abstract: The pathophysiology of neurodegenerative diseases, such as Alzheimer’s disease (AD), remain difficult to ascertain in part because animal models fail to fully recapitulate the complex pathophysiology of these diseases. In vitro models of neurodegenerative diseases generated with patient derived human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and human embryonic stem cells (hESCs) could provide new insight into disease mechanisms. Although protocols to differentiate hiPSCs and hESCs to neurons have been established, standard practice relies on two dimensional (2D) cell culture systems, which do not accurately mimic the complexity and architecture of the in vivo brain microenvironment. I have developed protocols to generate 3D cultures of neurons from hiPSCs and hESCs, to provide more accurate models of AD. In the first protocol, hiPSC-derived neural progenitor cells (hNPCs) are plated in a suspension of Matrigel™ prior to terminal differentiation of neurons. In the second protocol, hiPSCs are forced into aggregates called embryoid bodies (EBs) in suspension culture and subsequently directed to the neural lineage through dual SMAD inhibition. Culture conditions are then changed to expand putative hNPC populations and finally differentiated to neuronal spheroids through activation of the tyrosine kinase pathway. The gene expression profiles of the 3D hiPSC-derived neural cultures were compared to fetal brain RNA. Our analysis has revealed that 3D neuronal cultures express high levels of mature pan-neuronal markers (e.g. MAP2, β3T) and neural transmitter subtype specific markers. The 3D neuronal spheroids also showed signs of neural patterning, similar to that observed during embryonic development. These 3D culture systems should provide a platform to probe disease mechanisms of AD and enable to generation of more advanced therapeutics. / Dissertation/Thesis / Masters Thesis Bioengineering 2016

Síndrome de Angelman (AS - MIM 105830) é causada pela ausência de função do gene UBE3A que codifica uma proteína ubiquitina - ligase (E6-AP). Esse gene é expresso bialelicamente em vários tecidos exceto no cérebro, onde a expressão é preferencialmente materna. O RNA anti-senso de UBE3A é considerado o regulador dessa expressão diferencial entre os alelos, e faz parte de um transcrito grande que só o alelo paterno é expresso devido ao imprinting genômico; no cérebro, esse transcrito se entende até a região anti-senso de UBE3A, mas nos demais tecidos o transcrito é menor e não engloba a região anti-senso. Este trabalho visa obter um modelo para estudo da AS. Células-tronco da polpa do dente (SHEDs) de pacientes com deleção do segmento 15q11-q13 ou mutação no gene UBE3A foram caracterizadas e submetidas à diferenciação neuronal. A diferenciação foi analisada através do estudo de RNA e proteínas para marcadores neuronais e, também, por testes funcionais. As SHEDs são células-tronco mesenquimais e constituem uma população heterogênea. Essas células ou algumas dessas células já expressam algumas proteínas neuronais ou de células excitáveis como nestina, β-tubulina III, MAP2 e proteína de canais dependentes de voltagem de sódio e potássio. Um ponto interessante é que as SHEDs apresentam baixa expressão do UBE3A anti-senso e a expressão do UBE3A nas células de pacientes é menor que 50% da expressão encontrada nas células de controles, que pode indicar a ocorrência de expressão preferencial materna desse gene em outros tipos celulares além de neurônios maduros. Quando induzidas à diferenciação neurogênica, a maioria das linhagens controles apresentou aumento da expressão de MAP2 e, principalmente, β-tubulina III; e a maioria das linhagens de pacientes com AS não apresentou aumento notável na expressão dessas proteínas, exceto uma linhagem de paciente que aumentou a expressão de β-tubulina III. As células induzidas à diferenciação apresentaram aumento estatisticamente significativo da condutância de sódio através de canais de sódio dependentes de voltagem. Com a análise de expressão de UBE3A e do UBE3A anti-senso é possível afirmar que a expressão deles não alterou com a diferenciação neuronal. Assim, é possível concluir que as células-tronco da polpa do dente, com o protocolo de diferenciação neurogênica, progrediram na via de diferenciação, mas a maioria das células não atingiu o estágio de maturação necessário para que ocorresse o imprinting do UBE3A ou a via de diferenciação não ia em direção a neurônios que apresentam imprinting do UBE3A. / Angelman syndrome (AS - MIN 105830) is caused by the loss of function of the maternal UBE3A gene, which encodes an ubiquitin protein ligase (E6-AP). UBE3A displays biallelic expression in most of tissues, but maternal predominant expression is observed in the brain. A RNA antisense that is paternally expressed in some regions in the brain is considered to be responsible for this tissue-specific imprinting; UBE3A antisense is part of a large transcript that starts at SNURF-SNRPN gene and is paternally expressed, and in the brain this transcript includes UBE3A antisense region however in other tissues this region is not included. The aim of the present study is to develop a new model for studying AS. Dental pulp stem cells (SHEDs) were characterized and differentiated by an already described protocol. SHEDs intrinsically express some neuronal proteins as nestin, β-tubulin III, MAP2 and voltage-gated sodium channels and potassium channels. Interestingly, SHEDs also present a low expression of UBE3A antisense, and UBE3A expression in cells from patients with AS is lower than 50% of the cells from normal control, so it is possible that preferential maternal expression of this gene might occur in some cells beyond mature neurons. After the neuronal differentiation, most control lineages and one lineage of AS patients had an increase of MAP2 and β-tubulin III expression. Two control lineages and most lineages from AS patients did not have a notable increase of expression of these proteins. Neuronal differentiated cells displayed an increase in conductance through voltage-gated sodium channels. Analysis of UBE3A and UBE3A antisense expression in SHEDs and cells induced to differentiate into neurons indicated no changes in their expression. Thus, after neuronal differentiation induction, dental pulp stem cells progressed through neuronal differentiation pathway. However, most cells did not reach the stage which UBE3A imprinting occurs or the neuronal differentiation is resulting in a cell that do not present UBE3A imprinting.

Células tronco mesenquimais de tecido adiposo, são uma promissora ferramenta para aplicações clínicas em terapias celular e regenerativa, em vista da facilidade de sua extração e da maior quantidade de células por unidade de massa de tecido quando comparado a outras fontes clássicas de células mesenquimais como medula óssea. O protocolo clássico de extração e purificação dessas células, depende de sua adesão em plástico e xeno-materiais demandando muito tempo para ser utilizado por médicos para auxiliar pacientes em procedimentos de emergência. Estas células são capazes se diferenciar em diversos tipos celulares, o que as torna boas candidatas para terapia celular, embora sua capacidade de transdiferenciação para fenótipos neuronais seja ainda discutida. Neste trabalho demonstramos um novo processo para isolar essas células na base de epitopos específicos expressos (assinatura molecular de superfície) utilizando aptâmeros como ligantes de alta afinidade para estes sitios. Aptâmeros, moléculas de DNA simples fita identificadas a partir de uma biblioteca combinatória de sequencias de DNA simples-fita foram identificados por ciclos reiterativos de seleção in vitro (SELEX) utilizando células tronco do lipoaspirado como alvo. Dois aptâmeros isolados, denominados APT9 e APT11, foram capazes de identificar subpopulações (15,8 e 23,7% respectivamente) dentre as células tronco mesenquimais (classicamente CD29+/CD90+/CD45-) e separá-las usando nano-partículas magnéticas acopladas aos aptâmeros. Além disso, seguindo uma indução para diferenciação neuronal, as células tronco mesenquimais passam a apresentar morfologia neuronal e apresentam expressão e atividade de diversos receptores de neurotransmissores, avaliados por PCR real-time e imageamento de variações da concentração de cálcio intracelular ápos stimulação com vários agonistas de receptores metatrópicos e ionotrópicos. Ao longo da diferenciação, os níveis transcricionais de mRNA de receptores de cininas (B1 e B2), nicotínicos (alfa 7), muscarínicos (M1, M3 e M4), glutamatérgicos (AMPA2 e mGluR2), purinérgicos (P2Y1 e P2Y4) e GABAergicos (GABA-A, subunidade 3) e da óxido nítrico sintase neural aumentaram quando comparados aos níveis das células não diferenciadas, enquanto que os níveis de expressão de outros receptores incluindo purinérgicos P2X1, P3X4, P2X7 e P2Y6 e muscarínico M5 diminuíram. Os níveis de atividade das classes dos receptores estudados, por imageamento de variações da concentração de cálcio intrac, aumentaram para a maioria dos agonistas analisados durante a diferenciação neuronal com exceção para respostas induzidas por glutamato e NMDA. Células diferenciadas expressavam altos níveis de antígenos específicos de neurônios como β3-tubulina, NF-H, NeuN e MAP-2 indicando uma diferenciação em fenótipo neuronal bem sucedida. Desta maneira, esta tese, ao identificar aptâmeros, prove uma inovadora solução para médicos usarem as células tronco mesenquimais dentro de uma sala de cirurgia, através de um método que é capaz de purificar essas células em um tempo clínico viável, com pureza e sem contato com contaminantes. Além disso, nós mostramos aqui que com um protocolo como o proposto para diferenciação neuronal, nós poderíamos induzir essas células para se diferenciar em neurônios, através da ativação de fatores de transcrição específicos, levando às células tronco mesenquimais a serem possivelmente utilizadas em terapias celulares de reparo neuronal. / Adipose mesenchymal stem cells are promising tools for clinical applications in cellular and regeneration therapies, in view of easiness of extraction and higher amount of isolated stem cells per mass of tissue when compared to other classical mesenchymal stem cell sources including bone marrow. The classical protocol to extract and purify these cells, depending on plastic adherence and xeno-materials, is too time consuming to be used by physicians to help patients at emergency procedures. These cells are able to differentiate into various cell types, making them good candidates for cell therapy, however their capability for transdifferentiation into neural phenotypes is yet discussed. Here we show a novel process to isolate these cells using their surface molecular signature and aptamers, ssDNA molecules identified through the SELEX technique, denominated APT9 and APT11 that are able to identify subpopulations (15,8 and 23,7% respectively) within the mesenchymal stem cells (classically CD29+/CD90+/CD45-) and separate them using magnetic nano-particles attached to the aptamers. Moreover, following induction to neural differentiation, mesenchymal cells presents neuronal morphology and present expression and activity of several neurotransmitter receptors, as evaluated by real-time PCR and calcium imaging. During this process, mRNA transcription levels of bradykinin (B1 and B2), cholinergic (alpha 7), muscarinic (M1, M3 and M4), glutamatergic (AMPA2 and mGlu2), purinergic (P2Y1 and P2Y4) and GABAergic (GABA-A, subunit 3) receptors and neuronal nitric oxide synthase were augmented when compared to levels of undifferentiated cells, while the expression levels of other receptors including purinergic P2X1, P2X4, P2X7 and P2Y6 and muscarinic M5 receptors were down-regulated. Activity levels of the studied receptor classes, as studied by calcium imaging, increased for most of the agonists analyzed during the neuronal differentiation with the exception for glutamate- and NMDA-induced receptor responses. Differentiated cells expressed high levels of neuron-specific antigens such as β3-tubulin, NF-H, NeuN and MAP-2, indicating a successful differentiation into neuronal phenotypes. This thesis, by identifying aptamers, provides a novel solution for physicians to use mesenchymal stem cells inside a surgery room, by using a method that are able to purify the cells in a clinical viable time, with purity and no contact with contaminats. Furthermore, we show here that with a protocol as provided for neuronal differentiation, we could induce these cells to differentiate into neurons, by activating specific transcription factors,making mesenchymal stem cells to possibly be used in neuronal repair cell therapies.

Muitos subtipos de receptores são ativados pelo mesmo ligante, mas estão acoplados a diferentes mensageiros secundários podendo produzir sinalização divergente em uma célula, enquanto receptores ativados por diferentes ligantes, mas que compartilham o mesmo mensageiro secundário, podem produzir sinalização convergente. Para examinar as bases mecanísticas que influenciam a proliferação e a diferenciação celular determinamos as funções de liberação intracelular de Ca2+ e a excitabilidade celular mediada pelos receptores purinérgicos e colinérgicos utilizando imageamento de cálcio por microscopia confocal. Para tanto, caracterizamos a participação dos subtipos P2X1-7 e P2Y1,2,4,6 de receptores purinérgicos aos níveis dos transcritos de mRNA e de expressão protéica, assim como pela atividade de induzir os transientes de [Ca2+]i, aumento na concentração livre de cálcio intracelular, durante a diferenciação neuronal de células P19 de carcinoma embrionário, que foram utilizadas como modelo in vitro para o desenvolvimento neuronal precoce. Em células embriônicas os receptores P2Y1,2, P2X4 ou os heteromultímeros de P2X com farmacologia semelhante ao do receptor P2X4 foram os responsáveis pelos transientes de [Ca2+]i induzidos pelo ATP e seus análogos. Ao término da diferenciação neuronal, os receptores P2Y2,6 e P2X2 foram os principais mediadores das respostas de [Ca2+]i. Obtivemos evidências do envolvimento destes receptores na indução da proliferação tanto de células embriônicas como de progenitores neuronais, por ensaios de incorporação de BrdU, e da indução da diferenciação neuronal das células progenitoras, na presença de vários agonistas e antagonistas de receptores purinérgicos. Como resultado desses estudos, a regulação da proliferação e diferenciação celular foi principalmente devida aos subtipos de receptores P2Y1 e P2Y2, já que estes efeitos foram eliminados após a depleção dos depósitos intracelulares de cálcio e pela demonstração de que estes eram os possíveis receptores funcionais. Entre os receptores colinérgicos, fornecemos evidências para a expressão de receptores nicotínicos (nAChRs) e muscarínicos (mAChRs) funcionais durante a diferenciação de células P19. Detectamos a expressão e a atividade dos subtipos de nAChRs formados pelos subtipos α2-α7, β2, β4 e M1-M3 e M5 de mAChRs durante a diferenciação neuronal. As respostas de [Ca2+]i induzidas pelos agonistas dos nAChRs foram observadas em células P19 embriônicas e neuronais. As respostas de [Ca2+]i mediadas pelos receptores muscarínicos, em níveis próximos aos basais em células embriônicas, aumentaram durante a diferenciação. As elevações na [Ca2+]i induzidas pelos nAChRs em células indiferenciadas foram devidas ao influxo de Ca2+ do meio extracelular. Em células diferenciadas em neurônios, os aumentos de transientes de [Ca2+]i induzidos pelos nAChRs foram parcialmente inibidas após o pré-tratamento das células com a rianodina, enquanto as respostas de [Ca2+]i mediadas pelos mAChR não foram afetadas na presença deste composto, sugerindo uma contribuição da liberação de Ca2+ a partir dos depósitos de Ca2+ sensíveis à rianodina para as elevações mediadas pelos nAChRs. Demonstramos também, que a nicotina, agindo através dos nAChRs, inibiu a proliferação em células embriônicas, porém, a induziu em células progenitoras neuronais pela mobilização de Ca2+ dos depósitos intracelulares. A muscarina induziu em células embriônicas o aumento na proliferação via mAChRs acoplados às proteínas Gαq/11, e promoveu a diferenciação neuronal via M2 mAChRs em células precursoras neuronais. Estes dados sugeriram que a acetilcolina agindo via mAChR funciona como um mitógeno que ativa as proteínas quinases de trifosfato de inositol (IP3) e que poderia estar envolvida na síntese de DNA durante os estágios iniciais da neurogênese. Nós ainda provemos evidências que as oscilações de [Ca2+]i são características para cada estágio da diferenciação e são iniciadas pela liberação de Ca2+ mediada pelo IP3. As análises da determinação do fenótipo neuronal na presença de vários inibidores da transdução do sinal induzido pelo cálcio residem na liberação de Ca2+ induzida pelo IP3 é necessária para o progresso da diferenciação neuronal. Assim, os sinais espontâneos de [Ca2+]i são propriedades intrínsecas das células em diferenciação. A modulação de sua freqüência e amplitudes especifica a aquisição de um fenótipo de célula neuronal. / Various receptors subtypes are activated by the same ligand although coupled to different second messengers. These receptors act either by inducing divergent signaling in one cell, whereas in another cell different receptors may stimulate the very same pathways producing convergent signaling. We have characterized intracellular Ca2+- release and -influx mediated by purinergic and cholinergic receptors using calcium imaging by confocal microscopy to evaluate the mechanistic bases which influence cell proliferation and differentiation We have characterized the participation of purinergic subtypes P2X1-7 and P2Y1,2,4,6 receptor subtypes at mRNA transcription and protein expression levels as well as receptor-induced changes in free intracellular calcium concentration ([Ca2+]i) during differentiation of P19 embryonal carcinoma cells as an in vitro model for early neuronal development. The participation of individual P2X and P2Y receptor subtypes in the differentiation process was studied by employing different available purinergic receptor agonists and antagonists. In embryonic cells, P2Y1,2, P2X4 receptors, or P2X-heteromultimers with similar P2X4 pharmacology were responsible for ATP and ATP-analog-induced [Ca2+]i transients. Following completion of neuronal differentiation, P2Y2,6 receptors and P2X2 subtypes were the major mediators of the [Ca2+]i-response. Regulation of cell proliferation and differentiation of P19 embryonic and progenitor cells was mostly due to P2Y1 and P2Y2 receptor activation, as these effects were abolished following depletion of intracellular calcium stores, and they are probably the unique functional P2Y receptors at these stages of differentiation. We also provide evidence for expression of functional nicotinic (nAChRs) and muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs) during neuronal differentiation of P19 cells. We have detected expression and activity of nAChRs formed by the subunits α2-α7, β2, β4, and M1-M3 and M5 mAChR subtypes along the differentiation process. Receptor response in terms of nicotinic agonist-evoked Ca2+ flux was observed in embryonic and neuronal-differentiated cells. However, mAChRs-induced calcium responses, merely present in undifferentiated P19 cells, increased during neuronal differentiation. The nAChR-induced [Ca2+]i response in undifferentiated cells was due to Ca2+ influx. However, in differentiated P19 neurons the nAChR-induced [Ca2+]i response was partially inhibited following pretreatment of the cells with ryanodine, while the mAChR-induced response remained unaffected, suggesting the contribution of Ca2+ release from ryanodine-sensitive stores to nAChR- but not mAChR-mediated Ca2+ responses. The presence of functional nAChRs in embryonic cells suggests that these receptors are involved in triggering Ca2+ waves during initial neuronal differentiation. In the present study we have also shown that nicotine, acting via nAChRs, inhibited proliferation in embryonic cells, but induced cell division of progenitor cells by Ca2+ mobilization from internal stores. Stimulation of progenitor cells by muscarine led to an increase in DNA synthesis mainly resulting from activation of Gαq/11-coupled mAChRs. Muscarine as well promoted differentiation of neural precursor cells by activation of M2 mAChRs subtypes. These data suggest that acetylcholine, acting via mAChRs, functions as a mitogen during early neurogenesis. We also provide evidence that oscillations of [Ca2+]i as characteristics for the respective stage of differentiation are initiated by triphosphate inositol (IP3)-mediated Ca2+-release. Neuronal cell fate determination analysis in the presence of various inhibitors of calcium-induced signal transduction underlined that IP3-mediated Ca2+-release is necessary for neuronal differentiation progress. Thus, spontaneous Ca2+-signals are an intrinsic property of differentiating neural precursor cells. Modulation of their frequency and amplitude is believed to direct the acquisition of a defined neuronal phenotype.

Durante o desenvolvimento do sistema nervoso, as oscilações da concentração de cálcio intracelular livre resultam na proliferação celular, migração e diferenciação neuronal. Nesta tese foram investigadas a participação dos receptores ionotrópicos purinérgicos dos tipos P2X2 e P2X4 seletivos ao influxo de cálcio durante a diferenciação neuronal in vitro das células de carcinoma embrionário murino P19. Identificamos o padrão diferencial de expressão de receptores purinérgicos nas células indiferenciadas e neurônios P19. O receptor P2X4 é expresso durante toda a diferenciação neuronal e o receptor P2X2 é detectado na fase tardia da diferenciação em neurônios. Através de ensaios farmacológicos, foi possível identificar a participação dos receptores metabotropicos P2Y e do receptor P2X4 na formação dos corpos embriônicos, na proliferação celular e ou na determinação do fenótipo de progenitor neural. Durante a maturação neuronal os receptores P2X2 e P2Y1 participam da determinação do fenótipo neuronal glutamatérgico NMDA e os receptores P2X2 e P2Y2 no fenótipo neuronal colinérgico. A ausência de inibidores específicos e seletivos aos receptores purinérgicos levou-nos a empregar a técnica SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) a fim de identificar inibidores seletivos aos receptores P2X2 e P2X4. A técnica envolve a utilização da biblioteca combinatória randômica de RNA 2\'- F pirimidina modificadas resistentes a nucleases. Após 9 ciclos de seleção in vitro de SELEX (ciclo 9-P2X4), as sequências selecionadas mostraram-se seletivas a ligação somente ao receptor P2X4 e não aos receptores P2X2 ou P2X7 através de ensaios de ligação radioligante-receptor. Por patch clamping na configuração whole cell recording identificou-se que além de seletividade ao receptor, que a aplicação do RNA ciclo 9- P2X4 promoveu inibição da corrente ativada pelo ATP somente nos receptores P2X4 e não em P2X2 em celulas 1321N1 astrocitoma transfectadas. A incubação do RNA ciclo 9-P2X4 na concentração de 200 nM com as células no estágio indiferenciado inibiu a formação dos corpos embriônicos. Já utilização de 25 nM, resultou em mudanças morfológicas nas células diferenciadas. Estes dados corroboram com os dados farmacológicos que identificaram a participação do receptor P2X4 na diferenciação precoce. Após 11 ciclos P2X2 de seleção, identificou-se sequências com especificidade de ligação aos receptores P2X2. Aptâmeros, moleculas de RNA com sequência identificada e com alta afinidade ao alvo da seleção, foram isolados de ambas as bibliotecas, ciclo 9 P2X4 e ciclo 11 P2X2. A co-aplicação destes aptâmeros e ATP em ensaios de whole-cell recording resultou na inibição de 30 a 80% da corrente ativada pelo ATP nos receptores P2X2 ou P2X4. Estes testes em células PC12 de rato, que expressa os receptores endógenos, resultou em inibição da corrente ativada pelo ATP de modo semelhante. Além de termos desenvolvido aptâmeros como ferramentas para elucidar as funções dos receptores P2X2 e P2X4 durante o desenvolvimento, diferenciação, em processos fisiológicos e patológicos, estas moléculas resistentes a nucleases são as primeiras identificadas capazes de reconhecer, discernir e inibir dois subtipos de receptores purinérgicos sendo promissores para utilização terapêutica. / During the development of the nervous system, oscillations of intracellular calcium concentrations activate programs of gene expression resulting in proliferation, migration and neuronal differentiation of embryonic cells. In this thesis, the participation of ionotropic P2X2 and P2X4 receptor subtypes, whose receptor channels are highly permeable for calcium influx in the cells, was studied during the process of neuronal differentiation. We have identified differential gene expression of purinergic receptors in undifferentiated and neuronal-differentiated P19 cells. P2X4 receptor expression was present along neuronal differentiation of P19 cells, whereas P2X2 receptor expression was only detected when P19 cells became neurons. Based on purinergic receptor pharmacology we have determined the participation of P2X4 receptors in addition to metabotropic P2Y2 receptors in the formation of embryonic bodies as prerequisites for phenotype determination of P19 neural progenitor cells. Final neuronal maturation of P19 cells in the presence or absence of agonists or antagonists of purinergic receptors implicated the involvement of P2X2, P2Y1, and P2Y2 in the determination of the final neuronal phenotype, such as expression of NMDA-glutamate and cholinergic receptors. In order to further evaluate the functions of these P2X receptors and due to the absence of specific inhibitors for these receptor subtypes, we have used the SELEX technique (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) to select for specific inhibitors for P2X2 and P2X4 receptors. The 2\' -F-pyrimidine modified, nuclease- resistant combinatorial SELEX RNA pool enriched with inhibitors of P2X4 receptors following nine cycles of in vitro selection (cycle 9-P2X4) specifically interacted with P2X4 receptors and not with P2X2 or P2X7 receptors as verified in radioligand-receptor binding studies. Moreover, whole-cell recording measurements using astrocytoma cells expressing recombinant rat P2X2 or P2X4 receptors showed inhibition of P2X4 but not of P2X2 receptors by the selected RNA molecules. RNA molecules selected in vitro in 11 reiterative SELEX cycles using the P2X2 receptor as target specifically bound to membrane extracts containing recombinant P2X2 receptors. From both selected RNA libraries (against P2X4 and P2X2 receptors) aptamers, as RNA molecules with identified sequences and high-affinity binding, were identified by cloning and DNA sequencing. The presence of these aptamers in whole-cell recording experiments resulted in 30-80% inhibition of ATP-induced receptor activity and did not provoke any inhibitory effects on P2X receptors which had not been used as selection target. The activity of the aptamers selected using recombinant receptors as targets in inhibiting wild-type P2X4 or P2X2 receptors was verified in whole-cell recording experiments with PC12 cells which endogenously express both receptor subtypes. In addition of having developed aptamers as tools to elucidate P2X2 and P2X4 receptor functions during neuronal differentiation, these nuclease-resistant aptamers are suitable for in vivo use and may turn into therapeutics in the inhibition of purinergic receptor participation in pathophysiological conditions.

Durante o desenvolvimento do sistema nervoso, as oscilações da concentração de cálcio intracelular livre resultam na proliferação celular, migração e diferenciação neuronal. Nesta tese foram investigadas a participação dos receptores ionotrópicos purinérgicos dos tipos P2X2 e P2X4 seletivos ao influxo de cálcio durante a diferenciação neuronal in vitro das células de carcinoma embrionário murino P19. Identificamos o padrão diferencial de expressão de receptores purinérgicos nas células indiferenciadas e neurônios P19. O receptor P2X4 é expresso durante toda a diferenciação neuronal e o receptor P2X2 é detectado na fase tardia da diferenciação em neurônios. Através de ensaios farmacológicos, foi possível identificar a participação dos receptores metabotropicos P2Y e do receptor P2X4 na formação dos corpos embriônicos, na proliferação celular e ou na determinação do fenótipo de progenitor neural. Durante a maturação neuronal os receptores P2X2 e P2Y1 participam da determinação do fenótipo neuronal glutamatérgico NMDA e os receptores P2X2 e P2Y2 no fenótipo neuronal colinérgico. A ausência de inibidores específicos e seletivos aos receptores purinérgicos levou-nos a empregar a técnica SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) a fim de identificar inibidores seletivos aos receptores P2X2 e P2X4. A técnica envolve a utilização da biblioteca combinatória randômica de RNA 2\'- F pirimidina modificadas resistentes a nucleases. Após 9 ciclos de seleção in vitro de SELEX (ciclo 9-P2X4), as sequências selecionadas mostraram-se seletivas a ligação somente ao receptor P2X4 e não aos receptores P2X2 ou P2X7 através de ensaios de ligação radioligante-receptor. Por patch clamping na configuração whole cell recording identificou-se que além de seletividade ao receptor, que a aplicação do RNA ciclo 9- P2X4 promoveu inibição da corrente ativada pelo ATP somente nos receptores P2X4 e não em P2X2 em celulas 1321N1 astrocitoma transfectadas. A incubação do RNA ciclo 9-P2X4 na concentração de 200 nM com as células no estágio indiferenciado inibiu a formação dos corpos embriônicos. Já utilização de 25 nM, resultou em mudanças morfológicas nas células diferenciadas. Estes dados corroboram com os dados farmacológicos que identificaram a participação do receptor P2X4 na diferenciação precoce. Após 11 ciclos P2X2 de seleção, identificou-se sequências com especificidade de ligação aos receptores P2X2. Aptâmeros, moleculas de RNA com sequência identificada e com alta afinidade ao alvo da seleção, foram isolados de ambas as bibliotecas, ciclo 9 P2X4 e ciclo 11 P2X2. A co-aplicação destes aptâmeros e ATP em ensaios de whole-cell recording resultou na inibição de 30 a 80% da corrente ativada pelo ATP nos receptores P2X2 ou P2X4. Estes testes em células PC12 de rato, que expressa os receptores endógenos, resultou em inibição da corrente ativada pelo ATP de modo semelhante. Além de termos desenvolvido aptâmeros como ferramentas para elucidar as funções dos receptores P2X2 e P2X4 durante o desenvolvimento, diferenciação, em processos fisiológicos e patológicos, estas moléculas resistentes a nucleases são as primeiras identificadas capazes de reconhecer, discernir e inibir dois subtipos de receptores purinérgicos sendo promissores para utilização terapêutica. / During the development of the nervous system, oscillations of intracellular calcium concentrations activate programs of gene expression resulting in proliferation, migration and neuronal differentiation of embryonic cells. In this thesis, the participation of ionotropic P2X2 and P2X4 receptor subtypes, whose receptor channels are highly permeable for calcium influx in the cells, was studied during the process of neuronal differentiation. We have identified differential gene expression of purinergic receptors in undifferentiated and neuronal-differentiated P19 cells. P2X4 receptor expression was present along neuronal differentiation of P19 cells, whereas P2X2 receptor expression was only detected when P19 cells became neurons. Based on purinergic receptor pharmacology we have determined the participation of P2X4 receptors in addition to metabotropic P2Y2 receptors in the formation of embryonic bodies as prerequisites for phenotype determination of P19 neural progenitor cells. Final neuronal maturation of P19 cells in the presence or absence of agonists or antagonists of purinergic receptors implicated the involvement of P2X2, P2Y1, and P2Y2 in the determination of the final neuronal phenotype, such as expression of NMDA-glutamate and cholinergic receptors. In order to further evaluate the functions of these P2X receptors and due to the absence of specific inhibitors for these receptor subtypes, we have used the SELEX technique (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) to select for specific inhibitors for P2X2 and P2X4 receptors. The 2\' -F-pyrimidine modified, nuclease- resistant combinatorial SELEX RNA pool enriched with inhibitors of P2X4 receptors following nine cycles of in vitro selection (cycle 9-P2X4) specifically interacted with P2X4 receptors and not with P2X2 or P2X7 receptors as verified in radioligand-receptor binding studies. Moreover, whole-cell recording measurements using astrocytoma cells expressing recombinant rat P2X2 or P2X4 receptors showed inhibition of P2X4 but not of P2X2 receptors by the selected RNA molecules. RNA molecules selected in vitro in 11 reiterative SELEX cycles using the P2X2 receptor as target specifically bound to membrane extracts containing recombinant P2X2 receptors. From both selected RNA libraries (against P2X4 and P2X2 receptors) aptamers, as RNA molecules with identified sequences and high-affinity binding, were identified by cloning and DNA sequencing. The presence of these aptamers in whole-cell recording experiments resulted in 30-80% inhibition of ATP-induced receptor activity and did not provoke any inhibitory effects on P2X receptors which had not been used as selection target. The activity of the aptamers selected using recombinant receptors as targets in inhibiting wild-type P2X4 or P2X2 receptors was verified in whole-cell recording experiments with PC12 cells which endogenously express both receptor subtypes. In addition of having developed aptamers as tools to elucidate P2X2 and P2X4 receptor functions during neuronal differentiation, these nuclease-resistant aptamers are suitable for in vivo use and may turn into therapeutics in the inhibition of purinergic receptor participation in pathophysiological conditions.

<p>Valproic acid (<em>2-propylpentanoicacid</em>) has long been in use as an anticonvulsant and mood-stabilizer. Recently, VPA has been shown to inhibit the activity of histone deacetylases (HDACs), resulting in chromatin remodelling and changes in gene expression<em>.</em> Although the molecular mechanism for VPA action in the central nervous is not well understood, many signalling pathways have been suggested as targets for this HDAC inhibitor. For instance, VPA was found to induce differentiation in adult hippocampal neural progenitor cells via the β-catenin-Ras-ERK pathway. Also, VPA up regulated Bcl-2, a neurotrophic/neuroprotective protein, with association of extracellular signal-regulated kinase (ERK-1) and phosphatidylinositol 3- kinase (PI3) pathway activation. In this study, C17.2 neural stem cells were used to examine the effects of VPA on the expression of several neurotrophic factors including; cerebral dopamine neurotrophic factor (CDNF) and mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF), glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), <em>brain-derived neurotrophic factor</em><em> (</em>BDNF). Other genes including; the orphan nuclear receptor-related factor1 (Nurr-1), the early growth response protein 1(Egr-1), and the sex determining region Y-box-2 (Sox-2) were examined. Histone H3 acetylation and the ERK1/2 pathway were examined as possible targets for VPA action. Treatment with clinically relevant concentrations of VPA (1mM, and 3 mM) induced a significant increase of CDNF protein concentrations. Also, increases in the mRNA expression of GDNF, Nurr-1, and Egr-1 were detected following 24 hours VPA treatment at clinically relevant concentrations. Moreover, an increase of histone H3 acetylation was noticed in C17.2 NSCs. These findings might support the role of VPA in neuronal differentiation and neuroprotection.</p> / Master of Science (MSc)

Les cellules souches embryonnaires (cellules ES) sont pluripotentes et ont donc le potentiel de se différencier en cellules des trois feuillets embryonnaires, ainsi qu’en cellules de la lignée germinale. Ces propriétés en font un modèle pour l’étude des mécanismes de prolifération et de différenciation. Le facteur de transcription Lmx1b est impliqué dans la maintenance du phénotype différencié des neurones dopaminergiques mésencéphaliques. Et il a aussi été montré comme un facteur clef dans la différenciation et la maintenance des neurones sérotoninergiques du rhombencéphale générés dans les noyaux du Raphé. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés aux capacités de Lmx1b d’influencer la différenciation des cellules ES de souris en neurones sérotoninergiques. La première stratégie adoptée a résulté en une expression ectopique stable de Lmx1b dans les cellules ES et leurs dérivés. Le niveau d’expression de Lmx1b a fortement influencé les capacités de différenciation neuronale des cellules. Puis, l’analyse de marqueurs de différenciation spécifiques a montré une augmentation de l’expression des marqueurs sérotoninergiques, au contraire des marqueurs dopaminergiques ou de neurones moteur. La seconde stratégie a consisté en une surexpression inductible de Lmx1b dans les précurseurs neuraux dérivés de cellules ES pour mimer l’expression physiologique de Lmx1b. Après induction, Lmx1b était bien exprimé dans les cellules durant toutes les étapes de différenciation neuronale. L’activation de l’expression de Lmx1b au stade des colonies neuroépithéliales a aussi résulté en une amélioration de la différenciation sérotoninergique. Les résultats de ce travail soulignent les capacités de Lmx1b à diriger la différenciation des précurseurs neuraux dérivés de cellules ES vers la voie sérotoninergique in vitro. / Pluripotent Embryonic Stem Cells (ESC) have the potential to develop into cells of the three germ layers and of the germ line. Therefore, they are used as a model to study the proliferation and differentiation mechanisms. The LIM homeodomain transcription factor Lmx1b is involved in the maintenance of the differentiated phenotype of midbrain dopaminergic neurons. And it has been also demonstrated to be a key factor in differentiation and maintenance of hindbrain serotonergic neurons generated in the Raphe Nuclei. Here, we explored the capacity of Lmx1b to direct differentiation of mouse ESC (mESC) into serotonergic neurons. In the first approach, stable ectopic expression of Lmx1b was achieved. First, the level of Lmx1b expression was found to strongly influence the capacity of mESC to accomplish neuronal differentiation. Then, analysis of lineage-specific differentiation markers showed an increase in serotonergic markers’ expression by contrast to dopaminergic or motor neurons markers. In the second approach, Lmx1b was over-expressed in mESC-derived neural precursors by an inducible system in order to mimic the physiological onset of Lmx1b expression. After induction, Lmx1b was found to be stably expressed throughout neuronal differentiation. Activation of Lmx1b expression in neuroepithelial colonies resulted in enhancement of serotonergic differentiation, consistently with the stable system results. The results of this work highlight the capacity of Lmx1b to promote the shift of mESC-derived neural precursors toward a serotonergic fate in vitro.

Neurotrophins and their receptors are key molecules in the development of thenervous system. Neurotrophin-3 binds preferentially to its high-affinity receptorNTRK3, which exists in two major isoforms in humans, the full-length kinaseactiveform (150 kDa) and a truncated non-catalytic form (50 kDa). The twovariants show different 3'UTR regions, indicating that they might be differentiallyregulated at the post-transcriptional level. In this work we explore howmicroRNAs take part in the regulation of full-length and truncated NTRK3,demonstrating that the two isoforms are targeted by different sets of microRNAs.We analyze the physiological consequences of the overexpression of some of theregulating microRNAs in human neuroblastoma cells. Finally, we providepreliminary evidence for a possible involvement of miR-124 - a microRNA with noputative target site in either NTRK3 isoform - in the control of the alternativespicing of NTRK3 through the downregulation of the splicing repressor PTBP1. / Las neurotrofinas y sus receptores constituyen una familia de factores crucialespara el desarrollo del sistema nervioso. La neurotrofina 3 ejerce su funciónprincipalmente a través de una unión de gran afinidad al receptor NTRK3, del cualse conocen dos isoformas principales, una larga de 150KDa con actividad de tipotirosina kinasa y una truncada de 50KDa sin dicha actividad. Estas dos isoformasno comparten la misma región 3'UTR, lo que sugiere la existencia de unaregulación postranscripcional diferente. En el presente trabajo se ha exploradocomo los microRNAs intervienen en la regulación de NTRK3, demostrando que lasdos isoformas son reguladas por diferentes miRNAs. Se han analizado lasconsecuencias fisiológicas de la sobrexpresión de dichos microRNAs utilizandocélulas de neuroblastoma. Finalmente, se ha estudiado la posible implicación delmicroRNA miR-124 en el control del splicing alternativo de NTRK3 a través de laregulación de represor de splicing PTBP1.