Dans le contexte prébiotique du " monde ARN ", les ribonucléotides sont considérés comme étant les premières espèces à avoir émergé sur Terre. En milieu aqueux, leur formation est défavorable thermodynamiquement. Les voies de synthèse de nucléotides décrites en phase homogène impliquent l'utilisation des molécules activées. En 1951, Bernal a introduit une autre voie de synthèse impliquant des surfaces minérales. Cependant, dans cette voie, les effets thermodynamique et/ou catalytique des surfaces minérales restent inexplorés. Dans le cadre de l'hypothèse de Bernal, notre travail présente pour la première fois une étude in-situ de la réactivité thermique des " briques élémentaires " des nucléotides adsorbés sur des surfaces minérales avec comme objectif de réaliser la synthèse des nucléotides sans activation chimique. Ce travail a montré dans un premier temps que les surfaces minérales sont capables de déclencher la formation de polyphosphates inorganiques à partir de monophosphates à des températures modérées. D'autre part, l'adsorption du ribose sur la surface de la silice a permis d'améliorer sa stabilisation thermique : alors qu'il est instable dès 90°C en milieux aqueux, il devient stable jusqu'à 200°C après adsorption sur la silice. Dans un deuxième temps, nous avons mis en évidence la formation de PRPP, un intermédiaire réactionnel très important, par co-adsorption du ribose avec du phosphate inorganique sur la surface de la silice. Enfin, on a pu montrer la glycosylation de l'adénine et la formation après co-adsorption de ses composants sur les deux surfaces minérales utilisées. Une étude préliminaire suggère même la possibilité de dimérisation des nucléotides. / In the « RNA world» prebiotic scenario, ribonucleotide polymers are considered as the first biochemical species to have emerged. However, in aqueous solution, their formation through conventional mechanisms of condensation is thermodynamically forbidden. Several synthesis pathways of nucleotides have been described in aqueous solution; most often, they involve chemically activated molecules. Another pathway to nucleotides implies mineral surfaces, which have been considered in prebiotic processes at least since the work of Bernal in 1951. However, these studies have hardly tried to understand surface-molecule interactions and consequently, thermodynamic and/or catalytic effects of mineral surfaces are not well rationalized. In the context of Bernal's hypothesis, we present for the first time an in-situ study of the thermal reactivity of nucleotides “building blocks” adsorbed on mineral surfaces (amorphous silica, saponite) emphasizing the synthesis of nucleotides without chemical activation. In our work, we first show that mineral surfaces are able to trigger the formation of inorganic polyphosphates from monophosphates at moderate temperatures. On the other hand, adsorption of ribose on silica surface improves its thermal stabilization. While ribose decomposes at 90°C in aqueous solutions, it is stable up to 200°C on silica (in the presence of ZnCl2). Secondly, we have demonstrated the formation of PRPP, as important reaction intermediate, by co-adsorption of ribose and inorganic phosphate on the silica surface. Finally, we showed the glycosylation of adenine to adenosine and the formation of AMP (i.e. simultaneous glycosylation and phosphorylation) after co-adsorption of their components on both mineral surfaces employed. A preliminary study even suggests that nucleotide dimerisation can occur in the same conditions.

Titre de l'écran-titre (visionné le 30 octobre 2023) / Les variations structurales (SV) sont maintenant reconnues comme la principale source de polymorphisme génétique intraspécifique et peuvent contribuer aux processus évolutifs chez plusieurs organismes. Elles demeurent toutefois peu documentées en contexte de génomique des populations sauvages, en raison des nombreuses difficultés que comportent leur détection et leur génotypage. Le saumon atlantique (Salmo salar), qui montre une importante variabilité interpopulationnelle dans ses traits d'histoire de vie et son habitat, représente une espèce idéale pour étudier les SV d'importance adaptative. Dans ce contexte, nous avons développé un pipeline bio-informatique permettant de caractériser et d'analyser l'ensemble de la variation génétique à une échelle populationnelle, soit les SV, les polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) et les indels courts. Ce pipeline repose, entre autres, sur la combinaison de données de séquençage en lectures courtes et en lectures longues et sur l'intégration des graphes pangénomiques. À l'aide de ce pipeline, nous avons catalogué 115,907 SV, 8,777,832 SNP et 1,089,321 indels courts dans les génomes de 60 saumons des rivières Romaine et Puyjalon (Côte-Nord, Québec), deux populations présumément adaptées localement dont les individus diffèrent fortement dans leurs traits d'histoire de vie, incluant l'âge de la maturité sexuelle et le taux de croissance. L'analyse comparative des trois formes de polymorphisme a révélé une excellente concordance entre elles quant à la structure de population et à l'ampleur de la différenciation génétique entre les saumons des deux populations. De plus, plusieurs variants présentant la signature moléculaire de sélection naturelle touchent à des gènes impliqués dans la fonction du système nerveux : ces variants pourraient donc indirectement contribuer à la variation phénotypique observée chez les populations à l'étude, et ainsi avoir un rôle dans leur adaptation locale. Ce travail démontre la faisabilité de l'étude populationnelle des SV et témoigne de sa pertinence pour la génomique des populations des salmonidés. / Structural variants (SVs) are now recognized as the main component of intraspecific genetic polymorphism and can contribute to evolutionary processes in various organisms. However, they are inherently difficult to detect and genotype and therefore remain poorly documented in wild populations. Atlantic salmon (Salmo salar), which displays strong interpopulation variability in life history traits and habitat, offers a prime context for studying adaptive SVs. Here, we developed a population-scale variant characterization and analysis pipeline targeting SVs, single nucleotide polymorphisms (SNPs) and short indels. This pipeline mainly relies on the combination of both short- and long-read sequencing and on the integration of pangenome graphs. Using this pipeline, we catalogued 115,907 SVs, 8,777,832 SNPs and 1,089,321 short indels in the genomes of 60 salmon from the Romaine and Puyjalon rivers (Côte-Nord, Québec), two putatively locally adapted populations exhibiting pronounced variation in life history traits, namely age at maturity and growth rate. Comparative analysis of the three types of polymorphism revealed a highly consistent population structure and genetic differentiation between both populations. In addition, numerous variants bearing molecular signatures of natural selection were located nearby genes involved in nervous system function: these variants might thus indirectly contribute to the observed phenotypic variation in the Romaine and Puyjalon populations, especially in age at smoltification, and could therefore play a role in their local adaptation. This research demonstrates the feasibility of population-scale study of SVs and highlights its relevance for population genomics of salmonids.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles. / Ce ne sont pas moins de 98% de notre ADN qui constituent la partie non-codante du génome. D'abord qualifiée d'ADN « camelote », il a plus tard été identifié que cette portion de notre patrimoine génétique est caractérisée par une structure particulière de la chromatine associée aux fonctions régulatrices à l'origine de l'expression des programmes génétiques nécessaires à l'établissement de la myriade des types cellulaires composant notre organisme. Ce code régulateur constitue l'épigénome qui est une composante indispensable à l'expression organisée de l'exome qui représente la portion codante de notre ADN; il a par exemple été identifié certaines régions régulatrices appelées « enhancers » qui possèdent la capacité d'amplifier l'expression de gènes codants localisés à distance via une courbure de la chromatine permettant le rapprochement géographique de régions éloignées du génome. De cette façon si chaque cellule qui nous compose présente au sein de leur noyau une séquence d'ADN rigoureusement identique, c'est la manière dont le génome s'organise qui définit l'identité et le destin cellulaire. Cette organisation obéit à une hiérarchie à l'origine de la régulation fine de l'expression des gènes et pour laquelle une quelconque perturbation peut avoir des conséquences néfastes sur l'homéostasie cellulaire ou tissulaire. Ces dernières années la réduction drastique des couts de séquençage du génome humain a permis de développer de nombreuses techniques nous offrant l'opportunité de déchiffrer les impacts des variations génétiques non-codantes sur les phénotypes : de cette façon l'investigation des polymorphismes d'un seul nucléotide comme source de variation (SNPs), la capture de l'organisation tridimensionnelle du génome, ou encore la mesure de l'expression de gènes codants ou non-codants à l'échelle tissulaire ou de la cellule unique sont autant d'outils qui permettent potentiellement de décrypter le langage non-codant associé à l'établissement des phénotypes. En revanche la complexité des données générées par ces types d'approches ainsi que les défis que représente une intégration multidimensionnelle nécessite de développer des algorithmes rigoureux aussi bien analytiques qu'expérimentaux pour extraire les informations clés qui permettront de comprendre les phénotypes. Ce travail de doctorat visait à déchiffrer les conséquences de certaines variations génétiques non-codantes associées à la longévité et au rétrécissement aortique calcifié pour comprendre les mécanismes reliés à ces phénotypes par le développement d'approches holistiques intégrant une dualité expérimentale et analytique. À partir de données d'associations génétiques pour la longévité et d'expression de gènes à l'échelle tissulaire et de la cellule unique et grâce à l'utilisation d'approches évaluant la causalité d'associations par randomisation Mendélienne, il a été ainsi démontré que le tissu sanguin joue un rôle important dans la longévité par le biais de processus reliés à l'immunité innée et adaptative, et également que l'expression de 16 gènes dans le sang est associée à l'établissement de la trajectoire de la longévité directement ainsi que par le biais de certaines maladies. En utilisant la cartographie génétique tridimensionnelle et des informations relatives à la structure de la chromatine, il a d'autre part été possible durant ce doctorat de comprendre la régulation génétique au locus 1p21.2 associé au rétrécissement aortique calcifié et à l'expression de la palmdelphine dans la valve aortique, puis en complément grâce à des expériences *in vitro* dans des cellules de valve aortique issues de patients d'identifier un rôle de la palmdelphine dans la fibrose, un processus important dans la pathogenèse de cette maladie. Enfin, l'exploitation conjointe de données relatives à l'organisation tridimensionnelle du génome, à la structure de la chromatine et à l'expression de gènes codants et non-codants dans la valve aortique a aussi permis d'identifier que l'ARN long non-codant LINC01013 dérive d'un « super-enhancer » et est impliqué dans le développement de fibrose dans le rétrécissement aortique calcifié en contrôlant l'expression de *CCN2*, un gène important pour le maintien de l'homéostasie de la matrice extracellulaire de nombreux tissus. Ce travail de doctorat a donc renforcé l'importance du rôle des régions non-codantes dans le maintien de l'homéostasie et de l'intégrité des phénotypes en déchiffrant les conséquences de variations génétiques non-codantes associées à la longévité et au rétrécissement aortique calcifié. D'autre part, celui-ci a souligné la puissance d'approches holistiques intégrant une dualité expérimentale et analytique par le développement de nouveaux algorithmes qui ont permis d'identifier des mécanismes reliés à l'acquisition de ces phénotypes qui demeuraient jusqu'alors inconnus.

Les variations génétiques entre les individus peuvent expliquer plusieurs différences interindividuelles dans la présentation et la progression de certaines maladies. La parodontite apicale est une maladie causée par la réponse immunitaire de l'hôte en réponse à des pathogènes dans la pulpe dentaire. La reconnaissance decertains patrons moléculaires associés aux pathogènes (PAMP) par les récepteurs de reconnaissance de formes (PRR) localisés sur les cellules pulpaires mène à l'activation de la voie de signalisation des récepteurs de type *Toll Like récepteur 4* (TLR4), menant à l'activation du facteur nucléaire kappa B (NF-kB). Ceci se traduit en la production d'une multitude de médiateurs inflammatoires, comme l'interleukine-1 (IL-1), l'interleukine-6 (IL-6) et le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α). Ces molécules jouent un rôle clé dans la pathogenèse de la parodontite apicale en altérant le mécanisme de remodelage osseux en faveur de la lyse osseuse. Le projet de recherche présenté vise à évaluer l'impact de certains polymorphismes de nucléotides simples (SNPs) de la voie de signalisation des TLR4 sur la parodontite apicale. Les participants ont été recrutés dans les cliniques dentaires de la faculté de médecine dentaire de l'Université Laval. 52 participants avec une parodontite apicale ont été recrutés dans le groupe expérimental et 88 participants avec une santé bucco-dentaire optimale ont été recrutés pour le groupe contrôle. 3mL de salive de chaque participant ont été récoltés dans des tubes de collecte le jour de l'examen. Ces échantillons étaient ensuite utilisés pour en extraire l'ADN et effectuer un génotypage pour identifier les SNP visés par le projet de recherche. Deux SNPs du gène de TLR4 ont été sélectionnés (rs2770150 et rs4986790) ainsi que deux SNPs du gène de MYD88 (rs7744 et rs8177374). Une analyse statistique globale des participants ainsi que celles se basant sur l'âge et le sexe de deux groupes de participants ont été effectuées dans le but d'identifier une potentielle association entre ces SNPs de la voie de signalisation de TLR4 et la parodontite apicale. L'analyse statistique n'a révélé aucune association significative entre les génotypes et la prévalence de la parodontite apicale dans l'ensemble des données ou dans les analyses en sous-groupes. Selon les données disponibles dans ce projet de recherche, les SNPs rs2770150 et rs4986790 de TLR4 ainsi que rs7744 et rs8177374 de MYD88 n'ont pas d'impact sur la prévalence de laparodontite apicale ou la présence de symptômes cliniques dans la population québécoise.

Les rayons UV du soleil causent une variété de dommages dans l'ADN, parmi lesquels les dimères cyclobutilyques de pyrimidines (CPD) sont considérés comme hautement toxiques et dommageables pour un organisme. Par conséquent, il est important de comprendre comment la machinerie de réparation par excision des nucléotides (la NER), assure la réparation in vivo des CPD présents dans l'ADN empaqueté sous forme de chromatine. Il est connu que la présence du nucléosome inhiberait la NER, mais les détails fonctionnels demeurent mal compris, de même que les mécanismes cellulaires nécessaires pour contourner cette inhibition offerte par la chromatine. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, les gènes SIR (SIR1, SIR2, SIR3 et SIR4 ) permettent la formation d'une structure hétérochromatique sur le locus du type sexuel et les télomères. Cependant, l'impact de cette hétérochromatine sur la réparation des CPD est très peu étudié.Les travaux présentés dans cette thèse de doctorat ont permis de caractériser l'impact des gènes SIR dans la survie des cellules après irradiation aux rayons UV, de même que dans la réparation de l'ADN des régions hétérochromatiques. Premièrement, à l'aide d'une méthode basée sur le suivi de la croissance en milieu de culture liquide, nous avons démontré que les mutants sir[delta] sont plus résistants aux rayons UV par rapport aux cellules de types sauvages. Ce phénotype serait relié à l'effet de pseudo-diploïdie présent dans ces mutants, et plus précisément à la recombinaison homologue en phase G2/M du cycle cellulaire.Les protéines Sir ne joueraient donc pas un rôle directement dans la réparation des CPD. Par la suite, nous avons procédé à l'analyse de la cinétique de réparation de l'ADN du locus du type sexuel et des télomères dans des cellules de type sauvage et des mutants si2r[delta], sir3[delta], et rad26[delta] . À partir des résultats obtenus, nous avons pu tirer différentes conclusions préliminaires laissant croire que la présence de l'hétérochromatine faite par les protéines Sir n'inhiberait pas davantage la réparation par rapport à la présence des nucléosomes, du moins dans les régions sous-télomériques. De plus, nos résultats démontreraient que la réparation couplée à la transcription pourrait jouer un rôle important dans la réparation de ces régions. Ces hypothèses devront évidemment être testées.

La lignine représente 25% de la biomasse des végétaux terrestre. Sa quantité et sa qualité sont variables au sein des populations naturelles et sont devenues des cibles de l’amélioration génétique des eucalyptus. L’identification des polymorphismes génétiques impliqués dans la variation de ces caractères permettrait de disposer d’outils de diagnostic moléculaire pour une sélection précoce des meilleurs géniteurs et ainsi contribuer à l’augmentation des gains génétiques par unité de temps. Dans ce travail de thèse nous avons décrit la variabilité nucléotidique de gènes impliqués dans la biosynthèse des lignines, ainsi que la part de la variation génétique de ces deux caractères chez trois espèces d’Eucalyptus. En intégrant ces deux niveaux de variabilité au sein de plans de croisement factoriels, nous avons identifié des polymorphismes associés à la variation des caractères. Ces travaux posent les bases de la sélection assistée par marqueurs chez l’eucalyptus. / Lignins represent 25% of plant biomass on earth. Lignins quantity and quality vary within natural populations and have become major targets for genetic improvement of eucalyptus. Identifying genetic polymorphisms involved in the variation of these traits could provide molecular tools for early selection of plus trees and contribute to increase genetic gains expected by time units. In this thesis work, we described the nucleotide diversity of genes involved in lignin biosynthesis and the genetic part of the variation of lignins quantity and quality in three eucalyptus species. Integrating these two levels of variation in a factorial matting design, we identified Single Nucleotide Polymorphisms statistically associated to the variation of lignin quality. This work paves the way to marker assisted selection in eucalyptus.

Depuis que Parsons et col. ont découvert en 2008 que le gène de l’isocitrate déhydrogénase 1 (IDH1) est fréquemment muté dans les glioblastomes (12%), de nombreuses équipes ont étudié la prévalence et les caractéristiques des mutations des gènes IDH1 et 2 dans les gliomes.Les mutations du gène IDH1 sont observées dans environ 40% des gliomes. La mutation d’IDH1 la plus fréquentes dans les gliomes (>90% des cas) est la mutation R132H. La fréquence des mutations IDH1 et 2 est inversement corrélée au grade des gliomes (grade II ~80%, III ~50%, and IV ~10%). Les mutations IDH1/2 ont une valeur diagnostique ainsi que pronostique (associées à une meilleure survie). Pendant ce travail de thèse nous avons dans une première partie analysé la distribution de ces mutations IDH1/2 dans les différents gliomes, leur association avec d’autres altérations génétiques, ainsi que leur valeur diagnostique et pronostique dans une cohorte de 1332 patients atteints de gliomes. Nous confirmons sur cette très grande cohorte les données de la littérature et affinons la valeur pronostique des mutations IDH1/2. Dans une seconde partie, nous avons mis en évidence dans les gliomes un polymorphisme (SNP) du gène IDH1 (SNP rs 11554137; C (cytosine) substituted by T (thymin)) précédemment observé dans les leucémies myéloïdes aigues. Ce SNP, codon 105, est localisé dans le même exon que le codon 132 fréquemment muté, et nous avons montré qu’il est associé à une moins bonne survie des patients atteints de gliomes. Les mutations du codon 132 causent une baisse de l’activité enzymatique normale d’IDH1/2 qui est remplacé par le gain d’une nouvelle. Les protéines IDH1/2 mutés, au lieu de produire de l’alpha-cétoglutarate de façon NADP dépendante, réduisent de façon NADPH dépendante l’alpha-cétoglutarate en 2-hydroxyglutarate (2HG). Une forte concentration de 2HG et une baisse de la quantité de NADPH peuvent sensibiliser les tumeurs au stress oxidatif et donc potentialiser l’effet de la radiothérapie, ce qui pourrait expliquer la meilleure survie de ces patients. Nous avons donc dans une troisième partie étudié in vitro l’impact de la mutation IDH1R132H sur la survie après radiothérapie de cellules tumorales exprimant de façon stable ce gène muté. Les résultats obtenus montrent que dans certaines conditions ces cellules pourraient être plus radiosensibles que les mêmes cellules exprimant le gène IDH1 non-muté.Dans ce travail de thèse, nous avons donc étudié le gène IDH1 dans les gliomes de patients et tenté par une approche fonctionnelle in vitro d’évaluer l’impact de la mutation IDH1R132H sur la radiosensibilité des cellules tumorales. / Since Parsons et al. (2008) found the frequent mutations of IDH1 (12%) in GBMs, various reports have studied the prevalence and characteristic of IDH1 and IDH2 mutations.The mutations in the isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) gene occur in nearly 40% of gliomas. The frequency of IDH1 mutations are inversely connected with grade II (~80%), III (~50%), and IV (~ 10%) gliomas. Importantly, the status of IDH1 mutations is associated with a better outcome and demonstrated a diagnostic value. We analyzed also these mutations in distribution, association with tumor-derived other genetic alterations and the diagnostic and prognostic value in a cohort of 1332 glioma patients.A synonymous single nucleotide polymorphism [SNP rs 11554137; C (cytosine) substituted by T (thymin)] has been studied in gliomas patients. The SNP rs 11554137 (in codon 105) are located in the same exon with the IDH1 R132 mutations (in codon 132). And gliomas patients with SNP rs 11554137: C>T had a poorer outcome than patients without SNP rs 11554137. This was observed a similarly adverse effect in survival in patients with AML. Mutations in codon 132 can cause a decrease of IDH1/2 activity and also gain a new enzyme function for the NADPH dependent reduction of alpha-ketoglutarate to 2-hydroxyglutarate. High 2HG and low NADPH levels might sensitize tumors to oxidative stress, potentiating response to radiotherapy, and may account for the prolonged survival of patients harboring the mutations. So we studied further the alterations of function in IDH1R132H mutant cells in vitro. Based on the decrease of defence and the increase of impairing factors in tumor cells, we found that the tumors harbouring IDH1 mutations may have an elevated radiosensitivity. In the present study, we described the impact of IDH1 mutations in gliomas and search for new perspectives for the treatment strategy.

La stabilité du génome est compromise par les déséquilibres du pool de dNTPs qui affectent la vitesse de progression des fourches de réplication. Par exemple, la déficience en cytidine désaminase (CDA) conduit à un excès de dCTP qui induit un ralentissement des fourches de réplication. Les résultats obtenus au cours de ma thèse ont permis de mettre en évidence un nouveau mécanisme par lequel un déséquilibre du pool de nucléotides compromet la complétion de la réplication et la ségrégation correcte des chromosomes. En utilisant des techniques de peignage moléculaire, de microscopie électronique et d’imagerie cellulaire permettant de quantifier le niveau basal de PAR, nous avons montré que la réplication incomplète de l’ADN lorsque la CDA est absente est due à l’inhibition partielle de PARP-1, et n’est pas liée au ralentissement de la vitesse de progression des fourches de réplication. En effet, l’accumulation intracellulaire de dCTP inhibe l’activité de PARP-1 ce qui réduit l’activation de Chk1 et l’efficacité des points de contrôle situés en aval, favorisant ainsi l’accumulation de séquences d’ADN non répliquées en mitose. Celles-ci conduisent alors à la formation de ponts anaphasiques ultrafins (UFBs) entre les chromatides sœurs au niveau de sites difficiles à répliquer tels que les centromères et les sites fragiles. Ces résultats ont des implications directes dans le syndrome de Bloom (BS), une maladie génétique rare combinant prédisposition aux cancers et instabilité génétique. Ce syndrome est la conséquence de la mutation du gène BLM, codant pour une hélicase RecQ du même nom. La déficience en BLM conduit à une chute de l’expression de la CDA résultant en une augmentation des UFBs entièrement due à l’inhibition de PARP-1 par la dCTP, indépendamment de BLM. Ces travaux décrivent ainsi une conséquence pathologique encore inconnue du déséquilibre du pool de nucléotides et révèlent un rôle inattendu de PARP-1 dans la surveillance des séquences d’ADN non répliquées prévenant leur accumulation en mitose et les défauts de ségrégation des chromosomes associés. / Genome stability is jeopardized by imbalances of the dNTP pool; such imbalances affect the rate of fork progression. For example, cytidine deaminase (CDA) deficiency leads to an excess of dCTP, slowing the replication fork. We describe here a novel mechanism by which pyrimidine pool disequilibrium compromises the completion of replication and chromosome segregation. Using molecular combing, electron microscopy and a sensitive assay involving cell imaging to quantify steady-state PAR levels, we found that in CDA-deficient cells DNA replication was unsuccessful due to the partial inhibition of basal PARP-1 activity, rather than slower fork speed. Indeed, the intracellular accumulation of dCTP inhibits PARP-1 activity compromising the activation of Chk1 and the downstream checkpoints efficiency, allowing the subsequent accumulation of unreplicated DNA in mitosis. This unreplicated DNA leads to the formation of ultrafine anaphase bridges (UFBs) between sister-chromatids at “difficult-to-replicate” sites such as centromeres and fragile sites. These results have direct implications for Bloom syndrome (BS), a rare genetic disease combining susceptibility to cancer and genomic instability. BS results from mutation of the BLM gene, encoding BLM, a RecQ 3’-5’ DNA helicase, a deficiency of which leads to CDA downregulation. BS cells thus have a CDA defect, resulting in a high frequency of UFBs due entirely to dCTP-dependent PARP-1 inhibition and independent of BLM status. Our results describe previously unknown pathological consequences of the distortion of dNTP pools and reveal an unexpected role for PARP-1 in preventing unreplicated DNA accumulation in mitosis and in preventing chromosome segregation defects.

La myopathie de Duchenne est une maladie génétique qui se caractérise principalement par une dégénérescence progressive des muscles squelettiques dont la cause est l'absence de dystrophine fonctionnelle dans les muscles. A ce jour, il n'existe toujours pas de traitement efficace contre ces maladies. Comme le plus grand gène connu chez l'Homme, la dystrophine code pour une protéine de 427kDa. La protéine connecte l'actine avec le DAPC (Dystrophin Associated Protein Complex) dans les muscles striés. Pour l'instant, il y a 3 hypothèses concernant le mécanisme du DMD. L'absence de la dystrophine peut supprimer le lien physique entre les protéines structurales de la membrane basale (laminines) et les protéines structurales du cytosquelette (filaments intermédiaires et actine), ou la distribution et la fonction des canaux ioniques, ou des voies de signalisation nécessaires à la survie du muscle. Caenorhabditis elegans ne possède qu'un homologue du gène de la dystrophine humaine, le gène dys-1. La protéine DYS-1 présente 37% d'homologie avec la dystrophine humaine. Le double mutant dys-1(cx18) ; hlh-1(cc561) présente une forte dégénérescence musculaire. Comme le sarcomère de C. elegans ressemble au sarcomère de mammifère, C. elegans est modèle pertinent d'étude la maladie. En vue de comprendre la raison du DMD chez les mammifères et chez les vers, le groupe L. SEGALAT a effectué des cribles pour identifier les molécules et les gènes qui peuvent supprimer la dégénérescence musculaire. On a trouvé un gène pkc-2 qui est capable de supprimer la dégénérescence musculaire chez C. elegans. La protéine PKC-2 est l'orthologue de la Protein Kinase C Alpha (PKC) humaine et appartient à la famille du serine/threonine protéine kinase. Afin d'étudier la fonction du gène pkc-2, on a analysé l'expression du gène avec les construits différents in vivo et a utilisé la technique de double-hybride dans la levure. De plus, le crible par EMS (éthane méthyle sulfonâtes) a identifié une molécule sérotonine (5-HT) qui est un neuromédiateur, et supprime partiellement la dégénérescence musculaire des doubles mutants dys-1; hlh-1. La sérotonine a aussi un effet fort sur le mutant pkc-2(ok328), puisqu'elle provoque un phénotype blister. Ça nous permet de rechercher le lien entre la signalisation sérotoninergique et pkc-2. Le crible génétique peut contribuer à la connaissance du rôle pkc-2. [...]. Elle sert aussi de plate-forme de voie de signalisation intracellulaire. L'identification de Y59A8A.3 propose la possibilité que pkc-2 modifie la filamin A par l'intermédiaire de la filamin A interacting protéine 1. Le crible génétique par EMS pour rechercher des suppresseurs de l'effet blister de la sérotonine sur les mutants pkc-2(ok328) a donné 8 candidats sur 5000 F1s : cx253, cx254, cx259, cx263, cx267, cx268, cx270, cx276. Les mutations ont été localisées sur les chromosomes par SNP mapping avec une souche de C. elegans très polymorphe, mais le temps a manqué pour leur identification exacte. L'expérience valide notre approche à étudier le lien entre la signalisation sérotoninergique et pkc-2. En résumé, le but de la thèse était de rechercher la fonction du gène pkc-2 dans les mécanismes moléculaires conduisant à la nécrose musculaire en absence de dystrophine. Les résultats présentés dans la thèse apportent des réponses aux questions fondamentales sur pkc-2 et aussi demandent des expériences supplémentaires afin de élucider plus avant les mécanismes de la dégénérescence musculaire dystrophine-dépendante.

Les travaux présentés dans cette thèse s'intéressent à l'immobilisation de biomolécules pour le développement d'outils d'analyse multiparamétrique pour la caractérisation d'échantillons biologiques et le diagnostic, sur un support de type biopuce couplé à une détection colorimétrique.Un premier axe de recherche concerne le développement de tests d'hybridation d'acides nucléiques et d'immunotests à haut-débit automatisés sur plaque de filtration. Cette méthode a permis la mise au point d'un test de génotypage automatisé pour le dépistage transfusionnel haut-débit (génotypage érythrocytaire étendu) en collaboration avec l'Établissement Français du Sang Rhône-Alpes (EFS-RA). Il permet d'analyser 96 échantillons en quatre heures, et de caractériser six génotypes par échantillon. Cet outil a fait l'objet d'une validation sur un panel de 293 donneurs.La seconde partie des travaux présentés s'intéresse au développement d'un procédé d'immobilisation d'oligonucléotides sur un polymère particulier (PolyshrinkTM) pour l'élaboration d'un système d'analyse miniaturisé. Plusieurs stratégies d'activation ont été envisagées et ont abouti à la mise au point d'une technique d'immobilisation d'oligonucleotides in situ dans des plots d'hydrogel. La méthode de fabrication permet d'obtenir une matrice de plots d'hydrogel de 60 µm de diamètre et d'une hauteur de 6 µm en moyenne. En outre, il a été démontré que les oligonucléotides immobilisés dans les plots pouvaient détecter de façon quantitative et sélective les cibles complémentaires présentes dans l'échantillon analysé en utilisant une détection par colorimétrie ou par chimiluminescence.