Trichomonas vaginalis é um protozoário flagelado parasita do trato urogenital humano, agente etiológico da tricomonose - a DST não viral mais frequente no mundo. No processo inflamatório promovido pela infecção, a infiltração leucocitária é principal mudança citológica observada. Considerando o impacto da doença na saúde pública e a importância em investigar novos alvos terapêuticos para o tratamento da tricomonose, o estudo de aspectos bioquímicos do parasito torna-se fundamental. Nucleotídeos extracelulares, especialmente ATP, são liberados pelas células em situações de estresse, anóxia ou lesão, sequencialmente, as ectonucleotidases são capazes de hidrolizá-los, levando à produção de adenosina. De forma importante, T. vaginalis não realiza síntese de novo de purinas e as enzimas participam das vias de salvação. Avaliando-se o perfil das ectonucleotidases de T. vaginalis em uma condição de limitação de soro bovino, o qual representa a fonte de adenosina aos trofozoítos, observou-se um aumento significativo da hidrólise de ATP, ADP e AMP, assim como da expressão gênica da NTPDase e do metabolismo dos nucleotídeos extracelulares. Além disso, essa situação promoveu atraso do ciclo celular dos parasitos nos estágios G0/G1, sugerindo um aumento do pool intracelular de nucleotídeos da adenina. Na tentativa de melhor compreender os mecanismos envolvidos no recrutamento de leucócitos para o sítio da infecção, investigou-se a produção de óxido nítrico (NO) por neutrófilos estimulados com T. vaginalis. Os trofozoítos promoveram aumento dos níveis de NO, o qual, provavelmente, é sintetizado pela forma induzível da enzima óxido nítrico sintase. Os nucleotídeos da adenina não foram capazes de modular a produção de NO, diferentemente da adenosina, que provocou significativa redução da secreção do mediador, provavelmente através da ativação de receptores A2A. Os resultados obtidos nesta dissertação demonstram a importância das ectonucleotidases de T. vaginalis na geração de adenosina, e contribuem para o entendimento de mecanismos envolvidos com a imunidade na tricomonose. / Trichomonas vaginalis is a flagellated protozoan parasite of human urogenital tract that causes trichomonosis - the most common non-viral STD in the world. In the inflammatory process promoted by infection, the leukocytic infiltration is the main cytological change observed. Considering the disease impact on public health and the search for new therapeutic targets to trichomonosis treatment, it is important to investigate the biochemical aspects of the parasite. Extracellular nucleotides, especially ATP, are released by cells under stress, anoxia or injury and they can be degraded to adenosine by ectonucleotidases. Importantly, T. vaginalis lacks the ability to synthesize purines de novo, and the enzymes act on the salvage pathways generating the nucleosides. Evaluating the profile of T. vaginalis ectonucleotidases in a serum limitation condition, a significant increase in ATP, ADP and AMP hydrolysis was observed. NTPDase gene expression and the metabolism of extracellular nucleotides were also increased. Moreover, the serum limitation promoted cell cycle arrest at G0/G1 phases, suggesting an increase in intracellular pool of adenine nucleotides. To better understand the mechanisms involved in leukocyte recruitment to infection site, the nitric oxide (NO) production by neutrophils stimulated with T. vaginalis was investigated. The trophozoites caused increase in NO synthesis, which is probably performed by nitric oxide synthase. The adenine nucleotides were not able to modulate the NO production. In contrast, the adenosine promoted a significant reduction in the compound levels, likely through of A2A receptors activation. The results obtained in this study evidence the importance of T. vaginalis ectonucleotidases on adenosine generation and contribute to the host-parasite interactions as well as the immunity in trichomonosis.

Trichomonas vaginalis é um protozoário flagelado parasita do trato urogenital humano, agente etiológico da tricomonose - a DST não viral mais frequente no mundo. No processo inflamatório promovido pela infecção, a infiltração leucocitária é principal mudança citológica observada. Considerando o impacto da doença na saúde pública e a importância em investigar novos alvos terapêuticos para o tratamento da tricomonose, o estudo de aspectos bioquímicos do parasito torna-se fundamental. Nucleotídeos extracelulares, especialmente ATP, são liberados pelas células em situações de estresse, anóxia ou lesão, sequencialmente, as ectonucleotidases são capazes de hidrolizá-los, levando à produção de adenosina. De forma importante, T. vaginalis não realiza síntese de novo de purinas e as enzimas participam das vias de salvação. Avaliando-se o perfil das ectonucleotidases de T. vaginalis em uma condição de limitação de soro bovino, o qual representa a fonte de adenosina aos trofozoítos, observou-se um aumento significativo da hidrólise de ATP, ADP e AMP, assim como da expressão gênica da NTPDase e do metabolismo dos nucleotídeos extracelulares. Além disso, essa situação promoveu atraso do ciclo celular dos parasitos nos estágios G0/G1, sugerindo um aumento do pool intracelular de nucleotídeos da adenina. Na tentativa de melhor compreender os mecanismos envolvidos no recrutamento de leucócitos para o sítio da infecção, investigou-se a produção de óxido nítrico (NO) por neutrófilos estimulados com T. vaginalis. Os trofozoítos promoveram aumento dos níveis de NO, o qual, provavelmente, é sintetizado pela forma induzível da enzima óxido nítrico sintase. Os nucleotídeos da adenina não foram capazes de modular a produção de NO, diferentemente da adenosina, que provocou significativa redução da secreção do mediador, provavelmente através da ativação de receptores A2A. Os resultados obtidos nesta dissertação demonstram a importância das ectonucleotidases de T. vaginalis na geração de adenosina, e contribuem para o entendimento de mecanismos envolvidos com a imunidade na tricomonose. / Trichomonas vaginalis is a flagellated protozoan parasite of human urogenital tract that causes trichomonosis - the most common non-viral STD in the world. In the inflammatory process promoted by infection, the leukocytic infiltration is the main cytological change observed. Considering the disease impact on public health and the search for new therapeutic targets to trichomonosis treatment, it is important to investigate the biochemical aspects of the parasite. Extracellular nucleotides, especially ATP, are released by cells under stress, anoxia or injury and they can be degraded to adenosine by ectonucleotidases. Importantly, T. vaginalis lacks the ability to synthesize purines de novo, and the enzymes act on the salvage pathways generating the nucleosides. Evaluating the profile of T. vaginalis ectonucleotidases in a serum limitation condition, a significant increase in ATP, ADP and AMP hydrolysis was observed. NTPDase gene expression and the metabolism of extracellular nucleotides were also increased. Moreover, the serum limitation promoted cell cycle arrest at G0/G1 phases, suggesting an increase in intracellular pool of adenine nucleotides. To better understand the mechanisms involved in leukocyte recruitment to infection site, the nitric oxide (NO) production by neutrophils stimulated with T. vaginalis was investigated. The trophozoites caused increase in NO synthesis, which is probably performed by nitric oxide synthase. The adenine nucleotides were not able to modulate the NO production. In contrast, the adenosine promoted a significant reduction in the compound levels, likely through of A2A receptors activation. The results obtained in this study evidence the importance of T. vaginalis ectonucleotidases on adenosine generation and contribute to the host-parasite interactions as well as the immunity in trichomonosis.

Von Willebrand disease (vWD) is one of the most common inherited bleeding diseases, caused by a qualitative or quantitative deficiency of the von Willebrand factor (vWF). vWF is a multimeric glycoprotein synthesized by megakaryocytes and endothelial cells and it is present in the subendothelial matrix, blood plasma, platelets and endothelium. This glycoprotein represents an important role in thrombus formation by initiating platelet adhesion to sites of injury as well as platelet aggregation. The objective of this study was determine the activities of NTPDase (CD39), 5 -nucleotidase (EC 3.1.3.5, CD73) and Ectonucleotide Pyrophosphatase/Phosphodiesterase (E-NPP) enzymes in platelets patients from von Willebrand disease and healthy patients, as well as ristocetin-induced platelet aggregation (RIPA) and polymorphisms of the α2 gene of the α2β1 integrin. The following groups were studied: 14 patients diagnosed with vWD and 14 healthy patients for control group. For ristocetin-induced platelet aggregation was used a Platelet Rich Plasma (PRP) and Platelet Poor Plasma (PPP), using a final concentration of ristocetin in 1.25mg/mL. The polymorphisms of the α2 gene was analyzed through the Polymerase chain reaction (PCR), used for digestion of the PCR product of the Bgl II restriction site. NTPDase and E-NPP were decreased in platelets of patients with vWD compared to the group control. Moreover, the activity of the enzyme 5'- nucleotidase was not statistically significant. The results of the RIPA were significantly reduced in patients with vWD compared with the control. The allelic frequencies among vWD patients were found to be 78.57% for 807C and 21.43% for 807T. Our results indicate an decreased NTPDase and E-NPP activities in platelets, may be related to the low adhesiveness of platelets in patients with vWD. The allelic frequency 807C predominant suggests, in agreement with other studies, this polymorphism and factor characteristic of hemorrhagic manifestations in patients with DvW. / A doença de von Willebrand (DvW) é uma das mais comuns entre as doenças hemorrágicas, e é provocada por uma deficiência qualitativa ou quantitativa do fator de von Willebrand (FvW). O FvW é uma glicoproteína multimérica sintetizada por megacariócitos e células endoteliais e está presente no matriz subendotelial, no plasma sanguíneo, nas plaquetas e no endotélio. Esta glicoproteína desempenha um papel importante na formação do trombo plaquetário, iniciando a adesão plaquetária ao local do dano vascular, bem como, a agregação plaquetária. O objetivo deste estudo foi determinar a atividade das enzimas NTPDase (EC 3.6.1.5, CD39), 5'-nucleotidase (EC 3.1.3.5, CD73) e Ectonucleotideo pirofasfatase/fosfodiesterase (E-NPP) em plaquetas de pacientes com a DvW e em plaquetas de pacientes saudáveis, bem como agregação plaquetária induzida pela ristocetina (RIPA) e o polimorfismo do gene α2 da integrina α2β1 da superfície de plaquetas. Os grupos foram divididos da seguinte forma: 14 pacientes diagnosticados com DvW e 14 pacientes saudáveis, para o grupo controle. Para a RIPA foram utilizados um Plasma Rico em Plaquetas (PRP) e um Plasma Pobre em Plaquetas (PPP), utilizando-se uma concentração final de ristocetina de 1.25mg/mL. O polimorfismo do gene α2 foi analisado através da reação em cadeia de polimerase (PCR), utilizando para a digestão do produto da PCR a enzima de restrição Bgl II. Constatou-se que a atividade das enzimas NTPDase e E-NPP foram reduzidas em plaquetas de pacientes com DvW comparadas ao grupo controle. Por outro lado, a atividade da enzima 5'-nucleotidase não foi estatisticamente significativa. Os resultados para os RIPA foram significativamente reduzidos em pacientes com DvW comparado com o controle. A freqüência alélica encontrada entre os pacientes com DvW foi de 78,57% para o alelo 807C e de 21,43% para o alelo 807T. Nossos resultados indicam que a redução da atividade da NTPDase e da E-NPP em plaquetas pode estar relacionada à baixa adesividade das plaquetas em pacientes com DvW. A freqüência alélica 807C predominante sugere, de acordo com outros estudos, que este polimorfismo é fator característico das manifestações hemorrágicas em pacientes portadores da DvW.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Acute Myocardial Infarction (AMI) is one of the major public health problems in the world. Coronary occlusion, which occurs when an atherosclerotic plaque breaks, is the main mechanism that leads to AMI. With the objective of tissue reparation, there is an increase in platelet aggregation and thrombus formation. When ischemia/reperfusion occurs in AMI, Reactive Oxygen Species (ROS) are produced. The imbalance between ROS production and degradation may lead to an increase in oxidative stress. This study aimed to determine the activity of enzymes involved in thromboregulation, such as NTPDase and 5 -nucleotidase, as well as oxidative stress parameters. Evaluation of the oxidant system was carried out by lipid peroxidation and carbonyl protein determination, and the enzymatic and nonenzymatic antioxidant defense measurements were performed in platelets, total blood, plasma, and serum of AMI patients. The results demonstrated that an increase in the activity of NTPDase by ATP (54%) and ADP (45%) hydrolysis occurred in AMI patients when compared to the control group. The same occurred with 5 -nucleotidase activity. The hydrolysis of AMP increased 46% in AMI patients compared to the control group. The increase in ectonucleotidase activities could be related to a compensatory organic response to the pathologic state formed. Regarding oxidant levels, an increase in TBARS and carbonyl protein levels was observed in AMI patients when compared to the control group. The same occurred for the activities of the enzymatic antioxidants, superoxide dismutase (SOD), and catalase (CAT). However, a decrease in nonenzymatic antioxidants, such as vitamin C and vitamin E, was observed in AMI patients when compared to control. These results suggest an increase in oxidative stress in AMI, which was probably a result of the ischemic/reperfusion moment, as well as a decrease of antioxidant defenses. Furthermore, the increased antioxidant defense may act as a compensatory mechanism in consequence of the overproduction of ROS after AMI. No differences in the parameters tested were observed with the drugs utilized in AMI treatment in vitro. In conclusion, AMI results in oxidative damage as well as an increase in the organism s defenses as a compensatory response. / O Infarto Agudo do Miocárdio (IAM) é um dos maiores problemas de saúde pública no mundo. O principal mecanismo que leva ao IAM é a oclusão coronariana que ocorre quando uma placa aterosclerótica sofre fissura. Com o objetivo de reparação tecidual temos um aumento na agregação plaquetária e formação do trombo. Acompanhando o momento de isquemia e reperfusão que ocorre no IAM temos uma produção elevada de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs). Um desequilíbrio entre a produção e a degradação de EROs pode levar a geração de estresse oxidativo. Neste trabalho determinaram-se a atividade das enzimas envolvidas na tromboregulação: NTPDase e 5 -nucleotidase, e parâmetros de estresse oxidativo em pacientes que sofreram IAM e em pacientes controles. Foi realizada a avaliação do sistema oxidante através da determinação da peroxidação lipídica e da carbonilação protéica e a medida das defesas antioxidantes enzimáticas e não enzimáticas do organismo, em plaquetas, sangue total, plasma e soro destes pacientes. Os resultados demonstraram um aumento na atividade da NTPDase, revelada através da hidrólise dos nucleotídeos ATP (54%) e ADP (45%), em pacientes com IAM quando comparados com o grupo controle. O mesmo ocorreu com a atividade da enzima 5 -nucleotidase. A hidrólise do AMP aumentou 46% nos pacientes com IAM em relação ao grupo controle. O aumento na atividade das ectonucleotidases pode estar relacionado a uma resposta orgânica compensatória do organismo frente ao estado patológico formado. Em relação aos níveis de oxidantes determinados, observou-se um aumento nos níveis de TBARS e proteína carbonil em soro de pacientes com IAM quando comparados com o grupo controle. Esse aumento também foi observado para as defesas antioxidantes enzimáticas superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT). Entretanto, observou-se um decréscimo das defesas antioxidantes não enzimáticas como a vitamina C e a vitamina E no soro de pacientes com IAM. Estes dados sugerem um aumento do estresse oxidativo como resultado do momento de isquemia/reperfusão e da diminuição das defesas antioxidantes não enzimáticas. Além disso, o aumento das defesas antioxidantes enzimáticas poderiam agir como um mecanismo compensatório como consequência da superprodução de EROS após o IAM. Nenhuma interferência dos medicamentos utilizados no tratamento do IAM foram observadas sobre os parâmetros testados in vitro. Concluí-se então, que o IAM resulta tanto em danos oxidativos como mobilização das defesas do organismo para uma resposta compensatória.

Apyrasen (NTPDasen) sind Nukleosidtri- und diphosphat spaltende Enzyme. Bisher konnten Apyrasen in allen untersuchten Pro- und Eukaryonten nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu tierischen Organismen, in denen Apyrasen gut untersucht sind und eine Rolle in der Nukleotid-vermittelten Signaltransduktion spielen, ist in Pflanzen weit weniger bekannt. In dem Modellorganismus A. thaliana wurden bisher zwei Apyrasen – AtAPY1 und AtAPY2 – als funktionell beschrieben. Durch Knockoutstudien konnte gezeigt werden, dass beide Apyrasen redundant sind. Der Doppelknockout der AtAPY1 und AtAPY2 ist im Gegensatz zum Einzelknockout einer Apyrase letal. Auf Grund von Vorarbeiten wurde die AtAPY1 extrazellulär im Apoplasten vermutet, wo sie eine Rolle im ATP-Signalweg spielen könnte. In der vorliegenden Arbeit sollte die Apyrase 1 (AtAPY1) biochemisch charakterisiert und subzellulär lokalisiert werden. Die Aufklärung der biochemischen Eigenschaften und der subzellullären Lokalisation der AtAPY1 würde entscheidend mithelfen, die Funktion der Apyrasen in Pflanzen aufzuklären. Für die biochemische Charakterisierung wie der Bestimmung des pH-Optimums und des Substratspektrums der AtAPY1 war die Reinigung einer aktiven AtAPY1 notwendig. Da eine Überexpression einer aktiven AtAPY1 in E. coli nicht möglich war, wurde zur biochemischen Charakterisierung die AtAPY1 mit verschiedenen Systemen in vitro translatiert. Bei Verwendung von Retikulozytenextrakten konnte die AtAPY1 in vitro translatiert werden, zeigte aber in den Aktivitätstests keine Aktivität. Auf Grund ihrer enzymatischen Aktivität und Struktur scheint die AtAPY1 inhibierend auf verschiedene Expressionssysteme zu wirken, was die Gewinnung von aktiver AtAPY1 stark limitiert. In einem weiteren Ansatz wurde die AtAPY1-GFP nativ aus transgenen A. thaliana mittels anti-GFP markierter Matrix gereinigen. Die Reinigung der AtAPY1-GFP aus dem Gesamtproteinextrakt war erfolgreich und die immobilisierte AtAPY1-GFP zeigte eine Apyraseaktivität. Eine anschließende Elution des Proteins von der Matrix war allerdings zu stringent und führte zum vollständigen Aktivitätsverlust. Für die subzelluläre Lokalisation wurden Apyraseeinzelknockouts in Vorarbeiten mit zwei unabhängigen Konstrukten transformiert: zum einen wurde die Atapy1 C-terminal mit dem SNAP-Tag fusioniert und unter ihrem nativen Promotorbereich exprimiert, zum anderen erfolgte eine Überexpression der AtAPY1-GFP unter dem konstitutiven CaMV 35S-Promotor. Die komplementierten Pflanzen zeigten keine phänotypischen Unterschiede im Vergleich zum Wildtyp. Durch Immunfluoreszenz und in vivo Mikroskopie konnte die AtAPY1 in vesikelartigen Strukturen, jedoch nicht in der Plasmamembran oder extrazellulären Matrix nachgewiesen werden. Um die detektierten Strukturen einem Organell zuzuordnen, wurden Co-Lokalisationsstudien durchgeführt. Für Co-Lokalisation wurden die AtAPY1-GFP Pflanzen mit Markerproteinen transformiert oder mit den entsprechenden transgenen Pflanzen gekreuzt. Zum Nachweis der AtAPY1-GFP im sekretorischen Weg oder endozytotischen Vesikeln wurden transgene AtAPY1-GFP Pflanzen mit RabE1d-YFP transformiert, was jedoch keine Co-Lokalisation zeigte. Anschließend erfolgten Kreuzungen mit transgenen Pflanzen, die die Golgi-Markerproteine Membrin 12, Syntaxin of plants 32 oder Golgi transport protein 1-Homolog exprimierten. Mit allen drei Kreuzungen konnte eine Co-Lokalisation der AtAPY1-GFP mit dem entsprechenden Markerprotein im Golgi gezeigt werden. Durch eine zusätzliche Behandlung der AtAPY1-GFP Pflanzen mit dem Membranfarbstoff FM4-64, welcher das trans-Golgi-Netzwerk aber nicht den Golgi-Apparat anfärbt und dem fungiziden Toxin Brefeldin A, welches zur Bildung von BFA-Kompartimenten durch die Fusion des trans-Golgi-Netzwerks mit Endosomen und Teilen des trans-Golgi-Apparates führt, konnte die AtAPY1-GFP dem Golgi-Apparat zugewiesen werden. Weiterhin wurde untersucht, ob die AtAPY1 löslich oder membrangebunden im Golgi-Apparat vorliegt. Um zwischen löslichen, peripheren und integralen Membranproteinen zu unterscheiden, wurde das mikrosomale Pellet mit verschiedenen Detergenzien und Salzen behandelt. Hohe Salz- (2 M NaCl) und alkalische Bedingungen (0,2 M Na2CO3) führten zur Ablösung peripherer Proteine von der Membran. Harnstoff (4 M) und das anionische Detergenz SDS (0,2 %) führten zur Denaturierung von Proteinen und zum Nachweis integraler Proteine. Es konnte gezeigt werden, dass die AtAPY1-GFP ein integrales Membranprotein ist, da sie ausschließlich in den mit SDS und Harnstoff behandelten Fraktionen im Überstand mittels Western Blot nachgewiesen werden konnte. Die genaue Funktion der AtAPY1 im Golgi-Apparat ist noch ungeklärt, da der Fokus der bisherigen Apyraseforschung von einer Lokalisation der AtAPY1 in der Plasmamembran ausging und frühere Ergebnisse in neuem Kontext diskutiert werden müssen.

Apyrasen (NTPDasen) sind Nukleosidtri- und diphosphat spaltende Enzyme. Bisher konnten Apyrasen in allen untersuchten Pro- und Eukaryonten nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu tierischen Organismen, in denen Apyrasen gut untersucht sind und eine Rolle in der Nukleotid-vermittelten Signaltransduktion spielen, ist in Pflanzen weit weniger bekannt. In dem Modellorganismus A. thaliana wurden bisher zwei Apyrasen – AtAPY1 und AtAPY2 – als funktionell beschrieben. Durch Knockoutstudien konnte gezeigt werden, dass beide Apyrasen redundant sind. Der Doppelknockout der AtAPY1 und AtAPY2 ist im Gegensatz zum Einzelknockout einer Apyrase letal. Auf Grund von Vorarbeiten wurde die AtAPY1 extrazellulär im Apoplasten vermutet, wo sie eine Rolle im ATP-Signalweg spielen könnte. In der vorliegenden Arbeit sollte die Apyrase 1 (AtAPY1) biochemisch charakterisiert und subzellulär lokalisiert werden. Die Aufklärung der biochemischen Eigenschaften und der subzellullären Lokalisation der AtAPY1 würde entscheidend mithelfen, die Funktion der Apyrasen in Pflanzen aufzuklären. Für die biochemische Charakterisierung wie der Bestimmung des pH-Optimums und des Substratspektrums der AtAPY1 war die Reinigung einer aktiven AtAPY1 notwendig. Da eine Überexpression einer aktiven AtAPY1 in E. coli nicht möglich war, wurde zur biochemischen Charakterisierung die AtAPY1 mit verschiedenen Systemen in vitro translatiert. Bei Verwendung von Retikulozytenextrakten konnte die AtAPY1 in vitro translatiert werden, zeigte aber in den Aktivitätstests keine Aktivität. Auf Grund ihrer enzymatischen Aktivität und Struktur scheint die AtAPY1 inhibierend auf verschiedene Expressionssysteme zu wirken, was die Gewinnung von aktiver AtAPY1 stark limitiert. In einem weiteren Ansatz wurde die AtAPY1-GFP nativ aus transgenen A. thaliana mittels anti-GFP markierter Matrix gereinigen. Die Reinigung der AtAPY1-GFP aus dem Gesamtproteinextrakt war erfolgreich und die immobilisierte AtAPY1-GFP zeigte eine Apyraseaktivität. Eine anschließende Elution des Proteins von der Matrix war allerdings zu stringent und führte zum vollständigen Aktivitätsverlust. Für die subzelluläre Lokalisation wurden Apyraseeinzelknockouts in Vorarbeiten mit zwei unabhängigen Konstrukten transformiert: zum einen wurde die Atapy1 C-terminal mit dem SNAP-Tag fusioniert und unter ihrem nativen Promotorbereich exprimiert, zum anderen erfolgte eine Überexpression der AtAPY1-GFP unter dem konstitutiven CaMV 35S-Promotor. Die komplementierten Pflanzen zeigten keine phänotypischen Unterschiede im Vergleich zum Wildtyp. Durch Immunfluoreszenz und in vivo Mikroskopie konnte die AtAPY1 in vesikelartigen Strukturen, jedoch nicht in der Plasmamembran oder extrazellulären Matrix nachgewiesen werden. Um die detektierten Strukturen einem Organell zuzuordnen, wurden Co-Lokalisationsstudien durchgeführt. Für Co-Lokalisation wurden die AtAPY1-GFP Pflanzen mit Markerproteinen transformiert oder mit den entsprechenden transgenen Pflanzen gekreuzt. Zum Nachweis der AtAPY1-GFP im sekretorischen Weg oder endozytotischen Vesikeln wurden transgene AtAPY1-GFP Pflanzen mit RabE1d-YFP transformiert, was jedoch keine Co-Lokalisation zeigte. Anschließend erfolgten Kreuzungen mit transgenen Pflanzen, die die Golgi-Markerproteine Membrin 12, Syntaxin of plants 32 oder Golgi transport protein 1-Homolog exprimierten. Mit allen drei Kreuzungen konnte eine Co-Lokalisation der AtAPY1-GFP mit dem entsprechenden Markerprotein im Golgi gezeigt werden. Durch eine zusätzliche Behandlung der AtAPY1-GFP Pflanzen mit dem Membranfarbstoff FM4-64, welcher das trans-Golgi-Netzwerk aber nicht den Golgi-Apparat anfärbt und dem fungiziden Toxin Brefeldin A, welches zur Bildung von BFA-Kompartimenten durch die Fusion des trans-Golgi-Netzwerks mit Endosomen und Teilen des trans-Golgi-Apparates führt, konnte die AtAPY1-GFP dem Golgi-Apparat zugewiesen werden. Weiterhin wurde untersucht, ob die AtAPY1 löslich oder membrangebunden im Golgi-Apparat vorliegt. Um zwischen löslichen, peripheren und integralen Membranproteinen zu unterscheiden, wurde das mikrosomale Pellet mit verschiedenen Detergenzien und Salzen behandelt. Hohe Salz- (2 M NaCl) und alkalische Bedingungen (0,2 M Na2CO3) führten zur Ablösung peripherer Proteine von der Membran. Harnstoff (4 M) und das anionische Detergenz SDS (0,2 %) führten zur Denaturierung von Proteinen und zum Nachweis integraler Proteine. Es konnte gezeigt werden, dass die AtAPY1-GFP ein integrales Membranprotein ist, da sie ausschließlich in den mit SDS und Harnstoff behandelten Fraktionen im Überstand mittels Western Blot nachgewiesen werden konnte. Die genaue Funktion der AtAPY1 im Golgi-Apparat ist noch ungeklärt, da der Fokus der bisherigen Apyraseforschung von einer Lokalisation der AtAPY1 in der Plasmamembran ausging und frühere Ergebnisse in neuem Kontext diskutiert werden müssen.:ABKÜRZUNGEN 7 1. EINLEITUNG 9 1.1. APYRASEN 9 1.2. APYRASEN IN TIEREN 11 1.2.1. ROLLE DER NTPDASEN BEI DER THROMBOZYTENAGGREGATION 11 1.3. APYRASEN IN PFLANZEN 12 1.3.1. ROLLE EXTRAZELLULÄRER APYRASEN 13 1.3.2. GOLGI LOKALISIERTE APYRASEN 15 1.3.3. KENNTNISSTAND ÜBER APYRASEN IN A. THALIANA 16 1.4. VORARBEITEN 20 1.5. ZIELSTELLUNG 21 2. MATERIAL 22 2.1. GERÄTE 22 2.2. CHEMIKALIEN 23 2.3. HÄUFIG GENUTZTE PUFFER 24 2.4. BESONDERE VERBRAUCHSMATERIALIEN 24 2.5. KITS/STANDARDS 25 2.6. ENZYME 25 2.7. VEKTOREN 26 2.8. ZELLLINIEN 26 2.9. OLIGONUKLEOTIDE 27 2.10. ANTIKÖRPER (AK) 28 2.11. ANTIBIOTIKA/HERBIZIDE 28 2.12. VERWENDETE PFLANZENLINIEN 29 2.13. SCHLÜSSELNUMMERN (ACCESSION CODES) 29 2.14. SPEZIELLE SOFTWARE 30 3. METHODEN 31 3.1. ALLGEMEINE METHODEN 31 3.1.1. PFLANZENKULTIVIERUNG 31 3.1.1.1. Arabidopsis thaliana 31 3.1.1.2. Nicotiana benthamiana 31 3.1.2. KREUZEN VON A. THALIANA 31 3.1.3. TRANSFORMATION 31 3.1.3.1. Bakterien 31 3.1.3.2. Arabidopsis thaliana 32 3.2. MOLEKULARBIOLGISCHE METHODEN 33 3.2.1. PLASMIDPRÄPARATION 33 3.2.2. RNA-EXTRAKTION 33 3.2.3. REVERSE TRANSKRIPTION 33 3.2.4. NACHWEIS DER INTEGRITÄT VON RNA UND CDNA 34 3.2.5. DNA-EXTRAKTION AUS PFLANZEN 34 3.2.6. POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 35 3.2.7. AGAROSE-GELELEKTROPHORESE VON DNA 35 3.2.8. REINIGUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 36 3.2.9. DNA-FÄLLUNG 36 3.2.10. KLONIERUNG DER ATAPY1-HIS UND SNAP-HIS IN E. COLI 36 3.3.1. KOMPLEMENTATION VON APYRASE DOPPELKNOCKOUT MUTANTEN 37 3.3.2. IMMUNFLUORESZENZ 38 3.3.2.1. Probenpräparation 38 3.3.2.2. Konfokale Mikroskopie 39 3.3.3. IN VIVO MIKROSKOPIE VON ATAPY1-GFP EXPRIMIERENDEN KEIMLINGEN 39 3.3.3.1. FM4-64 und Brefeldin A – Behandlung 39 3.3.3.2. Co-Lokalisation mit RabE1d, MEMB12, GOT1P-Homolog, SYP32 40 3.3.4. PROTOPLASTENISOLATION 40 3.3.5. PH-WECHSEL IM APOPLASTEN VON ATAPY1-GFP-KEIMLINGEN 41 3.4. PROTEIN-BIOCHEMISCHE METHODEN 41 3.4.1. PROTEINISOLATION 41 3.4.2. SOLUBILISIERUNG VON MEMBRANPROTEINEN 41 3.4.3. PROTEINBESTIMMUNG 42 3.4.4. SDS-PAGE 42 3.4.5. WESTERN BLOT 43 3.4.6. COOMASSIE-FÄRBUNG 43 3.4.7. KOLLOIDALE COOMASSIE-FÄRBUNG 44 3.4.8. PONCEAU-S-FÄRBUNG 44 3.4.9. IMMUNDETEKTION 44 3.4.10. PROTEINREINIGUNG MITTELS NI-NTA-SÄULENCHROMATOGRAPHIE 45 3.4.11. ISOLATION UND REINIGUNG DER ATAPY1-GFP AUS A. THALIANA 46 3.4.12. IN-VITRO TRANSLATION (IVT) ATAPY1-GFP UND ATAPY1-SNAP 46 3.4.13. QUANTIFIZIERUNG DES ATAPY1-SNAP-PROTEINS (IVT) 47 3.4.14. AKTIVITÄTSMESSUNG DER ATAPY1 48 3.4.14.1. Eisensulfat-Test 48 3.4.14.2. Malachitgrün-Test 49 4. ERGEBNISSE 50 4.1. SUBZELLULÄRE LOKALISATION DER ATAPY1 50 4.1.1. KOMPLEMENTATION DES LETALEN ATAPY1 UND ATAPY2 DOPPELKNOCKOUTS 50 4.1.2. DIE ATAPY1 IST IM GOLGI-APPARAT LOKALISIERT 55 4.1.2.1. Indirekte Immunfluoreszenz von AtAPY1-SNAP in Vesikeln 55 4.1.2.2. AtAPY1-GFP lokalisiert in Vesikeln 56 4.1.2.3. Keine Lokalisation der AtAPY1 in Plasmamembran und Apoplast 58 4.1.3. CO-LOKALISATIONSSTUDIEN DER ATAPY1-GFP 59 4.1.3.1. Keine Co-Lokalisation in sekretorischen Vesikeln 60 4.1.3.2. AtAPY1 ist Brefeldin A-sensitiv 61 4.1.3.3. AtAPY1 co-lokalisiert nicht mit FM4-64 64 4.1.3.4. Co-Lokalisation mit den Golgimarkerproteinen MEMB12, GOT1P-Homolog und SYP32 65 4.1.4. ATAPY1 IST EIN INTEGRALES MEMBRANPROTEIN 67 4.2. BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER ATAPY1 69 4.2.1. EXPRESSION DER ATAPY1 IN E. COLI 69 4.2.2. IN VITRO TRANSLATION DER ATAPY1 71 4.2.3. REINIGUNG DER ATAPY1 AUS A. THALIANA 74 4.2.4. AKTIVITÄTSBESTIMMUNG DER ATAPY1 75 5. DISKUSSION 77 5.1. BEDEUTUNG DER LOKALISATION DER ATAPY1 FÜR DIE APYRASEFORSCHUNG 77 5.2. FUNKTION DER ATAPY1 IM GOLGI-APPARAT 78 5.2.1. AKKUMULATION VON STÄRKEGRANULA IN CHLOROPLASTEN 79 5.2.2. ROLLE DER APYRASEN BEI DER ZELLDIFFERENZIERUNG 81 6. AUSBLICK 86 7. ZUSAMMENFASSUNG 88 8. ABBILDUNGS- UND TABELLENVERZEICHNIS 90 9. LITERATURVERZEICHNIS 92 10. ANHANG 106

Introdução: A fisiopatologia da doença de Parkinson está associada a lesões por estresse oxidativo/nitrosativo. O ferro encontra-se acumulado na substância negra (SN) de pacientes com DP e está relacionado com esse dano através das espécies reagentes de oxigênio (EROs) e de nitrogênio (ERNs) na reação de Fenton. EROs e ERNs são produzidas normalmente em processos celulares e inflamatórios, e controladas por sistemas antioxidantes. Objetivo: Avaliar níveis periféricos de ferro em pacientes com DP para determinar se acúmulo na SN está relacionado com níveis elevados no sangue. Determinar biomarcadores periféricos confiáveis de estresse oxidativo/nitrosativo Métodos: Selecionados 40 pacientes com DP e 46 indivíduos controles para comparar níveis séricos de ferro, ferritina e transferrina, e de biomarcadores de estresse oxidativo/nitrosativo: superóxido dismutase (SOD), catalase, óxido nítrico (NOx), substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), tióis não-proteicos, “advanced oxidation protein products” (AOPP), “ferric reducing ability of plasma” (FRAP), NTPDases, ecto-5’-nucleotidase, adenosina deaminase (ADA), mieloperoxidase, albumina modificada pela isquemia (IMA) e vitamina C. Resultados: Níveis de ferro estavam diminuídos em pacientes com DP, enquanto ferritina e transferrina não mostraram diferença. Os biomarcadores de estresse oxidativo como TBARS, AOPP, NTPDases, IMA, mieloperoxidase, FRAP, vitamina C e tiois não-proteicos encontraram-se significativamente aumentados na DP. SOD, catalase, ecto-5’-nucleotidase não foram diferentes entre os grupos e os marcadores NOx e ADA foram significativamente aumentados nos controles. Nenhuma correlação foi encontrada entre os biomarcadores e dados sociodemográficos e de características da doença. Conclusão: Níveis plasmáticos de ferro encontram-se diminuídos em pacientes com DP comparados com controles saudáveis. Os biomarcadores TBARS, AOPP, NTPDases, IMA e mieloperoxidase mostraram-se confiáveis para lesão oxidativa, enquanto tióis não-proteicos, FRAP e vitamina C demonstram diminuição da capacidade antioxidante na DP. / Background: Parkinson’s disease (PD) pathophysiology is associated with oxidative/nitrosative stress damage. Iron accumulates in the substantia nigra (SN) of PD patients and is related to this damage along with oxygen and nitrogen reactive species (ROS, RNS) through Fenton reaction. ROS and RNS are normally produced in cell and inflammatory processes, controlled by antioxidant systems. Objective: To determine peripheral levels of iron, ferritin and transferrin in PD patients to evaluate whether iron accumulation in the SN could be related to serum levels. To determine reliable peripheral biomarkers of oxidative/nitrative stress. Methods: Forty PD patients and 46 controls were selected to compared serum levels of iron, ferritin, transferrin and oxidative/nitrative stress biomarkers: superoxide dismutase (SOD), catalase, nitric oxide (NOx), thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), non-protein thiols, advanced oxidation protein products (AOPP), ferric reducing ability of plasma (FRAP), NTPDases, ecto-5’-nucleotidase, adenosine deaminase (ADA), myeloperoxidase, ischemic-modified albumin (IMA) and vitamin C. Results: Iron levels were decreased in patients with PD, while ferritin and transferrin were not different. Oxidative stress biomarkers, TBARS, AOPP, NTPDases, IMA, myeloperoxidase, FRAP, vitamin C and non-proteic thiols were significantly higher in PD. SOD, catalase, ecto-5’-nucleotidase were not different between the groups and biomarkers NOx and ADA were significantly increased in the controls. No correlation was found between biomarkers and sociodemographic and disease data. Conclusion: Plasmatic levels of iron are decreased in patients with PD compared to healthy controls. Biomarkers TBARS, AOPP, NTPDases, IMA and myeloperoxidase presented as reliable to measure oxidative/nitrative damage, while non-proteic thiols, FRAP and vitamin C show a decrease in the antioxidant capacity in PD.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In this study, the effects of Aluminium (Al) and of different diets, both individually and in association, were investigated through the determination of NTPDase, 5 -nucleotidase and acetylcholinesterase (AChE) activities in rat brain. In addition, we investigated said effects on oxidative stress by determining activity of the antioxidant enzyme catalase as well as lipid peroxidation by measuring TBARS levels. Male rats were exposed to Al (50 mg/kg/day) by gavage during three months. NTPDase and 5 -nucleotidase activities were then determined in synaptosomes of cerebral cortex and hippocampus, as well as in platelets. ATP, ADP and AMP hydrolysis was increased in both synaptosomes of cerebral cortex and hippocampus, as well as in platelets. AChE activity and TBARS levels were determined in homogenate of different brain structures in mice exposed to Al (2.7 mg/kg/day) by gavage during three months. The group that received Al+sodium citrate presented an increase in AChE activity in hippocampus, striatum, cortex and hypothalamus. On the other hand, the group that received only Al presented a decrease in AChE activity in hypothalamus and an increase in striatum. Moreover, AChE was determined in S1 of different brain structures, synaptosomes of cerebral cortex and erythrocytes of male rats exposed to Al (50 mg/kg/day) by gavage during three months. There was an increase in AChE activity in S1 of striatum and hypothalamus and in synaptosomes of cerebral cortex and erythrocytes. However, in S1 of cerebellum, hippocampus and cortex there was a decrease. In addition, the effect of diets rich in saturated fat and refined sugar on AChE activity in homogenate of different brain structures, on catalase activity in liver and on TBARS levels in plasma and liver were determined in female and male rats. There was a decrease in AChE activity in hippocampus, cortex and hypothalamus of male and female rats given both a diet rich in saturated fat and a diet rich in refined sugar. There was no alteration of AChE activity in cerebellum and striatum. For both diets, catalase activity was increased in liver of male and female rats. In addition, considering the alterations brought about by the individual exposure to both environmental factors, Al and diets, the effect of the association of both factors was evaluated. Thus, after a period of three months of exposure to both Al (50 mg/kg/day) by gavage and diets rich in saturated fat and saturated/polyunsaturated fat ad libitum, NTPDase and 5 -nucleotidase activities were determined in synaptosomes of cerebral cortex and platelets of rats. Animals receiving both diets in association with Al and Al/Ci presented an increase in ATP, ADP and AMP hydrolysis in synaptosomes of cerebral cortex and platelets. The results obtained in the present study demonstrate that exposure to both environmental factors, Al and diets rich in saturated fat and refined sugar, either individually or in association, affected the purinergic and cholinergic systems and caused oxidative stress in rats. / Neste estudo, investigamos os efeitos do alumínio (Al) e de diferentes dietas, individualmente e em associação, através da determinação da atividade das enzimas NTPDase, 5 -nucleotidase e acetilcolinesterase (AChE) no encéfalo de roedores. Adicionalmente, investigamos o estresse oxidativo, através da atividade da enzima antioxidante catalase, e a peroxidação lipídica pela medida dos níveis de TBARS. Ratos machos foram expostos ao Al (50 mg/kg/dia) através de gavagem, por um período de 3 meses. Após o tratamento, foi determinada a atividade das enzimas NTPDase e 5 -nucleotidase em sinaptossoma de córtex cerebral, hipocampo e plaquetas. A hidrólise dos nucleotídeos ATP, ADP e AMP foi aumentada, nas frações sinaptossomais de córtex cerebral e hipocampo bem como nas plaquetas. A atividade da AChE e os níveis de TBARS foram determinados em homogeneizado de diferentes estruturas cerebrais de camundongos expostos ao Al (2,7 mg/kg/dia), através de gavagem, por um período de 3 meses. Quanto à atividade da AChE, o grupo que recebeu Al+citrato de sódio apresentou um aumento da atividade desta enzima em hipocampo, estriado, córtex e hipotálamo. Já o grupo que recebeu só Al apresentou uma diminuição da atividade em hipotálamo e um aumento em estriado. Além disto, a atividade da AChE foi determinada em S1 de diferentes estruturas cerebrais, sinaptossoma de córtex cerebral, e em eritrócitos de ratos machos expostos à Al (50 mg/kg/dia), através de gavagem, por 3 meses. A atividade da AChE apresentou um aumento em S1 de estriado e hipotálamo, e em sinaptossoma de córtex cerebral e eritrócitos. Porém, em sobrenadante (S1) de cerebelo, hipocampo e córtex houve uma diminuição. Adicionalmente, foi determinado o efeito de dietas ricas em gordura saturada e açúcar refinado sobre a atividade da enzima AChE em homogeneizado de diferentes estruturas encefálicas, e atividade da enzima catalase em fígado, e os níveis de TBARS em plasma e fígado de ratos machos e fêmeas. A atividade da AChE em hipocampo, córtex e hipotálamo de ratos machos e fêmeas foi diminuída, após exposição a ambas as dietas, rica em gordura e rica em açúcar. Nas estruturas cerebelo e estriado não houve alteração na atividade da AChE. Após o consumo de ambas as dietas, a atividade da enzima catalase foi aumentada em fígado de ratos machos e fêmeas. Adicionalmente, considerando todas as alterações ocasionadas pela exposição individual aos fatores ambientais, Al e dietas, foi avaliado o efeito da associação entre esses dois fatores. Dessa forma, após um período de 3 meses de exposição conjunta ao Al (50 mg/kg/dia) através de gavagem e o consumo ad libitum de dietas ricas em gordura saturada e gordura saturada/poliinsaturada, foram determinadas a atividade das enzimas NTPDase e 5 - nucleotidase em sinaptossomas de córtex cerebral e plaquetas de ratos. Os animais que receberam ambas as dietas administradas em conjunto com Al e Al/Ci apresentaram um aumento na hidrólise dos nucleotídeos ATP, ADP e AMP, em sinaptossoma de córtex cerebral e plaquetas. Os resultados obtidos no presente estudo relatam que a exposição de roedores a ambos os fatores ambientais Al e dietas ricas em gordura saturada e açúcar refinado, individualmente e em conjunto, afetam os sistemas purinérico e colinérgico, e causam estresse oxidativo.

Introdução: A fisiopatologia da doença de Parkinson está associada a lesões por estresse oxidativo/nitrosativo. O ferro encontra-se acumulado na substância negra (SN) de pacientes com DP e está relacionado com esse dano através das espécies reagentes de oxigênio (EROs) e de nitrogênio (ERNs) na reação de Fenton. EROs e ERNs são produzidas normalmente em processos celulares e inflamatórios, e controladas por sistemas antioxidantes. Objetivo: Avaliar níveis periféricos de ferro em pacientes com DP para determinar se acúmulo na SN está relacionado com níveis elevados no sangue. Determinar biomarcadores periféricos confiáveis de estresse oxidativo/nitrosativo Métodos: Selecionados 40 pacientes com DP e 46 indivíduos controles para comparar níveis séricos de ferro, ferritina e transferrina, e de biomarcadores de estresse oxidativo/nitrosativo: superóxido dismutase (SOD), catalase, óxido nítrico (NOx), substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), tióis não-proteicos, “advanced oxidation protein products” (AOPP), “ferric reducing ability of plasma” (FRAP), NTPDases, ecto-5’-nucleotidase, adenosina deaminase (ADA), mieloperoxidase, albumina modificada pela isquemia (IMA) e vitamina C. Resultados: Níveis de ferro estavam diminuídos em pacientes com DP, enquanto ferritina e transferrina não mostraram diferença. Os biomarcadores de estresse oxidativo como TBARS, AOPP, NTPDases, IMA, mieloperoxidase, FRAP, vitamina C e tiois não-proteicos encontraram-se significativamente aumentados na DP. SOD, catalase, ecto-5’-nucleotidase não foram diferentes entre os grupos e os marcadores NOx e ADA foram significativamente aumentados nos controles. Nenhuma correlação foi encontrada entre os biomarcadores e dados sociodemográficos e de características da doença. Conclusão: Níveis plasmáticos de ferro encontram-se diminuídos em pacientes com DP comparados com controles saudáveis. Os biomarcadores TBARS, AOPP, NTPDases, IMA e mieloperoxidase mostraram-se confiáveis para lesão oxidativa, enquanto tióis não-proteicos, FRAP e vitamina C demonstram diminuição da capacidade antioxidante na DP. / Background: Parkinson’s disease (PD) pathophysiology is associated with oxidative/nitrosative stress damage. Iron accumulates in the substantia nigra (SN) of PD patients and is related to this damage along with oxygen and nitrogen reactive species (ROS, RNS) through Fenton reaction. ROS and RNS are normally produced in cell and inflammatory processes, controlled by antioxidant systems. Objective: To determine peripheral levels of iron, ferritin and transferrin in PD patients to evaluate whether iron accumulation in the SN could be related to serum levels. To determine reliable peripheral biomarkers of oxidative/nitrative stress. Methods: Forty PD patients and 46 controls were selected to compared serum levels of iron, ferritin, transferrin and oxidative/nitrative stress biomarkers: superoxide dismutase (SOD), catalase, nitric oxide (NOx), thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), non-protein thiols, advanced oxidation protein products (AOPP), ferric reducing ability of plasma (FRAP), NTPDases, ecto-5’-nucleotidase, adenosine deaminase (ADA), myeloperoxidase, ischemic-modified albumin (IMA) and vitamin C. Results: Iron levels were decreased in patients with PD, while ferritin and transferrin were not different. Oxidative stress biomarkers, TBARS, AOPP, NTPDases, IMA, myeloperoxidase, FRAP, vitamin C and non-proteic thiols were significantly higher in PD. SOD, catalase, ecto-5’-nucleotidase were not different between the groups and biomarkers NOx and ADA were significantly increased in the controls. No correlation was found between biomarkers and sociodemographic and disease data. Conclusion: Plasmatic levels of iron are decreased in patients with PD compared to healthy controls. Biomarkers TBARS, AOPP, NTPDases, IMA and myeloperoxidase presented as reliable to measure oxidative/nitrative damage, while non-proteic thiols, FRAP and vitamin C show a decrease in the antioxidant capacity in PD.

Introdução: A fisiopatologia da doença de Parkinson está associada a lesões por estresse oxidativo/nitrosativo. O ferro encontra-se acumulado na substância negra (SN) de pacientes com DP e está relacionado com esse dano através das espécies reagentes de oxigênio (EROs) e de nitrogênio (ERNs) na reação de Fenton. EROs e ERNs são produzidas normalmente em processos celulares e inflamatórios, e controladas por sistemas antioxidantes. Objetivo: Avaliar níveis periféricos de ferro em pacientes com DP para determinar se acúmulo na SN está relacionado com níveis elevados no sangue. Determinar biomarcadores periféricos confiáveis de estresse oxidativo/nitrosativo Métodos: Selecionados 40 pacientes com DP e 46 indivíduos controles para comparar níveis séricos de ferro, ferritina e transferrina, e de biomarcadores de estresse oxidativo/nitrosativo: superóxido dismutase (SOD), catalase, óxido nítrico (NOx), substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), tióis não-proteicos, “advanced oxidation protein products” (AOPP), “ferric reducing ability of plasma” (FRAP), NTPDases, ecto-5’-nucleotidase, adenosina deaminase (ADA), mieloperoxidase, albumina modificada pela isquemia (IMA) e vitamina C. Resultados: Níveis de ferro estavam diminuídos em pacientes com DP, enquanto ferritina e transferrina não mostraram diferença. Os biomarcadores de estresse oxidativo como TBARS, AOPP, NTPDases, IMA, mieloperoxidase, FRAP, vitamina C e tiois não-proteicos encontraram-se significativamente aumentados na DP. SOD, catalase, ecto-5’-nucleotidase não foram diferentes entre os grupos e os marcadores NOx e ADA foram significativamente aumentados nos controles. Nenhuma correlação foi encontrada entre os biomarcadores e dados sociodemográficos e de características da doença. Conclusão: Níveis plasmáticos de ferro encontram-se diminuídos em pacientes com DP comparados com controles saudáveis. Os biomarcadores TBARS, AOPP, NTPDases, IMA e mieloperoxidase mostraram-se confiáveis para lesão oxidativa, enquanto tióis não-proteicos, FRAP e vitamina C demonstram diminuição da capacidade antioxidante na DP. / Background: Parkinson’s disease (PD) pathophysiology is associated with oxidative/nitrosative stress damage. Iron accumulates in the substantia nigra (SN) of PD patients and is related to this damage along with oxygen and nitrogen reactive species (ROS, RNS) through Fenton reaction. ROS and RNS are normally produced in cell and inflammatory processes, controlled by antioxidant systems. Objective: To determine peripheral levels of iron, ferritin and transferrin in PD patients to evaluate whether iron accumulation in the SN could be related to serum levels. To determine reliable peripheral biomarkers of oxidative/nitrative stress. Methods: Forty PD patients and 46 controls were selected to compared serum levels of iron, ferritin, transferrin and oxidative/nitrative stress biomarkers: superoxide dismutase (SOD), catalase, nitric oxide (NOx), thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), non-protein thiols, advanced oxidation protein products (AOPP), ferric reducing ability of plasma (FRAP), NTPDases, ecto-5’-nucleotidase, adenosine deaminase (ADA), myeloperoxidase, ischemic-modified albumin (IMA) and vitamin C. Results: Iron levels were decreased in patients with PD, while ferritin and transferrin were not different. Oxidative stress biomarkers, TBARS, AOPP, NTPDases, IMA, myeloperoxidase, FRAP, vitamin C and non-proteic thiols were significantly higher in PD. SOD, catalase, ecto-5’-nucleotidase were not different between the groups and biomarkers NOx and ADA were significantly increased in the controls. No correlation was found between biomarkers and sociodemographic and disease data. Conclusion: Plasmatic levels of iron are decreased in patients with PD compared to healthy controls. Biomarkers TBARS, AOPP, NTPDases, IMA and myeloperoxidase presented as reliable to measure oxidative/nitrative damage, while non-proteic thiols, FRAP and vitamin C show a decrease in the antioxidant capacity in PD.