La télangiectasie hémorragique héréditaire (HHT) est une maladie rare (1/10.000). Son incidence est plus élevée (pouvant atteindre 1/1000) dans certaines zones géographiques dont la région Poitou-Charentes. Cette maladie autosomique dominante est causée par des mutations d'un des trois gènes identifiés ENG, ACVRL1 et SMAD4 codant pour des protéines de la voie BMP spécifiquement exprimés dans les cellules endothéliales. Le nombre croissant de mutations détectées chez les patients et l'expressivité variable de certaines mutations nous a ammené à déterminer les conséquences de mutations afin d'établir une corrélation génotype/phénotype. Cette corrélation est importante pour le conseil génétique et évidemment le diagnostic prénatal. Dans ce contexte, nous avons étudié aux niveaux cellulaire et moléculaire les effets de plusieurs mutations. L'effet délétère de ces mutations sur la protéine et/ou l'épissage de l'ARN a été évalué. Nous avons montré que sur les 23 mutations d'ACVRL1 : 1) 18 mutations faux-sens affectent la fonctionnalité de la protéine en réponse à BMP9 et 3 mutations sont de simples polymorphismes, 2) la mutation exonique c.733A>G (p.Ile245Val) affecte l'épissage de l'exon 6, 3) La mutation c.1048+5G>A de l'intron 7 en dehors du site consensus induit un épissage aberrant de l'exon 7. En ce qui concerne l'ENG, nous avons analysé 4 mutations et nous avons montré que la mutation c.1088G>A (p.Cys363Tyr) a un impact sur l'activité du récepteur et que les mutations c.1134G>A (p.Ala378Ala) et c.1060C>T (p.Leu364Leu) altèrent l'épissage de l'exon 8. Ce travail montre l'importance de l'étude approfondie de toute nouvelle mutation par des études in silico, in vitro et in cellulo à différents niveaux cellulaires. Des études in vivo ultérieures peuvent compléter et appuyer la stratégie expérimentale que nous avons suivie. / Hereditary hemorrhagic telangiectasia (HHT) is a rare disease (1/10.000). Its incidence is higher in certain geographic areas including the Poitou-Charentes region (1/1000). This autosomal dominant disease is caused by mutations in one of three identified genes ENG, ACVRL1 and SMAD4 encoding BMP pathway proteins specially expressed in endothelial cells. The increasing number of mutations detected in patients and the variable expressivity of certain mutations has taken us to determine the consequences of mutations to establish a genotype/phenotype correlation. This correlation is important for genetic counseling and obviously for prenatal diagnosis. In this context, we investigated the effects of several mutations at the cellular and molecular levels. The deleterious impact of these mutations on the protein and/or RNA splicing was evaluated. We have shown that for the 23 mutations of ACVRL1: 1) 18 missense mutations affect the functionality of the protein in response to BMP9 and 3 are polymorphisms, 2) exonic mutation c.733A>G (p. Ile245Val) affects the splicing of the exon 6, 3) mutation c.1048+5G>A in intron 7 off the consensus site induces an aberrant splicing of exon 7. Concerning the ENG, we analyzed 4 mutations and we showed that the mutation c.1088G> A (p.Cys363Tyr) has an impact on the activity of the receptor and that the mutations c.1134G> A (p.Ala378Ala) and c.1060C> T (p.Leu364Leu) inhibit the splicing of exon 8. This work shows the importance of the comprehensive study of any new mutation by in silico, in vitro and in cellulo studies at different cellular levels. The in vivo studies can further complement and support the experimental strategy that we followed.

Les troubles du spectre autistique (TSA) touchent approximativement 1% de la population générale. Ces troubles se caractérisent par un déficit de la communication sociale, ainsi que des comportements stéréotypés et des intérêts restreints. Plusieurs gènes impliqués dans le déterminisme des TSA ont été identifiés, comme par exemple les gènes NLGN3-4X, NRXN1-3 et SHANK1-3. Au cours des années précédentes, les TSA ont été considérés comme un ensemble complexe de troubles monogéniques. Cependant, les études récentes du génome complet suggèrent la présence de gènes modificateurs (« multiple hits model »). La dyslexie est caractérisée par un trouble dans l’apprentissage de la lecture et de l’écriture qui touche 5--‐15% de la population générale. Les facteurs génétiques impliqués restent pour l’instant inconnus car seuls des gènes ou loci candidats ont été identifiés. Mon projet de thèse avait pour objectif de poursuivre l’identification des facteurs génétiques impliqués dans les TSA et de découvrir un premier facteur génétique pour la dyslexie. Pour cela, deux types de populations ont été étudiés : d’une part des patients atteints de TSA (N>600) provenant de France, de Suède et des Iles Faroe, d’autre part des patients atteints de dyslexie (N>200) provenant de France, en particulier une famille de 11 personnes atteintes sur 3 générations. J’ai utilisé à la fois la technologie des puces à ADN Illumina (600 K et 5M) et le séquençage complet du génome humain pour effectuer des analyses de liaison et d’association. Pour les TSA, grâce aux analyses de CNVs, j’ai pu identifier des gènes candidats pour l’autisme et confirmer l’association de plusieurs gènes synaptiques avec l’autisme. En particulier, l’étude d’une population de 30 patients des îles Faroe a pu confirmer l’implication des gènes NLGN1 et NRXN1 dans l’autisme et identifier un nouveau gène candidat IQSEC3. En parallèle, j’ai exploréPRRT2 localisé en 16p11.2. PRRT2 code pour un membre du complexe SNARE synaptique qui permet la libération des vésicules synaptiques. Je n’ai pas pu mettre en évidence d’association avec les TSA, mais j’ai montré que ce gène important pour certaines maladies neurologiques était sous pression de sélection différente selon les populations. Pour la dyslexie, j’ai effectué une analyse de liaison (méthode des lod-scores) pour une grande famille de 11 individus atteints sur trois générations. Cette étude a permis d’identifier CNTNAP2 comme un gène de vulnérabilité à la dyslexie. Cette découverte est importante car ce même gène est aussi associé aux TSA. Par contre, aucune des 20 variations rares découvertes par le séquençage complet du génome n’est localisée dans les parties codantes du gène. Plusieurs variations localisées dans des régions régulatrices sont candidates. En conclusion, les résultats de ma thèse ont permis d’identifier des gènes candidats pour les TSA, de confirmer le rôle des gènes synaptiques dans ce trouble, de montrer pour la première fois grâce à une analyse de liaison le rôle de CNTNAP2 dans la dyslexie. / Autism spectrum disorders (ASD) affect 1% of the general population. These disorders are characterized by deficits in social communication as well as stereotyped behaviors and restricted interests. Several genes involved in the determination of ASD have been identified, such as NLGN3-4, NRXN1-3 and SHANK1-3. In the previous years, ASD have been considered as a complex set of monogenic disorders. Recent studies on the complete genome nevertheless suggest the presence of modifier genes ("multiple hits model"). Dyslexia is characterized by difficulties in learning to read and write. It affects 5-15 % of the general population. Genetic factors involved remain unknown. Only candidate genes or loci have been identified. My thesis had two main objectives: pursuing the identification of genetic factors involved in ASD, and discovering a first genetic factor for dyslexia. I therefore studied two types of populations: on the one hand a group of patients with ASD (N > 600) from France, Sweden and the Faroe Islands, and on the other hand another group of patients with dyslexia (N > 200) from France, and more specifically a family of 11 people followed over 3 generations. I used both Illumina microarrays technology (600K and 5M) and the complete human genome sequencing to conduct linkage and association analyses. Regarding ASD, CNVs (copy number variants) analyses allowed me to confirm the association of several synaptic genes with autism and to identify new candidate genes. In particular, the study of a population of 30 patients from the Faroe Islands confirmed the involvement of NLGN1 and NRXN1 genes in autism and identified a new candidate gene, IQSEC3. At the same time, I explored PRRT2 located in 16p11.2. PRRT2 encodes a member of the synaptic SNARE complex that allows the release of synaptic vesicles. I have not been able to demonstrate any association with ASD, but I showed that this gene, which is important for some neurological diseases, was under different selection pressures according to the population considered. Regarding dyslexia, I realized a linkage analysis (lod-score method) for a large family of 11 individuals, with three generations affected. This study identified the CNTNAP2 gene as a vulnerability factor for dyslexia. This finding is important because this gene is also associated with ASD. Nevertheless, none of the 20 rare variations discovered by whole genome sequencing is localized in the coding parts of the gene. Only several variations localized in regulatory regions are robust candidates. To conclude, my findings enabled the identification of new candidate genes for ASD, the confirmation of the role of synaptic genes in this disorder, and the highlight for the first time of the role of CNTNAP2 in dyslexia through linkage analysis.

Les rétinites pigmentaires (RP) sont des pathologies rétiniennes cécitantes d'origine génétique caractérisées par une perte des photorécepteurs. Nous avons ciblé des formes de RP autosomique dominante consécutives à des mutations dans le gène du pigment visuel de la RHODOPSINE, du facteur d'épissage PRPF31 et du facteur de transcription impliqué dans le développement des photorécepteurs NR2E3. Les fibroblastes, issus de biopsies de peau de patients, ont été reprogrammés en cellules iPS par une technique dite non intégrative. Après stabilisation des cellules iPS, nous avons vérifié leur propriété de pluripotence et l'absence d'anomalies caryotypiques.Les cellules iPS porteuses d'une mutation sur le gène RHODOPSINE ont été différenciées dans le lignage des photorécepteurs. Nos résultats montrent que les photorécepteurs porteurs de la mutation P347L du le gène RHODOPSINE récapitulent la dégénérescence observée chez les patients.Nous montrons que les cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dérivées de cellules iPS porteuses de la mutation Cys294X du gène PRPF31 présentent des problèmes d'adhésion cellulaire due à l'absence de lame basale. Leur activité de phagocytose est alors perturbée, suggérant qu'un dysfonctionnement de l'EPR pourrait être à la base de la RP causée par la mutation Cys294X du gène PRPF31. Les modèles développés nous ont permis de mieux comprendre les processus à la base de la pathogénèse de certaines RP. Ces modèles associés à des protocoles de criblage, pourraient permettre d'évaluer l'efficacité et la toxicité de nouvelles molécules pharmacologiques, mais également être utilisés pour valider des approches de thérapie génique. / Retinitis pigmentosa (RP) is an inherited retinal diseases characterized by a loss of photoreceptors. We focused specific forms of autosomal dominant RP with mutations in the rod visual pigment RHODOPSIN, the ubiquitous splicing factor PRPF31 and the transcription factor involved in the development of photoreceptors NR2E3. Fibroblasts from skin biopsies of patients were reprogrammed into iPS cells by a non-integrative approach. After stabilization of iPS cell lines, we verified their pluripotency property and the absence of karyotype abnormalities. Based on the retinal differentiation protocol, iPS cells carrying a mutation in the RHODOPSIN gene have been differentiated in the photoreceptor lineage. Our results showed that the photoreceptors expressing the mutated form of RHODOPSIN summarizing the process of degeneration observed in RP patients. We show that retinal pigment epithelium (RPE) cells derived from iPS cells carrying a mutation in the PRPF31 gene lack basal membranes and have cell adhesion disorders. Consequently, their phagocytic activity is disturbed, suggesting that a malfunction of the RPE could be the primary step of the development of RP caused by mutation Cys294X in the PRPF31 gene. The models developed from specific-patient iPS cells have enabled us to better understand the processes underlying the pathogenesis of some RP. These models associated with screening protocols could be used to evaluate the efficacy and toxicity of new pharmacologic compounds but also used to validate new gene therapy approaches.

Introduction: les progrès thérapeutiques pour la prise en charge du carcinome urothélial de la vessie, ou tumeur de vessie infiltrant le muscle (TVIM), sont faibles depuis deux décennies, notamment sur le plan de la chimiothérapie, tant dans les formes localisées que métastatiques. L'identification de nouveaux biomarqueurs pouvant améliorer la prise en charge et le pronostic des patients apparait indispensable, notamment pour prédire la réponse aux traitements systémiques. Notre travail a cherché : (i) à identifier des facteurs biologiques prédictifs de rechute après les chimiothérapies adjuvantes (CA) utilisées actuellement, (ii) à déterminer si les altérations moléculaires, cibles de nouvelles thérapies, identifiées dans la tumeur vésicale sont conservées dans les métastases.Objectifs:(i) Rechercher une association entre la rechute après CA et l'expression de six biomarqueurs, ERCC1, Emmprin, Survivin, MDR1, p53 et topoisomérase IIα, dans la tumeur vésicale et/ou une métastase ganglionnaire(ii) Etudier l'hétérogénéité des mutations de FGFR3 dans les TVIM localement avancéesMatériels et Méthodes: Une cohorte rétrospective de 226 patients traités par cystectomie et CA, et une collection tumorale d'échantillons représentatifs de la tumeur primitive et d'une métastase ganglionnaire ont été constituées. L'expression des six biomarqueurs a été déterminée en immunohistochimie sur ces échantillons. Le statut mutationnel de FGFR3 a été déterminé en SNaPshot sur 84 paires tumeur primitive/métastase ganglionnaire.Résultats: Les survies observées dans la cohorte étaient proches de celles rapportées dans la littérature pour des patients de mêmes stades. La collection tumorale étudiée semble donc représentative des TVIM traitées en France. Aucun des six biomarqueurs n'était retrouvé comme prédictif de rechute après traitement. Une mutation de FGFR3 était retrouvée dans 4 (4,7%) des 84 échantillons appariés sans aucune discordance entre tumeur primitive et métastase ganglionnaire.Conclusions: L'expression de ces six biomarqueurs étudiés en immunohistochimie n'est pas associée à un risque de rechute après CA. Le statut mutationnel de FGFR3 est conservé au cours de la dissémination métastatique, et ses mutations activatrices sont présentes dans près de 5% des TVIM localement avancées. Leur conservation dans le processus métastatique renforce l'intérêt de l'évaluation de nouvelles thérapies ciblant le récepteur FGFR3 muté. Enfin, il est possible de rechercher cette mutation sur la tumeur vésicale ou une métastase avec la même pertinence. / Introduction: In muscle invasive urothelial carcinoma of the bladder (MI UCB), few progresses have been made in the last two decades, particularly in chemotherapy, both in localized and metastatic setting. The identification of new biomarkers that can improve the management and prognosis of patients appears essential. Such biomarkers will be clinically relevant if they can predict the response to systemic treatments. In this thesis, we studied biomarkers in two ways: (i) to identify predictive factors of relapse after cisplatin-based adjuvant chemotherapy (AC), (ii) to confirm that the molecular alterations targeted by new therapies and identified in bladder tumor are present in metastases.Objectives:(i) To examine the relationship between relapse after AC and expression of six biomarkers, ERCC1, Emmprin, Survivin, MDR1 p53 and topoisomerase IIα, in bladder tumor and / or lymph node metastases.(ii) To study the heterogeneity of FGFR3 mutations in locally advanced MI UCBMaterials and Methods: A retrospective cohort of 226 patients treated with cystectomy and AC, and tumor collection of representative samples of the primary tumor and lymph node metastases were constituted. The expression of six biomarkers was determined by immunohistochemistry on these samples and determined by morphometry. FGFR3 mutation status was determined by SNaPshot in 84 paired primary tumors and positive lymph nodes.Results: Survivals observed in the cohort were similar to those reported in the literature for patients of same stages, with tumor collection being representative of the MI UCB treated in France. None of the six biomarkers was found as an independent predictive factor of relapse after AC. FGFR3 mutation was found in 4 (4.7%) of the 84 paired samples with complete concordance between primary tumor and lymph node metastases.Conclusions: The expression of the six studied biomarkers by immunohistochemistry is not associated with risk of relapse following AC. FGFR3 mutation status is maintained during metastases process, and FGFR3 activating mutations are present in about 5% of locally advanced MI UCB. FGFR3 mutation remains a promising therapeutic target in a low subset of patients, and the evaluation of new therapies targeting the mutated FGFR3 receptor are needed. Finally, search for these mutations either in bladder tumor or in metastasis is relevant.

Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) avec dysplasie, identifiées par la classification OMS 2008 sous le nom de LAM-MRC (« AML with myelodysplasia-related changes »), sont actuellement définies par la présence de critères cliniques, cytologiques et cytogénétiques. Elles forment un groupe hétérogène tant sur le plan biologique que pronostique. Nous avons fait l'hypothèse que la caractérisation moléculaire des LAM-MRC pourrait permettre d'identifier des marqueurs spécifiques associés à ces pathologies et d'en distinguer différents sous-groupes. Nous avons mis en évidence que les LAM-MRC de risque cytogénétique intermédiaire présentent un profil mutationnel spécifique caractérisé par un taux élevé de mutation d'ASXL1 et une faible proportion de mutations de DNMT3A, NPM1 et FLT3. Les LAM-MRC de risque cytogénétique défavorable, essentiellement complexes et/ou monosomales, sont quant à elle associées aux mutations de TP53. Alors que les critères actuels des LAM-MRC ne permettent pas d'en stratifier le pronostic, nous avons montré que les mutations d'ASXL1 ou de TP53 sont des facteurs pronostics péjoratifs majeurs. Ainsi, une reclassification basée sur la présence de ces altérations moléculaires exclusives entre elles permettrait d'affiner le diagnostic et la stratification pronostique de ces maladies. Enfin, dans une stratégie de médecine personnalisée combinant le séquençage à haut débit à des tests de sensibilité thérapeutique in vitro, l'identification de tels marqueurs moléculaires permettraient de prédire la réponse aux traitements, de guider les choix thérapeutiques et d'orienter le développement de nouvelles drogues. / Acute myeloid leukemia (AML) with myelodysplasia-related changes (AML-MRC) as reported in the WHO 2008 classification are defined by the presence of clinical, morphological and cytogenetic criteria. AML-MRCs are heterogeneous diseases with prognostic heterogeneity. We hypothesized that molecular characterization of AML-MRC could identify specific molecular markers and disease subgroups. We showed that AML-MRCs with intermediate cytogenetic risk harbor a specific mutational profile characterized by a high frequency of ASXL1 mutations and a low incidence of DNMT3A, NPM1 and FLT3 mutations. Unfavorable cytogenetic risk AML-MRCs, especially due to complex and/or monosomal karyotypes, are associated with TP53 mutations. While WHO criteria do not stratify the prognosis of AML-MRC patients, we showed that the mutations of ASXL1 or TP53 are major poor prognostic factors. The criteria defining AML-MRC do not identify distinct clinical and biological subgroups and do not predict outcome of patients with AML-MRC. In contrast, ASXL1 and TP53-mutated AML identify two distinct biological subgroups of AML-MRC with very poor outcome. This molecular characterization could be useful to redefine AML-MRC in a future classification aiming at merging biological characterization and specific prognostic value. Finally, we showed that a personalized treatment approach combining next generation sequencing and in vitro drug screening could be useful to predict therapeutic response and to guide both treatment choices and new targeted drug developments.

VKORC1 est une enzyme membranaire du réticulum endoplasmique, responsable de la réduction de la vitamine K époxyde en vitamine K quinone, activant la synthèse des facteurs de coagulation. VKORC1 constitue ainsi une cible thérapeutique privilégiée des anticoagulants de type anti-vitamine K (AVKs). Cependant, certaines mutations de VKORC1 induisent une dérégulation physiologique et/ou une résistance aux AVKs. En l’absence de données structurales, plusieurs modèles topologiques de VKORC1 ont été proposés à partir des données biochimiques et biophysiques, fréquemment contradictoires. La topologie de VKORC1 ainsi que l'implication des résidus de cystéine (strictement conservés chez toutes les VKORs) dans le mécanisme enzymatique de la protéine restent incertaines. Nous avons construit, par des méthodes in silico, un modèle 3D de la VKORC1 humaine sauvage (hVKORC1WT) à l'échelle atomique. Des simulations de dynamique moléculaire de la protéine, en considérant tous les résidus de cystéine sous leur forme oxydée (SH), nous ont permis d'identifier les résidus de cystéine les plus susceptibles de former des ponts disulfures. Nous avons par conséquent décrit les conformations métastables de hVKORC1WT mimant les états fonctionnels de la protéine. L’étude de la reconnaissance des formes époxyde et réduites de la vitamine K par les conformations prédites de hVKORC1WT a mis en évidence leur sélectivité réciproque. Les conformations de hVKORC1WT ciblées par chaque forme de la vitamine K et leur rôle dans le mécanisme de réduction de la molécule ont ainsi été caractérisés. Nous avons postulé à partir de ces résultats le mécanisme enzymatique détaillé de hVKORC1WT et proposé la structure-cible des AVKs. Les interactions entre la cible prédite - hVKORC1WT à l'état actif - et trois AVKs différents ont été décrites en termes d’énergie libre de liaison. Ces résultats ont été corrélés avec les constantes d'inhibition mesurées in vivo, validant nos prédictions théoriques. Notre protocole, développé pour hVKORC1WT, est applicable aux formes mutées de l’enzyme. Il permettra la description des mécanismes modifiant l'activité réductase de hVKORC1 et/ou provoquant une résistance aux AVKs. Cette description ouvre la voie à la conception d'une nouvelle génération d'inhibiteurs surmontant les résistances aux AVKs. Notre concept et le protocole établi pour l’étude de hVKORC1 peuvent être étendus à l'analyse des VKORs mammaliennes et aux autres enzymes de la famille des oxydoréductases. / VKORC1 is an endoplasmic reticulum membrane-resident enzyme, responsible for vitamin K epoxide reduction to vitamin K quinone that activates coagulation factors synthesis. VKORC1 is thus a prominent target of vitamin K agonists (VKAs) in anticoagulant therapies. However, some VKORC1 mutations lead to physiological dysregulation and/or VKAs resistance. No VKORC1 structural data is available, and postulated topological models are based on biochemical and biophysical experimental observations frequently contradicting. Topology of VKORC1 and involvement of cysteines residues (highly conserved in VKORs) in the protein enzymatic mechanism remain unclear. We built an in silico 3D model of the wild-type human VKORC1 (hVKORC1WT) at the atomistic scale. Molecular dynamics simulations of the protein model, carrying all the cysteines residues in their oxidized form (SH), were used for identification of cysteines residues which may plausibly form disulfide bridges. We thus described hVKORC1WT metastable conformations depicting the functionally relevant states of protein. Study of the vitamin K (in epoxide and in reduced forms) recognition by the predicted conformations of hVKORC1WT revealed their reciprocal selectivity. The hVKORC1WT conformations targeted by each vitamin K form were established and their role in the reduction mechanism of this molecule was explained. Using our results, we postulated the comprehensive enzymatic mechanism of hVKORC1WT and we proposed the 3D structure as the VKAs target. Interactions between the predicted target - hVKORC1WT active state - and three different VKAs were characterized. The obtained affinities (free binding energy) were in good correlation with in vivo measured inhibition constants (Ki), thus validating our theoretical predictions. Our protocol developed for hVKORC1WT is suitable for a study of its mutants. Description of the enzymatic mechanisms of mutated hVKORC1 will lead to understanding of the modified reductase activity or/and to explaining of its resistance to VKAs. Such data are crucial for the development of novel strategies in the design of a new generation of inhibitors overcoming VKAs resistance. Our concept and the established in silico protocol can be extended to analysis of mammalian VKORs and other oxidoreductases family proteins.

Les Troubles du Spectre Autistique (TSA) forment un groupe hétérogène de troubles neurodéveloppementaux caractérisés par des déficits de l’interaction sociale et de la communication ainsi que la présence de comportements répétitifs et d’intérêts restreints. Les TSA affectent environ un individu sur 68. Ils se manifestent généralement durant les trois premières années de vie mais, pour certains cas, les symptômes sont reconnus plus tard, quand les exigences sociales augmentent. Les études de jumeaux et la récurrence des troubles dans certaines familles démontrent l’importance des facteurs génétiques dans la vulnérabilité aux TSA. Cependant, l’architecture génétique des TSA reste difficile à caractériser car elle est extrêmement hétérogène et il est très compliqué d’identifier, pour chacun des patients, la combinaison d’allèles à risque. Notre laboratoire a identifié la première voie génétique associée aux TSA – la voie NLGN-NRXN-SHANK- qui joue un rôle clé dans la plasticité synaptique. Il existe un nombre de plus en plus grand de gènes associés aux TSA mais peu d’études ont été réalisées sur des cohortes épidémiologiques et dans des populations isolées. L'analyse des données de génotypage et de séquençage d’exome de 357 individus issus des îles Féroé (36 patients, 136 apparentés des patients, 185 témoins) nous a permis de mettre en évidence un nombre plus important de Variations du Nombre de Copies (CNVs), un coefficient de consanguinité supérieur, un plus grand nombre de mutations homozygotes et délétères ainsi qu’un Polygenic Risk Score (ASD-PRS) supérieur chez les patients TSA comparés aux individus témoins. Notre analyse confirme le rôle de plusieurs loci associés aux TSA (NRXN1, ADNP, délétion 22q11) et a permis d’identifier de nouvelles mutations tronquant la protéine (GRIK2, ROBO1, NINL et IMMP2L) ou récessives (KIRREL3 et CNTNAP2) affectant des gènes déjà associés aux TSA. Nous avons également mis en évidence trois nouveaux gènes candidats jouant un rôle important dans la plasticité synaptique (RIMS4, KALRN et PLA2G4A) à travers la présence de mutations de novo délétères chez des patients sans déficience intellectuelle. Au total, nous avons pu identifier une cause génétique expliquant les TSA pour 11% des patients et au moins une mutation fortement délétère dans des gènes candidats chez 39% des patients. Aucune cause génétique n'a pu être trouvée chez 50% des patients. En résumé, notre étude permet de mieux comprendre l’architecture génétique des TSA dans les populations isolées en soulignant à la fois l'impact des variants communs et des variants rares mais également en révélant le rôle de nouveaux gènes pour les TSA. Ces gènes codent pour des protéines essentielles pour le neurodéveloppement et l’identification de ces facteurs impliqués dans la formation et l'entretien des synapses pourrait ainsi fournir de nouvelles pistes afin de mieux comprendre les bases biologiques des TSA et de découvrir de nouvelles stratégies thérapeutiques. Il est cependant nécessaire de comprendre plus avant l'impact de la combinaison de différentes mutations sur la fonction neuronale afin de mieux caractériser l’architecture génétique des TSA. / Autism Spectrum Disorders (ASDs) are a heterogeneous group of neurodevelopmental disorders characterized by deficits in social interaction and communication as well as the presence of repetitive behaviors and restricted interests. ASD affects approximately one in 68 individuals. They usually occur during the first three years of life but, in some cases, symptoms are recognized later, when social demands increase. There is a strong genetic component to ASD, as indicated by the recurrence risk in families and twin studies. However, the genetic architecture of ASD remains largely unknown because of its extreme heterogeneity. It is very challenging to identify, for each patient, the combination of risk alleles. Our laboratory identified the first genetic pathway associated with ASD – the NLGN-NRXN-SHANK pathway – playing a key role in synaptogenesis during development. There are an increasing number of genes associated with ASDs but few studies have been conducted on epidemiological cohorts and isolated populations. Here, we investigated 357 individuals from the Faroe Islands including 36 patients with ASD, 136 of their relatives and 185 non-ASD controls. Data from SNP array and whole exome sequencing revealed that patients had a higher burden of copy-number variants, higher inbreeding status, higher load of homozygous deleterious mutations, and a higher ASD polygenic risk score compared to controls. We confirmed the role of several ASD-associated loci (NRXN1, ADNP, 22q11 deletion) and identified new truncating (GRIK2, ROBO1, NINL and IMMP2L) or recessive variants (KIRREL3 and CNTNAP2) affecting genes already associated with ASD. We have also identified three novel candidate genes playing key roles in synaptic plasticity (RIMS4, KALRN and PLA2G4A) carrying deleterious de novo mutations in patients without intellectual disability. Overall, for 11% of individuals with ASD, a known genetic cause was identified, for 39% at least one strongly deleterious mutation was identified in a compelling candidate gene and for 50% no obvious genetic cause was detected. In summary, our study provides a better understanding of the genetic architecture of ASD in isolated populations by highlighting both the impact of common and rare variants but also by revealing the role of new genes for ASD. These genes code for proteins that are essential for neurodevelopment. The identification of these factors involved in synapse formation and maintenance could provide new leads to better understand the biological basis of ASD and find novel therapeutic strategies. However, it is necessary to further understand the combined impact of different mutations on neuronal function in order to better characterize the genetic architecture of ASD.

Les tumeurs de la vessie sont le quatrième cancer en terme de fréquence chez l’homme dans les pays industrialisés. Elles peuvent schématiquement être séparées en deux sous-groupes principaux : les tumeurs basales, peu différenciées, et les tumeurs luminales, différenciées. PPARγ est un récepteur nucléaire fortement exprimé dans ce second groupe, qui agit en hétérodimère avec un co-récepteur partenaire, RXRα, et possède un rôle essentiel dans la différenciation des cellules de l’urothélium normal. Récemment, un rôle protumorigénique de PPARγ a été mis en évidence dans les tumeurs luminales de vessie, où son activité est augmentée par le biais d’amplifications de PPARγ, ainsi que des mutations activatrices de son partenaire, RXRα. Le premier axe de mon projet a consisté à mieux caractériser ce rôle protumorigénique de PPARγ. J’ai d’abord participé à la mise en évidence de mutations récurrentes activatrices de PPARγ dans les tumeurs luminales de la vessie renforçant le rôle protumorigénique du récepteur dans ces tumeurs. J’ai ensuite cherché à identifier les gènes cibles de l’hétérodimère PPARγ/RXRα pouvant médier cet effet protumorigénique. Grâce à des analyses transcriptomiques après extinction de l’expression PPARγ ou de RXRα et des expériences de ChIP-sequencing de PPARγ et RXRα, j’ai pu identifier 30 gènes candidats. L’étude de l’implication de ces gènes dans la progression tumorale des tumeurs luminales présentant des altérations de la voie PPARγ/RXRα est actuellement en cours. Parallèlement à ce rôle protumorigénique dans les tumeurs luminales, des résultats suggéraient que ce gène pourrait posséder un rôle suppresseur de tumeurs dans le sous-groupe basal. La deuxième partie de mon projet a consisté à explorer cette hypothèse. J’ai pu montrer que des délétions hétérozygotes de PPARγ sont associées à ce sous-groupe de tumeurs basales, qui présente également une diminution globale de l’expression de PPARγ. De plus, parmi les mutations non-récurrentes de PPARγ identifiées dans ces tumeurs, certaines sont des mutations inactivatrices, capables d’inhiber l’activité transcriptomique de l’hétérodimère PPARγ/RXRα en favorisant la fixation de co-répresseurs de l’hétérodimère. J’ai également pu montrer un rôle anti-tumoral de PPARG dans les tumeurs basales puisque l’expression de PPARγ dans des lignées cellulaires basales à la suite de leur transfection avec un plasmide codant pour PPARγ est capable d’inhiber leur viabilité. Ce projet a ainsi permis de mettre en évidence un rôle dual de PPARγ dans les tumeurs de vessie, avec un rôle protumorigénique dans les tumeurs luminales, où il est suractivé par des amplifications et des mutations activatrices, et un rôle suppresseur de tumeurs dans les tumeurs basales, où il est réprimé par des délétions et de mutations inactivatrices. / Bladder tumors are the fourth cancer in terms of frequency in men, in industrialized countries. Bladder cancers can be divided into two main subgroups: undifferentiated basal tumors and differentiated luminal tumors. The nuclear receptor PPARγ, which is highly expressed in the second subgroup, forms a heterodimer with its partner, the nuclear receptor RXRα, and plays a key role in normal urothelial differentiation. A protumorigenic role of PPARγ has been established in luminal bladder cancer, with an increased activity through PPARγ genomic amplification or activating mutations of its partner, RXRα. The first part of my project aimed to better characterize this protumorigenic effect. I first participated in the identification of recurrent activating mutations of PPARγ in the luminal subgroup, enhancing its protumorigenic role in those tumors. Then, I tried to identify the PPARγ/RXRα heterodimer target genes that drive its protumorigenic role. By analyzing transcriptomic data following down regulation of PPARγ and RXRα, as well as ChIP-sequencing data for each of them, I identified 30 candidate target genes. The implication of the candidate genes in tumor progression of luminal cancer carrying PPARγ/RXRα pathway alteration is in progress. As opposed to its protumorigenic role in luminal tumors, some results suggested that PPARγ could play a tumor suppressor role in the basal subgroup. The second part of my project explored this hypothesis. I characterized PPARγ deletions associated with the basal subgroup, which presents a global PPARγ downregulation. Moreover, some of the non-recurrent mutations identified in this subgroup are inactivating mutations, able to inhibit the transcriptomic activity of the PPARγ/RXRα heterodimer, by an enhanced affinity of the heterodimer for co-repressors. I also showed an antitumor effect of PPARγ in basal tumors: its expression in basal bladder cell lines after transfection with a plasmid coding for PPARγ was able to inhibit cell viability. This project highlighted the dual role of PPARγ in bladder tumors, with a protumorigenic effect in luminal tumors through amplifications and activating mutations, and a tumor suppressor effect in basal tumors through deletions and inactivating mutations.

Les mutations de résistance génotypiques constituent un problème majeur pour l’optimisation du traitement antirétroviral chez les patients infectés par le VIH-1 naïfs au traitement ou prétraités. Cependant, l’analyse de l’impact des mutations sur la réponse au traitement est compliquée par i) le nombre élevé de mutations, ii) la colinéarité possible entre ces mutations, iii) le faible nombre de patients inclus dans les études et iv) la définition du critère de jugement. Les objectifs de cette thèse sont 1) de donner une vue d’ensemble et de discuter, en collaboration avec le réseau européen NEAT (European AIDS treatment network), les critères de jugement utilisés dans les essais cliniques récents et ceux utilisés lors de l’analyse des mutations de résistance, 2) d’évaluer l’impact des mutations génotypiques sur la réponse au traitement chez les patients naïfs dans le cadre d’une grande collaboration Européenne (EuroCoord-CHAIN) et 3) de comparer des méthodes adaptées pour les données à haute-dimension dans le but de construire un score génotypique pour la prédiction de la réponse virologique chez les patients prétraités. Les critères de jugement composites sont les plus utilisés dans les essais cliniques récents mais un critère purement virologique devrait être utilisé pour l’analyse de l’impact des mutations génotypiques. Les mutations de résistance transmises impactent sur la réponse à la première ligne de traitement si le traitement antirétroviral n’est pas adapté au génotype du virus du patient. L’analyse en composantes principales et l’analyse partial least square avaient une bonne capacité à prédire la réponse virologique mais n'étaient guère meilleures que le score génotypique. Nous allons continuer à travailler sur la comparaison de ces méthodes utilisant des critères de jugement différents dans le cadre de notre collaboration avec le Forum for collaborative HIV research. / Genotypic resistance mutations are a major concern for antiretroviral treatment optimisation in HIV-1 infected treatment naïve and treatment experienced patients. However, the analysis of the impact of genotypic mutations on treatment outcome is hampered by methodological issues such as the i) high number of possible mutations, ii) the potential collinearity between mutations, iii) the low number of patients included in those studies and iv) the definition of a virological endpoint. The objective of this thesis are 1) to give an overview and to discuss endpoints used in recent clinical trials in collaboration with European AIDS treatment network (NEAT) and those used in the context of drug resistance analysis, 2) to investigate the impact of genotypic resistance mutations on treatment outcome in treatment naïve patients in a huge European collaboration EuroCoord-CHAIN and 3) to compare methods adapted for high-dimensional data in order to construct a genotypic score to predict treatment outcome in treatment experienced patients. We saw that most of the endpoints used in recent clinical trials are composite endpoints but pure virological outcomes should be used for the evaluation of drug resistance mutations. Transmitted drug resistance mutations impact on virological outcome of initial antiretroviral therapy if the treatment of the patient is not adapted to the viral genotype the patient is harbouring. Principal component analysis and partial least square showed a good performance but had only a slightly better predictive capacity for a virologal outcome compared to the genotypic score. We continue working on the comparison of these and other methods using different endpoints in the context of a collaboration with the Forum for collaborative HIV research.

Par l'accumulation de mutations bénéfiques lors de cycles successifs de mutagénèse, l'évolution dirigée offre un cadre rationnel pour l'amélioration des protéines à vocation industrielle. Elle permet une exploration large de l'espace possible des séquences ainsi que leurs capacités fonctionnelles. Elle est cependant lourde à mettre en oeuvre et nécessite des moyens importants. Des approches in silico font usage d'un jeu minimal de données expérimentales et utilisent la modélisation statistique combinée à des algorithmes d'apprentissage machine. Elles ont été développées pour explorer de façon heuristique l'espace possible des séquences et de la fitness et d'identifier les mutations et interactions entre résidus les plus intéressantes. C'est l'objet de cette thèse qui explore la construction et l'application de modèles statistiques s'appuyant sur des jeux minimaux de données expérimentales pour relier fitness, ou activité, à la séquence biologique des variants. L'étude s'articule autour d'un choix crucial d'une méthode de numérisation, de descripteurs de la séquence et de méthodes de régression. La méthode ProSAR de R. Fox (2005) et les limites de son applicabilité sur des jeux de données expérimentales ont été étudiées. De nouvelles méthodes ont aussi été développées, prenant en compte les propriétés physico-chimiques des acides aminés et leurs périodicités. Elle a permis de découvrir de nouveaux descripteurs reliant la séquence à l'activité et propose des approches innovantes qui ont la capacité de traiter des cadres biologiques très divers, même lorsque peu de données biologiques sont disponibles. / Via the accumulation of beneficial mutations through successive rounds of mutations, directed evolution offers a rational framework for the amelioration of protein of industrial interest. It enables the large exploration of the sequence space and fitness. However, they are wet-lab intensive and may reveal to be time consuming and costly. In silico approaches using minimal sets of experimental data and statistical models combined with machine learning algorithms have been developed to explore heuristically the sequence space and to identify the effect of the potential epistatic interactions between residues on protein fitness. This work focused on the construction and application of statistical models relying on minimal experimental datasets to study protein sequence to activity relationships (ProSAR). In particular, the choices of appropriate numerical encoding methods, of descriptors extracted from protein sequences and of regression methods were investigated. The original ProSAR method from R. Fox (2005) and the limits of its applicability on experimental datasets have been studied. New methods that consider physico-chemical features of amino acids and their periodicities have been explored. This study unveils novel descriptors of the sequence-activity relationship and provides innovative approaches that can deal with very diverse biological datasets, even when few biological data are available.