A esclerose múltipla é a principal doença desmielinizante do sistema nervoso central (SNC). É considerada a principal causa de incapacidade neurológica em adultos jovens. O comprometimento cognitivo é muito comum nessa doença, envolvendo o aprendizado, a memória e a organização cortical do movimento, funções vitais que são reguladas pelo sistema colinérgico. O modelo de desmielinização tóxica induzida pelo brometo de etídio (BE) foi utilizado neste estudo, para avaliar a atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE) no estriado (ST), hipocampo (HP), córtex cerebral (CC), hipotálamo (HY) e ponte (PN) associado ao tratamento com interferon beta (IFN-b), ciclosporina A (CsA), vitamina E (vit E) e ebselen (Ebs). Além disso, também foi investigado o efeito in vitro do BE na atividade da AChE, juntamente com os parâmetros cinéticos dessa enzima no ST, HP, CC e CB de ratos adultos. Os resultados demonstraram que o BE inibiu significativamente a atividade da AChE no ST, HP, CC e CB nas concentrações de 0,00625, 0,0125, 0,025, 0,05 e 0,1mM e a análise dos dados cinéticos mostraram uma inibição do tipo incompetitiva no ST, HP e CC, enquanto no CB a inibição foi do tipo mista. No estudo in vivo, foi observado uma inibição na atividade da AChE no CC, ST, HP, HY, PN e CB nos diferentes períodos avaliados pós-injeção do BE (3, 7, 15, 21 e 30 dias). Quando ratos desmielinizados com BE foram tratados com IFN-b e CsA, não houve alteração na atividade dessa enzima. Por outro lado, o tratamento com Vit E e Ebs foram capazes de aumentar a atividade da AChE no ST, CC e HP. Estudos imuno-histoquímicos demonstraram que nos ratos tratados com Vit E e Ebs as lesões induzidas pelo BE foram menores, sugerindo que estes compostos interferem no desenvolvimento de lesões desmielinizantes. Foi também avaliado o efeito per se do IFN-b, da CsA, da Vit E e do Ebs na atividade da AChE, os quais demonstraram um efeito inibitório sobre a atividade dessa enzima. Em plaquetas de ratos desmielinizados, foi observado uma diminuição na atividade da NTPDase e o tratamento com a Vit E e o Ebs modularam a hidrólise dos nucleotídeos de adenina. O presente trabalho demonstrou que o BE é um potente inibidor da atividade da AChE in vitro e os resultados in vivo demonstraram que a atividade dessa enzima está alterada após um evento de desmielinização tóxica no SNC. Os resultados deste estudo ajudaram a confirmar que drogas utilizadas no tratamento de pacientes com esclerose múltipla tais como o IFN-b e a CsA causam efeitos na atividade da AChE. A Vit E e o Ebs, além de demonstrarem uma interação com a neurotransmissão colinérgica, também modularam a hidrólise dos nucleotídeos de adenina em plaquetas de ratos, contribuindo no controle da coagulação plaquetária em processos desmielinizantes. Neste contexto, sugere-se que o IFN-b, a CsA, a vitamina E e o ebselen podem ser investigados em estudos futuros com a intenção de encontrar uma melhor terapia para beneficiar pacientes com patologias desmielinizantes. / Multiple sclerosis is the main demyelinating disease of the central nervous system (CNS). It is the most common cause of neurological disability among young adults. The cognitive impairment is very commum in this illness, involving learning, memory and cortical organization of the movement, vital functions regulated by the cholinergic system. The model of toxic demyelination induced by ethidium bromide (EB) was used to evaluate brain acetylcholinesterase (AChE) activity in the striatum (ST), hippocampus (HP), cerebral cortex (CC), cerebellum (CB), hypothalamus (HY) and pons (PN), associated with treatment with interferon beta (IFN-b), ciclosporine A (CsA), vitamin E (Vit E) and ebselen (Ebs). In addition, the per se effect of EB on AChE activity was studied in vitro together with the kinetic parameters of this enzyme in the ST, HP, CC and CB of adult rats. The results showed that EB in vitro significantly inhibited AChE activity in the ST, HP, CC and CB at concentrations of 0.00625, 0.0125, 0.025, 0.05 and 0.1mM. The kinetic analysis demonstrated an uncompetitive inhibition in the ST, HP and CC, whereas in the CB the inhibition type was mixed. In relation to the in vivo results, AChE activity was inhibited after demyelination by EB in the CC, ST, HP, HY, PN and CB at the post-injection points of time evaluated (3-7-15-21 and 30 days). When demyelinated rats were submitted to the treatment with IFN-b and CsA, the results demonstrated that these compounds did not alter AChE activity. However, Vit E and Ebs were able to increase AChE activity in the ST, CC and HP. In addition, immunohistochemistry studies demonstrated that in Vit E and Ebs treated rats, the lesions induced by EB were smaller suggesting that these compounds somehow interfered in the development of the lesions. The per se effect of IFN-b, CsA, Vit E and Ebs were also evaluated, demonstrating that these compounds have an inhibitory effect on AChE activity. Platelets of the demyelinated rats demonstrated a reduction in NTPDase activity and the treatments with Ebs and Vit E modulated adenine nucleotide hydrolysis. The present investigation demonstrated that EB is a strong inhibitor of AChE activity in vitro and the results in vivo showed that the activity of this enzyme is altered after an event of toxic demyelination in the CNS. The results this study help the confirm that drugs used in the treatment of the patients with multiple sclerosis such as IFN-b and CsA cause effects in the AChE activity. The Vit E and Ebs besides of interaction with the cholinergic neurotransmission also modulated adenine nucleotide hydrolysis in platelets of the rats, contributing to the control of the platelet coagulant status in the demyelinating process. In this context, we can suggest that IFN-b, CsA, Vit E and Ebs may be investigated in future studies with the intention of finding a better therapy for to improve patients with demyelinating pathologies.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Diabetes mellitus is a major public health problem throughout the world. Besides the most common complications in the peripheral nervous system, diabetes may also cause a series of cognitive, structural and functional alterations in the central nervous system (CNS). Acetylcholinesterase (AChE), NTPDase and 5 -nucleotidase are important enzymes involved in neurotransmission and alterations in their activities have been observed in various diseases including diabetes. Resveratrol is a polyphenol abundant in grapes and red wine that possesses many biological activities such as antioxidant, anti-inflammatory and neuroprotective. In this context, the objective of the present study was to investigate the effect of resveratrol on the activity of the enzymes AChE, NTPDase and 5 -nucleotidase in the brain from streptozotocin (STZ) -induced diabetic rats. Furthermore, the effects of diabetes and resveratrol on memory were investigated through the inhibitory avoidance test. The following groups were studied: Control/saline; Control/RV 10 mg/kg; Control/RV 20 mg/kg; Diabetic/saline; Diabetic/RV 10 mg/kg; Diabetic/RV 20 mg/kg. The animals were treated during 30 days after which time they were sacrificed and samples were collected for enzymatic assays. The results demonstrated that AChE activity in the supernatant of cortex, striatum, hippocampus, cerebellum, hypothalamus and cerebral cortex synaptosomes were increased in the diabetic/saline group compared to the control/saline group. Treatment with resveratrol prevented the increase of AChE activity in the diabetic/RV 10 and diabetic/RV 20 groups. When resveratrol was administered per se, a decrease in AChE activities was observed in the cortex, striatum and hippocampus in the control/RV 10mg/kg and control/RV 20 groups. In the inhibitory avoidance test, a decrease in step down latency was observed in the diabetic/saline group and the treatment with resveratrol prevented this increase in the diabetic /RV 10 and diabetic/RV 20 groups. In relation to NTPDase and 5 - nucleotidase, an increase in the activities was observed in the diabetic/saline group. Treatment with resveratrol produced a more pronounced increase in the activities of these enzymes in the diabetic /RV 10 and diabetic/RV 20 groups. When administered per se, resveratrol also triggered an increase in NTPDase and 5 -nucleotidase. The results obtained in the present study demonstrate that AChE, NTPDase and 5 - nucleotidase activities are altered in diabetic rats and treatment with resveratrol was able to modulate the activity of these enzymes, indicating that this compound may be promising in the treatment of disorders in the cholinergic and purinergic neurotransmission in the diabetic state. / O diabetes mellitus é um dos maiores problemas de saúde pública no mundo. Além das principais complicações no sistema nervoso periférico o diabetes pode também causar uma série de alterações cognitivas, funcionais e estruturais no sistema nervoso central (SNC). A acetilcolinesterase (AChE), NTPDase e 5 -nucleotidase são importantes enzimas envolvidas na neurotransmissão e alterações na sua atividade tem sido encontradas em várias doenças incluindo o diabetes. O resveratrol é um polifenol abundante em uvas e no vinho tinto, e possui muitas atividades biológicas como antioxidante, antiinflamatória e neuroprotetora. Neste contexto, o objetivo do presente estudo foi investigar o efeito do resveratrol na atividade das enzimas AChE, NTPDase e 5 -nucleotidase em encéfalo de ratos diabéticos induzidos com estreptozotocina. Além disso, foi investigado o efeito do diabetes e do resveratrol na memória através do teste de esquiva inibitória. Os seguintes grupos foram estudados (n=8-13): Controle/salina; Controle/RV 10mg/kg; Controle/RV 20 mg/kg; Diabético/salina; Diabético/RV 10 mg/kg; Diabético/RV 20 mg/kg. O tratamento foi realizado por 30 dias e após este período os animais foram sacrificados e as amostras coletadas para os ensaios enzimáticos. Os resultados demonstraram que a atividade da AChE em sobrenadante de córtex, estriado, hipocampo, cerebelo, hipotálamo e em sinaptossomas de córtex cerebral está aumentada no grupo diabético/salina comparado para o grupo controle/salina. O tratamento com resveratrol foi capaz de prevenir o aumento da atividade da AChE nos grupos diabético/RV 10 e diabético/RV 20. Quando o resveratrol foi administrado per se um decréscimo na atividade da AChE no córtex estriado e hipocampo nos grupos controle/RV 10; controle/RV 20 foi observado comparado com o grupo controle /salina. Na tarefa de esquiva inibitória um decréscimo no tempo de latência foi observado no grupo diabético/salina e o tratamento com resveratrol preveniu este decréscimo nos grupos diabético/RV 10 e diabético/RV 20. Em relação a NTPDase e 5 -nucleotidase um aumento na atividade foi observado no grupo diabético/salina comparado para o grupo controle/salina. O tratamento com resveratrol potencializou o aumento na atividade destas enzimas nos grupos diabético/RV 10 e diabético/RV 20. Quando administrado per se, o resveratrol também provocou um aumento na atividade da NTPDase e da 5 -nucleotidase. Os resultados obtidos no presente estudo demonstram que a atividade da AChE, NTPDase e 5 -nucleotidase está alterada em ratos diabéticos e o tratamento com resveratrol foi capaz de modular a atividade destas enzimas indicando que este composto pode ser promissor no tratamento de desordens na neurotransmissão colinérgica e purinérgica causadas no estado diabético.

A poluição ambiental por metais pesados tem aumentado muito devido às ações antropogênicas tais como as atividades industriais e o uso de fertilizantes fosfatados na agricultura. Entre os metais tóxicos encontrados no meio ambiente, o cádmio (Cd) é um dos que apresenta maior interesse clínico, uma vez que as intoxicações por esse metal são de difícil tratamento. O Cd pode afetar vários órgãos como o fígado, rins, pulmões, ovários, ossos, testículos e cérebro. A toxicologia do Cd é extremamente complexa e tem sido amplamente estudada, mas ainda não está completamente esclarecida. Sendo assim, o objetivo da presente tese foi investigar os efeitos da intoxicação por Cd sobre parâmetros comportamentais e memória, bioquímicos, hematológicos e a bioacumulação desse metal em diferentes tipos celulares de ratos expostos ao cloreto de Cd (CdCl2) ou ao Cd proveniente de batatas contaminadas, e ainda utilizar o antioxidante N-acetilcisteína (NAC) no tratamento deste tipo de intoxicação buscandose avaliar o seu possível efeito protetor. Para tal, foram realizados dois experimentos: a) ratos machos Wistar adultos foram expostos oralmente a 2 mg/kg de Cd e/ou 150 mg/kg de NAC, um dia sim e outro não, durante um período experimental de 30 dias; b) ratos machos Wistar recém desmamados ingeriram, durante 5 meses, dieta a base de bolo contendo 1, 5 ou 25 mg/kg de CdCl2 ou Cd presente em tubérculos de batatas crescidas na presença de 10 μM de CdCl2. A partir desses experimentos pode-se concluir que: a) A intoxicação por CdCl2 causa aumento na concentração de Cd nas estruturas cerebrais (cerebelo, estriado, hipotálamo, hipocampo e córtex cerebral), nos níveis de peroxidação lipídica e na atividade da enzima AChE nas diferentes estruturas cerebrais estudadas ocasionando prejuízos à memória dos ratos. Além disso, a NAC é capaz de diminuir os níveis de peroxidação lipídica e subsequentemente restaurar a atividade da AChE modulando assim, a neurotransmissão colinérgica e melhorando os processos cognitivos. Sendo assim, sugere-se que a NAC possa ser um fármaco promissor em terapias alternativas contra a neurotoxicidade induzida pelo Cd; b) A exposição ao CdCl2 promove um aumento na concentração de Cd no plasma, baço e timo, causa danos hematológicos, não altera a atividade da enzima NTPDase em linfócitos, diminui a atividade da AChE em linfócitos e sangue total bem como da BChE em soro de ratos. Além disso, a NAC foi eficaz em diminuir os efeitos danosos do Cd provavelmente por diminuir os níveis de Cd nos órgãos linfóides, reverter ou amenizar os danos hematológicos e relacionados aos leucócitos mesmo sem alterar a atividade das enzimas colinesterases; c) O CdCl2 aumenta a hidrólise de nucleotídeos de adenina em sinaptossomas de córtex cerebral e diminui em plaquetas de ratos. Provavelmente, o aumento na atividade das enzimas NTPDase e 5’-nucleotidase no SNC causado pelo Cd seja uma resposta compensatória do organismo uma vez que a rápida hidrólise de ATP e ADP favorece a produção de adenosina, uma molécula neuroprotetora. Por outro lado, em plaquetas o Cd causou uma diminuição na atividade da NTPDase e, não alterou a atividade da 5’-nucleotidase sugerindo que a possível elevação no nível de ATP e ADP conduza a um estado hipercoagulável nos ratos intoxicados por esse metal. Além disso, a NAC restaura a atividade dessas enzimas no SNC, mas não apresenta interferência sobre elas em plaquetas; d) A dieta prolongada com CdCl2 ou com Cd proveniente de batatas contaminadas ocasiona aumento no comportamento de ansiedade e prejuízo à memória de ratos o que provavelmente, seja resultado de uma concentração aumentada de Cd e de uma atividade aumentada da AChE e diminuída da Na+,K+-ATPase em diferentes estruturas cerebrais devido a esse metal. Em linhas gerais, os resultados obtidos na presente tese demonstram que apesar de todos os mecanismos propostos pelos quais o Cd poderia afetar o comportamento continuarem a gerar controvérsia, é evidente que a exposição ao CdCl2 tanto a curto quanto a longo prazo, bem como ao Cd proveniente de batatas contaminadas interfere nas funções cerebrais aumentando a concentração de Cd, diminuindo ou aumentando a atividade da AChE, aumentando a lipoperoxidação bem como diminuindo a atividade da Na+,K+-ATPase em diferentes estruturas cerebrais, consequentemente sendo prejudicial ao comportamento animal, como memória e ansiedade. O Cd afeta sistematicamente o organismo dos animais estando presente tanto no plasma, quanto nos órgãos linfóides e no encéfalo alterando, assim, a atividade das enzimas NTPDase, 5’-nucleotidase, AChE e BChE de diferentes tipos celulares. Além disso, a NAC é capaz de reverter ou amenizar vários efeitos danosos causados pelo Cd sugerindo que este fármaco possa ser considerado após estudos adicionais um importante aliado em terapias contra a intoxicação por esse metal. / The environmental pollution by heavy metals has increased greatly due to anthropogenic activities such as industrial activities and the use of phosphate fertilizers in agriculture. Among the toxic metals found in the environment, cadmium (Cd) is a metal that presents the greatest clinical interest, since poisoning by this metal is difficult to treat. Cd may affect various organs such as liver, kidneys, lungs, ovaries, bones, testes and brain. The toxicology of Cd is extremely complex and has been widely studied, but it is not yet fully elucidated. Therefore, the objective of this thesis was to investigate the effects of Cd intoxication on memory as well as behavioral, biochemical, hematological and bioaccumulation parameters of this metal in different cell types of rats exposed to Cd chloride (CdCl2) or Cd from contaminated potatoes. Also, we investigated the antioxidant N-acetylcysteine (NAC) in the treatment of this type of poisoning seeking to evaluate its possible protective effect. Two experiments were performed: i) adult male Wistar rats were exposed orally to 2 mg/kg Cd and/or 150 mg/kg NAC, every other day for 30 days; ii) weaned male Wistar rats fed for 5 months, cake-based diet containing 1, 5 or 25 mg/kg CdCl2 or Cd present in tubers of potatoes grown in the presence of 10 μM of CdCl2. From these experiments we conclude: Firstly, CdCl2 intoxication caused an increase in the Cd concentration in brain structures (cerebellum, striatum, hypothalamus, hippocampus and cerebral cortex), in the levels of lipid peroxidation, and in the AChE activity of different brain structures studied causing damage to memory of rats. NAC was able to reduce the levels of lipid peroxidation and subsequently restore the AChE activity, modulating thereby the cholinergic transmission and improving the cognitive processes. Thus, NAC may be a promising drug for alternative therapies against neurotoxicity induced by Cd. Secondly, the exposure to CdCl2 increased the Cd concentration in plasma, spleen and thymus, caused damages in the hematological parameters, did not alter the NTPDase activity in lymphocytes as well as decreased the AChE activity in lymphocytes and whole blood and the BChE activity in serum of rats. NAC was effective in reducing the harmful effects of Cd probably by decreasing the levels of Cd in the lymphoid organs, reversing or minimizing the hematological damage and related to leukocytes even without changing the activity of cholinesterases. Thirdly, CdCl2 increases the hydrolysis of adenine nucleotides in synaptosomes of cerebral cortex and decreases in platelets of rats. The increase in the NTPDase and 5'-nucleotidase activities in CNS caused by Cd could be a compensatory response of the organism since the rapid hydrolysis of ATP and ADP favors the production of adenosine, a neuroprotective molecule. On the other hand, Cd decreased the NTPDase activity and did not alter 5'-nucleotidase activity in platelets suggesting that the possible increase in the ATP and ADP levels could lead to a hypercoagulable state in rats intoxicated with this metal. NAC restores the activity of these enzymes in the CNS, but had no interference in platelets. Finally, the prolonged diet with CdCl2 or Cd from contaminated potatoes resulted in an increased anxiety-like behavior and damaged memory of rats which was likely to be a result of the increased concentration of Cd, the increased AChE activity and decreased Na+,K+-ATPase activity in the different brain structures studied. In general, the results obtained in this thesis show that despite all the proposed mechanisms by which Cd could affect the behavior still generate controversy, it is clear that the exposure to CdCl2 at both short and long terms as well as to Cd from contaminated potatoes interferes the brain function by increasing Cd concentration, decreasing or increasing the AChE activity, increasing lipid peroxidation and decreasing Na+,K+-ATPase activity in several brain structures, thus being detrimental to the animal behavior influencing memory and anxiety. Cd affected systematically the animal body since it is present in plasma, lymphoid organs and brain, changing the activity of the enzymes NTPDase, 5'-nucleotidase, AChE and BChE of different cell types. In addition, NAC was able to reverse or ameliorate several deleterious effects caused by Cd suggesting that this drug may be, after additional studies, considered an important factor in therapies against intoxication by this metal.

A poluição ambiental por metais pesados tem aumentado muito devido às ações antropogênicas tais como as atividades industriais e o uso de fertilizantes fosfatados na agricultura. Entre os metais tóxicos encontrados no meio ambiente, o cádmio (Cd) é um dos que apresenta maior interesse clínico, uma vez que as intoxicações por esse metal são de difícil tratamento. O Cd pode afetar vários órgãos como o fígado, rins, pulmões, ovários, ossos, testículos e cérebro. A toxicologia do Cd é extremamente complexa e tem sido amplamente estudada, mas ainda não está completamente esclarecida. Sendo assim, o objetivo da presente tese foi investigar os efeitos da intoxicação por Cd sobre parâmetros comportamentais e memória, bioquímicos, hematológicos e a bioacumulação desse metal em diferentes tipos celulares de ratos expostos ao cloreto de Cd (CdCl2) ou ao Cd proveniente de batatas contaminadas, e ainda utilizar o antioxidante N-acetilcisteína (NAC) no tratamento deste tipo de intoxicação buscandose avaliar o seu possível efeito protetor. Para tal, foram realizados dois experimentos: a) ratos machos Wistar adultos foram expostos oralmente a 2 mg/kg de Cd e/ou 150 mg/kg de NAC, um dia sim e outro não, durante um período experimental de 30 dias; b) ratos machos Wistar recém desmamados ingeriram, durante 5 meses, dieta a base de bolo contendo 1, 5 ou 25 mg/kg de CdCl2 ou Cd presente em tubérculos de batatas crescidas na presença de 10 μM de CdCl2. A partir desses experimentos pode-se concluir que: a) A intoxicação por CdCl2 causa aumento na concentração de Cd nas estruturas cerebrais (cerebelo, estriado, hipotálamo, hipocampo e córtex cerebral), nos níveis de peroxidação lipídica e na atividade da enzima AChE nas diferentes estruturas cerebrais estudadas ocasionando prejuízos à memória dos ratos. Além disso, a NAC é capaz de diminuir os níveis de peroxidação lipídica e subsequentemente restaurar a atividade da AChE modulando assim, a neurotransmissão colinérgica e melhorando os processos cognitivos. Sendo assim, sugere-se que a NAC possa ser um fármaco promissor em terapias alternativas contra a neurotoxicidade induzida pelo Cd; b) A exposição ao CdCl2 promove um aumento na concentração de Cd no plasma, baço e timo, causa danos hematológicos, não altera a atividade da enzima NTPDase em linfócitos, diminui a atividade da AChE em linfócitos e sangue total bem como da BChE em soro de ratos. Além disso, a NAC foi eficaz em diminuir os efeitos danosos do Cd provavelmente por diminuir os níveis de Cd nos órgãos linfóides, reverter ou amenizar os danos hematológicos e relacionados aos leucócitos mesmo sem alterar a atividade das enzimas colinesterases; c) O CdCl2 aumenta a hidrólise de nucleotídeos de adenina em sinaptossomas de córtex cerebral e diminui em plaquetas de ratos. Provavelmente, o aumento na atividade das enzimas NTPDase e 5’-nucleotidase no SNC causado pelo Cd seja uma resposta compensatória do organismo uma vez que a rápida hidrólise de ATP e ADP favorece a produção de adenosina, uma molécula neuroprotetora. Por outro lado, em plaquetas o Cd causou uma diminuição na atividade da NTPDase e, não alterou a atividade da 5’-nucleotidase sugerindo que a possível elevação no nível de ATP e ADP conduza a um estado hipercoagulável nos ratos intoxicados por esse metal. Além disso, a NAC restaura a atividade dessas enzimas no SNC, mas não apresenta interferência sobre elas em plaquetas; d) A dieta prolongada com CdCl2 ou com Cd proveniente de batatas contaminadas ocasiona aumento no comportamento de ansiedade e prejuízo à memória de ratos o que provavelmente, seja resultado de uma concentração aumentada de Cd e de uma atividade aumentada da AChE e diminuída da Na+,K+-ATPase em diferentes estruturas cerebrais devido a esse metal. Em linhas gerais, os resultados obtidos na presente tese demonstram que apesar de todos os mecanismos propostos pelos quais o Cd poderia afetar o comportamento continuarem a gerar controvérsia, é evidente que a exposição ao CdCl2 tanto a curto quanto a longo prazo, bem como ao Cd proveniente de batatas contaminadas interfere nas funções cerebrais aumentando a concentração de Cd, diminuindo ou aumentando a atividade da AChE, aumentando a lipoperoxidação bem como diminuindo a atividade da Na+,K+-ATPase em diferentes estruturas cerebrais, consequentemente sendo prejudicial ao comportamento animal, como memória e ansiedade. O Cd afeta sistematicamente o organismo dos animais estando presente tanto no plasma, quanto nos órgãos linfóides e no encéfalo alterando, assim, a atividade das enzimas NTPDase, 5’-nucleotidase, AChE e BChE de diferentes tipos celulares. Além disso, a NAC é capaz de reverter ou amenizar vários efeitos danosos causados pelo Cd sugerindo que este fármaco possa ser considerado após estudos adicionais um importante aliado em terapias contra a intoxicação por esse metal. / The environmental pollution by heavy metals has increased greatly due to anthropogenic activities such as industrial activities and the use of phosphate fertilizers in agriculture. Among the toxic metals found in the environment, cadmium (Cd) is a metal that presents the greatest clinical interest, since poisoning by this metal is difficult to treat. Cd may affect various organs such as liver, kidneys, lungs, ovaries, bones, testes and brain. The toxicology of Cd is extremely complex and has been widely studied, but it is not yet fully elucidated. Therefore, the objective of this thesis was to investigate the effects of Cd intoxication on memory as well as behavioral, biochemical, hematological and bioaccumulation parameters of this metal in different cell types of rats exposed to Cd chloride (CdCl2) or Cd from contaminated potatoes. Also, we investigated the antioxidant N-acetylcysteine (NAC) in the treatment of this type of poisoning seeking to evaluate its possible protective effect. Two experiments were performed: i) adult male Wistar rats were exposed orally to 2 mg/kg Cd and/or 150 mg/kg NAC, every other day for 30 days; ii) weaned male Wistar rats fed for 5 months, cake-based diet containing 1, 5 or 25 mg/kg CdCl2 or Cd present in tubers of potatoes grown in the presence of 10 μM of CdCl2. From these experiments we conclude: Firstly, CdCl2 intoxication caused an increase in the Cd concentration in brain structures (cerebellum, striatum, hypothalamus, hippocampus and cerebral cortex), in the levels of lipid peroxidation, and in the AChE activity of different brain structures studied causing damage to memory of rats. NAC was able to reduce the levels of lipid peroxidation and subsequently restore the AChE activity, modulating thereby the cholinergic transmission and improving the cognitive processes. Thus, NAC may be a promising drug for alternative therapies against neurotoxicity induced by Cd. Secondly, the exposure to CdCl2 increased the Cd concentration in plasma, spleen and thymus, caused damages in the hematological parameters, did not alter the NTPDase activity in lymphocytes as well as decreased the AChE activity in lymphocytes and whole blood and the BChE activity in serum of rats. NAC was effective in reducing the harmful effects of Cd probably by decreasing the levels of Cd in the lymphoid organs, reversing or minimizing the hematological damage and related to leukocytes even without changing the activity of cholinesterases. Thirdly, CdCl2 increases the hydrolysis of adenine nucleotides in synaptosomes of cerebral cortex and decreases in platelets of rats. The increase in the NTPDase and 5'-nucleotidase activities in CNS caused by Cd could be a compensatory response of the organism since the rapid hydrolysis of ATP and ADP favors the production of adenosine, a neuroprotective molecule. On the other hand, Cd decreased the NTPDase activity and did not alter 5'-nucleotidase activity in platelets suggesting that the possible increase in the ATP and ADP levels could lead to a hypercoagulable state in rats intoxicated with this metal. NAC restores the activity of these enzymes in the CNS, but had no interference in platelets. Finally, the prolonged diet with CdCl2 or Cd from contaminated potatoes resulted in an increased anxiety-like behavior and damaged memory of rats which was likely to be a result of the increased concentration of Cd, the increased AChE activity and decreased Na+,K+-ATPase activity in the different brain structures studied. In general, the results obtained in this thesis show that despite all the proposed mechanisms by which Cd could affect the behavior still generate controversy, it is clear that the exposure to CdCl2 at both short and long terms as well as to Cd from contaminated potatoes interferes the brain function by increasing Cd concentration, decreasing or increasing the AChE activity, increasing lipid peroxidation and decreasing Na+,K+-ATPase activity in several brain structures, thus being detrimental to the animal behavior influencing memory and anxiety. Cd affected systematically the animal body since it is present in plasma, lymphoid organs and brain, changing the activity of the enzymes NTPDase, 5'-nucleotidase, AChE and BChE of different cell types. In addition, NAC was able to reverse or ameliorate several deleterious effects caused by Cd suggesting that this drug may be, after additional studies, considered an important factor in therapies against intoxication by this metal.

Trichomonas vaginalis é o agente etiológico da doença sexualmente transmissível não viral mais comum no mundo, sendo registrados aproximadamente 276 milhões de novos casos de tricomonose a cada ano. O estabelecimento da infecção se deve principalmente à capacidade de adesão do parasito às células epiteliais vaginais, cervicais ou de próstata, seguida pela intensa reação inflamatória, resultado da infiltração de neutrófilos no sítio da infecção. Nucleotídeos e nucleosídeos, especialmente ATP e adenosina, são liberados para o espaço extracelular por células em situações de estresse ou injúria tecidual e desenvolvem seus efeitos sinalizadores através da ativação de purinoceptores. Ainda, as ectonucleotidases, NTPDase e ecto-5’-nucleotidase, são capazes de hidrolisar os nucleotídeos gerando adenosina e finalmente, a enzima adenosina deaminase (ADA) é responsável pela conversão de adenosina em inosina. A expressão gênica de cinco NTPDases putativas presentes no genoma de T. vaginalis foram investigadas, assim como o envolvimento da sinalização purinérgica na relação parasito-hospedeiro. Nossos resultados mostraram que diferentes isolados de T. vaginalis expressam os genes TvNTPDase1, 2, 3, 4 e 5, sendo observado o maior número de transcritos para TvNTPDase1, 2 e 4. A sequência preditiva de aminoácidos revelou a presença das cinco regiões conservadas da apirase, domínios transmembrana, sítios de fosforilação, peptídeos sinais e os prováveis sítios ativos da enzima. A análise filogenética demonstrou maior similaridade das TvNTPDases com as formas intracelulares da enzima, como as NTPDases 4 e 7 humanas e a de Saccharomyces cerevisiae. Além disso, a restrição de soro promoveu aumento significativo da atividade da NTPDase de T. vaginalis, no entanto sem corresponder com o aumento de expressão gênica de determinada(s) sequência(s). Quanto à participação da sinalização purinérgica na resposta inflamatória de células do hospedeiro frente ao parasito, foram utilizados como modelos celulares as células epiteliais vaginais (HMVII), cervicais (HeLa) e neutrófilos humanos. As linhagens HMVII e HeLa mostraram expressar todos os subtipos de receptores P1, P2X e P2Y e XI os diferentes isolados de T. vaginalis, que foram cocultivados com as células, mostraram hidrolisar eficientemente os nucleotídeos ATP, ADP e AMP. Ainda, o isolado clínico fresco TV-LACM6 foi o único a apresentar elevada citotoxicidade frente às células epiteliais vaginais e cervicais, no entanto não foi detectado aumento da liberação de ATP pelas células após o cocultivo, provavelmente devido à alta atividade da enzima NTPDase observada nesse isolado. Os trofozoítos de T. vaginalis não foram capazes de aumentar a produção de IL-8 e IL-6 pelas linhagens HMVII e HeLa, e apenas os isolados ATCC30236 e TV-LACM6 causaram aumento na secreção da citocina MIP-3α pelas células epiteliais cervicais. Finalmente, o nucleotídeo ATP e o nucleosídeo adenosina não modularam a produção dos mediadores inflamatórios investigados. Em relação aos neutrófilos, estes mostraram aumentar a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e IL-8 após incubação com os trofozoítos de T. vaginalis. Os nucleotídeos e nucleosídeos da adenina e guanina não produziram efeito na produção de ERO e IL-8; no entanto, quando o nucleosídeo adenosina foi incubado junto com o inibidor da enzima ADA (EHNA) observou-se uma redução significativa da produção de ERO e IL-8 pelos neutrófilos, devido à inibição da ADA e consequentemente, ao aumento da concentração de adenosina disponível no meio extracelular. Os nossos resultados indicaram a ativação do receptor A1 dos neutrófilos nessa condição. O conjunto de dados aqui obtidos contribuiu para uma melhor caracterização da família de enzimas NTPDases de T. vaginalis assim como para um maior conhecimento acerca da influência da sinalização purinérgica na relação parasito-hospedeiro. / Trichomonas vaginalis is the agent of the most common non-viral sexually transmitted disease worldwide, causing 276.4 million new cases a year. The establishment of the infection is closely related to the parasite ability to adhere to vaginal, cervical and prostate epithelial cells, followed by an intense inflammatory response as result of neutrophil infiltration. Nucleotides and nucleosides, mainly ATP and adenosine, are released into the extracellular space by cells under stress or injury and they exert their signaling effects through activation of the purinoceptors. Moreover, the ectonucleotidases, NTPDase and ecto-5'-nucleotidase, are capable of hydrolyzing the nucleotides producing adenosine and finally, the adenosine deaminase (ADA) is responsible for the conversion of adenosine to inosine. We investigated the gene expression of five putative NTPDases found in T. vaginalis genome as well as the involvement of purinergic signaling on the host-parasite relationship. Our results showed that different T. vaginalis isolates are able to express TvNTPDase1, 2, 3, 4 and 5 and that TvNTPDase1, 2 and 4 are the most expressed genes. Predictive amino acid sequence revealed the presence of the five apyrase conserved regions, transmembrane domains, phosphorylation sites, signal peptides and the active sites. Phylogenetic analysis showed that TvNTPDases share more similarity with the intracellular enzymes, such as human NTPDase 4 and 7 and Saccharomyces cerevisiae NTPDase. In addition, the serum limitation caused a significant increase in NTPDase activity, but without association with the gene expression of a specific TvNTPDase sequence. Regarding the participation of purinergic signaling on the inflammatory responses against the parasite, the vaginal (HMVII) and cervical (HeLa) epithelial cells and the human neutrophils were used as cellular models. HMVII and HeLa cell lines showed to express all subtypes of P1, P2X and P2Y receptors and the different T. vaginalis isolates, which were co-cultured with the cells, showed to hydrolyze efficiently ATP, ADP and AMP. Furthermore, only the fresh clinical isolate, TV-LACM6, caused a profound cytotoxicity against the vaginal and cervical epithelial cells. Interestingly, it was not detected an increase in ATP release by the cells after cocultivation, probably due to the high NTPDase activity dislplayed by TV-LACM6 isolate. The T. vaginalis trophozoites were not able to increase the production of IL-8 and IL-6 by HMVII and HeLa cells and only ATCC30236 and TV-LACM6 isolates enhanced MIP-3α secretion by the cervical epithelial cells. Finally, neither ATP nor adenosine has modulated the production of the inflammatory mediators here investigated. Considering the neutrophils, T. vaginalis stimulated the production of reactive oxygen species (ROS) and IL-8 by these immune cells and both adenine as guanine nucleotides and nucleosides did not cause any effect on ROS and IL-8 levels. However, when adenosine was incubated with an ADA inhibitor (EHNA) we observed a significant reduction of ROS and IL-8 production by neutrophils, due to inhibition of ADA with a subsequent increase of adenosine concentration in the extracellular milieu. . Our results suggested the participation of A1 receptor in this condition. The data set obtained in this study contributed to the characterization of T. vaginalis NTPDases family as well as to a better understanding of the influence of purinergic signaling on host-parasite relationship.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Cadmium (Cd) is considered one of the most toxic heavy metals for its ability to affect different tissues, including the brain and the immune system. The molecular mechanisms of toxicity of Cd are not well established, however, it is known that one of the consequences of Cd exposure is the generation of oxidative stress. Conversely, the quercetin, one flavonoid present in various foods performs various therapeutic functions in the body, such as antioxidant activity, anti-inflammatory and neuroprotective action. Thus, the aim of this study was to investigate the effects of quercetin on the behavioral tests, the activity of the enzymes acetylcholinesterase (AChE), Na+, K+-ATPase and the δ-dehydratase aminolevulinic acid (δ-ALA-D), as well as parameters of oxidative stress in the central nervous system of adult male wistar rats exposed to CdCl2. The activities of enzymes AChE, NTPDase and adenosine deaminase (ADA) of peripheral lymphocytes, butyrylcholinesterase (BuChE) in the serum and myeloperoxidase (MPO) in plasma were also measured in the peripheral system of these animals. The rats were exposed to CdCl2 (2.5 mg / kg) and quercetin (5, 25 or 50 mg / kg) by gavage (1 ml/kg) for 45 days. Hence, the animals were divided into eight groups (n = 10-14): saline/control, saline/Querc 5 mg/kg, saline/Querc 25 mg/kg, saline/Querc 50 mg/kg, Cd/ethanol, Cd/Querc 5 mg/kg, Cd/Querc 25 mg/kg and Cd/Querc 50 mg/kg. The groups treated with Cd and quercetin, received the antioxidant quercetin solution after 30 minutes of the administration of Cd solution. At the end of 45 days of the treatment the animals were submitted to training and behavioral tests. After, they were anesthetized by halothane inhalation, and blood collection was performed to set serum, plasma and peripheral lymphocytes apart. Then the animals were euthanized, with part of the brain being removed for analysis of the enzyme δ-ALA-D activity, while the other part of brain was dissected into, cerebral cortex, striatum, cerebellum, hippocampus and hypothalamus, for future enzymatic assays. The results showed that Cd is able to cross the blood brain barrier, therefore, although the amount of Cd accumulated in the different brain structures studied was low, it was significantly higher than in control. Simultaneous treatment of quercetin in Cd exposed animals was ineffective to decrease these levels of Cd. The Cd exposure caused impairment on learning and memory, besides causing an increase in the anxiogenic behavior type. Nevertheless, the treatment with quercetin prevented the undesirable effects caused by exposure to the metal in the anxiety and memory. In relation to enzymatic activities in the brain, it was observed that Cd exposure reduced AChE activity in cerebral cortex and hippocampus, while as activation of the enzyme was observed in hypothalamus. Furthermore, a decrease in the Na+, K+-ATPase enzyme activity in cerebral cortex, hippocampus and hypothalamus was observed, as well as a decrease in the δ-ALA-D activity in total brain of Cd exposed animals. Interestingly, the quercetin co-administration in the Cd exposed animals prevented the changes in the activity of the enzymes AChE and Na+, K+-ATPase in different brain structures, though has not restored the δ-ALA-D enzyme activity. It was also observed an increase in ROS production, in lipid peroxidation, in protein oxidation, the levels of double stranded DNA and changes in the antioxidant system, such as, reduction in the glutathione reductase (GR) activity, levels of total thiols (T-SH) and reduced glutathione (GSH), and an increase in the glutathione S-transferase (GST) enzyme activity in cerebral cortex, hypothalamus and hippocampus of Cd exposed animals. Co-administration of quercetin in Cd exposed rats was able to prevent totally or partially the changes caused by metal exposure in oxidative stress parameters. It is suggested that quercetin is able to reduce the oxidative damage caused by exposure to these metal and subsequently restore the AChE and Na+, K+-ATPase activities, modulating cholinergic neurotransmission and improving cognitive processes. In relation to the peripheral system, there was an increase in the NTPDase, ADA, AChE, BuChE and MPO activities in Cd exposed rats. Based on these results it is possible to infer that the increase in NTPDase activity is a compensatory effect due to the increase in ATP levels in circulation. It is suggested that decreased levels of ACh are available in the circulation due to increase in the peripheral cholinesterase activity. When rats were treated with the quercetin, flavonoid was able to modulate the activities of these enzymes probably due to the anti-inflammatory property of the compound. Accordingly, it is suggested that quercetin prevents or eases the toxicity caused by exposure to metal due to its antioxidant and anti-inflammatory activities. Therefore, it is believed that the flavonoid may be a promising drug in alternative therapies against toxicity induced by the metal in the central nervous system and peripheral system. / O cádmio (Cd) é considerado um dos metais pesados de maior toxicidade devido a sua capacidade de afetar diferentes tecidos, incluindo o encéfalo, bem como o sistema imunológico. Os mecanismos moleculares de toxicidade do Cd ainda não estão bem estabelecidos, contudo, sabe-se que uma das consequências da exposição ao Cd é a geração de estresse oxidativo. Por outro lado, a quercetina, um flavonoide presente em vários alimentos, exerce diversas funções terapêuticas no organismo, como atividade antioxidante, anti-inflamatória e ação neuroprotetora. Sendo assim, o objetivo do presente estudo foi investigar os efeitos da quercetina sobre os testes comportamentais, a atividade das enzimas acetilcolinesterase (AChE), a Na+,K+-ATPase e a δ-desidratase aminolevulinato (δ-ALA-D), bem como os parâmetros de estresse oxidativo no sistema nervoso central de ratos machos wistar adultos expostos ao CdCl2. Também foi avaliada, no sistema periférico destes animais, a atividade das enzimas AChE, NTPDases e adenosina desaminase (ADA) de linfócitos periféricos, butirilcolinesterase (BuChE) do soro e a mieloperoxidase (MPO) do plasma. Os ratos foram expostos ao CdCl2 (2,5 mg/kg) e quercetina (5, 25 ou 50 mg/kg) por gavagem (1ml/kg) durante 45 dias. Para isso, os animais foram distribuídos em oito grupos (n=10-14): salina/controle, salina/Querc 5mg/kg, salina/Querc 25 mg/kg, salina/Querc 50 mg/kg, Cd/etanol, Cd/ Querc 5mg/kg, Cd/Querc 25mg/kg e Cd/Querc 50 mg/kg. Os grupos tratados com Cd e quercetina receberam a solução antioxidante após 30 minutos da administração da solução de Cd. No final do período de 45 dias de tratamento os animais foram submetidos aos treinos e aos testes comportamentais. Posteriormente, foram anestesiados, através da inalação de halotano, e foi realizada a coleta de sangue e separação de soro, plasma e linfócitos periféricos. Em seguida os animais foram submetidos à eutanásia, com parte do encéfalo sendo retirada para a análise da atividade da enzima δ-ALA-D, enquanto que outra parte foi dissecada em córtex cerebral, estriado, cerebelo, hipocampo e hipotálamo, para posteriores ensaios enzimáticos. Os resultados obtidos mostraram que o Cd é capaz de atravessar a barreira hematoencefálica, pois, embora a quantidade de Cd acumulada nas diferentes estruturas encefálicas estudadas tenha sido baixa, ainda assim, foi significativamente maior que o controle. O tratamento concomitante da quercetina nos animais expostos ao Cd foi ineficiente em diminuir estes níveis de Cd. A exposição ao Cd causou prejuízos na aprendizagem e memória, além de causar um aumento no comportamento do tipo ansiogênico. Por outro lado, o tratamento com a quercetina preveniu os efeitos indesejáveis causados pela exposição ao metal na ansiedade e memória. Em relação às atividades enzimáticas no encéfalo, verificou-se que a exposição ao Cd reduziu a atividade da enzima AChE no córtex cerebral e no hipocampo, enquanto que uma ativação da enzima foi observada no hipotálamo. Além disso, observou-se uma diminuição na atividade da enzima Na+, K+-ATPase no córtex cerebral, hipocampo e hipotálamo, bem como uma diminuição na atividade da δ-ALA-D no encéfalo total de animais expostos ao Cd. Interessantemente, a co-administração com a quercetina em animais expostos ao Cd impediu as alterações na atividade das enzimas AChE e Na+, K+-ATPase em diferentes estruturas encefálicas, embora não tenha restaurado a a atividade da enzima δ-ALA-D. Verificou-se, também, um aumento na produção de ROS, na lipoperoxidação, na oxidação de proteínas, nos níveis de DNA dupla fita e alterações no sistema antioxidante, como a diminuição na atividade da enzima glutationa redutase (GR), nos níveis de tióis totais (T-SH) e glutationa reduzida (GSH), e um aumento na atividade da enzima glutationa S-transferase (GST) no córtex cerebral, hipocampo e hipotálamo dos animais expostos ao Cd. A co-administração da quercetina nos ratos expostos ao Cd foi capaz de impedir totalmente ou parcialmente as alterações causadas pela exposição ao metal nos parâmetros do estresse oxidativo. Sugere-se que a quercetina é capaz de diminuir o dano oxidativo causado pela exposição ao metal e, subsequentemente, restaurar a atividade da AChE e Na+, K+-ATPase, modulando, assim, a neurotransmissão colinérgica e melhorando os processos cognitivos. Em relação ao sistema periférico, verificou-se um aumento na atividade das enzimas NTPDase, ADA, AChE, BuChE e MPO nos ratos expostos ao Cd. A partir desse resultado pode-se inferir que o aumento na atividade da NTPDase seja um efeito compensatório devido ao aumento dos níveis de ATP na circulação. Sugere-se que níveis diminuídos de ACh estão disponíveis na circulação devido ao aumento na atividade das colinesterases periféricas. Quando os ratos foram tratados com quercetina o flavonoide foi capaz de modular a atividade dessas enzimas provavelmente devido à propriedade anti-inflamatória do composto. Deste modo, propõe-se que a quercetina previne ou ameniza a toxicidade causada pela exposição ao metal devido a sua atividade antioxidante e anti-inflamatória. Logo, acredita-se que este flavonoide possa ser um fármaco promissor em terapias alternativas contra a toxicidade induzida pelo metal no sistema nervoso central e periférico.

Trichomonas vaginalis é o agente etiológico da doença sexualmente transmissível não viral mais comum no mundo, sendo registrados aproximadamente 276 milhões de novos casos de tricomonose a cada ano. O estabelecimento da infecção se deve principalmente à capacidade de adesão do parasito às células epiteliais vaginais, cervicais ou de próstata, seguida pela intensa reação inflamatória, resultado da infiltração de neutrófilos no sítio da infecção. Nucleotídeos e nucleosídeos, especialmente ATP e adenosina, são liberados para o espaço extracelular por células em situações de estresse ou injúria tecidual e desenvolvem seus efeitos sinalizadores através da ativação de purinoceptores. Ainda, as ectonucleotidases, NTPDase e ecto-5’-nucleotidase, são capazes de hidrolisar os nucleotídeos gerando adenosina e finalmente, a enzima adenosina deaminase (ADA) é responsável pela conversão de adenosina em inosina. A expressão gênica de cinco NTPDases putativas presentes no genoma de T. vaginalis foram investigadas, assim como o envolvimento da sinalização purinérgica na relação parasito-hospedeiro. Nossos resultados mostraram que diferentes isolados de T. vaginalis expressam os genes TvNTPDase1, 2, 3, 4 e 5, sendo observado o maior número de transcritos para TvNTPDase1, 2 e 4. A sequência preditiva de aminoácidos revelou a presença das cinco regiões conservadas da apirase, domínios transmembrana, sítios de fosforilação, peptídeos sinais e os prováveis sítios ativos da enzima. A análise filogenética demonstrou maior similaridade das TvNTPDases com as formas intracelulares da enzima, como as NTPDases 4 e 7 humanas e a de Saccharomyces cerevisiae. Além disso, a restrição de soro promoveu aumento significativo da atividade da NTPDase de T. vaginalis, no entanto sem corresponder com o aumento de expressão gênica de determinada(s) sequência(s). Quanto à participação da sinalização purinérgica na resposta inflamatória de células do hospedeiro frente ao parasito, foram utilizados como modelos celulares as células epiteliais vaginais (HMVII), cervicais (HeLa) e neutrófilos humanos. As linhagens HMVII e HeLa mostraram expressar todos os subtipos de receptores P1, P2X e P2Y e XI os diferentes isolados de T. vaginalis, que foram cocultivados com as células, mostraram hidrolisar eficientemente os nucleotídeos ATP, ADP e AMP. Ainda, o isolado clínico fresco TV-LACM6 foi o único a apresentar elevada citotoxicidade frente às células epiteliais vaginais e cervicais, no entanto não foi detectado aumento da liberação de ATP pelas células após o cocultivo, provavelmente devido à alta atividade da enzima NTPDase observada nesse isolado. Os trofozoítos de T. vaginalis não foram capazes de aumentar a produção de IL-8 e IL-6 pelas linhagens HMVII e HeLa, e apenas os isolados ATCC30236 e TV-LACM6 causaram aumento na secreção da citocina MIP-3α pelas células epiteliais cervicais. Finalmente, o nucleotídeo ATP e o nucleosídeo adenosina não modularam a produção dos mediadores inflamatórios investigados. Em relação aos neutrófilos, estes mostraram aumentar a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e IL-8 após incubação com os trofozoítos de T. vaginalis. Os nucleotídeos e nucleosídeos da adenina e guanina não produziram efeito na produção de ERO e IL-8; no entanto, quando o nucleosídeo adenosina foi incubado junto com o inibidor da enzima ADA (EHNA) observou-se uma redução significativa da produção de ERO e IL-8 pelos neutrófilos, devido à inibição da ADA e consequentemente, ao aumento da concentração de adenosina disponível no meio extracelular. Os nossos resultados indicaram a ativação do receptor A1 dos neutrófilos nessa condição. O conjunto de dados aqui obtidos contribuiu para uma melhor caracterização da família de enzimas NTPDases de T. vaginalis assim como para um maior conhecimento acerca da influência da sinalização purinérgica na relação parasito-hospedeiro. / Trichomonas vaginalis is the agent of the most common non-viral sexually transmitted disease worldwide, causing 276.4 million new cases a year. The establishment of the infection is closely related to the parasite ability to adhere to vaginal, cervical and prostate epithelial cells, followed by an intense inflammatory response as result of neutrophil infiltration. Nucleotides and nucleosides, mainly ATP and adenosine, are released into the extracellular space by cells under stress or injury and they exert their signaling effects through activation of the purinoceptors. Moreover, the ectonucleotidases, NTPDase and ecto-5'-nucleotidase, are capable of hydrolyzing the nucleotides producing adenosine and finally, the adenosine deaminase (ADA) is responsible for the conversion of adenosine to inosine. We investigated the gene expression of five putative NTPDases found in T. vaginalis genome as well as the involvement of purinergic signaling on the host-parasite relationship. Our results showed that different T. vaginalis isolates are able to express TvNTPDase1, 2, 3, 4 and 5 and that TvNTPDase1, 2 and 4 are the most expressed genes. Predictive amino acid sequence revealed the presence of the five apyrase conserved regions, transmembrane domains, phosphorylation sites, signal peptides and the active sites. Phylogenetic analysis showed that TvNTPDases share more similarity with the intracellular enzymes, such as human NTPDase 4 and 7 and Saccharomyces cerevisiae NTPDase. In addition, the serum limitation caused a significant increase in NTPDase activity, but without association with the gene expression of a specific TvNTPDase sequence. Regarding the participation of purinergic signaling on the inflammatory responses against the parasite, the vaginal (HMVII) and cervical (HeLa) epithelial cells and the human neutrophils were used as cellular models. HMVII and HeLa cell lines showed to express all subtypes of P1, P2X and P2Y receptors and the different T. vaginalis isolates, which were co-cultured with the cells, showed to hydrolyze efficiently ATP, ADP and AMP. Furthermore, only the fresh clinical isolate, TV-LACM6, caused a profound cytotoxicity against the vaginal and cervical epithelial cells. Interestingly, it was not detected an increase in ATP release by the cells after cocultivation, probably due to the high NTPDase activity dislplayed by TV-LACM6 isolate. The T. vaginalis trophozoites were not able to increase the production of IL-8 and IL-6 by HMVII and HeLa cells and only ATCC30236 and TV-LACM6 isolates enhanced MIP-3α secretion by the cervical epithelial cells. Finally, neither ATP nor adenosine has modulated the production of the inflammatory mediators here investigated. Considering the neutrophils, T. vaginalis stimulated the production of reactive oxygen species (ROS) and IL-8 by these immune cells and both adenine as guanine nucleotides and nucleosides did not cause any effect on ROS and IL-8 levels. However, when adenosine was incubated with an ADA inhibitor (EHNA) we observed a significant reduction of ROS and IL-8 production by neutrophils, due to inhibition of ADA with a subsequent increase of adenosine concentration in the extracellular milieu. . Our results suggested the participation of A1 receptor in this condition. The data set obtained in this study contributed to the characterization of T. vaginalis NTPDases family as well as to a better understanding of the influence of purinergic signaling on host-parasite relationship.

Trichomonas vaginalis é o agente etiológico da doença sexualmente transmissível não viral mais comum no mundo, sendo registrados aproximadamente 276 milhões de novos casos de tricomonose a cada ano. O estabelecimento da infecção se deve principalmente à capacidade de adesão do parasito às células epiteliais vaginais, cervicais ou de próstata, seguida pela intensa reação inflamatória, resultado da infiltração de neutrófilos no sítio da infecção. Nucleotídeos e nucleosídeos, especialmente ATP e adenosina, são liberados para o espaço extracelular por células em situações de estresse ou injúria tecidual e desenvolvem seus efeitos sinalizadores através da ativação de purinoceptores. Ainda, as ectonucleotidases, NTPDase e ecto-5’-nucleotidase, são capazes de hidrolisar os nucleotídeos gerando adenosina e finalmente, a enzima adenosina deaminase (ADA) é responsável pela conversão de adenosina em inosina. A expressão gênica de cinco NTPDases putativas presentes no genoma de T. vaginalis foram investigadas, assim como o envolvimento da sinalização purinérgica na relação parasito-hospedeiro. Nossos resultados mostraram que diferentes isolados de T. vaginalis expressam os genes TvNTPDase1, 2, 3, 4 e 5, sendo observado o maior número de transcritos para TvNTPDase1, 2 e 4. A sequência preditiva de aminoácidos revelou a presença das cinco regiões conservadas da apirase, domínios transmembrana, sítios de fosforilação, peptídeos sinais e os prováveis sítios ativos da enzima. A análise filogenética demonstrou maior similaridade das TvNTPDases com as formas intracelulares da enzima, como as NTPDases 4 e 7 humanas e a de Saccharomyces cerevisiae. Além disso, a restrição de soro promoveu aumento significativo da atividade da NTPDase de T. vaginalis, no entanto sem corresponder com o aumento de expressão gênica de determinada(s) sequência(s). Quanto à participação da sinalização purinérgica na resposta inflamatória de células do hospedeiro frente ao parasito, foram utilizados como modelos celulares as células epiteliais vaginais (HMVII), cervicais (HeLa) e neutrófilos humanos. As linhagens HMVII e HeLa mostraram expressar todos os subtipos de receptores P1, P2X e P2Y e XI os diferentes isolados de T. vaginalis, que foram cocultivados com as células, mostraram hidrolisar eficientemente os nucleotídeos ATP, ADP e AMP. Ainda, o isolado clínico fresco TV-LACM6 foi o único a apresentar elevada citotoxicidade frente às células epiteliais vaginais e cervicais, no entanto não foi detectado aumento da liberação de ATP pelas células após o cocultivo, provavelmente devido à alta atividade da enzima NTPDase observada nesse isolado. Os trofozoítos de T. vaginalis não foram capazes de aumentar a produção de IL-8 e IL-6 pelas linhagens HMVII e HeLa, e apenas os isolados ATCC30236 e TV-LACM6 causaram aumento na secreção da citocina MIP-3α pelas células epiteliais cervicais. Finalmente, o nucleotídeo ATP e o nucleosídeo adenosina não modularam a produção dos mediadores inflamatórios investigados. Em relação aos neutrófilos, estes mostraram aumentar a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e IL-8 após incubação com os trofozoítos de T. vaginalis. Os nucleotídeos e nucleosídeos da adenina e guanina não produziram efeito na produção de ERO e IL-8; no entanto, quando o nucleosídeo adenosina foi incubado junto com o inibidor da enzima ADA (EHNA) observou-se uma redução significativa da produção de ERO e IL-8 pelos neutrófilos, devido à inibição da ADA e consequentemente, ao aumento da concentração de adenosina disponível no meio extracelular. Os nossos resultados indicaram a ativação do receptor A1 dos neutrófilos nessa condição. O conjunto de dados aqui obtidos contribuiu para uma melhor caracterização da família de enzimas NTPDases de T. vaginalis assim como para um maior conhecimento acerca da influência da sinalização purinérgica na relação parasito-hospedeiro. / Trichomonas vaginalis is the agent of the most common non-viral sexually transmitted disease worldwide, causing 276.4 million new cases a year. The establishment of the infection is closely related to the parasite ability to adhere to vaginal, cervical and prostate epithelial cells, followed by an intense inflammatory response as result of neutrophil infiltration. Nucleotides and nucleosides, mainly ATP and adenosine, are released into the extracellular space by cells under stress or injury and they exert their signaling effects through activation of the purinoceptors. Moreover, the ectonucleotidases, NTPDase and ecto-5'-nucleotidase, are capable of hydrolyzing the nucleotides producing adenosine and finally, the adenosine deaminase (ADA) is responsible for the conversion of adenosine to inosine. We investigated the gene expression of five putative NTPDases found in T. vaginalis genome as well as the involvement of purinergic signaling on the host-parasite relationship. Our results showed that different T. vaginalis isolates are able to express TvNTPDase1, 2, 3, 4 and 5 and that TvNTPDase1, 2 and 4 are the most expressed genes. Predictive amino acid sequence revealed the presence of the five apyrase conserved regions, transmembrane domains, phosphorylation sites, signal peptides and the active sites. Phylogenetic analysis showed that TvNTPDases share more similarity with the intracellular enzymes, such as human NTPDase 4 and 7 and Saccharomyces cerevisiae NTPDase. In addition, the serum limitation caused a significant increase in NTPDase activity, but without association with the gene expression of a specific TvNTPDase sequence. Regarding the participation of purinergic signaling on the inflammatory responses against the parasite, the vaginal (HMVII) and cervical (HeLa) epithelial cells and the human neutrophils were used as cellular models. HMVII and HeLa cell lines showed to express all subtypes of P1, P2X and P2Y receptors and the different T. vaginalis isolates, which were co-cultured with the cells, showed to hydrolyze efficiently ATP, ADP and AMP. Furthermore, only the fresh clinical isolate, TV-LACM6, caused a profound cytotoxicity against the vaginal and cervical epithelial cells. Interestingly, it was not detected an increase in ATP release by the cells after cocultivation, probably due to the high NTPDase activity dislplayed by TV-LACM6 isolate. The T. vaginalis trophozoites were not able to increase the production of IL-8 and IL-6 by HMVII and HeLa cells and only ATCC30236 and TV-LACM6 isolates enhanced MIP-3α secretion by the cervical epithelial cells. Finally, neither ATP nor adenosine has modulated the production of the inflammatory mediators here investigated. Considering the neutrophils, T. vaginalis stimulated the production of reactive oxygen species (ROS) and IL-8 by these immune cells and both adenine as guanine nucleotides and nucleosides did not cause any effect on ROS and IL-8 levels. However, when adenosine was incubated with an ADA inhibitor (EHNA) we observed a significant reduction of ROS and IL-8 production by neutrophils, due to inhibition of ADA with a subsequent increase of adenosine concentration in the extracellular milieu. . Our results suggested the participation of A1 receptor in this condition. The data set obtained in this study contributed to the characterization of T. vaginalis NTPDases family as well as to a better understanding of the influence of purinergic signaling on host-parasite relationship.

Trichomonas vaginalis é um protozoário flagelado parasita do trato urogenital humano, agente etiológico da tricomonose - a DST não viral mais frequente no mundo. No processo inflamatório promovido pela infecção, a infiltração leucocitária é principal mudança citológica observada. Considerando o impacto da doença na saúde pública e a importância em investigar novos alvos terapêuticos para o tratamento da tricomonose, o estudo de aspectos bioquímicos do parasito torna-se fundamental. Nucleotídeos extracelulares, especialmente ATP, são liberados pelas células em situações de estresse, anóxia ou lesão, sequencialmente, as ectonucleotidases são capazes de hidrolizá-los, levando à produção de adenosina. De forma importante, T. vaginalis não realiza síntese de novo de purinas e as enzimas participam das vias de salvação. Avaliando-se o perfil das ectonucleotidases de T. vaginalis em uma condição de limitação de soro bovino, o qual representa a fonte de adenosina aos trofozoítos, observou-se um aumento significativo da hidrólise de ATP, ADP e AMP, assim como da expressão gênica da NTPDase e do metabolismo dos nucleotídeos extracelulares. Além disso, essa situação promoveu atraso do ciclo celular dos parasitos nos estágios G0/G1, sugerindo um aumento do pool intracelular de nucleotídeos da adenina. Na tentativa de melhor compreender os mecanismos envolvidos no recrutamento de leucócitos para o sítio da infecção, investigou-se a produção de óxido nítrico (NO) por neutrófilos estimulados com T. vaginalis. Os trofozoítos promoveram aumento dos níveis de NO, o qual, provavelmente, é sintetizado pela forma induzível da enzima óxido nítrico sintase. Os nucleotídeos da adenina não foram capazes de modular a produção de NO, diferentemente da adenosina, que provocou significativa redução da secreção do mediador, provavelmente através da ativação de receptores A2A. Os resultados obtidos nesta dissertação demonstram a importância das ectonucleotidases de T. vaginalis na geração de adenosina, e contribuem para o entendimento de mecanismos envolvidos com a imunidade na tricomonose. / Trichomonas vaginalis is a flagellated protozoan parasite of human urogenital tract that causes trichomonosis - the most common non-viral STD in the world. In the inflammatory process promoted by infection, the leukocytic infiltration is the main cytological change observed. Considering the disease impact on public health and the search for new therapeutic targets to trichomonosis treatment, it is important to investigate the biochemical aspects of the parasite. Extracellular nucleotides, especially ATP, are released by cells under stress, anoxia or injury and they can be degraded to adenosine by ectonucleotidases. Importantly, T. vaginalis lacks the ability to synthesize purines de novo, and the enzymes act on the salvage pathways generating the nucleosides. Evaluating the profile of T. vaginalis ectonucleotidases in a serum limitation condition, a significant increase in ATP, ADP and AMP hydrolysis was observed. NTPDase gene expression and the metabolism of extracellular nucleotides were also increased. Moreover, the serum limitation promoted cell cycle arrest at G0/G1 phases, suggesting an increase in intracellular pool of adenine nucleotides. To better understand the mechanisms involved in leukocyte recruitment to infection site, the nitric oxide (NO) production by neutrophils stimulated with T. vaginalis was investigated. The trophozoites caused increase in NO synthesis, which is probably performed by nitric oxide synthase. The adenine nucleotides were not able to modulate the NO production. In contrast, the adenosine promoted a significant reduction in the compound levels, likely through of A2A receptors activation. The results obtained in this study evidence the importance of T. vaginalis ectonucleotidases on adenosine generation and contribute to the host-parasite interactions as well as the immunity in trichomonosis.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease autoimmune of unknown etiology. Patients with RA have a lower survival than the general population, the most common cause of mortality in these patients is cardiovascular disease. The systemic inflammation that occurs in RA produces a spectrum of proatherogenic changes including endothelial dysfunction, insulin resistance, dyslipidemia, prothrombotic effects and pro-oxidative stress. Endothelial dysfunction is the key event in early atherogenesis. The platelets are known to have an important role in the maintenance of endothelial integrity and homeostasis, and also are key players in atherothrombosis. Extracellular adenine nucleotides ATP, ADP and AMP and the nucleoside adenosine, modulate a variety of tissue effects, exerting several effects on the platelets. This work determined the activity of enzymes involved in the degradation of nucleotides and nucleosides (NTPDase, 5 -nucleotidase E-NPP and ADA) in platelets from patients with RA and controls patients. It was selected thirty-five RA patients from the Hospital of the Federal University of Santa Maria and the diagnostic was based on the criteria of American College of Rheumatology. The results showed an increase in the activity of NTPDase (approximately 100%), 5 -nucleotidase (170%), E-NPP (approximately 100%) and ADA (approximately 45%) in the platelets of patients with RA when compared to control group. The increased activity of these enzymes could be related to a compensatory response of the organism due to the disease. The platelet aggregation was also determined in these patients and no changes were found when compared to the control group. The increase in ADA activity was lower when compared to the increase observed in the other enzymes activities (NTPDase, 5 -nucleotidase and ENPP). Possibly not all generated adenosine is converted by the ADA, which could explain the normality of platelet aggregation in patients with RA. No interference of the drugs (methotrexate, leflunomide,hydroxychloroquine and prednisone) utilized in RA treatment was observed on the enzymatic activities tested in vitro. In this way, it is possible to conclude that the NTPDase, 5 -nucleotidase, E-NPP and ADA activities are altered in platelets of patients with RA, which could be considered a compensatory response against the disease. / A artrite reumatóide (AR) é uma doença inflamatória crônica autoimune, de etiologia desconhecida. Os pacientes portadores de AR têm uma sobrevida menor do que a da população em geral, sendo que a causa mais comum de mortalidade é a doença cardiovascular. A inflamação sistêmica que ocorre na AR produz um espectro de mudanças proaterogênicas que incluem a disfunção endotelial, a resistência à insulina, a dislipidemia, os efeitos protrombóticos e o estresse oxidativo. A disfunção endotelial é um evento chave no início da aterogênese. As plaquetas são conhecidas por ter um importante papel na manutenção da integridade endotelial e da hemostasia, possuindo um papel chave na aterotrombose. Os nucleotídeos extracelulares de adenina ATP, ADP e AMP e o nucleosídeo adenosina, modulam uma variedade de efeitos teciduais, além de exercererm diversos efeitos nas plaquetas. Neste trabalho foi determinada a atividade das enzimas envolvidas na degradação de nucleotídeos e nucleosídeos (NTPDase, 5 -nucleotidase, E-NPP e ADA) em plaquetas de pacientes com AR. Foram selecionados 35 pacientes do Hospital Universitário de Santa Maria com diagnóstico de AR, o qual foi baseado nos critérios de classificação do Colégio Americano de Reumatologia. Os resultados demonstraram um aumento na atividade das enzimas NTPDase (aproximadamente 100%), 5 -nucleotidase (170%), E-NPP (aproximadamente 100%) e ADA (aproximadamente 45%) em plaquetas de pacientes com AR quando comparado ao controle. O aumento da atividade dessas enzimas pode estar relacionado com uma resposta compensatória do organismo frente à doença. Também foi determinado o perfil da agregação plaquetária nesses pacientes, o qual encontrou-se inalterado quando comparado ao controle. O aumento da atividade da enzima ADA foi menor quando comparado ao aumento das atividades das outras enzimas (NTPDase, 5 -nucleotidase e E-NPP). Possivelmente, nem toda a adenosina gerada é convertida pela ADA, o que poderia explicar a normalidade da agregação plaquetária nos pacientes estudados. Não foi observada nenhuma interferência dos fármacos (hidroxicloroquina, leflunomida, metotrexato e prednisona) utilizados no tratamento de AR sobre a atividade das enzimas testadas in vitro. Concluiu-se que a atividade das enzimas NTPDase, 5 -nucleotidase, E-NPP e ADA encontram-se alteradas em plaquetas de pacientes com AR, o que poderia ser considerado uma resposta compensatória do organismo frente à doença.