O carcinoma epidermóide (CE) representa mais de 90% das neoplasias malignas encontradas na boca. Em casos avançados, quando o controle locoregional já não é possível somente com o tratamento cirúrgico mais a radioterapia, a quimioterapia adjuvante e neoadjuvate torna-se uma importante modalidade de tratamento para aumentar a qualidade de vida e sobrevida desses pacientes. Eventos moleculares que ocorrem durante a carcinogênese assemelham-se àqueles observados no processo da inflamação. Dessa forma, o estudo de substâncias anti-inflamatórias pode ser um importante caminho para o desenvolvimento e aperfeiçoamento de novos agentes quimioterápicos para o câncer. O objetivo deste estudo foi verificar uma possível ação antineoplásica de 2 anti-inflamatórios naturais (óleos de Copaiba e Andiroba) e um sintético (Dexametasona) numa linhagem de carcinoma epidermóide de orofaringe (FaDu), além de verificar se há uma correlação da expressão da proteína NFkB (fator de transcrição de genes envolvidos nos processos de carcinogênese e inflamação) com a inibição da proliferação celular. Para tanto, foram feitas análises quantitativas (curvas de crescimento, curva de viabilidade celular e Western Blot) e qualitativas (imunofluorescência) antes e depois do tratamento celular com os fármacos. O grupo controle foi representado pelas mesmas células (FaDu) cultivadas na ausência dos fármacos pesquisados. Após tratamento foi observado diminuição do crescimento e da viabilidade celular promovida por todos os fármacos, porém com potenciais de ação diferentes. O óleo de Copaíba apresentou uma potente ação inibição da proliferação e indução de apoptose, este último verificado pela positividade do teste Tunel para células apoptóticas. O óleo de Andiroba e Dexametasona promoveram inibição da proliferação dessas células, mas não indução de apoptose, sendo que para o último fármaco a ação foi dependente da concentração e tempo. Também pôde-se observar uma diminuição da expressão e marcação nuclear do NFkB por western Blot e imunofluorescência, respectivamente, após tratamento com os três antiinflamatórios. Os óleos de Copaíba e Andiroba e a Dexametasona, anti-inflamatórios naturais e sintético, respectivamente, promoveram ação de inibição da proliferação celular da linhagem FaDu, tendo uma relação com os níveis diminuídos da proteína NFkB que é responsável pela regulação de genes envolvidos nos processos de proliferação e sobrevivência celular. / Squamous cell carcinoma represents more than 90% of oral cavity malignancies. In advanced cases, when locoregional control is not possible using only surgery and radiotherapy adjuvant chemotherapy may play an important role to improve the quality of life and survival of these patients. Molecular events that occur during carcinogenesis are similar to those observed in the inflammatory process. So, the study of anti-inflammatory substances may be an important way for the development of new chemotherapeutic drugs for cancer. The aim of this study was to analyze a possible antitumoral effect of 2 natural anti-inflammatory oils (Copaiba and Andiroba) and a synthetic drug (dexamethasone) in a cell lineage of oropharynx squamous cell carcinoma (FaDu). Moreover, we tried to correlate NFkB protein expression with the inhibition of cell proliferation. Drugs effects were evaluated through quantitative methods (Western Blot method, growth and cell viability curves) and qualitative analyses (Immunofluorescence methods) before and after cell treatment. The control group was represented by the same cells (FaDu) grown in the absence of the drugs studied. After treatment all drugs promoted reduced growth and cell viability but with different potential actions. Copaiba oil showed a potent anti-proliferation action and to be inductor of apoptosis; the latter checked by testing positive for Tunel apoptotic cells. Andiroba oil and Dexamethasone promoted inhibition of cell proliferation, but not induction of apoptosis. The Dexamethasone action was time and dose dependent. There was a decrease expression and nuclear staining of NFkB by Western Blot and Immunofluorescence methods, respectively, after treatment with three anti-inflammatory substances. Oils of Copaiba and Andiroba and the dexamethasone promoted inhibition of cell proliferation FaDu lineage, showing an association with the level of expression of NFkB, which regulate genes that are involved in proliferation and cell survival.

O carcinoma epidermóide (CE) representa mais de 90% das neoplasias malignas encontradas na boca. Em casos avançados, quando o controle locoregional já não é possível somente com o tratamento cirúrgico mais a radioterapia, a quimioterapia adjuvante e neoadjuvate torna-se uma importante modalidade de tratamento para aumentar a qualidade de vida e sobrevida desses pacientes. Eventos moleculares que ocorrem durante a carcinogênese assemelham-se àqueles observados no processo da inflamação. Dessa forma, o estudo de substâncias anti-inflamatórias pode ser um importante caminho para o desenvolvimento e aperfeiçoamento de novos agentes quimioterápicos para o câncer. O objetivo deste estudo foi verificar uma possível ação antineoplásica de 2 anti-inflamatórios naturais (óleos de Copaiba e Andiroba) e um sintético (Dexametasona) numa linhagem de carcinoma epidermóide de orofaringe (FaDu), além de verificar se há uma correlação da expressão da proteína NFkB (fator de transcrição de genes envolvidos nos processos de carcinogênese e inflamação) com a inibição da proliferação celular. Para tanto, foram feitas análises quantitativas (curvas de crescimento, curva de viabilidade celular e Western Blot) e qualitativas (imunofluorescência) antes e depois do tratamento celular com os fármacos. O grupo controle foi representado pelas mesmas células (FaDu) cultivadas na ausência dos fármacos pesquisados. Após tratamento foi observado diminuição do crescimento e da viabilidade celular promovida por todos os fármacos, porém com potenciais de ação diferentes. O óleo de Copaíba apresentou uma potente ação inibição da proliferação e indução de apoptose, este último verificado pela positividade do teste Tunel para células apoptóticas. O óleo de Andiroba e Dexametasona promoveram inibição da proliferação dessas células, mas não indução de apoptose, sendo que para o último fármaco a ação foi dependente da concentração e tempo. Também pôde-se observar uma diminuição da expressão e marcação nuclear do NFkB por western Blot e imunofluorescência, respectivamente, após tratamento com os três antiinflamatórios. Os óleos de Copaíba e Andiroba e a Dexametasona, anti-inflamatórios naturais e sintético, respectivamente, promoveram ação de inibição da proliferação celular da linhagem FaDu, tendo uma relação com os níveis diminuídos da proteína NFkB que é responsável pela regulação de genes envolvidos nos processos de proliferação e sobrevivência celular. / Squamous cell carcinoma represents more than 90% of oral cavity malignancies. In advanced cases, when locoregional control is not possible using only surgery and radiotherapy adjuvant chemotherapy may play an important role to improve the quality of life and survival of these patients. Molecular events that occur during carcinogenesis are similar to those observed in the inflammatory process. So, the study of anti-inflammatory substances may be an important way for the development of new chemotherapeutic drugs for cancer. The aim of this study was to analyze a possible antitumoral effect of 2 natural anti-inflammatory oils (Copaiba and Andiroba) and a synthetic drug (dexamethasone) in a cell lineage of oropharynx squamous cell carcinoma (FaDu). Moreover, we tried to correlate NFkB protein expression with the inhibition of cell proliferation. Drugs effects were evaluated through quantitative methods (Western Blot method, growth and cell viability curves) and qualitative analyses (Immunofluorescence methods) before and after cell treatment. The control group was represented by the same cells (FaDu) grown in the absence of the drugs studied. After treatment all drugs promoted reduced growth and cell viability but with different potential actions. Copaiba oil showed a potent anti-proliferation action and to be inductor of apoptosis; the latter checked by testing positive for Tunel apoptotic cells. Andiroba oil and Dexamethasone promoted inhibition of cell proliferation, but not induction of apoptosis. The Dexamethasone action was time and dose dependent. There was a decrease expression and nuclear staining of NFkB by Western Blot and Immunofluorescence methods, respectively, after treatment with three anti-inflammatory substances. Oils of Copaiba and Andiroba and the dexamethasone promoted inhibition of cell proliferation FaDu lineage, showing an association with the level of expression of NFkB, which regulate genes that are involved in proliferation and cell survival.

La participation de HNF4[alpha] à la réponse inflammatoire se manifeste par différents rôles, notamment par la régulation transcriptionnelle du cytochrome P450, de l'oxyde nitrique synthase inductible, mais également par la protection face aux maladies inflammatoires de l'intestin (MII). En effet, la perte de HNF4[alpha] au niveau de l'épithélium intestinal de souris rend celles-ci plus sensibles face à l'induction d'une colite chimique. Également, l'expression de HNF4[alpha] est perdue au niveau des tissus coliques de patients atteints de maladies inflammatoires de l'intestin, dont la colite ulcéreuse. Les MII sont caractérisées par une activation chronique de la réponse immune et inflammatoire le long du tractus gastro-intestinal. L'agent causal est, dans la majorité des cas, la flore intestinale, laquelle peut activer plusieurs réponses inflammatoires, telle la sécrétion abondante de cytokines et d'interleukines pro-inflammatoires ainsi que le recrutement et l'infiltration de cellules immunitaires à l'épithélium, causant des dommages importants à la muqueuse intestinale et menant ainsi à une augmentation de la perméabilité de l'épithélium intestinal. La perte de HNF4[alpha] au niveau de l'épithélium colique de souris a mené à l'apparition spontanée d'inflammation, à l'infiltration massive de cellules leucocytaires et a révélé une augmentation de la production de plusieurs facteurs pro-inflammatoires, dont la chimiokine KC/CXCL1. Cette molécule est en fait un chimioattractant important pour les neutrophiles et autres cellules leucocytaires. Dans cette optique, nous avons évalué, par immunobuvardage et gel de rétention, l'impact d'un stress pro-inflammatoire sur l'expression et l'activité de HNF4[alpha]. Nous avons également déterminé l'effet de l'expression de HNF4[alpha] sur la production de KC/CXCL 1 ainsi que les mécanismes de régulation de HNF4[alpha] sur l'expression de la chimiokine. Nous avons quantifié, par qPCR et par ELISA, la production et la sécrétion de KC/CXCL1 par les différentes lignées de cellules épithéliales intestinales surexprimant le facteur de transcription HNF4[alpha]. Aussi, nous avons montré l'influence de HNF4[alpha] sur l'activation de NF[kappa]B, puisque ce facteur est responsable de la régulation transcriptionnelle de KC/CXCL1. Nous avons, en effet, montré que l'activation par phosphorylation, la translocation nucléaire et la capacité de liaison à l'ADN de NF[kappa]B sont diminuées dans les modèles cellulaires de surexpression de HNF4[alpha]. Nous avons finalement évalué l'effet de HNF4[alpha] sur la dégradation de l'inhibiteur de kappaB (I[kappa]B[alpha]). Dans cette étude, nous avons montré que le facteur de transcription HNF4[alpha] régule de façon négative la production de la chimiokine KC/CXCL1 en modulant l'activité transcriptionnelle de NF[kappa]B via la stabilisation de l'inhibiteur I[kappa]B.

The nuclear factor kappa B (NFKB) signalling pathway is essential in the establishment and propagation of inflammation in the intestine. An increased number of cells, predominantly of the macrophage and intestinal epithelial cell (IEC) type, are known to contain the active form of the NF1d3-p65 subunit in inflamed and noninflamed intestinal tissue from Crahn's disease (CD) patients, though this remains to be confirmed. However the stimuli that induce NFKB activation in IECs and the mechanism of NFKB activation in macrophages, are only poorly understood. As such, this thesis has investigated the NFKB signalling pathway and its role in intestinal inflammation. Increased levels of NFKB DNA-binding activity and inhibitor kappa B alpha (IKBa) protein levels were found in both inflamed and non-inflamed intestinal tissue from CD patients. However, Bcl-3 levels did not significantly change. In HeLa Ohio cells, a human mucosal epithelial cell line, interleukin-l ~ (IL-l ~), lipopolysaccharide (LPS) and Phorbol 12-myritate I3-acetate (PMA) were shown to induce NFKB activation. However, when these same stimuli were used in another human IEC line, Caco-2, little NFKB-mediated gene expression was observed unless a combination of stimuli, IL-l~, LPS and tumour necrosis factor alpha (TNFa), was used. In RAW 264.7 cells, a murine macrophage cell line, LPS-stimulated NFKBmediated NO production was shown to involve protein kinase C epsilon (PKCc). Subsequently, PKC€ protein levels were also shown to be up-regulated in inflamed intestinal tissue from TNBS-treated rats. This was associated with increased NFlcB activation and IKBa protein levels, increases that were absent in non~inflamed tissue from TNBS-treated rats. In addition, IKB~ and Bcl-3 protein levels did not differ between inflamed and non-inflamed tissues, although they did vary with intestinal region. In conclusion, this study shows that abnormal NFKB activation and IKBa expression occurs in CD, and also suggests increased NFKB activation IKBa expression can coexist within inflamed intestinal tissue. In addition, the IEC line Caco-2 is shown to be relatively unresponsive to NFKB activation. In the macrophage cell line, RAW 264.7, PKC£ is involved in NFKB-mediated gene expression, and PKC£ protein levels are increased in the inflamed, TNBS-treated, intestine.

The female genital tract is a mucosal epithelium that has an array of factors contributing to the cervicovaginal immune environment. Like with systemic immunity, innate and adaptive immune mediators are integrated in the efficiency for fighting infections in the female genital tract. Our study addresses the role of pregnancy and HIV infection on concentrations of cytokines in genital tract fluid that play a role in HIV sexual transmission. We focused on two pathways: The NF-KB inflammation pathway that has been implicated in susceptibility to HIV infection, and two interferon pathways that have been associated with antiviral immune defense. We hypothesized that pregnant women have increased proinflammatory cytokines in genital secretions, potentially putting them at increased risk for HIV infection, and that HIV-infected women could have upregulated Type 1 interferon pathways that may regulate HIV replication in the genital tract, and infection by other viruses. This study compared the immune mediator profiles in genital secretions of women between the ages of 18 and 40 years old belonging to four groups: HIV Negative/ Non Pregnant, HIV Negative/Pregnant, HIV Positive/ Non Pregnant, and HIV positive/ pregnant. Cytokine concentrations in cervicovaginal lavage fluid were measured using ELISA and MAGPIX assays. A number of statistical methods were used to characterize cytokine pathways and to link pathway associated cytokines to HIV serostatus and/or pregnancy. The study showed that HIV positive women had higher levels of proinflammatory cytokines including IL-1α, IL-2RA, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-17, MIF, MIG, MIP-1ß, SCGF, TNF-α, and TRAIL. Only the antimicrobial peptide lysozyme was significantly decreased in HIV positive women. However, lysozyme was significantly increased in pregnant women where as the following cytokines were significantly decreased in pregnant women: ß-NGF, G-CSF, GM-CSF, GRO-α, HGF, IGN-α2, IFN-γ, IL-2RA, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, IL-13, IL-16, IL-17, TNF-α, TRAIL. The correlation analysis showed that HIV positive nonpregnant women could have upregulated: NFκB, type I interferon and interferon-γ pathways. The correlation analysis showed that the NFκB pathway could be upregulated in pregnant HIV negative women and these findings suggest that vaginal inflammation may play a role in HIV transmission from HIV-infected women to uninfected pregnant women. Moreover, upregulated interferon pathways could help understand how the body regulates genital viral infections in HIV-infected women.

Obesity is a known risk factor for breast cancer. Since obesity rates are constantly rising worldwide, understanding the molecular details of the interaction between adipose tissue and breast tumors becomes an urgent task. To investigate potential molecular changes in breast cancer cells induced by co-existing adipocytes, we used a co-culture system of different breast cancer cell lines (MCF-7 and T47D: ER+/PR+/HER2- and MDA-MB-231: ER-/PR-/HER2-) and murine 3T3-L1 adipocytes. Here, we report that co-culture with adipocytes revealed distinct changes in global gene expression pattern in the different breast cancer cell lines. Our microarray data revealed that in both ER+ cell lines, top upregulated genes showed significant enrichment for hormone receptor target genes. In triple-negative MDA-MB-231 cells, co-culture with adipocytes led to the induction of pro-inflammatory genes, mainly involving genes of the Nf-κB signaling pathway. Moreover, co-cultured MDA-MB-231 cells showed increased secretion of the pro-inflammatory interleukins IL-6 and IL-8. Using a specific NF-κB inhibitor, these effects were significantly decreased. Finally, migratory capacities were significantly increased in triple-negative breast cancer cells upon co-culture with adipocytes, indicating an enhanced aggressive cell phenotype. Together, our studies illustrate that factors secreted by adipocytes have a significant impact on the molecular biology of breast cancer cells.:1. Einleitung ......................................................................................................... 4 1.1 Übergewicht und Adipositas – die Volkskrankheit des 21. Jahrhunderts ........ 4 1.2 Fettgewebe – Fett ist nicht gleich Fett ........................................................... 5 1.3 Fehlfunktionen des Fettgewebes bei Adipositas ............................................ 6 1.4 Der Zusammenhang zwischen Adipositas und Krebs ..................................... 7 1.4.1 Adipositas und die Tumormikroumgebung .................................................. 7 1.4.2 Adipositas-induzierte Inflammation und Krebs ............................................. 9 1.4.3 Die Insulin-IGF1-Achse................................................................................11 1.4.4 Östrogen-Synthese in adipösem Fettgewebe ............................................12 1.4.5 Tumorzellmetabolismus ..............................................................................12 1.5 Ziele der Arbeit ............................................................................................. 14 2 Publikation ...................................................................................................... 15 3 Zusammenfassung der Arbeit ......................................................................... 29 4 Literaturverzeichnis.......................................................................................... 34 5 Anlagen ........................................................................................................... 43 5.1 Supplemental Material .................................................................................. 43 5.1.1 Supplemental Figures ................................................................................45 5.1.2 Supplemental Tables ..................................................................................51 5.2 Erklärung über den wissenschaftlichen Beitrag des Promovenden zur Publikation ......................................................................................................... 66 5.3 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen und Symbole ............................ 67 5.4 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit .............................. 69 5.5 Lebenslauf ................................................................................................... 70 5.6 Publikationsverzeichnis ................................................................................ 72 5.7 Vorträge und Posterpräsentationen mit publizierten Abstracts ..................... 73 5.8 Danksagung ................................................................................................. 74

HIV infection has been shown to predispose patients to accelerated development of heart disease. One mechanism for this pathology may involve endothelial activation either by HIV itself or by its secreted proteins, gp120 (a viral envelope protein) and tat (a protein that upregulates transcription of viral genes). We have studied the effects of gp120 and tat on signaling and production of inflammatory cytokines by Human Pulmonary Artery Endothelial Cells (HPAEC). HPAEC were stimulated at varying time points with combinations of gp120, tat, and monokines (IL-1β and TNFα). Cell lysate fractions were analyzed for MAP Kinase activity and NFκB activation, and culture supernatants were assayed for inflammatory cytokines (IL-6 and IL-8). The production of IL-6 and IL-8 was significantly enhanced by tat but not by gp120. Both gp120 and tat, however, induced significant morphological changes in HPAEC. The only synergy noted was between high levels of tat and TNFα acting on the production of IL-6. When HPAEC were stimulated with IL-1β and TNFα, peak phosphorylation of p38 MAP Kinase was found at 45 minutes, while NFκB was maximally activated at two hours. Both the ERK1,2 and p38 cascades of MAP Kinase were activated by tat, and an increase in NFκB phosphorylation and translocation were noted. We conclude that the HIV tat protein could be involved in inflammatory changes in endothelium leading to the accelerated development of heart disease in HIV patients.

Die Inzidenz des ösophagealen Adenokarzinoms (EAC) ist in den letzten Jahrzehnten in Ländern mit hohem durchschnittlichem Einkommen gestiegen, ohne dass sich die Prognose dieser Erkrankung wesentlich verbessert hat. Der größte Teil der EAC wird erst in fortgeschrittenem Stadium diagnostiziert. Bei bereits fortgeschrittenen, aber noch operablen Karzinomen muss zusätzlich zur Ösophagusresektion noch eine perioperative Chemotherapie durchgeführt werden, bei welcher das FLOT-Schema angewendet wird. Dabei bekommen die Patient:innen die Chemotherapeutika 5-Fluoruracil, Oxaliplatin und Docetaxel und Leucovorin. In diesen Fällen liegt das 3-Jahres-Überleben trotz der sehr belastenden Therapie nur bei 57%. Auch bei bereits inoperabel fortgeschrittenen Karzinomen kommen in palliativer Intention eine (Poly-)Chemotherapie, beispielsweise mit Oxaliplatin, Cisplatin und/oder 5-Fluorouracil, und weitere symptomlindernde Maßnahmen zum Einsatz. Das Ansprechen auf die Chemotherapie ist über alle Erkrankungsstadien hinweg individuell sehr unterschiedlich und kann bisher nur schlecht vorhergesagt werden. Die Gründe des Inzidenzanstiegs des EAC sind ebenfalls noch weitgehend unklar. Wahrscheinlich spielt der Lebensstil eine entscheidende Rolle: Tabakrauchen und Übergewicht gehören zu den Hauptrisikofaktoren des EAC und begünstigen die Entstehung einer gastroösophagealen Refluxerkrankung (GERD). Die Refluxerkrankung selbst kann wiederum zu einem Barrett-Ösophagus, der Präkanzerose des EAC, führen. Dieser Progress führt auf histologischer Ebene von der Barrett-Metaplasie über die Dysplasie zum Karzinom und wird auch Barrett-Sequenz genannt. Da die GERD als Hauptrisikofaktor gilt und eine verminderte Säureproduktion des Magens durch PPI-Therapie oder eine H. pylori Infektion vor der Entstehung eines EACs schützt, ist die Untersuchung der Auswirkungen des pH-Wertes auf die ösophageale Schleimhaut von zentraler Bedeutung. Die Schleimhaut wird durch die Magensäure geschädigt und reagiert mit einer Inflammationsreaktion, welche chronifizieren kann und zur Einwanderung von Immunzellen, Zytokinfreisetzung und ROS-Akkumulation führt. Ist die Zelle einer repetitiven Säureexposition ausgesetzt, werden Signalwege aktiviert, welche vor den schädigenden Auswirkungen der ROS, der Inflammationsreaktion und vor Apoptose schützen. Bei langfristiger dauerhafter Aktivierung dieser Signalwege wird der Zellmetabolismus protumorigen verändert und Mutationen akkumulieren, ohne dass sie repariert werden oder die Zelle stirbt. Hält dieser Ausnahmezustand über lange Zeit an erhöht sich das Risiko für eine Barrett-Metaplasie und eine Progression zum EAC. Die durch den Reflux von Magensäure hervorgerufenen molekularen Veränderungen des Nrf2- und NFκB-Signalwegs über die verschiedenen Stadien der Entwicklung des EAC sind Gegenstand dieser Arbeit. Der Nrf2-Signalweg wird durch zellulären und oxidativen Stress aktiviert und führt über die Aktivierung der ARE-Regionen in der DNA zur verstärkten Transkription verschiedener Enzyme. Dabei wird unter anderem die Expression von Enzymen aller drei Phasen der Biotransformation, für Schlüsselenzyme des Glukose-, Lipid- und Aminosäurestoffwechsels und der Redox-Homöostase hochreguliert. In gesunden Zellen führt dies zum Schutz vor dem Absterben durch externe Stressoren. Ist der Nrf2-Signalweg jedoch dauerhaft aktiv, führt er zur Reprogrammierung des Zellmetabolismus und begünstigt so die Entstehung von Krebs. Der NFκB-Signalweg ist einer der wichtigsten Signalwege für die Regulierung von Zellstoffwechsel, Inflammationsreaktionen und Apoptose. Die erhöhte Expression von NFκB wurde bereits in mehreren Krebsarten, so auch im EAC, nachgewiesen. Der Mechanismus der Inflammation ist ebenfalls in die Progression der Barrett-Sequenz involviert. Um die Auswirkungen von Säure auf Zellen der ösophagealen Schleimhaut in verschieden Stadien der Krebsentstehung detaillierter zu untersuchen, wurde ein in vitro Modell aus sechs immortalisierten Zelllinien genutzt, welches die Barrett-Sequenz abbilden soll. Zwei der Zelllinien repräsentieren gesunde ösophageale Schleimhaut (EPC1 und EPC2), eine repräsentiert die Metaplasie (CP-A), eine die Dysplasie (CP-B) und weitere zwei Zelllinien stammen von Patient:innen mit EAC in verschiedenen Stadien (OE33 im UICC Stadium IIa und OE19 im UICC Stadium III). Zusätzlich kam ein 3D-Zellkulturmodell zum Einsatz, bei welchem EPC2 als Epithelzellschicht auf einer Schicht aus Fibroblasten in Matrigel kultiviert und anschließend histologisch aufgearbeitet und gefärbt wurden. Der Reflux von Magensäure und die damit einhergehende Veränderung des Umgebungsmilieus der Zellen wurde durch Ansäuern des Zellkulturmediums mit Salzsäure simuliert. Anhand dieses Modells konnte die Reaktion auf saure pH-Werte in verschiedenen Refluxsimulationsexperimenten untersucht werden. Sowohl die Viabilität der Zelllinien als auch die Aktivität des Nrf2- und NFκB-Signalwegs unterschieden sich dabei deutlich. Das Überleben der Zellen unter Behandlung mit saurem Medium ist grundsätzlich abhängig von der Expositionsdauer und dem pH-Wert. Die Zelllinien in einem fortgeschrittenen Stadium der Barrett-Sequenz zeigten zudem im Vergleich ein besseres Überleben in der Refluxsimulation und sind resistenter gegenüber sauren pH-Werten als die Zelllinien, welche gesunder Schleimhaut entstammen. In 3D Kulturen wird die Epithelschicht histologisch sichtbar durch die Refluxsimulation geschädigt. Die Genexpression von Nrf2 selbst und seinem Downstreamtarget HO1 konnte mittels qPCR für die Zelllinien bzw. Immunhistochemie gegen HO1 für die 3D-Kulturen gezeigt werden. Bei den physiologischen und meta- bzw. dysplastischen Zelllinien zeigte sich keine Veränderung der Nrf2-Expression nach einer zweitägigen Refluxsimulation. Die Expression von HO1 stieg jedoch bei allen Zelllinien an. In histologischen Schnitten der 3D-Kultur mit EPC2 kann im Vergleich zur Kontrolle ebenfalls eine Hochregulation des Nrf2-Downstream-Moleküls HO1 gezeigt werden. Dieser HO1-Anstieg spricht für eine normale Aktivierung des Nrf2-Signalweges nach einem auslösenden Ereignis, die noch nicht zu einer dauerhaften Erhöhung der Nrf2-Expression führt. In den beiden EAC-Zelllinien wurde die Aktivität des Nrf2-Signalweges nach Säurestimulation zusätzlich auf weiteren Ebenen untersucht. Die Konzentration von nukleärem Nrf2 konnte mittels Western Blot bestimmt werden und die Transkriptionsaktivität in ARE wurde mittels Luciferase-Assay nachgewiesen. Die Aktivierung des NFκB-Signalweges wurde ebenfalls mit Western Blots untersucht. Bei der Zelllinie OE33 im UICC-Stadium II steigen sowohl die nukleäre Nrf2- Konzentration als auch die Luciferase-Aktivität nach der Säurestimulation an. Auch die Nrf2- und die HO1-Expression waren im Vergleich zur Kontrolle signifikant erhöht. Die nukleäre NFκB-Konzentration war nach der Refluxsimulation stark erhöht. Bei der Zelllinie OE19 im UICC-Stadium III konnte nach der Säurestimulation ebenfalls eine signifikante Konzentrationserhöhung von Nrf2 im Zellkern nachgewiesen werden. Die mittels Luciferase-Assay untersuchte ARE-Aktivität und das Expressionslevel von Nrf2 und HO1 im Vergleich zur Kontrolle zeigten jedoch keine Veränderung. Die nukleäre NFκB-Konzentration war zwar signifikant erhöht, der Anstieg fiel jedoch deutlich geringer aus als bei OE33 Zellen. Die beiden EAC-Zelllinien wurden außerdem nach der Behandlung mit 5-Fluorouracil untersucht. Die Zelllinie OE19 ist resistent gegenüber den beiden zur Behandlung des EAC eingesetzten Chemotherapeutika 5-FU und Cisplatin. Auch eine Säureexposition ändert bei OE19 nichts an der Resistenz gegenüber 5-FU. Während bei OE33 in normalem Kulturmedium die Zellviabilität unter 5-FU deutlich sank, zeigte sie sich bei niedrigeren pH-Werten fast unverändert, so dass der Effekt des Chemotherapeutikums nahezu aufgehoben wurde. Ein Erklärungsansatz für die unterschiedliche Reaktion der beiden Zelllinien könnte sein, dass OE19 im Stadium schon weiter fortgeschritten ist als OE33. Durch den stark veränderten Krebszellmetabolismus ist die bereits maximale Aktivierung der beiden Signalwege wahrscheinlich, sodass keine Aktivierungsreserve vorhanden ist. Nrf2 wird zwar von Keap1 abgelöst und gelangt in den Zellkern, hat aber auf die untersuchten Downstreamtargets keinen weiter steigernden Effekt. Der Schutz der maximal aktivierten Signalwege vor ROS und Apoptose ist so effektiv, dass die Zellen bereits gegen 5-FU resistent sind. Bei OE33 werden jedoch durch Säurestimulation der Nrf2- und NFκB-Signalweg stark aktiviert, was in diesem Erklärungsansatz zu einem besseren Schutz der Zellen und zu einer erhöhten Chemoresistenz in saurer Umgebung führen würde.

Le syndrome périodique lié à NLRP12 (NLRP12-AD) est une maladie rare appartenant au groupe des maladies auto-inflammatoires systémiques héréditaires. Ces maladies sont causées par des anomalies du système immunitaire inné. Les cryopyrinopathies (CAPS) sont une famille de maladie auto-inflammatoire liées à des mutations gain de fonction du gène NLRP3. NLRP3 fait partie d’un composant central de l’inflammation, l’inflammasome. En 2007, Jéru et al. ont décrit un premier patient présentant des symptômes évocateurs d’un CAPS qui n’était pas porteur de mutation de NLRP3 mais présentait une mutation de NLRP12. Depuis, 33 patients pédiatriques atteints de NLRP12-AD ont été décrits dans la littérature. Les signes cliniques de la maladie sont variables et ne permettent pas d’établir de critères cliniques diagnostics fiables. La pathogénicité des mutations observées chez les patients est difficile à établir. Les patients atteints de NLRP12-AD représentent également un défi thérapeutique, un certain nombre d’entre eux ne répondant pas aux anti-IL1, un traitement pourtant efficace dans la plupart des inflammasomopathies. De nombreuses études se sont intéressées au rôle de NLPR12, qui posséderait à la fois des propriétés pro et anti-inflammatoires par sa capacité à inhiber les voies canoniques et non canoniques de NFkb mais aussi à former un inflammasome. Le rôle exact de NLRP12 reste controversé, avec des résultats différents selon les cellules ou les stimuli utilisés lors des expériences. L’objectif de notre étude est de créer un modèle in vitro fiable et reproductible afin de mieux comprendre la physiopathologie de NLRP12. Il permettra ensuite d’étudier les mutations de NLRP12 retrouvées chez des patients présentant des symptômes de maladie auto-inflammatoire pour améliorer les performances et la fiabilité du diagnostic et proposer des traitements personnalisés aux patients concernés. Nous avons créé un modèle de cellules THP1 NLRP12 KO en utilisant la technologie de CRISPR/Cas9 qui a permis d’induire une délétion homozygote à la jonction entre le 2ème intron et le 3ème exon de NLRP12, qui code pour le domaine fonctionnel de la protéine. Nos cellules KO semblent sécréter moins de cytokine pro-inflammatoire (IL-1β et TNFα) que les cellules WT, suggérant un rôle pro-inflammatoire de NLRP12 dans notre modèle. Nous avons par ailleurs décrit une cohorte nord-américaine de 17 patients porteurs de mutations de NLRP12 afin d’étudier leurs mutations et produit des vecteurs lentiviraux contenant ces mutations. Nous prévoyons d’explorer le rôle de NLRP12 sur l’activation de la voie NFkB et la formation d’un inflammasome puis de transduire nos cellules KO avec les différentes mutations de nos patients et d’analyser leurs conséquences sur ces mêmes voies et sur la sécrétion cytokinique. / NLRP12-AD is part of a new group of rheumatics’ diseases: the systemic autoinflammatory diseases. Those diseases are caused by defect or dysfunction in the innate immune system. Cryopyrin-associated periodic syndromes (CAPS) is a family of systemic autoinflammatory disease initially linked to NLRP3 gain-of-function heterozygous mutations. NLRP3 is part of a key component of inflammation, the inflammasome. In 2007, Jeru et al. described the first patient with CAPS phenotype, but without NLRP3 mutations. This patient had NLRP12 mutations. Since then, 33 pediatric patients with NLRP12-AD have been published. There is no specific clinical presentation that allow homogenous diagnosis. Determination of the causality of the mutations remains tricky. Lastly, some patients have shown resistance to anti-IL1 treatment, a medication that is highly effective in other inflammasomopathies such as CAPS, a puzzling observation as to the role of NLRP12. NLRP12 has been described with both anti- and pro- inflammatory roles, by its ability to inhibit the canonical and non-canonical NFkB pathways, but also through its hypothetic capacity to form an inflammasome. Hence, the exact role of NLRP12 remains controversial and its role might be stimuli- or cell-dependant. Our objective is to create a reliable and reproductible in vitro model to better understand the role of NLRP12. This model will then allow us to study NLRP12 mutations found in patients with auto-inflammatory symptoms. This will improve our diagnostic performance and help to offer to patients the most suitable therapy. We created NLRP12 knockout THP-1 cells by using the CRPISP-Cas 9 gene editing technology. We were able to induce a homozygous deletion at the intron 2/exon 3 junction that encodes the protein functional domain. Our KO cells seems to secrete less pro-inflammatory cytokines (IL-1β and TNFα) than WT cells. This suggests a pro-inflammatory role of NLRP12. We described a North American cohort of 17 pediatric patients with NLRP12 mutations to study their mutations in our model and produced lentiviral vectors containing those mutations. We planned to study the effects of NLRP12 on NFkB activation and on inflammasome formation. Then, we will transduce our KO cells with the patient’s mutations and compare their consequences on inflammation pathways and cytokine secretion.

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