L’infection par le virus de l’hépatite B (VHB) reste un problème de santé publique avec plus de 880 000 décès chaque année dans le monde. Au stade chronique de l’infection virale B, des complications peuvent survenir comme la fibrose, la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. L'implication du VHB, de ses protéines ou de sa variabilité génétique dans la fibrose hépatique reste à élucider. Toutefois, des méta-analyses semblent montrer un lien statistiquement significatif entre la présence de la double mutation A1762T/G1764A dans le promoteur basal du core (PBC) du VHB et la fibrose sévère. C’est pourquoi nous avons orienté nos travaux de recherche selon deux axes : l’implication des mutations du PBC et de la région précore (PC) dans la sévérité des lésions hépatiques ainsi que le rôle des protéines HBc et HBe du VHB dans l’induction de la fibrogénèse. Dans un premier temps, deux études cliniques ont permis de confirmer l’association significative du double mutant PBC avec la fibrose sévère indépendamment du génotype viral. Nous avons également démontré un effet antagoniste de la mutation G1899A située dans la région PC vis-à-vis du double mutant PBC dans la sévérité de la fibrose. La deuxième partie de nos travaux a consisté à développer une technique innovante de production de protéines en utilisant la transduction de la lignée HepaRG par des vecteurs lentiviraux contenant la séquence de la protéine GFP (green fluorescent protein). En parallèle, nous avons synthétisé des particules lentivirales contenant les séquences sauvages et mutées du PBC et de la région PC, avec pour objectif de produire les protéines HBc et HBe dans les HepaRG. / The hepatitis B virus (HBV) infection remains a significant public health problem with more than 880 000 deaths every year worldwide. At the stage of chronic HBV infection, complications can occur such as fibrosis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The role of HBV, its protein and its genomic variability in fibrosis are still unclear. Meta-analysis seems to indicate a strong link between the double mutation A1762T/G1764A detection in the basal core promotor (BCP) of HBV and the development of fibrosis. In this context, our work aimed to explore: i. the implication of BCP or precore (PC) regions mutations on the severity of fibrosis, and ii. the role of HBc and HBe proteins in fibrosis induction. For the first approach, our studies confirmed the association between the presence of the BCP double mutation and severe fibrosis, independently of the viral genotype. We also showed that the G1899A mutation in the PC region presents an antagonist effect regarding the double BCP mutant for fibrosis severity. In the second part of our work, we developed an innovative technology to produce protein via the transduction of HepaRG cells using lentiviral technology with a plasmid vector containing GFP (greenfluorescent protein) sequence. We also obtained lentiviral particles containing the wild and mutated sequences for the BCP and PC regions, in order to produce HBc and HBeprotein in HepaRG cells and to explore of the pathogenic role of BCP and PC mutants.

Les mycoplasmes sont des bactéries atypiques, dépourvues de paroi et souvent considérées comme des cellules minimales du fait de la taille réduite de leur génome. De nombreuses espèces sont pathogènes et ont un impact économique important dans les filières d'élevage, notamment pour les ruminants. Les mycoplasmes n'échappent pas au phénomène mondial de la résistance aux antibiotiques. Contrairement à la plupart des autres bactéries, les mycoplasmes ne contiennent pas de plasmides conjugatifs souvent incriminés dans la dissémination horizontale de gènes de résistance, la base moléculaire principalement décrite étant la mutation chromosomique des gènes cibles. De façon générale, le transfert horizontal de gènes (HGT) chez les mycoplasmes a longtemps été sous-estimé. Récemment, deux mécanismes de HGT ont été décrits chez Mycoplasma agalactiae : le transfert d'élément conjugatif et intégratif (ICE), et le transfert non-conventionnel de régions chromosomiques par conjugaison appelé MCT (Mycoplasma Chromosomal Transfer). Nos travaux se sont attachés à explorer ce dernier mécanisme et à évaluer son impact sur l'acquisition de la résistance aux antibiotiques. Une analyse de génomique comparative a été conduite à partir du séquençage de nombreux mutants spontanément résistants et de transconjugants générés par des expériences de mating et sélectionnés pour leur résistance. Nos résultats montrent que le MCT conduit de façon distributive au transfert simultané de nombreux fragments. En une seule étape de conjugaison impliquant deux souches, ce phénomène génère une population variée de génomes hautement mosaïques. Il accélère la dissémination de l'antibiorésistance, permettant l'acquisition de plusieurs mutations distantes associées à la résistance en un seul événement. De par les multiples possibilités de réassemblage génomique qu'il produit, le MCT pourrait avoir des conséquences importantes sur d'autres processus adaptatifs comme la virulence ou la spécificité d'hôte. Enfin, les modalités distributives et l’ampleur du MCT expliquent l'origine des transferts de gènes précédemment détectés in silico entre de nombreux mycoplasmes. Ce phénomène pourrait donc avoir eu des répercussions importantes sur l'évolution de ces bactéries minimales et être un facteur clé de leur persistance et virulence actuelles. / Mycoplasmas are wall-less bacteria often portrayed as minimal cells because of their reduced genomes. Several species are pathogenic and have a significant economic impact on livestock production, especially for ruminants. Mycoplasmas are also concerned with the worldwide increase in antibiotic resistance. In contrast to the majority of bacteria, these simple bacteria are deprived of conjugative plasmids that are frequently implicated in the horizontal dissemination of resistance genes: in mycoplasmas antibiotic resistance mainly relies on chromosomal mutations in target genes. In Mycoplasmas, the horizontal gene transfer (HGT) has long been underestimated. Recently, two conjugative mechanisms of HGT were described in Mycoplasma agalactiae: the transfer of an integrative and conjugative element (ICE), and the unconventional transfer of chromosomal DNA further designed by “MCT” for Mycoplasma Chromosomal Transfer. Our current study focused on exploring MCT mechanisms and on estimating its impact on antibiotic resistance dissemination. Comparative genomic analyses were performed from the sequencing (i) of spontaneous resistant mutants and (ii) of transconjugants selected by mating experiments and selected based on their resistance. Data revealed that MCT generated the simultaneous transfer of multiple, unrelated donor-fragments following a distributive process. In one conjugative step involving two strains, MCT generated a variety of highly mosaic genomes. This phenomenon was also shown to accelerate the dissemination of antibiotic resistance, by allowing in one step the acquisition of multiple and dispersed mutations associated with resistance. Due to the limitless ability of this phenomenon in reshuffling genomes, MCT may offer a valuable contribution in other adaptive processes such as virulence or host specificity. Finally, the distributive nature and the extent of MCT explain the origin of genes transfers detected in silico in several mycoplasma species. MCT is certainly a major player in the evolution of these minimal bacteria and a key factor of their persistence and virulence.

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez la femme et constitue un véritable problème de santé publique. Les progrès de la biologie moléculaire ont permis la caractérisation des principales voies de signalisation et ont mis en évidence l'implication majeure de la signalisation cellulaire dans les processus de cancérogenèse. Des cibles moléculaires ont ainsi été identifiées et ont permis le développement de thérapeutiques dites ciblées, telles que les anticorps monoclonaux ou encore les inhibiteurs de kinase. Malgré ces avancées considérables qui ont permis l'amélioration de la prise en charge des patientes, on constate l'apparition de résistances aux traitements. Ce travail avait pour objectifs d'identifier de nouveaux biomarqueurs et de déterminer leur signification clinique, leur intérêt théranostique ainsi que leur impact sur la réponse aux traitements. Dans un premier temps nous avons étudié les mutations activatrices du gène PIK3CA. Ces mutations sont retrouvées dans 25% des cancers du sein et sont impliquées dans la résistance au trastuzumab, aux anti-œstrogènes et aux inhibiteurs de mTOR. 149 échantillons de tumeurs de sein infiltrantes ont été analysés par une technique de PCR-HRM (High Resolution Melting) et 118 échantillons par une technique de PCR-ARMS (Amplification Refractory Mutation System). Les résultats des 2 techniques étaient concordants (k=0,845 ; p<0,001) et une relation entre mutations du gène PIK3CA et grade SBR a été mise en évidence, les tumeurs de grade SBR III étant moins fréquemment mutées que les autres (p=0.025 en HRM et p=0.009 en ARMS). Dans un second temps, notre travail a consisté en l'exploration fonctionnelle des voies de signalisation PI3K/AKT/mTOR, RAS/RAF/MAPKinases et P38MAPKinase. Pour cela nous avons analysé le niveau d'expression des phosphoprotéines p-AKT, p-GSK3ß, p-S6 kinase, p-MEK1, p-ERK1/2, p-P90RSK, p-IGF1R ainsi que p-P38MAPK par immuno-analyse multiplexe. Cette partie a comporté 3 études. Une première étude rétrospective sur 45 échantillons de tumeurs mammaires invasives congelées a mis en évidence des niveaux d'expression de P38 et de p-P38 plus élevés dans les tumeurs RE+. La deuxième étude était une étude prospective visant à déterminer des biomarqueurs de réponse à l'association trastuzumab-évérolimus chez des patientes présentant un cancer du sein précoce traitées en préopératoire. Cette étude a révélé une augmentation statistiquement significative du niveau d'expression de p-MEK1 (p=0.012), p-ERK1/2 (p=0.003) et p-P38MAPK (p<0.001) dans le bras de traitement associant l'évérolimus au trastuzumab qui pourrait s'expliquer par la suppression par l'évérolimus d’une boucle de rétrocontrôle négatif contrôlant l'activation de la voie RAS/RAF/MAPKinases. Dans le bras de traitement évaluant le trastuzumab seul, aucune variation du niveau d'expression des phosphoprotéines n'a été mise en évidence, y compris en aval du récepteur HER2, ce qui soulève l'hypothèse d'un mécanisme d'action prédominant immunologique du trastuzumab. La troisième étude qui comparait l'impact du trastuzumab in vitro et en situation clinique confirme la différence des mécanismes d'action mis en jeu en fonction des conditions cellulaires et cliniques. Dans son ensemble, ce travail a mis en évidence que la détermination du statut mutationnel du gène PIK3CA et du niveau d’expression des phosphoprotéines pourrait être utile à une meilleure caractérisation moléculaire des cancers du sein et à l’optimisation de la personnalisation des prescriptions de thérapies ciblées / Breast cancer is the most frequently diagnosed cancer in women and is a real public health problem.Advances in molecular biology have allowed the characterization of the major signaling pathways and revealed their major implication in carcinogenesis processes. Molecular targets have been identified and have enabled the development of targeted therapies, such as monoclonal antibodies, or kinase inhibitors. Despite these considerable advances that have improved the care of patients, emerging of resistance to treatments has been observed. The aim of this work was to identify new tumor biomarkers and determine their clinical significance, their theranostic interest and their impact on the response to targeted therapies. Initially, we studied the activating mutations of the PIK3CA gene. These mutations are found in 25% of breast cancers and are involved in resistance to trastuzumab, antiestrogens and mTOR inhibitors. We analyzed 149 invasive breast tumor samples for PIK3CA gene mutations by PCR-HRM (High Resolution Melting) and 118 by PCR-ARMS (Amplification Refractory Mutation System). The results achieved with the 2 techniques were consistent (k = 0.845; p <0.001) and a relationship between PIK3CA mutations and grade SBR was highlighted with a lower occurrence of mutations in SBR grade III tumors (p=0.025 in HRM and p=0.009 in ARMS). Secondly, we investigated the functional alteration of PI3K/AKT/mTOR, RAS/RAF/MAPKinases and P38MAPKinase signaling pathways. We have analyzed the expression level of phosphoproteins p-AKT, p-GSK3ß, p-S6 kinase, p-MEK1, p-ERK1 / 2, p-P90RSK, p-IGF1R and p-p38MAPK by multiplex immunoanalysis. This part includes 3 studies. The first study was a retrospective study of 45 frozen samples of invasive breast tumors in which we observed that the level of expression of P38 and p-P38 was higher in the ER + tumors. The second study was a prospective study to identify biomarkers of response to trastuzumab-everolimus association in patients with early breast cancer treated preoperatively. This study showed a statistically significant increase of the expression level of p-MEK1 (p = 0.012), p-ERK1/2 (p = 0.003) and p-p38MAPK (p<0.001) in arm treated by trastuzumab associated with everolimus. It could be explained by the repression of a negative feedback loop involving S6K, PI3K and RAS by everolimus, leading to the activation of RAS/RAF/MAPKinases signaling pathway. In the control arm investigating trastuzumab alone, no significant variations of the level of expression of phosphoproteins was demonstrated, raising the hypothesis of the implementation of a predominant immunological mechanism of action for Trastuzumab. The third study that compared effect of trastuzumab in vitro and in clinical setting confirms that trastuzumab has different modes of action when evaluated in cells and in clinical conditions. As a whole, this work showed that determining the mutation status of PIK3CA and the expression level of phosphoproteins could be useful to refine the molecular characterization of breast cancers and optimize the criteria used to personalize the prescription of targeted therapies

Les syndromes myélodysplasiques (SMD) forment un groupe de pathologies clonales de la cellule souche hématopoïétique (CSH) caractérisées par une hématopoïèse inefficace. La présence d’au moins une anomalie génétique (anomalie cytogénétique ou mutation somatique) est observée dans plus de 90% des cas. Ainsi, plusieurs clones moléculaires pouvaient coexister au moment du diagnostic de la maladie. Dans les SMD avec délétion du chromosome 5 (del(5q)), il a récemment été montré que les anomalies étaient présentes dès le stade de la CSH. Dans les SMD, la pénétrance des anomalies génétiques décrites est incomplète. De plus, peu de choses sont actuellement connues sur l’ordre d’apparition des mutations et leur impact fonctionnel sur les différents clones moléculaires dans le cas des SMD non-del(5q). Grâce au séquençage d’exome entier (WES) de patients ne présentant aucune mutation dans les gènes décrits dans les SMD, nous avons décrit l’existence de mutations dans les gènes BCOR et BCORL1, chez respectivement 4,2% et 0,8% des patients. Les mutations du gène BCOR arrivent tardivement au cours de l’évolution de la maladie et affectent le pronostic des patients. Des approches à l’échelle unicellulaire nous ont également permis d’observer que la majeure partie des mutations identifiées chez les patients sont retrouvées dès le stade CD34+CD38-. Chez les patients, plusieurs clones moléculaires coexistent à ce stade. De plus, les mutations des gènes de l’épissage et de la régulation épigénétique sont fréquemment acquises en premier dans les cellules hématopoïétiques les plus immatures des patients porteurs de SMD. Nous avons observé que certaines mutations, acquises secondairement, sont réparties inégalement dans les différents compartiments hématopoïétiques et peuvent avoir un impact sur la différenciation hématopoïétique. Enfin, nous montrons que la répartition des clones moléculaires évolue au cours du temps. En réponse au traitement par Lenalidomide, on observe également une évolution rapide de l’architecture clonale qui peut être liée au statut de réponse des patients. Ces résultats tendent à confirmer l’hétérogénéité génétique mais aussi fonctionnelle des SMD. Nous avons pu identifier de nouvelles mutations impliquées secondairement dans la physiopathologie des SMD. Il existe une dominance clonale précoce dans les SMD du fait de l’acquisition de toutes les mutations dans les cellules hématopoïétiques immatures. Cependant, les différentes populations hématopoïétiques peuvent présenter des génotypes différents. Enfin cette architecture est variable au cours de l’évolution de la maladie. / Myelodysplastic syndromes (MDS) are a group of clonal disorders of the hematopoietic stem cell (HSC) characterized by ineffective hematopoiesis. At least one genetic abnormality (cytogenetic abnormality or somatic mutation) is observed in more than 90% of cases. Thus, it has been observed several molecular clones which could coexist at diagnosis of the disease. In MDS with deletion of chromosome 5 (del (5q)), it has recently been shown that defects were present in the HSC. In MDS, the penetrance of genetic abnormalities described is incomplete. In addition, little is currently known about the order of appearance of mutations and their functional impact on different molecular clones in the case of non-del (5q) MDS. Through the whole exome sequencing (WES) of patients without mutation in the genes described in MDS, we described the existence of mutations in genes BCOR and BCORL1, in respectively 4.2% and 0.8% of patients. Mutations in the gene BCOR were acquired lately during the course of the disease and affect the prognosis of patients. Approaches at the single cell level have also allowed us to observe that most of the mutations identified in patients are found at the immature differentiation stage CD34+CD38-. In patients, several molecular clones could coexist at this stage. In addition, mutations in gene splicing and epigenetic regulation are frequently first acquired in the most immature hematopoietic cells of MDS patients. We found that certain mutations, acquired in a second time, are distributed unevenly in different hematopoietic compartment and may have an impact on hematopoietic differentiation. Finally, we showed that the distribution of molecular clones evolves over time. In response to treatment with Lenalidomide, it has also been observed a rapid evolution of clonal architecture that can be linked to patient response status. These results tend to confirm the genetic but also functional heterogeneity in MDS. We have identified new mutations involved in the pathogenesis of MDS. We observed an early clonal dominance in MDS because of the acquisition of all mutations in immature hematopoietic cells. However, different hematopoietic populations can have different genotype. Finally, the architecture of mutations could be modifying during the course of the disease.

Depuis le premier séquençage du génome humain au début des années 2000, de grandes initiatives se sont lancé le défi de construire la carte des variabilités génétiques inter-individuelles, ou bien encore celle des altérations de l'ADN tumoral. Ces projets ont posé les fondations nécessaires à l'émergence de la médecine de précision, dont le but est d'intégrer aux dossiers médicaux conventionnels les spécificités génétiques d'un individu, afin de mieux adapter les traitements et les stratégies de prévention. La traduction des variations et des altérations de l'ADN en prédictions phénotypiques constitue toutefois un problème difficile. Les séquenceurs ou puces à ADN mesurent plus de variables qu'il n'y a d'échantillons, posant ainsi des problèmes statistiques. Les données brutes sont aussi sujettes aux biais techniques et au bruit inhérent à ces technologies. Enfin, les vastes réseaux d'interactions à l'échelle des protéines obscurcissent l'impact des variations génétiques sur le comportement de la cellule, et incitent au développement de modèles prédictifs capables de capturer un certain degré de complexité.Cette thèse présente de nouvelles contributions méthodologiques pour répondre à ces défis.Tout d'abord, nous définissons une nouvelle représentation des profils de mutations tumorales, qui exploite leur position dans les réseaux d'interaction protéine-protéine. Pour certains cancers, cette représentation permet d'améliorer les prédictions de survie à partir des données de mutations, et de stratifier les cohortes de patients en sous-groupes informatifs. Nous présentons ensuite une nouvelle méthode d'apprentissage permettant de gérer conjointement la normalisation des données et l'estimation d'un modèle linéaire. Nos expériences montrent que cette méthode améliore les performances prédictives par rapport à une gestion séquentielle de la normalisation puis de l'estimation. Pour finir, nous accélérons l'estimation de modèles linéaires parcimonieux, prenant en compte des interactions deux à deux, grâce à un nouvel algorithme. L'accélération obtenue rend cette estimation possible et efficace sur des jeux de données comportant plusieurs centaines de milliers de variables originales, permettant ainsi d'étendre la portée de ces modèles aux données des études d'associations pangénomiques. / Since the first sequencing of the human genome in the early 2000s, large endeavours have set out to map the genetic variability among individuals, or DNA alterations in cancer cells. They have laid foundations for the emergence of precision medicine, which aims at integrating the genetic specificities of an individual with its conventional medical record to adapt treatment, or prevention strategies.Translating DNA variations and alterations into phenotypic predictions is however a difficult problem. DNA sequencers and microarrays measure more variables than there are samples, which poses statistical issues. The data is also subject to technical biases and noise inherent in these technologies. Finally, the vast and intricate networks of interactions among proteins obscure the impact of DNA variations on the cell behaviour, prompting the need for predictive models that are able to capture a certain degree of complexity. This thesis presents novel methodological contributions to address these challenges. First, we define a novel representation for tumour mutation profiles that exploits prior knowledge on protein-protein interaction networks. For certain cancers, this representation allows improving survival predictions from mutation data as well as stratifying patients into meaningful subgroups. Second, we present a new learning framework to jointly handle data normalisation with the estimation of a linear model. Our experiments show that it improves prediction performances compared to handling these tasks sequentially. Finally, we propose a new algorithm to scale up sparse linear models estimation with two-way interactions. The obtained speed-up makes this estimation possible and efficient for datasets with hundreds of thousands of main effects, thereby extending the scope of such models to the data from genome-wide association studies.

L’agence internationale de recherche sur le cancer (IARC) a indiqué que le travail posté qui provoquait une disruption circadienne était probablement cancérogène chez l’Homme. Ainsi, une perturbation expérimentale sévère du système circadien accélère-t elle la progression tumorale et pourrait favoriser la cancérogénèse. Durant ma thèse, j’ai démontré que la disruption circadienne résultant d’une mutation ou d’une mise au silence des gènes de l’horloge Per ou Cry accélérait la cancérogénèse hépatique induite par la diéthylnitrosamine, en favorisant l’instabilité génomique, la prolifération cellulaire, et l’inflammation. J’ai montré que l’alimentation programmée ou la dexaméthasone modifiaient la régulation circadienne de ces trois caractéristiques du cancer, suggérant ainsi qu’une intervention thérapeutique ciblant le système circadien pourrait prévenir la cancérogénèse. J’ai ainsi mis en évidence le contrôle circadien de trois mécanismes moléculaires de la cancérogenèse précoce et proposé deux interventions ciblant l’horloge circadienne dans un but de prévention de la cancérogenèse. / The International Agency for Research on Cancer (IARC) concluded that “shift-work that involves circadian disruption is probably carcinogenic to humans”. Severe disruption alteration accelerated tumor progression and enhanced carcinogenesis. During my PhD, I demonstrated that circadian disruption resulting from mutation of Per and Cry clock genes accelerated liver carcinogenesis induced by diethylnitrosamine through promoting genomic instability, cellular proliferation, and inflammation. I showed that meal timing or dexamethasone altered circadian regulation of these three characteristics of cancer, suggesting a therapeutic intervention targeting the circadian system could prevent carcinogenesis. I have thus demonstrated the circadian control of three molecular mechanisms of early carcinogenesis and proposed two interventions targeting the circadian clock for liver carcinogenesis prevention.

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:38:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Janaina de Araujo Evangelista.pdf: 5258011 bytes, checksum: f25739b96a1b2d123d21c1753b3204e8 (MD5) Previous issue date: 2011-05-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / subtropical regions of the planet. In North America, Plasmodium vivax is responsible for the most part of the infections. In 2011, 250,498 cases of malaria fever were studied; 80% of these cases were caused by Plasmodium vivax. The purpose of this study was to investigate the diversity generation of the gene MSP1 from Plasmodium vivax through the analisys of a specific mutation in the region from the block 2 genetic precombination events. In order to identify the existing mutations in multiclonal infections and generation of diversity in PvMSP1 a series of experiments were done, respectively, the extraction of genomic DNA of the parasite, PCR (polymerase chain reaction) using specific primers for the block 2, ligation of the fragment to cloning vector (top), processing using Escherichia coli competent cells, selection of colonies belonging to the same sample, DNA sequencing and analysis of synonymous and nonsynonymous mutations as their location in the prediction of B and T cell epitopes (not synonymous). The calculation of genetic distance between recombinant clones of the same sample by the MEGA 4.0 program confirmed the multiclonality of samples. The alignment of amino acid sequences showed the presence of genetic recombination events using DNASP program. DNA sequences obtained showed another interesting result: several synonymous and non-synonymous mutations in a relatively small stretch of DNA. Genetic diversity showed most mutations are not synonymous, and that most of them were located in regions referred to as B and T cell epitopes by BcPred and ProPred. So, as expected, the genetic diversity based on synonymous mutations and not synonymous possible sustains the phenomenon of escape on the immunity of the host. The characterization of these polymorphisms may contribute to immunological studies aiming at the development of a vaccine against malaria on stages caused by p. vivax. / A malária é um problema da saúde pública amplamente distribuída nas regiões tropicais e subtropicais do globo. No continente americano, o Plasmodium vivax é responsável por maior parte das infecções. No ano de 2011, 250.498 casos de malária foram observados no estado do Amazonas; 80% destes casos foram causados por Plasmodium vivax. O objetivo desse trabalho foi Investigar a geração de diversidade do gene MSP1 de Plasmodium vivax através da análise de mutações pontuais na região do bloco 2, eventos de precombinação genética. Para identificar as mutações existentes nas infecções multiclonais e geração de diversidade em PvMSP1 realizou-se uma série de experimentos, respectivamente, a extração de DNA genômico do parasita, PCR (Reação da Polimerase em Cadeia) utilizando primers específicos para o bloco 2, ligação do fragmento ao vetor de clonagem ( TOPO), transformação utilizando células de E.coli competentes , seleção de colônias pertencentes a uma mesma amostra, seqüenciamento de DNA e análise das mutações não sinônimas e sinônimas quanto sua localização em regiões de predição de epítopos de células B e T (não sinônimas). O cálculo da distância genética entre clones recombinantes de uma mesma amostra pelo programa MEGA 4.0 confirmou a multiclonalidade das amostras. O alinhamento das sequências de aminoácidos mostrou a presenção de eventos de recombinação genética utilizando o programa DNASP. As sequências de DNA obtidas demonstrou outro resultado interessante: várias mutações sinônimas e não sinônimas num trecho relativamente pequeno de DNA. A diversidade genética mostrou mais mutações não sinônimas, sendo que maior parte delas estavam localizadas em regiões previstas como epítopos das células B e T pelo programa BcPred e ProPred. Assim, como esperado, a diversidade genética baseado nas mutações sinônimas e não sinônimas sustenta o fenômeno de escape sobre a imunidade do hospedeiro. A caracterização desses polimorfismos poderá contribuir para estudos imunológicos visando o desenvolvimento de uma vacina contra os estágios eritrocitários da malária causada por P.vivax.

Il existe, entre la Serbie et la France, une véritable communauté scientifique en ce qui concerne le droit public. En effet, depuis le XIXe siècle, si l’on se penche sur l’histoire, les publicistes serbes et français s’interrogent sur les mêmes problèmes relatifs à l’État et sa pérennité. Ceci n’a rien d’étonnant car la Serbie, comme la France, a sa place dans le cadre de l’espace européen contemporain et répond à ses modèles. Les concepts de droit public que nous connaissons, par rapport au cas étudié, sont de deux types : nous pouvons distinguer les concepts de processus, qui témoignent d’une dynamique particulière, et les concepts de cas, qui nous amènent à une analyse statique. Concernant les premiers, il est question de transition démocratique, transition constitutionnelle, succession d’États, dislocation, sécession, séparation d’États et internationalisation du droit public. Pour les seconds, il s’agit des concepts d’État, personnalité morale, d’État constitutionnel, souveraineté, État composé (état fédéré, régional, autonomies), État de droit, démocratie et administration internationale. Il ne nous a pas semblé nécessaire de créer d’autres concepts. En effet, la plupart des points problématiques rappellent les grandes théories, plus ou moins directement. Dans le cadre de notre recherche il a bien été question de faire un bilan de ces théories, au regard d’un cas concret : la République de Serbie depuis, 1990, au moment de l’introduction du pluripartisme, dans la Yougoslavie titiste mourante. Le but de cette analyse est de proposer notre contribution car nous n’avons pas la prétention de fonder une nouvelle théorie de l’État. Mais au vu des mécanismes du droit, comme outil nous permettant de penser l’État, le cas de la Serbie, depuis 1990, et ses données spécifiques, nous amènent à engager une piste de réflexion sur l’État tel qu’il peut être pensé et critiqué, en ce début de XXIe siècle. / The nineteenth century, if one looks at History, French and Serbian publicists have questioned the same problems with regard to the issue State and its future. This is not surprising as Serbia, like France, has its place in the framework of the European contemporary public Law. The concepts of public Law that we know from the cases studied are of two types: we can distinguish between concepts of process, which has proven to be particularly dynamic, and concepts of case law that leads us to a static analysis. The former relates to a democratic transition, constitutional transition, succession, dislocation, secession, separation of state and internationalization of public law. The latter, pertains to concepts of state, legal status, sovereignty, state compound (federal state, regional autonomies), Rule of law, Democracy and international administration. It did not seem necessary to create other concepts. Indeed, the most problematic issues involve the major theories, more or less directly. Part of our research has included a review of these theories, in terms of a concrete case: the Republic of Serbia since 1990, when the introduction of multipartism in Tito's Yugoslavia came to end. The purpose of this analysis is to offer our contribution ; we do not pretend to find a new theory of the state. Indeed in view of the mechanisms of Law as a tool to consider the question of state, in the case of Serbia, since 1990, with its specific circumstances, leads us to initiate a line of reflexions on the issue of state that may be thought as criticism, in the early twenty-first century.

Les aminoacyl-ARNt synthétases mitochondriales humaines (aaRS mt) sont des enzymes clés de la traduction mitochondriale. Elles catalysent l'aminoacylation des ARNt par les acides aminés correspondent. Des mutations dans leurs gènes sont corrélées à des pathologies avec un large spectre de phénotypes cliniques, mais aux mécanismes moléculaires sous-jacents encore incompris. L'objectif de ce travail de thèse s'intègre dans les axes scientifiques du laboratoire, mais élargit l'intérêt et les connaissance à un système encore peu exploré: l'arginyl-ARNt synthétase mitochondriale (ArgRS mt). Des mutations dans la ArgRS sont liées à une hypoplasie Pontocérébelleuse (PCH6), une pathologie neurodéveloppementale sévère. Le travail de cette thèse s’articule autour de 3 axes : (I) L’analyse des phénotypes cliniques des pathologies liées aux mutations dans les aaRS mt, (II) La caractérisation des propriétéscellulaires de l’ArgRS mt, et (III) L'étude de l’impact de mutations « pathologiques » sur diverses propriétés de l’ArgRS mt. Combinés avec les travaux précédents, les résultats obtenus sont une contribution importante à l'élargissement des connaissances fondamentales des mt aaRSs, et apportent un nouvel éclairage sur le lien entre les mt-aaRSs-mutations et la maladie. / Human mitochondrial aminoacyl-tRNA synthetases (mt-aaRSs) are housekeeping enzymes involved in the mitochondrial translation. They catalyze the aminoacylation of tRNAs with their cognate amino acids. Mutations in their nuclear genes are correlated with pathologies with a broad spectrum of clinical phenotypes, but with so far no clear explanations about the underlying molecular mechanism(s). The aim of this PhD work follows the long-standing efforts of the host laboratory but expand the interest and knowledge to an unexplored system: the human mitochondrial arginyl-tRNA synthetase (mt-ArgRS). Mutations in the mt-ArgRS lead to Pontocebellar hypoplasia type 6, a severe neuro-developmental pathology. I thus contributed to i) comprehensively analyze the clinical data reported in pathologies related to mutations on mt-aaRSs, resulting in a categorization according to the affected anatomical system; ii) decipher some cellular properties of the mt-ArgRS; and iii) investigate to impact of disease-associated mutations on mt-aaRSs properties. Combined with previous works, the present results expand the knowledge of the mt-aaRSs, shedding new light on the link between mt-aaRSs-mutations and disease.

Le paludisme reste une des principales causes de mortalité infantile dans le monde tropical. L'émergence continue des résistances du parasite aux anti-paludiques constitue un sérieux problème de santé publique. La recherche de nouvelles cibles thérapeutiques, basée sur une connaissance plus approfondie des mécanismes moléculaires de la vie du parasite, est une nécessité permanente dans un paradigme de « reine rouge » qui s'applique parfaitement à la capacité d'adaptation du parasite. La découverte récente d'une métacaspase de Plasmodium falciparum (PfMCA1) et la mise en évidence de son rôle potentiel dans l'apoptose du parasite, fait qu'elle est une cible thérapeutique contre le paludisme. Dans le but de mieux approfondir les connaissances sur cette protéine cible, nous avons voulu, dans un premier temps, déterminer la structure tridimensionnelle de PfMCA1, afin de confirmer les différentes structures prédites in silico, et chercher de nouvelles molécules candidates par le docking moléculaire. Cependant cet objectif n'a pas pu être atteint, à cause d'un phénomène d'autoclivage de la protéine suite à son expression, ce qui fait que nous n'avons pas réussi à récupérer la protéine. Dans un second temps, nous avons étudié la métacaspase de Plasmodium vivax (PvMCA1) en comparaison avec PfMCA1, et nous avons montré que les résidus histidine et cystéine dans la dyade catalytique sont bien conservés. Nous avons identifié un deuxième site potentiel dans le domaine catalytique de PvMCA1. A partir d'échantillons collectés en Mauritanie, au Soudan et à Oman, nous avons montré que les résidus histidine et cystéine, ainsi, que les résidus du second site du domaine catalytique de PvMCA1 sont très variables. Les mutations de ces résidus doivent faire l'objet d'étude approfondie de leurs effets sur la fonction de la protéine PvMCA1. Ce polymorphisme trouvé dans les résidus catalytiques de PvMCA1, doit-être évalué comme marqueurs moléculaires de résistance / Malaria remains one of the main causes of infant mortality in the tropical world.The continuous emergence of parasite resistant to drug treatment is a serious threat to public health. Exploring new therapeutics targets based on depth knowledge on molecular mechanism of the parasite’s life is utmost needed in a paradigm of « red queen», which applies perfectly on the ability of the parasitic adaptation. The recent discovery of metacaspase of Plasmodium falciparum (PfMCA1) and the demonstration of its potential role in apoptosis, make it a therapeutic target against malaria. In order to increase knowledge about this protein, we planned, to determine the three-dimensional structure of PfMCA1, to confirm the different structures predicted in silico, and to look for new drug using molecular docking. However, this goal was not reached, since autoprocessing occurred during expression, and we failed to obtain the full-length protein. Then we studied the metacaspase of Plasmodium vivax (PvMCA1) in comparison with PfMCA1 and, we shown that histidine and cysteine residues in the dyad catalytic are well conserved. We have identified a second potential site in the catalytic domain of PvMCA1. We shown that residues in both putative sites are highly polymorphic in samples from Mauritania, Sudan and Oman. Mutations on these residues need to be deeply studied for their effects on the PvMCA1 function. This polymorphism found in catalytic residues of PvMCA1should be evaluated as new molecular marker of resistance