae (AM). The first objective of this work was to evaluate the development of MA in overproducing and insensitive mutants to ethylene (epinastic and Never ripe, respectively) and verify if enzymes related to plant defense system are differentially regulated by ethylene during the symbiosis development. The colonization of epinastic (epi) roots by G. clarum was significantly reduced when compared with Micro-Tom (MT), moreover, the functionality of the symbiosis as demonstrated by transcripts accumulation of LePT4, was strongly reduced when compared with MT. Still, the pattern of colonization and functionality of the symbiosis in the Nr mutant did not differ from MT. Induction in the transcripts accumulation of genes encoding chitinase and enzymes related to oxidative stress was observed in epi mutant, whereas transcripts accumulation of -1, 3-glucanase was strongly induced in the Nr mutant. The second objective was to determine whether the reduced colonization observed in mutants deficient in ABA is dependent on ethylene production. For this purpose, mutants that differ in ABA deficiency and produce different amounts of ethylene (notabilis and sitiens) and the epi mutant were inoculated with G. clarum and treated with an ethylene inhibitor called aminoethoxivinilglicin (AVG). The intraradical colonization of G. clarum in epi and notabilis (not) mutants was significantly reduced when compared with MT and sitiens mutant was less susceptible to colonization in comparison with other genotypes. The application of AVG to 10 µM completely restored the colonization in the epi but not in mutants deficient in ABA. The transcripts accumulation of LePT4 confirmed the results of colonization. The genes that encode key enzymes in the biosynthesis of ethylene, LeACS2 and LeACO4, were positively regulated by inoculation with G. clarum and the restoration in the development of MA observed in epi which received AVG probably involved ACC oxidase (LeACO4). Transcripts accumulation of genes that encode ACC oxidase (LeACO1 and LeACO4) were induced significantly in sit showing that overproduction of ethylene in this mutant can involve ACC oxidase. Finally, the induction in the accumulation of gene transcripts LeNCED was observed in all genotypes and mycorrhizal roots of epi which received AVG demonstrating that LeNCED is regulated positively by the inoculation with G. clarum and that ethylene regulates the expression of this gene. Results show that ethylene and ABA are involved in regulating of MA development and ethylene modulates the expression of genes related to the plant defense system allowing the establishment and functionality of the symbiosis.

Os hormônios vegetais etileno e ABA são possíveis reguladores chave do desenvolvimento das micorrizas arbusculares (MAs). O primeiro objetivo deste trabalho foi avaliar o desenvolvimento da MA em mutantes superprodutores e insensíveis ao etileno (epinastic e Never ripe, respectivamente) e verificar se enzimas relacionadas ao sistema de defesa vegetal são reguladas diferencialmente pelo etileno durante o desenvolvimento da simbiose A colonização de raízes de epinastic (epi) por G. clarum foi significativamente reduzida quando comparada com Micro-Tom (MT), além disso, a funcionalidade da simbiose, demonstrada pelo acúmulo de transcritos de LePT4, foi fortemente reduzida quando comparada com MT. Por outro lado, o padrão de colonização e funcionalidade da simbiose no mutante Nr não diferiu de MT. Indução no acúmulo de transcritos de genes que codificam quitinases e enzimas relacionadas ao estresse oxidativo foi observada no mutante epi, enquanto o acúmulo de transcritos de uma -1,3-glucanase foi fortemente induzido no mutante Nr. O segundo objetivo foi verificar se a colonização reduzida observada em mutantes deficientes em ABA é dependente da produção do etileno. Para tanto, mutantes que diferem na deficiência de ABA e produzem diferentes quantidades de etileno (notabilis e sitiens) e o mutante epi foram inoculados com G. clarum e tratados com aminoethoxivinilglicina (AVG), um inibidor de etileno. A colonização intrarradicular de G. clarum nos mutantes epi e notabilis (not) foi significativamente reduzida quando comparada com MT, sendo que o mutante sitiens (sit) foi o menos susceptível à colonização em relação aos demais genótipos. A aplicação de AVG a 10 µM restaurou completamente a colonização em epi, mas não nos mutantes deficientes em ABA. O acúmulo de transcritos de LePT4 confirmou os resultados de colonização. Os genes que codificam enzimas chave na biossíntese do etileno, LeACS2 e LeACO4, foram regulados positivamente pela inoculação com G. clarum, e a restauração do desenvolvimento da MA observada em epi que recebeu AVG, provavelmente envolveu ACC oxidase (LeACO4). O acúmulo de transcritos dos genes que codificam ACC oxidase (LeACO1 e LeACO4) foi induzido significativamente em sit, mostrando que a superprodução de etileno observada neste mutante pode envolver a regulação da ACC oxidase. Por fim, indução no acúmulo de transcritos do gene LeNCED foi observada em todos os genótipos micorrizados e em raízes de epi que receberam AVG, demonstrando que LeNCED é regulado positivamente pela inoculação com G. clarum e que o etileno regula a expressão deste gene. Os resultados demonstram que etileno e ABA estão envolvidos na regulação do desenvolvimento de MA e que etileno modula a expressão de genes relacionados ao sistema de defesa vegetal permitindo o estabelecimento de uma simbiose funcional. / The plant hormones ethylene and ABA are probably key developmental regulators of arbuscular mycorrhizae (AM). The first objective of this work was to evaluate the development of MA in overproducing and insensitive mutants to ethylene (epinastic and Never ripe, respectively) and verify if enzymes related to plant defense system are differentially regulated by ethylene during the symbiosis development. The colonization of epinastic (epi) roots by G. clarum was significantly reduced when compared with Micro-Tom (MT), moreover, the functionality of the symbiosis as demonstrated by transcripts accumulation of LePT4, was strongly reduced when compared with MT. Still, the pattern of colonization and functionality of the symbiosis in the Nr mutant did not differ from MT. Induction in the transcripts accumulation of genes encoding chitinase and enzymes related to oxidative stress was observed in epi mutant, whereas transcripts accumulation of -1, 3-glucanase was strongly induced in the Nr mutant. The second objective was to determine whether the reduced colonization observed in mutants deficient in ABA is dependent on ethylene production. For this purpose, mutants that differ in ABA deficiency and produce different amounts of ethylene (notabilis and sitiens) and the epi mutant were inoculated with G. clarum and treated with an ethylene inhibitor called aminoethoxivinilglicin (AVG). The intraradical colonization of G. clarum in epi and notabilis (not) mutants was significantly reduced when compared with MT and sitiens mutant was less susceptible to colonization in comparison with other genotypes. The application of AVG to 10 µM completely restored the colonization in the epi but not in mutants deficient in ABA. The transcripts accumulation of LePT4 confirmed the results of colonization. The genes that encode key enzymes in the biosynthesis of ethylene, LeACS2 and LeACO4, were positively regulated by inoculation with G. clarum and the restoration in the development of MA observed in epi which received AVG probably involved ACC oxidase (LeACO4). Transcripts accumulation of genes that encode ACC oxidase (LeACO1 and LeACO4) were induced significantly in sit showing that overproduction of ethylene in this mutant can involve ACC oxidase. Finally, the induction in the accumulation of gene transcripts LeNCED was observed in all genotypes and mycorrhizal roots of epi which received AVG demonstrating that LeNCED is regulated positively by the inoculation with G. clarum and that ethylene regulates the expression of this gene. Results show that ethylene and ABA are involved in regulating of MA development and ethylene modulates the expression of genes related to the plant defense system allowing the establishment and functionality of the symbiosis.