Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-12-26. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:54Z : No. of bitstreams: 1 Publico-11764a.pdf: 1760987 bytes, checksum: 26371946d909a5525c0bd6c7cc6d7c33 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:55Z : No. of bitstreams: 2 Publico-11764a.pdf: 1760987 bytes, checksum: 26371946d909a5525c0bd6c7cc6d7c33 (MD5) Publico-11764b.pdf: 969495 bytes, checksum: d87ae7194b036aaff67581e32d434f64 (MD5) / Objetivo: Verificar se indivíduos susceptíveis e não-susceptíveis às convulsões clônicas induzidas pelo DMCM, um agonista inverso benzodiazepínico, diferem: 1) na sensibilidade ao efeito hipnótico induzido pelo diazepam e por outros moduladores alostéricos positivos do receptor GABAA; 2) na marcação auto-radiográfica com o [3H]- flunitrazepam ao longo do encéfalo; 3) na marcação de [3H]-L-glutamato e do [3H]-MK 801 em membranas de regiões encefálicas; e 4) na atividade da enzima Na+/K+- ATPase, bem como na marcação da [3H]-ouabaína às isoenzimas Na+/K+- ATPase de alta e de baixa afinidade ao radioligante em membranas de regiões encefálicas. Métodos: Ratos Wistar, machos, adultos foram administrados intraperitonealmente duas vezes com uma DC50 de DMCM (com intervalo de uma semana entre as administrações), obtendo-se dois grupos distintos: o grupo susceptível às convulsões (SC), que apresentou convulsões clônicas em ambas as exposições à droga, e o grupo não-susceptível às convulsões (NSC), que não apresentou alterações motoras em ambas as exposições. Após cerca de 25 dias da segunda administração de DMCM, os grupos selecionados foram submetidos aos experimentos com os hipnóticos diazepam, pentobarbital e etanol, nos quais foram registrados o tempo e a latência de sono ou foram sacrificados e seus encéfalos retirados para os seguintes ensaios bioquímicos: 1) auto-radiografia com o [3H]-flunitrazepam; 2) marcação de [3H]-L-glutamato e de [3H]- MK 801 em membranas neuronais; e 3) atividade enzimática da Na+/K+- ATPase e marcação de [3H]-ouabaína em enzimas de alta e baixa afinidade em membranas neuronais. Resultados: O grupo SC apresentou menor tempo de sono induzido pelo diazepam com relação ao grupo NSC, embora não tenham se distinguindo no tempo de sono induzido pelo pentobarbital e pelo etanol. Com relação aos experimentos bioquímicos, observou-se uma menor marcação de [3H]-flunitrazepam na região CA2 ventral do hipocampo no grupo SC. Quanto à ligação de [3H]-L-glutamato foi menor no grupo SC nas regiões do córtex frontal, amígdala + córtex límbico e hipocampo, enquanto que a ligação de [3H]-MK 801 foi menor no córtex frontal, hipocampo e estriado. Embora os grupos não tenham se diferenciado na atividade enzimática da Na+/K+- ATPase, o grupo SC apresentou uma menor marcação da [3H]-ouabaína em isoenzimas de alta afinidade nas regiões do tronco encefálico, córtex frontal e hipocampo, bem como uma menor marcação de [3H]-ouabaína nas regiões do tronco encefálico e córtex frontal em isoenzimas de baixa afinidade. Conclusão: As diferenças entre os grupos quanto à sensibilidade ao efeito convulsivante do DMCM, à ansiedade observada em experimentos anteriores, bem como à sensibilidade ao efeito hipnótico do diazepam podem estar associadas a uma diferença nos sítios benzodiazepínicos da região CA2 ventral do hipocampo, na ix atividade glutamatérgica e em isoformas específicas da Na+/K+- ATPase em determinadas regiões encefálicas. / Objective: The aim of this work was to verify if rats susceptible and non-susceptible to clonic convulsions induced by DMCM, a benzodiazepine inverse agonist, differ: 1) in the sensitivity to the hypnotic effect induced by diazepam and by others positive allosteric modulators of GABAA receptors; 2) in auto-radiographical analysis of [3H]-flunitrazepam binding along the brain; 3) in the binding of [3H]-L-glutamate and of [3H]-MK 801 in membranes from discrete brain regions; and 4) in the Na+/K+-ATPase activity, as well as in the binding of [3H]-ouabain to Na+/K+-ATPase isoenzimes with high and low affinity to the radioligand in membranes from discrete brain regions. Methods: Adult, male, Wistar rats were administered with two intraperitoneal injections of a convulsant dose 50% (CD50) of DMCM (one-week interval between them), resulting in two distinct groups: the group susceptible to clonic convulsions (SC), which presented clonic convulsions in both the expositions to the drug, and the group nonsusceptible to clonic convulsions (NSC), which did not present any motor disturbance in both the expositions. After 25 days from the second exposition to DMCM, the selected groups were submitted to the experiments with the hypnotics diazepam, pentobarbital and ethanol, in which were registered the latency and the time of sleep or they were sacrified and their brains were removed to carry out the following assays: 1) autoradiography with [3H]-flunitrazepam; 2) binding with the [3H]-L-glutamate and with the [3H]-MK 801 in neuronal membranes; 3) enzymatic activity of Na+/K+-ATPase and binding of [3H]-ouabain to the isoenzimes with high and low affinity in neuronal membranes. Results: The SC group presented a lower sleeping time induced by diazepam compared to the NSC group, and did not differ in the sleeping time induced by pentobarbital and ethanol. Concearning the biochemical experiments, it was observed a lower binding of [3H]-flunitrazepam in the CA2 subregion of ventral hippocampus in the SC group. A lower binding of [3H]-L-glutamate was also observed in the SC group in the frontal cortex, amygdala plus limbic cortex and hippocampus, whereas the binding of [3H]-MK 801 was lower in the frontal cortex, hippocampus and striatum compared to the NSC group. Althougt the groups did not differ in the enzymatic activity of Na+/K+- ATPase, the SC group presented a lower binding of [3H]-ouabain to the high-affinity isoenzimes in the brainstem, frontal cortex and hippocampus, as well as a lower binding of [3H]-ouabain to the low-affinity isoenzimes in the brainstem and in the frontal cortex compared to the NSC group. Conclusion: The differences between the groups concerning the sensitivity to the convulsant effect of DMCM, the level of anxiety previously observed, as well as the sensitivity to the hypnotic effect of diazepam may be associated with the GABAA/benzodiazepine site in CA2 subregion of ventral hippocampus, with glutamatergic activity and with specific isoforms of Na+/K+-ATPase in rat brain regions. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The organotellurium compounds have been the subject of research due to their pharmacological and toxicological properties. It is believed that the main mechanism involved in the toxicity of these compounds is the ability to interact with sulfhydryl groups from molecules biologically active. Beyond the toxicological effects, some pharmacological properties have been attributed to organotellurium compounds. This study aimed to investigate the potential toxicological and pharmacologic of 2-phenylethynyl-butyltellurium (PEBT) through experiments in vitro and in vivo in rodents. To evaluate the toxicological effect the PEBT was used at different concentrations in the oxidation of mono and dithiols and analysis of enzyme Na+K+ -ATPase and lactate dehydrogenase in vitro. Furthermore, lethality studies were performed to calculate the LC50 LD50 of this compound and for better understanding their toxicity. To evaluate the pharmacological effect the PEBT was used at a dose of 1mg/kg 30 minutes before the behavioral experiments, evaluation of locomotor activity, forced swim test (FST) and the tail suspension test (TST), immediately after testing the cerebral cortex was removed for analysis of monoamine oxidase (MAO) enzyme. The results showed that the PEBT oxidized thiols of low molecular weight and inhibits the activity of the enzyme Na+K+ - ATPase by oxidation of sulfhydryl groups, and such oxidation is dependent on the tellurium atom in the structure of this compound. Moreover, the acute administration of PEBT showed an antidepressant-like effect on TNF in mice, as well inhibits the activity of MAO-A enzyme in the cerebral cortex, demonstrating the involvement of this enzyme in its antidepressant-like effect. / Os compostos orgânicos de telúrio têm despertado o interesse dos pesquisadores, devido as suas propriedades farmacológicas e toxicológicas. Acredita-se que o principal mecanismo envolvido na toxicidade desses compostos, seja a capacidade de interagir com os grupamentos sulfidrílicos de moléculas biologicamente ativas. Além dos efeitos toxicológicos, propriedades farmacológicas vêm sendo atribuídas aos compostos orgânicos de telúrio. Esse estudo teve como objetivo investigar o potencial toxicológico e farmacológico do 2- feniletinilbutil-telúrio (PEBT), através de experimentos in vitro e in vivo em roedores. Para a avaliação toxicológica, o PEBT foi utilizado em diferentes concentrações na oxidação de mono e ditiois e na determinação da atividade das enzimas Na+K+ -ATPase e lactato desidrogenase, in vitro. Ainda nesse sentido estudos de letalidade foram realizados para calcular a CL50 e DL50 desse composto para melhor compreender a sua toxicidade. Para a avaliação farmacológica, o PEBT foi administrado em camundongos, na dose de 1 mg/kg 30 minutos antes dos experimentos comportamentais, avaliação da atividade locomotora, teste do nado forçado (TNF) e teste de suspensão da cauda (TSC). Após os testes comportamentais, os animais foram mortos e o córtex cerebral foi retirado para determinação da atividade da enzima monoamina oxidase (MAO). Os resultados mostraram que o PEBT oxida tióis de baixo peso molecular e inibe a atividade da enzima Na+K+ -ATPase, pela oxidação de seus grupamentos sulfidrilicos, sendo essa oxidação depende da presença do átomo de telúrio na estrutura do composto. Além disso, a administração aguda do PEBT produz um efeito do tipo antidepressivo no TNF em camundongos, bem como inibe a atividade da enzima MAO-A em córtex cerebral, demonstrando o envolvimento dessa enzima no seu efeito do tipo antidepressivo.

A ouabaína (OUA) promoveu hipertensão arterial (HA) após 5, 10 e 20 semanas de tratamento e modificou a função vascular de artérias mesentéricas de resistência (AMR). O tratamento por 5 semanas com OUA aumentou o óxido nítrico (NO) e a expressão protéica da isoforma neuronal de óxido nítrico (nNOS), ao passo que diminuiu os prostanóides vasoconstritores. Além disso, reduziu a expressão protéica da Cu-Zn superóxido dismutase (SOD) e aumentou a atividade funcional da Na+K+-ATPase. Já o tratamento por 10 semanas com OUA aumentou NO e prostanóides vasodilatadores, enquanto diminuiu a expressão protéica da nNOS e da COX-2. O tratamento por 20 semanas reduziu o NO e a expressão protéica da nNOS. Porém, aumentou o ânion superóxido, o tromboxano A2 e a expressão protéica de ambas: a SOD e a COX-2. Em conclusão, o tratamento com OUA promoveu HA e alterações funcionais em AMR, sendo estas dependentes do tempo analisado, pois no tratamento durante 5 e 10 semanas estas alterações não contribuem para a manutenção da HA, enquanto que o tratamento durante 20 semanas contribui. / Ouabain treatment (OUA) developed hypertension after 5, 10 and 20 weeks and modified the vascular function in mesenteric resistance arteries (MRA). 5-weeks treatment with OUA increased nitric oxide (NO) and neuronal isoform of nitric oxide (nNOS) protein expression. On the other side, this treatment reduced vasoconstrictors prostanoids. Besides decreased Cu-Zn superoxide dismutase (SOD) protein expression and increased functional activity of Na+K+-ATPase. 10-weeks treatment enhance NO and vasodilators prostanoids but reduced both nNOS and COX-2 protein expression. 20-weeks treatment reduced NO and nNOS protein expression. Nevertheless increased anion superoxide, tromboxan A2 and both SOD and COX-2 protein expression. In conclusion, OUA treatment induced HA and functional alterations in MRA that are time-dependents, because in 5 and 10 weeks of treatment these alterations are not likely to maintenance of HA, but the changes observed in the treatment during 20 weeks contributes.

As propriedades bioquímicas da (Na+,K+)-ATPase branquial do siri eurialino Callinectes danae aclimatado à salinidade de 15 o/oo foram estudadas. A análise do gradiente de centrifugação em sacarose revelou a presença de um único pico entre 30-35% de sacarose, com uma boa correlação entre as atividades PNFFase a ATPase totais e (Na+,K+)-ATPase. A atividade residual observada na presença de ouabaína 3 mM sugere a presença de outros sistemas de enzimas atuantes. A eletroforese em condições desnaturantes nos microsomas de brânquias de C. danae em animais recém-coletados em salinidade de 33 o/oo (não aclimatados) e de aclimatados a salinidades de 15 e 33 o/oo por um período de 10 dias mostrou a presença de pequenas diferenças nos padrões eletroforéticos das diferentes amostras. A análise por Western blot mostrou um aumento significativo da proporção relativa da subunidade alfa da (Na+,K+)-ATPase em relação à proteína total na fração microsomal do tecido branquial de animais aclimatados à salinidade de 15 o/oo quando comparados aos animais aclimatados a 33 o/oo. Entretanto, proporções similares de subunidade alfa foram observadas para amostras de animais recém-coletados a salinidade de 33 o/oo e aclimatados a 15 o/oo. A estimulação da atividade (Na+,K+)-ATPase pelo ATP ocorreu através de uma curva de saturação monofásica apresentando interações sítio-sítio (nH=1,2), com V= 298,8 ± 16,7 U/mg, com K0,5 de 174,2 ± 9,8 uM. A estimulação da atividade ATPase da (Na+,K+)-ATPase por íons Mg2+ (V= 299,16 ± 14,06 U/mg; K0,5= 767,31 ± 36,06 uM), íons Na+ (V= 309,0 ± 15,8 U/mg; K0,5= 7,8 ± 0,4 mM), íons K+ (V= 300,6 ± 15,3 U/mg; K0,5= 1,63 ± 0,08 mM) e íons NH4+ (V= 345,1 ± 19,0 U/mg; K0,5= 6,0 ± 0,3 mM) ocorreu através de interações sítio-sítio. A atividade da enzima foi modulada sinergisticamente pelos íons K+ com atividade máxima variando de 300,6 ± 15,3 U/mg para 514,6 ± 26,2 U/mg, na ausência e na presença 50 mM de íons NH4+, respectivamente. Além disso, foi observado um significativo aumento na afinidade aparente da enzima pelo íon K+ da ordem de 10 vezes (diminuiu de 1,6 ± 0,08 mM para 0,157 ± 0,008 mM). Similarmente ao observado para os íons K+, o íon NH4+ estimulou sinergisticamente a atividade da enzima na presença de diferentes concentrações de íons K+. A estimulação da atividade da enzima pelo íon NH4+ também ocorreu através de interações cooperativas entre os sítios. Embora tenha sido observado um aumento da atividade específica da enzima de 345,1 ± 19,0 U/mg para 516,8 ± 27,9 U/mg, não foram observadas variações significativas nos valores de nH e K0,5 com o aumento da concentração de íons K+. A ouabaína inibiu cerca de 90% da atividade ATPase total. A inibição pela ouabaína apresentou valor de KI de 45,09 ± 2,51 uM. O ortovanadato também inibiu atividade (Na+,K+)-ATPase na mesma faixa (90%) através de uma curva de inibição monofásica, com valor de KI da ordem de 1,31 ± 0,06 uM. O emprego de bafilomicina A1, tapsigargina e teofilina, juntamente com a ouabaína, na atividade ATPase total descartam a presença de V-ATPase, Ca2+-ATPase ou fosfatase, respectivamente. Apesar da inibição por oligomicina corresponder a menos de 3,7%, esse valor aparentemente sugere a presença de uma F0F1-ATPase. Além disso, a inibição por ácido etacrínico, em conjunto com os experimentos de estimulação por da atividade ATPase da enzima por íons Na+ sugere fortemente a presença de uma K+-ATPase. A (Na+,K+)-ATPase hidrolisou o substrato PNFF obedecendo à cinética Michaeliana com velocidade de V= 102,9 ± 4,3 U/mg e KM= 1,7 ± 0,1 mM. Já a estimulação da atividade K+-fosfatase da enzima por íons Mg2+ (V= 93,7 ± 2,3 U/mg; K0,5= 1,40 ± 0,03 mM), K+ (V= 94,9 ± 3,5 U/mg; K0,5= 2,9 ± 0,1 mM) e NH4+ (V= 106,2 ± 2,2 U/mg; K0,5= 9,8 ± 0,2 mM) seguiu uma cinética cooperativa, sugerindo a presença de múltiplos sítios de ligação. Entretanto, a atividade K+-fosfatase não foi estimulada sinergísticamente na presença de íons K+ mais NH4+. Os íons sódio (KI= 22,7 ± 1,7 mM) e ortovanadato (KI= 28,1 ± 1,4 nM) inibiram completamente a atividade fosfatase total através de uma única curva de inibição. / The biochemical properties of the (Na+,K+)-ATPase from the gill microsomal tissue of the euryhaline, marine, swimming crab Callinectes danae, acclimated to 15 0/00 salinity, were investigated. Sucrose gradient centrifugation analyses revealed a unique peak, between 30-35% sucrose, coincident with the total PNPPase, ATPase, and (Na+,K+)-ATPase activities. The residual activity observed in the presence of 3 mM ouabain suggests the existence of other enzyme systems. Electrophoresis under denaturing conditions, using material from fresh-caught crabs (33 o/oo salinity, not acclimated), and from crabs acclimated to 15 or 33 o/oo salinity, for 10 days, revealed differences in migration pattern. Western blot analyses showed a significant increase in the amount of (Na+,K+)-ATPase alpha-subunit relative to total protein, for crabs acclimated to 15 o/oo compared to those acclimated to 33 o/oo salinity. However, the proportion of alpha-subunit in samples from fresh-caught crabs acclimated to 33 o/oo and those acclimated to 15 o/oo salinity was similar. (Na+,K+)-ATPase activity was stimulated by ATP and showed a single saturation curve, exhibiting site-site interactions (nH=1.2), with V= 298.8 ± 16.7 U/mg, and K0.5= 174.2 ± 9.8 uM. Stimulation of the ATPase activity by Mg2+ (V= 299.16 ± 14.06 U/mg; K0.5= 767.31 ± 36.06 uM), Na+ (V= 309.0 ± 15.8 U/mg; K0.5= 7.8 ± 0.4 mM), K+ (V= 300.6 ± 15.3 U/mg; K0.5= 1.63 ± 0.08 mM) and NH4+ ions (V= 345.1 ± 19.0 U/mg; K0.5= 6.0 ± 0.3 mM) occurred through site-site interactions. (Na+,K+)-ATPase activity was synergistically modulated by K+ ions, maximum activity varying from 300.6 ± 15.3 U/mg to 514.6 ± 26.2 U/mg, in the absence and presence of 50 mM NH4+ ions, respectively. K+ ions induced a 10-fold increase in enzyme apparent affinity (from 1.6 ± 0.08 mM to 0.157 ± 0.008 mM). As for K+ ions, NH4+ synergistically stimulated enzyme activity in the presence of variable K+ concentrations. The stimulation by NH4+ ions exhibited cooperative, site-site interactions. Although an increase in specific activity from 345.1 ± 19.0 U/mg to 516.8 ± 27.9 U/mg was seen, no significant changes in nH and K0.5 were observed. Ouabain inhibited total ATPase activity by about 90%, showing a KI= 45.09 ± 2.51 uM. Orthovanadate also inhibited the (Na+,K+)-ATPase with a KI of 1.31 ± 0.06 uM. Although the inhibitory effect of oligomycin was minimal (3.7%), this inhibition may suggest F0F1-ATPase activity. The inhibition by ethacrynic acid, in association with Na+ ion stimulation of the ATPase activity, suggests the presence of a K+-ATPase. The (Na+,K+)-ATPase hydrolyzed PNPP (K+-phosphatase activity) obeying Michaelian kinetics, with V= 102.9 ± 4.3 U/mg and KM= 1.7 ± 0.1 mM. The stimulation of K+-phosphatase activity by Mg2+ (V= 93.7 ± 2.3 U/mg; K0.5= 1.4 ± 0.03 mM), K+ (V= 94.9 ± 3.5 U/mg; K0.5= 2.9 ± 0.1 mM), and NH4+ ions (V= 106.2 ± 2.2 U/mg; K0.5= 9.8 ± 0.2 mM) following cooperative kinetics, suggests multiple binding sites. K+-phosphatase activity, however, was not synergistically stimulated by K+ and NH4+. Sodium ions (KI= 22.7 ± 1.7 mM), and orthovanadate (KI= 28.1 ± 1.4 nM) totally inhibited the total phosphatase activity.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Growing evidence has shown that leukotrienes are important contributors in the pathophysiology of several SNC inflammatory diseases where excitotoxicity is involved, including traumatic brain injury, encephalitis, Parkinson's disease, ischemia, epilepsy and neuropathic pain. However little is known about the molecular mechanism by which leukotrienes facilitate excitatory activity in the brain. Thus, in this study we investigated the effect of antagonists for cysteinyl leukotrienes receptors (CysLT) on PTZ-induced seizure in mice. Bay-u9973 (3 and 30 nmol), montelukast (0.03 and 0.3 μmol) and pranlukast (1 and 3 μmol), increased the latency to generalized seizures and decreased the mean amplitude of EEG recordings during seizures. LTD4 (0.2 and 2 pmol) reverted the anticonvulsant effect of montelukast (0.3 μmol). Montelukast (0.03 and 0.3 μmol) prevented PTZ-induced BBB disruption, an effect that was reversed by LTD4 (6 pmol). In addition, doses of LTD4 (0.2 and 2 pmol) which reversed the effect of montelukast in crisis did not alter the protective effect of montelukast on the barrier, dissociating the anticonvulsant of protective effect on BBB. The confocal microscopy analysis revealed that 1. PTZ increased the number of CD45+ and IgG cells in cerebral cortex, indicating BBB leakage with leukocyte infiltration; 2. while LTD4 (6 pmol) potentiated, montelukast decreased the effect of PTZ on leukocyte migration. Considering that increase levels of leukotrienes and decrease in Na+,K+-ATPase are common findings in several excitotoxic conditions, including epileptic seizures, we also investigated the effects of LTD4 on the activity of Na+,K+-ATPase activity in mice hippocampal slices. LTD4 10 and 100 nM decreases Na+,K+-ATPase activity alpha 2, 3 and alpha 1 subunits, respectively, in mice hippocampal slices. The inhibitory effect of LTD4 on Na+,K+-ATPase activity was not observed in hippocampal homogenates, indicating that it requires intact cells. Moreover, we showed that LTD4-induced decrease Na+,K+-ATPase activity was reversed by CysLT1R inverse agonis, montelukast (1 μM). In addition, we also showed that possibly the PKC activation pathway is involved in LTD4-induced decrease of Na+,K+-ATPase activity in mice hippocampal slices, since PKC inhibitor, GF 109203X (0,3 μM), prevent this effect. Finally, but not least important, we have demonstrated that animals injected with LTD4 (2 pmol/3 μL icv), there also occurs a decrease in Na+,K+-ATPase activity, corroborating our in vitro findings and confirming the biological importance of this work. In summary, we showed that CysLT1 receptor activation modulates hippocampal Na+,K+-ATPase activity in mice, suggesting a possible mechanism for the involvement of leukotrienes in several dosorders related with brain inflammation and hyperexcitability. / Evidências crescentes têm mostrado que os leucotrienos são importantes contribuintes na patofisiologia de diversas doenças inflamatórias do sistema nervoso central nas quais a excitotoxicidade esteja envolvida, incluindo trauma crânio-encefálico, encefalite, doença de Parkinson, isquemia, dor neuropática e epilepsia. Entretanto pouco se sabe sobre o mecanismo molecular pelo qual os leucotrienos facilitam a atividade excitatória no encéfalo. Assim, neste trabalho investigamos o efeito de antagonistas para receptores de leucotrienos cisteínicos (CysLT) sobre as convulsões induzidas por PTZ em camundongos. Bay-u9973 (3 and 30 nmol), montelucaste (0.03 and 0.3 μmol) e pranlucaste (1 and 3 μmol), aumentaram a latência para as crises e diminuíram a amplitude média do EEG durante as crises. Montelucaste (0.03 and 0.3 μmol) preveniu a ruptura da BHE induzida pelo PTZ, e o efeito foi revertido pelo LTD4 (6 pmol). Além disso, as doses de LTD4 (0.2 and 2 pmol) que reverteram o efeito do montelucaste nas crises não alteraram o efeito protetor do montelucaste sobre a barreira, dissociando o efeito anticonvulsivante do efeito protetor sobre a BHE. As análises de microscopia confocal revelaram: 1) PTZ aumentou o número de células CD45+ e IgG no córtex, evidenciando a ruptura da BHE; 2) enquanto o LTD4 (6 pmol) potencializou, o montelucaste diminuiu o efeito do PTZ sobre a migração leucocitária. Considerando que níveis aumentados de leucotrienos e diminuição na atividade da Na+,K+-ATPase são achados comuns em diversas condições excitotóxicas, incluindo crises epilépticas, também investigamos o efeito do LTD4 sobre a atividade da Na+,K+- ATPase em fatias de hipocampo de camundongos. LTD4 nas doses de 10 e 100 nM, diminuiu a atividade das subunidades alfa 2/3 e alfa 1, respectivamente. O efeito inibitório do LTD4 na atividade da Na+,K+-ATPase não foi reproduzido quando realizado com homogeneizado de hipocampo, indicando que esse efeito requer a célula intacta. A fim de nos certificarmos de que o LTD4 (10 nM) estava se ligando ao receptor CysLT1, incubamos as fatias com anticorpo anti- CysLT1, e verificamos que, na presença do anticorpo, o LTD4 perde o efeito. Além disso, observamos que a diminuição na atividade da Na+,K+-ATPase induzida pelo LTD4 foi revertida pelo montelucaste (1 μM), agonista inverso dos receptores CysLT1. Neste trabalho mostramos ainda que a ativação da PKC possivelmente esteja envolvida no efeito do LTD4 sobre a atividade da Na+,K+-ATPase em fatias de hipocampo de camundongos, uma vez que o GF 109203X (0,3 μM), inibidor da PKC, preveniu esse efeito. Por fim, mas não menos importante, também demonstramos que em animais injetados i.c.v. com LTD4 (2 pmol/3 μL, i.c.v.), também ocorre uma diminuição na atividade da Na+,K+-ATPase, corroborando com nossos achados in vitro e confirmando a importância biológica deste trabalho. Assim, este trabalho mostrou evidências do envolvimento dos receptores CysLT1 nas crises induzidas por PTZ bem como na permeabilidade da BHE, sendo a modulação da enzima Na+,K+-ATPase um possível mecanismo para a implicação dos leucotrienos em diversas doenças do SNC relacionadas com inflamação e hiperexcitabilidade.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of this study was to evaluate the effect of the essential oil of Lippia alba (EOLA) as a feed additive on ionoregulatory and metabolic parameters, and pituitary hormones expression in silver catfish, Rhamdia quelen. Fish were fed for 20 days with different concentrations of EOLA (0.0 control, 0.25 and 0.50 mL kg-1 food). Plasma Na+, Cl- , K+ and cortisol, and metabolic parameters were not affected by the diet, with the exception of ALT (alanine aminotransferase), which was higher in the liver of fish fed 0.50 mL EOLA kg-1 food. Fish fed 0.25 mL EOLA kg-1 food presented higher Na+/K+-ATPase activity and somatolactin expression, but H+-ATPase activity and growth hormone and prolactin expression did not change. The EOLA can be used as a dietary supplement for silver catfish at the evaluated concentrations, but using 0.25 mL EOLA kg-1 food seems to be more suitable than 0.50 mL EOLA kg-1 food since the latter may be related to liver damage. / O objetivo deste estudo foi analisar o efeito do óleo essencial de Lippia alba (EOLA) adicionado à ração de Rhamdia quelen (jundiá) em parâmetros metabólicos, osmorregulatórios e endócrinos. Os peixes foram alimentados por 20 dias com diferentes concentrações de OELA (0,00; 0,25 e 0,50 mL kg-1 ração). Os peixes foram alimentados durante 20 dias com diferentes concentrações de OELA (0,0 - controle, 0,25 e 0,50 mL kg-1 de ração). Parâmetros metabólicos, Na+, Cl-, K+ e cortisol no plasmas não foram afetados pela dieta, com a exceção de ALT (alanina aminotransferase), que foi maior no fígado dos peixes alimentados com 0,50 mL OELA kg -1 de ração. Os peixes alimentados com 0,25 mL EOLA kg-1 de ração, apresentaram maior atividade de Na+/K+-ATPase e da expressão da somatolactina, mas a atividade de H+-ATPase e da expressão do hormônio do crescimento e da prolactina não alterou-se. O OELA pode ser utilizado como um suplemento dietético para o jundiá nas concentrações testadas, mas 0,25 mL EOLA kg -1 de ração, parece ser melhor do que a concentração de 0,50 mL kg-1, uma vez que esta última pode estar relacionada com danos no fígado.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The contamination of the aquatic environment occurs as a consequence of industrial, agricultural and anthropogenic activities. Aquatic ecosystems are often contaminated with metals such as copper and zinc, which are essential in low concentrations but toxic at high concentrations. Thus, the aim of this study was to establish the mean lethal concentration (LC50) within 96 hours of zinc for silver catfish (Rhamdia quelen) and to evaluate the possible effects on biochemical parameters of fish exposed to 0.0 (control), 1.0 and 5.0 mg/L zinc for 96h. The parameters analyzed were reactive substances to thiobarbituric acid (TBARS), protein carbonyl, acetylcholinesterase (AChE), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione S-transferase (GST), non-protein thiols (NPSH) and Na+/K+-ATPase. The LC50 value found was 8.07 mg/L. The results of sublethal exposure showed that TBARS levels decreased in liver and brain at every tested Zn concentration. In gills, there was an increase on TBARS levels at 1.0 mg/L and a decrease at 5.0 mg/L, while no changes in muscle were observed. Exposure to zinc decreased protein carbonyls in liver of silver catfish exposed to 5.0 mg/L and gills in every tested concentration. In brain there were no changes in protein carbonyl and in muscle there was an increase at both concentrations. In liver, the SOD activity increased at both zinc concentrations. CAT activity in liver did not change at any concentration. The GST activity decreased in liver and brain increased at both concentrations used. In gills, GST increased in fish exposed to 1.0 mg/L and in muscle at 5.0 mg/L. NPSH levels showed no changes in liver either in gills. In brain there was an increase on NPSH levels at 5.0 mg/L, while the muscle declined at both concentrations. The AChE activity in brain decreased at both zinc concentrations, whereas there was no change in muscle activity for this enzyme. The Na+/K+-ATPase activity was inhibited in gill and intestine in every used concentration. We may conclude that zinc altered biochemical parameters of silver catfish and also the inhibition of brain AChE and Na+/K+-ATPase activity in intestine and gills may be used as biomarkers of waters contaminated by zinc. / A contaminação do ambiente aquático ocorre como consequência das atividades industriais, agrícolas e antropogênicas. Ecossistemas aquáticos são frequentemente contaminados com metais como cobre e zinco, que são essenciais em baixas concentrações, mas tóxicos em concentrações elevadas. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi estabelecer a concentração letal média (CL50) em 96 horas do zinco para jundiá (Rhamdia quelen) e avaliar os possíveis efeitos sobre parâmetros bioquímicos destes peixes expostos a 0,0 (controle), 1,0 e 5,0 mg/L de zinco por 96h. Os parâmetros analisados foram substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), proteína carbonil, acetilcolinesterase (AChE), superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa S-transferase (GST), tióis não-proteicos (NPSH) e Na+/K+-ATPase. O valor da CL50 encontrado foi de 8,07 mg/L. Os resultados da exposição subletal mostraram que os níveis de TBARS diminuíram no fígado e no cérebro em todas concentrações de Zn testadas. Nas brânquias, houve um aumento dos níveis de TBARS na concentração de 1,0 mg/L e uma diminuição na 5,0 mg/L, enquanto que no músculo não foram observadas alterações. A exposição ao zinco diminuiu a carbonilação de proteínas no fígado de jundiás expostos a 5,0 mg/L e nas brânquias nas duas concentrações testadas. No cérebro não houve alterações na proteína carbonil e no músculo, houve um aumento nas duas concentrações. No fígado, a atividade da SOD aumentou em ambas as concentrações de zinco testadas. A atividade da CAT no fígado não teve alteração em nenhuma das concentrações. A atividade da GST diminuiu no fígado e aumentou no cérebro para ambas as concentrações utilizadas. Nas brânquias, o aumento da GST ocorreu na concentração de 1,0 mg/L e no músculo dos peixes expostos a 5,0 mg/L. Os níveis de NPSH não mostraram alterações no fígado e nem nas brânquias. No cérebro houve um aumento nos níveis de NPSH na concentração de 5,0 mg/L, enquanto que no músculo diminuiu nas duas concentrações. A atividade da AChE em cérebro diminuiu nas duas concentrações de zinco, enquanto que no músculo não houve alteração na atividade desta enzima. A atividade da Na+/K+-ATPase foi inibida em brânquias e intestino em todas as concentrações usadas. Com estes resultados, podemos concluir que o zinco alterou os parâmetros bioquímicos dos jundiás e que a inibição da AChE cerebral e da Na+/K+-ATPase no intestino e brânquias podem ser utilizadas como biomarcadores de águas contaminadas por zinco.

Ouabain and other cardiotonic steroids are known to inhibit Na + ,K + -ATPase (NKA), theion pump responsible for the ionic gradient across the plasma membrane. These steroidsdisplay a selective toxicity towards several tumour cells in comparison to primary humancells, however, the mechanism behind this is not yet understood. Here, we examined theouabain toxicity in renal epithelial cells, proximal tubular cells (PTCs) of different origin. Weinvestigated the relative cytotoxicity in cancer cells (A-498) and papilloma virus-transformedPTCs (HK-2) as well as to primary human PTCs (hPTC) to validate key components in theeffect. In exposure to ouabain, we examined the cell viability and density by MTT and CrystalViolet assays, and cell migration by a scratch assay. The cytotoxic effect was also studied invarious pH, glucose and potassium ion concentrations. In addition, apoptosis was examinedby the TUNEL assay, and if ouabain kills cancer cells through activation of thevolume-regulated anion channel VRAC channel via NKA. We found that there is a decrease in viable cells when cells are exposed to ouabain ≥ 10nM, however, the effect was not seen to be selective towards cancer cells, nor due toapoptosis and the activation of VRAC. The cytotoxic effect was greater in more acidicextracellular pH ~6.8, but independent of glucose concentration in the medium. Interestingly,the effect was also reversed at an increased extracellular concentration of potassium, andouabain did selectively inhibit the cancer cells to migrate. Thus, there could be potential forouabain to act as an anti-cancer agent for renal cancer and to inhibit tumour metastasization. / Ouabain och andra kardiotoniska steroider är kända för att inhibera Na + ,K + -ATPas (NKA),membranpumpen som är ansvarig för den aktiva jontransporten av natrium och kalium ochjongradienten över plasmamembranet. De har påvisat en selektiv toxicitet mot vissatumörceller i jämförelse med primära humana celler, men det är dock inte förstått hurmekanismen bakom denna företeelse fungerar. I denna studien undersökte vi ouabainstoxicitet i njurcancerceller (A-498) och papillomavirustransformerade proximala tubuliceller(hPTC) för att identifiera effektens nyckelkomponenter. Vid exponering av ouabain undersökte vi cellviabiliteten och -densiteten genom MTT- ochkristallviolett-analyser, samt cellmigrering genom scratch-analys. Den cytotoxiska effektenstuderades också under olika pH-förhållanden samt glukos- och kaliumkoncentrationer.Dessutom undersöktes det om apoptos orsakar celldöd genom TUNEL-analys, och omouabain dödar njurcancerceller genom aktivering av den volymreglerade anjonkanalen(VRAC) via NKA. Vi fann minskning av cellernas livskraft vid exponering av ≥ 10 nM ouabain, men effektentycktes dock inte se ut att vara selektiv gentemot cancerceller, inte heller på grund av apoptosoch aktivering av VRAC. Den cytotoxiska effekten var större vid lägre pH, men oberoendeav mediets glukoskoncentrationen. Intressant nog motverkades också effekten vid förhöjdkoncentration av kaliumjoner, och ouabain hämmade selektivt cancercellerna att migrera.Således finns det en viss potential för ouabain att kunna fungera som ett anticancermedel motnjurcancer och att hämma metastasutveckling.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Espécies do gênero Valeriana são tradicionalmente utilizadas para tratar ansiedade, irritabilidade e desordens de sono. A Organização Mundial da Saúde indica o uso de preparações farmacêuticas como alternativa aos benzodiazepínicos para tratamento da ansiedade e insônia. Entre as substâncias ativas presentes no gênero Valeriana destacam-se os óleos voláteis, valepotriatos, flavonóides e lignanas. Entretanto, estudos farmacológicos com produtos isolados são escassos. Espécies nativas de Valeriana, que ocorrem no Rio Grande do Sul, têm sido estudadas em relação a sua composição química, sendo a espécie Valeriana glechomifolia a que possui maior teor de valepotriatos. Neste estudo, diferentes métodos de extração de valepotriatos foram comparados e extratos enriquecidos em valepotriatos foram testados em modelos animais de sedação, ansiedade e depressão. Valepotriatos isolados foram submetidos a ensaios de ligação a receptores benzodiazepínico e serotonérgico (5HT1A) e ensaios de atividade da enzima Na+K+ATPase. A extração por fluido supercrítico com dióxido de carbono (SCCO2) foi realizada em temperatura constante de 40 oC e pressões variáveis (90, 120, 150 e 200 bar) e demonstrou maior teor de valepotriatos que os métodos de extração por maceração em ultrassom e maceração Entre as diferentes pressões de extração utilizadas no método de SCCO2, o maior teor de valepotriatos foi apresentado pela fração obtida na pressão de 90 bar. Todos os extratos mostraram o mesmo perfil qualitativo de valepotriatos. Flavonóides também foram obtidos através de maceração por ultrassom em metanol. A dose letal mediana dos valepotriatos obtidos por maceração por ultrassom foi de 42±3 mg/kg, i.p. Esta mesma solução extrativa, na dose de 10 mg/kg, v.o. (gavage), foi inefetiva no labirinto em cruz elevado e tempo de sono barbitúrico, sugerindo a ausência de propriedades ansiolíticas e hipnótico-sedativas. Resultados similares foram obtidos com a solução extrativa enriquecida em flavonóides. Valtrato, acevaltrato, 1-b-acevaltrato, diavaltrato e o flavonóide codificado como B6 não apresentaram ligação ao sítio benzodiazepínico do complexo receptor GABAA, nem ao receptor serotonérgico (5HT1A) viii na faixa de concentração de 1-100 μM. Os valepotriatos inibiram a atividade da enzima Na+K+-ATPase na faixa de concentração micromolar. A fração de valepotriatos obtida por SCCO2 (10 mg/kg, gavage) foi efetiva no teste da natação forçada, sem interferir na atividade locomotora espontânea, sugerindo uma atividade do tipo antidepressiva. Em conclusão, a extração por fluido supercrítico com dióxido de carbono mostrou-se eficiente para a obtenção de frações enriquecidas em valepotriatos e estas substâncias representam uma nova classe química com atividade inibitória não seletiva da enzima Na+K+ATPase, e com atividade do tipo antidepressiva. / Species of the genus Valeriana are traditionally used to treat anxiety, irritability and sleep disorders. The World Health Organization indicates pharmaceutical preparations of V. officinalis as an alternative to benzodiazepine drugs for treating anxiety and insomnia. Volatile oil, valepotriates, flavonoids and lignan have been suggested as active substances of the Valeriana genus. However pharmacological studies on isolated compounds are scarce. Species of Valeriana native to Rio Grande do Sul have been studied regarding their chemical composition being Valeriana glechomifolia the species with highest valepotriate’ contents. In this study different methods of extraction of valepotriates from aerial parts of V. glechomifolia were compared, and valepotriate’ enriched extracts were tested in mice models of sedation, anxiety and depression. Isolated valepotriates were submitted to binding to benzodiazepine and 5HT1A receptors, and assayed for the Na+K+ATPase inhibitory activity. The extraction by supercritical carbon dioxide (SCCO2) was carried out at 40 oC under 90, 120, 150 or 200 bar affording higher valepotriates contents than maceration with dichloromethane and ultrasound. The highest valepotriates yielding was obtained with SCCO2 (40 oC , 90 bar). All extracts presented the same qualitative valepotriate’ profile. Flavonoids were also obtained from methanol extracts. The median lethal dose of valepotriates obtained by maceration was determined as 42±3 mg/kg, i.p. This valepotriate’ enriched extract (10 mg/kg, p.o., gavage) was ineffective in the elevated plus maze and barbiturate sleeping time tests suggesting that it does not present anxiolitic or hypnotic-sedative properties. Similar results were obtained with flavonoids’ enriched extract. Valtrate, acevaltrate, 1-b-acevaltrate, diavaltrate and the flavonoid named B6 did not bind to benzodiazepine site of receptor GABAA complex neither to serotonergic receptor (5HT1A) at 1-100 μM. The valepotriates inhibited the Na+K+ATPase activity at micromolar concentration range. The valepotriates fraction obtained by SCCO2 (10 mg/kg, gavage) was effective in the forced swimming test without interfering with the spontaneous locomotor activity suggesting that it presents an antidepressant-like activity. In conclusion the extraction by supercritical carbon dioxide is valuable to obtain valepotriates enriched fractions; and valepotriates seem to represent new chemical entities with no selective inhibitory activity of Na+K+ATPase, as well as with antidepressant-like activity.