No description available.

Glycosaminoglycans (GAGs) are linear polysaccharides whose disaccharide building blocks consist of an amino sugar and either uronic acid or galactose. They are expressed on virtually all mammalian cells, usually covalently attached to proteins, forming proteoglycans. GAGs are highly negatively charged due to an abundance of sulfate and carboxylic acid groups, and are structurally very diverse, with differences arising from chain length, the type of monomeric units, the linkages between each monomeric unit, the position of sulfate groups, and the degree of sulfation. GAGs are known to interact with a multitude of proteins, impacting diverse physiological and pathological processes. In addition, most of the biological interactions mediated by proteoglycans are believed to be primarily because of the GAG chains present on their surface. Considering the involvement of GAGs in multiple diseases, their use in the development of drugs has been of significant interest in the pharmaceutical field. Heparin, the first GAG-based drug developed in 1935, is still the most widely used anticoagulant in the world. The therapeutic potential of GAGs for the treatment of many other disease states, including cancer, inflammation, infection, wound healing, lung diseases, and Alzheimer’s disease, is being actively studied with many GAGs currently in clinical trials. However, challenges associated with the heterogeneous and complex structure of GAGs, limit their successful development. To combat such issues, our lab has focused on developing Non- Saccharide GAG Mimetics (NSGMs) as structural mimics of GAGs. NSGMs, being synthetic molecules, offer multiple advantages over GAGs. The studies mentioned here describe our efforts in the development of NSGMs as potential therapeutics for cancer, and cystic fibrosis.

Ziel dieser Studie war es, Auswirkungen von subgingival applizierter Hyaluronsäure (Gengigel®) nach scaling and root planing (SRP) auf mikrobiologische Variablen bei Parodontitispatienten nachzuweisen. Dabei wurden die möglichen Zusammenhänge zwischen Ergebnissen der Bakterienspezies und zuvor ermittelten Ergebnissen klinischer Variablen untersucht. An der Untersuchung nahmen 20 Männer und 29 Frauen teil. Es erfolgte eine Randomisierung in zwei Gruppen, bestehend aus einer Testgruppe mit 23 und einer Kontrollgruppe mit 26 Probanden. Bei den Versuchteilnehmern wurde in zwei Sitzungen in einem 24-stündigen Abstand ein SRP mittels Hand- und Ultraschallinstrumenten durchgeführt. Am Ende des SRP wurde in der Testgruppe Gengigel prof® (mit 0,8% Hyaluronsäure) in die parodontalen Taschen eingebracht. Zusätzlich trugen die Probanden der Testgruppe während der folgenden 14 Tage zweimal täglich morgens und abends Gengigel® (0,2%) auf den Gingivarand auf. In der Kontrollgruppe erfolgte das übliche SRP ohne Verwendung von Gengigel®. Alle Probanden wurden zu Beginn der Untersuchung, nach drei und sechs Monaten aus parodontologischer Sicht untersucht. Des Weiteren wurden Proben der Sulkusflüssigkeit für eine spätere Analyse von zehn parodontopathogenen Keimen sowie der Peroxidase- und Granulozytenaktivität gewonnen. Im Gegensatz zur kontinuierlichen Zunahme in der Kontrollgruppe (p=0,035) konnte beim Verlauf der Gesamtbakterienzahl für die Testgruppe keine Veränderung der Keimzahlen (p=0,737) beobachtet werden. In der Testgruppe wurde nach sechs Monaten für Campylobacter rectus, Treponema denticola und Aggregatibacter actinomycetemcomitans eine Reduktion der Keimbelastung festgestellt (p=0,05; p=0,043; p=0,066). Am Ende der Untersuchung waren in der Testgruppe keine Unterschiede in der bakteriellen Besiedlung unterschiedlich tiefer Taschen mehr nachweisbar (p=1). In der Testgruppe bestand eine stark signifikante Korrelation der Granulozytenaktivität mit der Zeit (r=0,443; p<0,0001) und mit der Gesamtbakterienzahl (r=0,336; p=0,009). Die Ergebnisse der Studie weisen auf einen wachstumshemmenden Effekt der Hyaluronsäure auf parodontopathogene Bakterien hin, welcher womöglich auf einer indirekten Interaktion mit dem Immunsystem basiert.

L’adiponectine, une adipokine aux niveaux plasmatiques inversement associés aux composantes du syndrome métabolique, protège contre l’athérosclérose et réduit les risques d’infarctus du myocarde. Les cellules progénitrices endothéliales (EPCs) jouent un rôle dans la réparation vasculaire et leur nombre est réduit chez les patients atteints de maladies cardiovasculaires. Nous croyons que les effets de l’adiponectine peuvent s’expliquer entre autres via ses interactions avec les EPCs. Trois sous-population d’EPCs, isolées du sang de donneurs sains, ont été caractérisées par immunophénotypage par cytométrie en flux. L’expression des récepteurs de l’adiponectine, AdipoR1, AdipoR2 et H-cadherin par les EPCs et les cellules endothéliales a été évaluée par qPCR. Les effets de l’adiponectine sur la migration et l’apoptose des EPCs et sur l’apoptose des HUVECs ont été étudiés. L’expression de l’élastase des neutrophiles par les EPCs et son activité ont été testées. Les résultats de qPCR montrent que l’AdipoR1 est plus fortement exprimé que l’AdipoR2 alors qu’H-cadhérine n’est pas détectable dans les EPCs. Les EPCs précoces expriment aussi l’élastase. L’expression d’AdipoR1 a été confirmée par immunobuvardage. L’adiponectine augmente de façon significative la survie de deux sous-populations d’EPCs, mais pas celle des HUVECs, en condition de privation de sérum. L’activité de l’élastase a été confirmée dans le milieu conditionné par les EPCs. Les EPCs expriment les récepteurs de l’adiponectine et l’élastase. L’adiponectine protège les EPCs contre l’apoptose et pourrait augmenter leur capacité de réparation vasculaire. L’activité élastase des EPCs pourrait moduler localement l’activité de l’adiponectine par la génération de sa forme globulaire. / Adiponectin, an adipokine whose plasma levels are inversely correlated to metabolic syndrome components, protects against atherosclerosis and reduces myocardium infarction-associated risks. Endothelial progenitor cells (EPCs) are involved in vascular repair and their number is reduced in patients with cardiovascular disease. We hypothesized that positive effects of adiponectin against atherosclerosis are explained in part by its interaction with EPCs. EPCs were obtained from healthy volunteers’ venous blood by mononuclear cell isolation and plating on collagen-coated dishes. Three subpopulations of EPCs were characterized by flow cytometry immunophenotyping. Expression of adiponectin receptors, AdipoR1, AdipoR2 and H-cadherin was evaluated by qPCR in EPCs and endothelial cells. Effects of recombinant adiponectin on apoptosis of EPCs and HUVECs were assessed. Expression of neutrophil elastase by EPCs and enzymatic activity on adiponectin processing were assessed. Quantitative PCR of EPCs and HUVECs mRNA showed a higher expression of AdipoR1 compared to AdipoR2 and no expression of H-cadherin in EPCs. Expression of AdipoR1 in EPCs was confirmed by Western Blot. We demonstrated that early EPCs express neutrophil elastase. Adiponectin significantly increased survival of two subpopulations of EPCs in condition of serum deprivation but had no effects on HUVECs. Neutrophil elastase activity was confirmed in EPCs conditioned media. Adiponectin protects some EPCs subpopulations against apoptosis and therefore could modulate their involvement in vascular repair. Neutrophil elastase activity of EPCs could locally modify adiponectin activity by its ability to generate the globular form of adiponectin.

No description available.

Human neutrophil elastase (HNE) is a uniquely destructive serine protease with the ability to unleash a wave of proteolytic activity by destroying the inhibitors of other proteases. Although this phenomenon forms an important part of the innate immune response to invading pathogens, it is responsible for the collateral host tissue damage observed in chronic conditions such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), and in more acute disorders such as the lung injuries associated with COVID-19 infection. Previously, a combinatorially selected activity-based probe revealed an unexpected substrate preference for oxidised methionine, which suggests a link to oxida-tive pathogen clearance by neutrophils. Here we use oxidised model substrates and inhibitors to confirm this observation and to show that neutrophil elastase is specifically selective for the di-oxygenated methionine sulfone rather than the mono-oxygenated methionine sulfoxide. We also posit a critical role for ordered solvent in the mechanism of HNE discrimination between the two oxidised forms methionine residue. Preference for the sulfone form of oxidised methionine is especially significant. While both host and pathogens have the ability to reduce methionine sulfoxide back to methionine, a biological pathway to reduce methionine sulfone is not known. Taken to-gether, these data suggest that the oxidative activity of neutrophils may create rapidly cleaved elas-tase “super substrates” that directly damage tissue, while initiating a cycle of neutrophil oxidation that increases elastase tissue damage and further neutrophil recruitment.

Neutrophile Granulocyten wirken als einer der ersten Abwehrmechanismen gegen invasive Mikroorganismen im angeborenen Immunsystem von Mammalia. Aktiviert durch inflammatorische Signale verlassen diese Granulocyten das vaskuläre System und migrieren durch das Gewebe zum Infektionsherd. Dort binden sie die Mikroorganismen, phagozytieren und eliminieren diese schließlich mit hoher Effizienz. Humane Neutrophile Elastase (NE) ist Bestandteil der neutrophilen Granula und spielt eine entscheidende Rolle im Abbau von Virulenzfaktoren enteroinvasiver Bakterien, einschließlich der Shigella Virulenzfaktoren IpaB (invasion antigen plasmid B) und IcsA (intracellular spread A). NE gehört zu der Familie der Chymotrypsin-ähnlichen Serinproteasen, die sich durch Sequenz- und Strukurähnlichkeit auszeichnen, jedoch sehr unterschiedliche biologische Funktionen aufweisen. Cathepsin G (CG) ist wie NE eine Chymotrypsin-ähnliche Serinprotease und ebenfalls in neutrophilen Granula lokalisiert. Allerdings zeigt CG keine Aktivität gegenüber Virulenzfaktoren von Shigella. Obwohl die Kristallstrukturen von CG und NE fast identisch sind, konnten einzelne oder mehrere Aminosäuren in der Substratbindungsspalte identifiziert werden, die zwischen den beiden Enzymen differieren. Dies legte die Vermutung nahe, dass die Spezifität von NE gegenüber Virulenzfaktoren in diesen Unterschieden codiert sein könnte. Daher wurden diese Aminosäuren durch die analogen CG Aminosäuren oder durch Alanin ersetzt. Der Vergleich der funktionellen Eigenschaften der NE Mutanten mit wildtyp NE zeigte, dass die Aminosäuren an den Positionen 98 und 216-224 entscheidend für die Substratspezifität von NE sind. Die NE Mutanten N98A, 216-218 und 216-224 waren nicht mehr in der Lage, die Virulenzfaktoren IcsA und IpaB sowie das NE Peptidsubstrat abzubauen. Stattdessen haben diese Mutanten die Fähigkeit erlangt, das CG Peptidsubstrat abzubauen. Zusammenfassend konnten wir Aminosäuren in NE identifizieren, die sowohl die Spezifität von NE für das Peptidsubstrat als auch für die Virulenzfaktoren von Shigella flexneri determinieren. / Neutrophil granulocytes are one of the first lines of defense of the mammalian innate immune system against invading microorganisms. In response to inflammatory stimuli, neutrophils migrate from the blood stream to infected tissues where they bind, engulf and inactivate microorganisms efficiently. Human neutrophil elastase (NE), a neutrophil granule component, is a key host defense protein that rapidly destroys virulence factors of enteroinvasive pathogens including IpaB (invasion plasmid antigen B) and IcsA (intracellular spread A) from Shigella. NE belongs to the family of chymotrypsin-like serine proteases with sequence and structural similarity but with very different biological functions. Cathepsin G (CG) is another abundant chymotrypsin-like serine protease in neutrophil granules. However, in contrast to NE, CG does not cleave virulence factors of Shigella. The crystallographic structures of NE and CG are very similar but we identified single or multiple residues in the substrate-binding cleft to differ in these two enzymes. We hypothesized that NE specificity for bacterial virulence factors resides within these structural differences. Therefore these specific residues in NE were replaced with the analogous amino acids of CG or with alanine. By comparing the functional properties of these NE mutants to wildtype NE we were able to show that the amino acids at position 98 and 216-224 are crucial for the substrate specificity of NE. The NE mutants N98A, 216-218 and 216-224 did not cleave the virulence factors IcsA and IpaB as well as the NE peptide substrate but cleaved the CG peptide substrate. In summary, we identified residues in NE that determine the specificity of NE for the peptide substrate and for the Shigella flexneri virulence factors.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JannisonKCR_DISSERT.pdf: 3798069 bytes, checksum: 8a7cf649e9d79113b8221c30286c11d0 (MD5) Previous issue date: 2010-05-07 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Seeds from legumes including the Glycine max are known to be a rich source of protease inhibitors. The soybean Kunitz trypsin inhibitor (SKTI) has been well characterised and has been found to exhibit many biological activities. However its effects on inflammatory diseases have not been studied to date. In this study, SKTI was purified from a commercial soy fraction, enriched with this inhibitor, using anion exchange chromatography Resource Q column. The purified protein was able to inhibit human neutrophil elastase (HNE) and bovine trypsin. . Purified SKTI inhibited HNE with an IC50 value of 8 ?g (0.3 nM). At this concentration SKTI showed neither cytotoxic nor haemolytic effects on human blood cell populations. SKTI showed no deleterious effects on organs, blood cells or the hepatic enzymes alanine amine transferase (ALT) and aspartate amino transferase (AST) in mice model of acute systemic toxicity. Human neutrophils incubated with SKTI released less HNE than control neutrophils when stimulated with PAF or fMLP (83.1% and 70% respectively). These results showed that SKTI affected both pathways of elastase release by PAF and fMLP stimuli, suggesting that SKTI is an antagonist of PAF/fMLP receptors. In an in vivo mouse model of acute lung injury, induced by LPS from E. coli, SKTI significantly suppressed the inflammatory effects caused by elastase in a dose dependent manner. Histological sections stained by hematoxylin/eosin confirmed this reduction in inflammation process. These results showed that SKTI could be used as a potential pharmacological agent for the therapy of many inflammatory diseases / Sementes de leguminosas s?o conhecidas como uma rica fonte de inibidores de proteinases, destacando-se dentre estes o inibidor de tripsina da soja (SKTI) que ? uma prote?na amplamente estudada e caracterizada para muitas propriedades biol?gicas. Entretanto seus efeitos aplicados a desordens inflamat?rias ainda s?o pouco conhecidos. SKTI foi purificado ? partir de uma fra??o comercial de soja atrav?s de cromatografia de troca ani?nica em Resource Q. A prote?na purificada foi capaz de inibir a elastase de neutr?filos humanos (ENH) e a tripsina bovina. O valor da sua IC50 foi de 8 &#956;g.mL-1 (0.3 nM) e nessa concentra??o o SKTI n?o foi capaz de provocar efeitos hemol?ticos ou citot?xicos sobre as popula??es celulares sangu?neas humanas. Por meio do modelo de toxicidade sist?mica aguda, utilizando camundongos, tamb?m n?o foram observados efeitos delet?rios sobre ?rg?os, c?lulas sangu?neas e altera??es nos n?veis das enzimas hep?ticas aspartato amino transferase (AST) e alanina amino transferase (ALT). Neutr?filos humanos incubados com SKTI na concentra??o de 0.3 nM apresentaram uma diminui??o da libera??o de ENH quando estimulados pelos ativadores PAF e fMLP (83,1% e 70 %, respectivamente). Estes resultados mostram que o SKTI foi capaz de afetar ambas as vias PAF/fMLP de libera??o de ENH, sugerindo esta prote?na como um poss?vel antagonista dos receptores PAF/fMLP. Modelos in vivo de inj?ria pulmonar aguda mediante estimula??o por LPS de Escherichia. coli demonstraram uma supress?o significativa dos eventos inflamat?rios atribu?dos ? atividade elast?sica de forma dose dependente. Cortes histol?gicos corados por hematoxilina e eosina confirmaram a diminui??o da inflama??o tecidual. Estes resultados sugerem que o SKTI pode ser indicado como um potencial agente farmacol?gico na terapia de muitas doen?as inflamat?rias

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 NorbertoKVM_DISSERT.pdf: 2522986 bytes, checksum: 6298d49730e0d9c9d5418ad46a9b33f5 (MD5) Previous issue date: 2011-02-22 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Studies indicate that several components were isolated from medicinal plants, which have antibacterial, antifungal, antitumor and anti-inflammatory properties. Sepsis is characterized by a systemic inflammation which leads to the production of inflammatory mediators exacerbated by excessive activation of inflammatory cells and disseminated intravascular coagulation (DIC), in which the human neutrophil elastase plays an important role in its pathogenesis. Several epidemiological studies suggest that components of plants, especially legumes, can play a beneficial role in reducing the incidence of different cancers. A chymotrypsin inhibitor of Kunitz (Varela, 2010) was purified from seeds of Erythrina velutina (Mulungu) by fractionation with ammonium sulfate, affinity chromatography on Trypsin-Sepharose, Chymotrypsin-Sepharose and ion exchange chromatography on Resource Q 1 ml (GE Healthcare) in system FPLC / AKTA. The inhibitor, called EvCI, had a molecular mass of 17 kDa determined by SDS-PAGE. The purified protein was able to inhibit human neutrophil elastase (HNE), with an IC50 of 3.12 nM. The EvCI was able to inhibit both pathways of HNE release stimulated by PAF and fMLP (75.6% and 65% respectively). The inhibitor also inhibited leukocyte migration in septic mice about 87% and prolonged the time of coagulation and inhibition factor Xa. EvCI showed neither hemolytic activity nor cytotoxicity. EvCI showed a selective antiproliferative effect to HepG2 cell lines with IC50 of 0.5 micrograms per milliliter. These results suggest EvCI as a molecule antagonist of PAF / fMLP and a potential use in fighting inflammation related disorders, disseminated intravascular coagulation (DIC) and cancer / Estudos indicam que v?rios componentes medicinais foram isolados de vegetais, os quais apresentam atividades antibacterianas, antif?ngicas, antitumorais e anti-inflamat?rias. Sepse ? caracterizada por uma inflama??o sist?mica que tem como conseq??ncia a produ??o exarcebada de mediadores inflamat?rios, pela excessiva ativa??o de c?lulas inflamat?rias e coagula??o intravascular disseminada (CIVD), na qual a elastase neutrof?lica humana exerce um papel importante na sua patog?nese. Diversos estudos epidemiol?gicos sugerem que componentes de vegetais, especialmente de leguminosas, podem desempenhar um papel ben?fico na redu??o da incid?ncia de diferentes tipos de c?ncer. Um inibidor de quimotripsina do tipo Kunitz (Varela, 2010) foi purificado de sementes de Erythrina velutina (Mulungu) por fracionamento com sulfato de am?nio, cromatografias de afinidade em Tripsina-Sepharose e Quimotripsina-Sepharose e cromatografia de troca i?nica em Resource Q 1 mL (GE Healthcare), em sistema FPLC/AKTA. O inibidor, denominado EvCI, apresentou uma massa molecular de 17 kDa, determinada por SDS-PAGE. A prote?na purificada foi capaz de inibir a elastase de neutr?filos humanos (ENH), apresentando um IC50 de 3,12 nM. O EvCI foi capaz de inibir ambas as vias de libera??o de ENH estimuladas por PAF e fMLP (75,6% e 65%, respectivamente). O inibidor tamb?m inibiu a migra??o leucocit?ria em camundongos s?pticos em cerca de 87% e prolongou o tempo de coagula??o com inibi??o do fator Xa. EvCI n?o apresentou atividade hemol?tica nem citot?xica. EvCI apresentou um efeito antiproliferativo seletivo para linhagens de c?lulas HepG2 com IC50 de 0,5 &#956;g /mL. Estes resultados sugerem o EvCI como uma mol?cula antagonista dos receptores PAF/fMLP e um potencial emprego no combate a dist?rbios relacionados a inflama??o, coagula??o intravascular disseminada (CIVD) e cancer

Ziel dieser Studie war es, Auswirkungen von subgingival applizierter Hyaluronsäure (Gengigel®) nach scaling and root planing (SRP) auf mikrobiologische Variablen bei Parodontitispatienten nachzuweisen. Dabei wurden die möglichen Zusammenhänge zwischen Ergebnissen der Bakterienspezies und zuvor ermittelten Ergebnissen klinischer Variablen untersucht. An der Untersuchung nahmen 20 Männer und 29 Frauen teil. Es erfolgte eine Randomisierung in zwei Gruppen, bestehend aus einer Testgruppe mit 23 und einer Kontrollgruppe mit 26 Probanden. Bei den Versuchteilnehmern wurde in zwei Sitzungen in einem 24-stündigen Abstand ein SRP mittels Hand- und Ultraschallinstrumenten durchgeführt. Am Ende des SRP wurde in der Testgruppe Gengigel prof® (mit 0,8% Hyaluronsäure) in die parodontalen Taschen eingebracht. Zusätzlich trugen die Probanden der Testgruppe während der folgenden 14 Tage zweimal täglich morgens und abends Gengigel® (0,2%) auf den Gingivarand auf. In der Kontrollgruppe erfolgte das übliche SRP ohne Verwendung von Gengigel®. Alle Probanden wurden zu Beginn der Untersuchung, nach drei und sechs Monaten aus parodontologischer Sicht untersucht. Des Weiteren wurden Proben der Sulkusflüssigkeit für eine spätere Analyse von zehn parodontopathogenen Keimen sowie der Peroxidase- und Granulozytenaktivität gewonnen. Im Gegensatz zur kontinuierlichen Zunahme in der Kontrollgruppe (p=0,035) konnte beim Verlauf der Gesamtbakterienzahl für die Testgruppe keine Veränderung der Keimzahlen (p=0,737) beobachtet werden. In der Testgruppe wurde nach sechs Monaten für Campylobacter rectus, Treponema denticola und Aggregatibacter actinomycetemcomitans eine Reduktion der Keimbelastung festgestellt (p=0,05; p=0,043; p=0,066). Am Ende der Untersuchung waren in der Testgruppe keine Unterschiede in der bakteriellen Besiedlung unterschiedlich tiefer Taschen mehr nachweisbar (p=1). In der Testgruppe bestand eine stark signifikante Korrelation der Granulozytenaktivität mit der Zeit (r=0,443; p<0,0001) und mit der Gesamtbakterienzahl (r=0,336; p=0,009). Die Ergebnisse der Studie weisen auf einen wachstumshemmenden Effekt der Hyaluronsäure auf parodontopathogene Bakterien hin, welcher womöglich auf einer indirekten Interaktion mit dem Immunsystem basiert.