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Le protozoaire Leishmania est à l’origine d’une maladie tropicale négligée qui peut s’avérer mortelle si elle n’est pas traitée adéquatement. Dans les dernières années, l’efficacité des médicaments utilisés dans le combat de la leishmaniose a grandement diminué en raison de la résistance du parasite à ceux-ci. Bien que le Topotecan (TPT), présentement utilisé comme antitumoral, ait démontré une activité antileishmaniale puissante (EC50 de l’ordre des nanomolaires), son efficacité pourrait être compromise par l’émergence de la résistance du parasite d’autant plus que des résistances tumorales cliniques au TPT ont déjà été rapportées. Dans cette étude, les mécanismes de résistance au TPT par Leishmania infantum ont été caractérisés d’un point de vue moléculaire. Le génome complet des parasites sélectionnés résistants au TPT (16 x EC50) (TPT700.1, TPT700.2, TPT700.3) a été séquencé. Le rôle dans la résistance des différents éléments génétiques identifiés a été confirmé à l’aide d’une complémentation par nucléofection épisomale dans le parasite sauvage et a été étudié avec des simulations computationnelles. Aucune amplification ni délétion n’a été identifiée et seulement une variation mineure du nombre de chromosomes a été observée. Cependant, un polymorphisme d’un seul nucléotide non synonyme a été identifié dans le gène de la grande sous-unité de la topoisomérase IB (TOP IB), la cible du TPT, chez chacun des parasites mutants résistants conférant des niveaux de résistance variables (TPT700.1 F187Y > TPT700.3 W232R > TPT700.2 G191A > sauvage). De plus, des modélisations in sillico ont permis d’illustrer la proximité de ces substitutions d’acides aminés au site catalytique de TOP IB ainsi qu’au site de liaison du TPT. En conclusion, ces résultats suggèrent qu’une mutation ponctuelle dans la grande sous-unité TOP IB est suffisante pour engendrer des hauts niveaux de résistance (environ 24 x EC50) chez TPT700.1F187Y, TPT700.2G191A et TPT700.3 W232R. TPT pourrait être considéré comme un modèle pharmacologique pour l’étude de la résistance chez Leishmania. / Leishmania, a protozoan parasite, causes a neglected tropical disease that is fatal if left untreated. In recent years, the effectiveness of the drugs used to tackle leishmaniasis has decreased dramatically due to the emergence of drug resistant parasites. Even though Topetecan (TPT), currently employed as an anti-tumoral drug, has shown strong anti-leishmanial activity (its EC50 being measured in nanomoles), its efficiency may be compromised by the resistance developped by the parasites, similarly to the resistance already recorded by tumoral cells to the drug. In this study, the mecanisms of resistance to TPT by Leishmania infantum were caracterised at the molecular level. The whole genome of parasites resistant to TPT (16 x EC50) (TPT700.1, TPT700.2, TPT700.3) was sequenced. The role of various genetic elements in the resistance mecanisms was confirmed via a complementation by episomal nucleofection in the wild type and was studied with the help of computational models. Neither amplications nor deletions were identified and only a minor variation in the chromosome number was observed. However, a non-synonymous single nucleotide polymorphism was identified in the gene coding the large subunit of topoisomerase IB, TPT’s target, within each of the resistant mutant parasites confering variable levels of resistance (TPT700.1 F187Y > TPT700.3 W232R > TPT700.2 G191A > wild type). Furthermore, in sillico models highlighted the proximity of these amino acid substitutions to the catalytic site of topoisomerase IB and also to the binding pockets of TPT. In conclusion, these results suggest that a point mutation in the large subunit of TOP IB is sufficient to confer high levels of resistance (about 24 x EC50) to TPT700.1F187Y, TPT700.2G191A and TPT700.3 W232R. Therefore, TPT can be considered a pharmacological tool to study resistance in Leishmania.

Titre de l'écran-titre (visionné le 8 novembre 2023) / Le longicorne asiatique, Anoplophora glabripennis, originaire de Chine et de la péninsule coréenne, est devenu un insecte nuisible qui représente une menace significative pour les forêts et les économies du monde entier. La gestion efficace de ses invasions et de ses dommages potentiels repose sur une détection précoce grâce aux méthodes de biosurveillance. Dans cette thèse, j'utilise des techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS) et des méthodes de génomique des populations pour 1) caractériser la similarité et la différenciation des populations de ce coléoptère, 2) identifier les signatures génomiques qui déterminent la différenciation entre les lignées génétiques et les signatures génomiques associées à l'adaptation environnementale (i.e. variables climatiques), en particulier l'adaptation au froid, 3) éclairer l'histoire de son invasion en Amérique du Nord. Dans le premier chapitre, j'étudie la structure de population des ALB indigènes de l'Asie pour informer la conception des outils de biosurveillance afin d'identifier les sources d'invasion. En utilisant des individus de populations indigènes, en séquençant leurs génomes grâce au séquençage par génotypage (GBS), et en identifiant des marqueurs de polymorphisme nucléotidique (SNP) à l'échelle du génome, j'ai comparé la diversité génétique, mesuré le flux de gènes, et effectué des tests d'assignation de population. J'ai identifié six groupes génétiques avec une division claire entre les groupes du nord et du sud de l'aire de répartition native de cette espèce. Nos résultats démontrent qu'un petit nombre de SNPs peut assigner précisément des individus à des régions géographiques, jetant les bases pour de nouveaux outils de biosurveillance pour l'ALB. Dans le deuxième chapitre, j'examine les signatures génomiques sous sélection associées aux variables climatiques, en particulier la température. J'ai effectué un séquençage complet du génome sur dix échantillons multiplexés, chacun avec 20 individus, pour produire une forte densité de marqueurs SNP à l'échelle du génome. Le criblage du génome et l'analyse gène-environnement (GEA) ont été utilisés pour identifier plus de 5 000 gènes potentiellement impliqués dans l'adaptation locale chez l'ALB. Alors que des gènes communs de tolérance au froid, tels que la glycérol kinase, les cytochromes P450, la protéine antigel et les protéines de choc thermique ont été trouvés à travers des analyses de sélection, ceux-ci n'étaient pas significatifs dans l'analyse GEA, indiquant une relation complexe entre les facteurs environnementaux et l'évolution génétique de la tolérance au froid. Ce profilage génomique complet offre de nouvelles perspectives sur les mécanismes génétiques sous-jacents à l'adaptation locale chez cette espèce. Dans le troisième chapitre, j'utilise des données génomiques obtenues grâce à la technologie GBS pour reconstruire l'histoire invasive du longicorne asiatique en Amérique du Nord (NA) et mieux comprendre les invasions biologiques. Les résultats révèlent que la plupart des populations invasives de NA proviennent de plusieurs introductions indépendantes du nord de la Chine. Les origines spécifiques incluent la Région Nord Deux pour les populations de l'Illinois, de Toronto et de l'Ohio, la Région Sud pour les populations du Massachusetts, et la Région Nord Un pour les populations de Farmingdale, New York. Après leur introduction, toutes les populations ont connu des goulots d'étranglement, certaines connaissant également une seconde expansion, comme New York. Les résultats de notre étude sont cohérents avec les données historiques, offrant de nouvelles perspectives sur la dynamique d'invasion de cette espèce. En conclusion, cette thèse présente une étude approfondie sur la structure populationnelle, l'adaptation et l'histoire invasive du longicorne asiatique en utilisant des techniques génomiques avancées. Nos découvertes améliorent non seulement notre compréhension de la biologie de ce coléoptère et de ces mécanismes adaptatifs, mais fournissent également des perspectives précieuses pour le développement de stratégies de biosurveillance efficaces pour gérer et atténuer les impacts de ses invasions. Alors que la menace des espèces invasives continue d'augmenter à l'échelle mondiale, les méthodes et les connaissances acquises grâce à cette étude peuvent être appliquées à d'autres nuisibles invasifs, contribuant finalement à la protection de nos forêts, écosystèmes et économies. / The Asian longhorned beetle (ALB) Anoplophora glabripennis, native to China and Korea Peninsula, has become a global insect pest that poses a significant threat to forests and economies worldwide. Effective management of its invasions and potential damage relies on early detection through biosurveillance methods. In this thesis, I utilize next-generation sequencing (NGS) techniques and population genomics methods to 1) characterize the beetle's population similarity and differentiation, 2) identify genomic signatures that determine the differentiation between genetic lineages in its native range and signatures related to environmental adaptation associated with climate variables especially cold adaptation, and 3) provide insight on its invasion history in North America. In the first chapter, I investigate the population structure of native ALB populations to inform the design of biosurveillance tools for identifying invasion sources. By collecting native population samples, sequencing their genomes using genotyping-by-sequencing (GBS), and obtaining genome-wide single nucleotide polymorphism (SNP) markers, I compared genetic diversity, measured gene flow, and conducted population assignment tests. I identified six genetic clusters with a clear division between northern and southern groups. Our results demonstrate that a small number of SNPs can accurately assign individuals to geographic regions, laying the foundation for new ALB biosurveillance tools. In the second chapter, I examine genomic signatures under selection and associated with climate variables, specifically temperature. I performed whole genome sequencing on ten pooled samples, each with 20 individuals, to produce high-density genome-wide SNP markers. Genome scans and gene-environment analysis (GEA) were used to identify over 5,000 genes potentially involved in local adaptation in ALB. Notably, while common cold tolerance genes, such as glycerol kinase, cytochrome P450s, antifreeze protein, and heat shock proteins, were found through selection scans, these were not significant in GEA analysis, indicating a complex relationship between environmental factors and genetic evolution of cold tolerance. This comprehensive genomic profiling provides new insights into the genetic mechanisms underlying local adaptation in this species. In the third chapter, I use genomic data obtained through GBS technology to reconstruct the invasion history of the Asian longhorned beetle in North America (NA) to better understand the biological invasions in the invasive region. Findings reveal that most NA invasive populations originated from multiple independent introductions from northern China. Specific origins include North Region Two for populations in Illinois, Toronto, and Ohio, South Region for Massachusetts populations, and North Region One for Farmingdale, New York populations. Post introduction, all populations experienced bottleneck events, with some also experiencing secondary spread, such as New York. The results of our study are consistent with historical records, offering further insights into the invasion dynamics of this species. In conclusion, this thesis presents a detailed study of the Asian longhorned beetle's population structure, adaptation, and invasion history using advanced genomic techniques. Our findings not only enhance our understanding of the beetle's biology and adaptive mechanisms but also provide valuable insights for developing effective biosurveillance strategies to manage and mitigate the impacts of its invasions. As the threat of invasive species continues to rise globally, the methods and knowledge gained from this study can be applied to other invasive pests, ultimately contributing to the protection of our forests, ecosystems, and economies.

Le mélanome malin est l’un des cancers les plus mortels dont l’incidence continue à augmenter chaque année avec peu de traitement efficace à long terme. Il est causé et initié principalement par l’exposition excessive aux rayons ultraviolets engendrant des photoproduits hautement génotoxiques. Il est bien connu que la cascade de signalisation PI3K/Akt joue un rôle crucial dans la régulation des processus qui sont généralement dérégulés durant le développement tumoral comme la prolifération, le contrôle du cycle cellulaire et l’apoptose. Néanmoins, l’implication de cette voie moléculaire dans la réponse aux dommages à l’ADN est peu caractérisée. Chez les mammifères, trois isoformes de la protéine kinase Akt ont été identifiées: Akt1, Akt2 et Akt3. Bien qu’elles soient très homologues en termes de séquence, plusieurs études ont montré que ces isoformes ont des fonctions biologiques distinctes, et nous suggérons qu’elles puissent contribuer différemment à la régulation de la réponse génotoxique. Les objectifs de ce projet étaient de: (i) évaluer l’activation d’Akt dans les cellules de mélanomes (ii) déterminer l’impact de l’inhibition de cette activité sur la régulation de la réponse cellulaire aux UV (iii) vérifier si la perte d’expression de l’un ou de l’autre des isoformes d’Akt peut réguler la réponse aux UV. Nous avons démontré qu’Akt est transitoirement hyperactivée par phosphorylation suite aux irradiations UV dans les lignées cellulaires de mélanomes. Afin de déterminer l'importance de cette activation dans la réponse cellulaire aux UV, notre approche était de diminuer (i) la phosphorylation d’Akt par l’usage d’inhibiteurs pharmacologiques ou (ii) l’expression de chaque isoforme d’Akt par l’approche des ARN interférents. Nous avons montré que l’inhibition de la phosphorylation d’Akt amène à l’augmentation du taux de l’apoptose induit par les UV d’une manière isoforme spécifique, alors qu’elle n’a aucun effet sur la régulation de la voie de réparation par excision de nucléotides (NER), qui est la seule voie humaine pour éliminer les dommages à l’ADN induits par les UV. En somme, notre étude constitue un nouvel aspect qui permet de mieux comprendre les mécanismes moléculaires du développement de mélanomes malins suites aux irradiations ultraviolettes. / Malignant melanoma is one of the deadliest cancers whose incidence continues to rise each year with a few effective long-term treatments. It is caused and initiated mainly by excessive exposure to ultraviolet radiation generating highly genotoxic DNA photoproducts. It is well known that the PI3K/Akt signaling cascade plays a crucial role in the regulation of processes commonly deregulated in tumor development such as proliferation, cell cycle control and apoptosis. Nevertheless, the nuclear involvement of this molecular pathway in the genotoxic response is poorly characterized. In mammals, three Akt kinase isoforms have been identified: Akt1, Akt2 and Akt3. Although these exhibit a high degree of homology, several studies have shown that they have distinct biological functions; therefore, we suggest that these isoforms may contribute differently to the regulation of genotoxic response. The objectives of this project were to: (i) evaluate Akt activation in UV-irradiated melanoma cells, (ii) determine the effect of the Akt phosphorylation inhibition on the regulation of the cellular response to UV, (iii) evaluate whether the loss of the expression of one or more of Akt isoforms can regulate the cellular response to UV. We demonstrated that Akt undergoes transient hyperactivation after UV treatment in melanoma cell lines. To determine the importance of this activation, our approach was to reduce (i) the phosphorylation of Akt by the use of pharmacological inhibitors or (ii) the expression of each individual Akt isoform using RNA interference. We have shown that inhibition of Akt phosphorylation leads to increased rates of UV-induced apoptosis in an isoform specific manner, while exerting no effect on regulation of nucleotide excision repair (NER), the only human pathway for eliminating UV-induced DNA damage. In summary, our study provides a better understanding of the molecular mechanisms of malignant melanoma development in response to UV.

Les travaux présentés dans cette thèse s’intéressent à l’immobilisation de biomolécules pour le développement d’outils d’analyse multiparamétrique pour la caractérisation d’échantillons biologiques et le diagnostic, sur un support de type biopuce couplé à une détection colorimétrique.Un premier axe de recherche concerne le développement de tests d’hybridation d’acides nucléiques et d’immunotests à haut-débit automatisés sur plaque de filtration. Cette méthode a permis la mise au point d’un test de génotypage automatisé pour le dépistage transfusionnel haut-débit (génotypage érythrocytaire étendu) en collaboration avec l’Établissement Français du Sang Rhône-Alpes (EFS-RA). Il permet d’analyser 96 échantillons en quatre heures, et de caractériser six génotypes par échantillon. Cet outil a fait l’objet d’une validation sur un panel de 293 donneurs.La seconde partie des travaux présentés s’intéresse au développement d’un procédé d’immobilisation d’oligonucléotides sur un polymère particulier (PolyshrinkTM) pour l’élaboration d’un système d’analyse miniaturisé. Plusieurs stratégies d’activation ont été envisagées et ont abouti à la mise au point d’une technique d’immobilisation d’oligonucleotides in situ dans des plots d’hydrogel. La méthode de fabrication permet d’obtenir une matrice de plots d’hydrogel de 60 µm de diamètre et d’une hauteur de 6 µm en moyenne. En outre, il a été démontré que les oligonucléotides immobilisés dans les plots pouvaient détecter de façon quantitative et sélective les cibles complémentaires présentes dans l’échantillon analysé en utilisant une détection par colorimétrie ou par chimiluminescence. / The work reported in this thesis focuses on biomolecules immobilization for the development of multiparametric analysis tools on a biochip coupled with a colorimetric detection, applied to the characterization of biological samples and to diagnosis.The first concern was the development of high-throughput automated hybridization tests and immunotests on a filtration plate. This method led to the elaboration of an automated platform for extended blood group genotyping in collaboration with the Etablissement Français du Sang Rhône-Alpes (EFS-RA). It enables to analyze 96 samples in four hours and to characterize six genotypes per sample. Its analytical performances were validated on a panel of 293 blood donors.The second part of this work aimed to elaborate a new strategy for oligonucleotide immobilization on an innovative polymer (PolyshrinkTM) for the development of miniaturized analysis systems. Several approaches were evaluated and led to an in-situ immobilization of oligonucleotides in hydrogel dots technique. This method leads to 6 µm hydrogel dots with a diameter of 60 µm. Moreover it was demonstrated that such immobilized oligonucleotides were able to detect targets specifically and quantitatively using either a chemiluminescent or a colorimetric detection.

Les variations en nombre de copies (CNV) sont des gains ou pertes d’une séquence d’ADN et peuvent avoir un rôle dans la susceptibilité à certaines maladies. Les CNVs peuvent être détectés par les puces de SNPs de haute résolution en analysant les intensités des allèles avec des algorithmes de détection des CNVs tels que CNV partition, PennCNV et QuantiSNP. Dans cette thèse, nous avons évalué les performances de ces outils pour la détection des CNVs au niveau pangénomique et pour les tests d'association. Nous avons également étudié des stratégies d'association combinant les informations de l'allèle et du nombre de copies pour des SNP situés dans des CNV. Nous avons appliqué ces outils pour mener une étude d’association pan-génomique avec les CNV en utilisant les données de l'étude espagnole du cancer de lavessie (SBC)/EPICURO générées par la puce Illumina 1M.Nos résultats montrent une faible fiabilité et une faible sensibilité des algorithmes de détection des CNV. Dans la région du gène GSTM1 où un CNV très fréquent existe qui est associé au risque de cancer de la vessie, nous avons constaté que les algorithmes de détection des CNV ont de faibles performances. Néanmoins, l’utilisation de la mesure d'intensité des allèles dans les tests d'association peut alors être une alternative intéressante car cela nous a permis de détecter cette association connue. Pour les SNPs situés dans des CNVs, nous avons étudié plusieurs stratégies de tests d'association et nous avons montré que la plus puissante était d’utiliser un modèle avec deux termes correspondant respectivement à la somme et à la différence du nombre de copies des deux allèles. Finalement, en appliquant ces stratégies à l'étude (SBC)/EPICURO, nous avons identifié des CNVs potentiellement associés au risque de cancer de la vessie, ainsi que des SNP dont l'allèle et le nombre de copies pourraient être impliqués dans le risque de cancer de la vessie. / Copy number variations (CNVs) are losses or gains of DNA sequences that may play a role in specific disease susceptibility. CNVs can be detected by high-resolution SNP-arrays through the analysis of allele intensities with CNV calling algorithms such as CNVpartition, PennCNV and QuantiSNP. In this thesis, we identified and assessed the performances of available tools for CNV calling and for association testing, at the genome-wide level. We also investigatedassociation strategies that combine information on both the allele and the number of copies for SNPs located in CNV regions. We applied these tools to conduct a genome-wide association study with CNV using data from the Spanish Bladder Cancer (SBC)/EPICURO Study generated by the Illumina 1M SNP-array. Our results showed a low reliability and a low sensitivity of the investigated CNV calling algorithms applied to SNP-array data. The GSTM1 locus shows a very frequent CNV that is associated with bladder cancer (BC) risk. We reported that the calling algorithms performed very poorly in identifying this CNV. We proposed using allele intensity measures (LRR) as a screening step to assess association as it allowed the detection of the GSTM1 CNV association with BC. To combine the allele and the number of copies for SNPs located in CNV regions, we investigated several strategies of association testing and we showed that the more powerfulone used a two-term model with the sum and the difference of the number of copies of both alleles. Finally, by applying these strategies to the (SBC)/EPICURO Study, we identified CNV regions potentially associated with BC risk, as well as SNPs for which both the allele and the number of copies could be involved in BC risk.

La myopathie de Duchenne est une maladie génétique qui se caractérise principalement par une dégénérescence progressive des muscles squelettiques dont la cause est l’absence de dystrophine fonctionnelle dans les muscles. A ce jour, il n’existe toujours pas de traitement efficace contre ces maladies. Comme le plus grand gène connu chez l’Homme, la dystrophine code pour une protéine de 427kDa. La protéine connecte l’actine avec le DAPC (Dystrophin Associated Protein Complex) dans les muscles striés. Pour l’instant, il y a 3 hypothèses concernant le mécanisme du DMD. L’absence de la dystrophine peut supprimer le lien physique entre les protéines structurales de la membrane basale (laminines) et les protéines structurales du cytosquelette (filaments intermédiaires et actine), ou la distribution et la fonction des canaux ioniques, ou des voies de signalisation nécessaires à la survie du muscle. Caenorhabditis elegans ne possède qu’un homologue du gène de la dystrophine humaine, le gène dys-1. La protéine DYS-1 présente 37% d’homologie avec la dystrophine humaine. Le double mutant dys-1(cx18) ; hlh-1(cc561) présente une forte dégénérescence musculaire. Comme le sarcomère de C. elegans ressemble au sarcomère de mammifère, C. elegans est modèle pertinent d’étude la maladie. En vue de comprendre la raison du DMD chez les mammifères et chez les vers, le groupe L. SEGALAT a effectué des cribles pour identifier les molécules et les gènes qui peuvent supprimer la dégénérescence musculaire. On a trouvé un gène pkc-2 qui est capable de supprimer la dégénérescence musculaire chez C. elegans. La protéine PKC-2 est l’orthologue de la Protein Kinase C Alpha (PKC) humaine et appartient à la famille du serine/threonine protéine kinase. Afin d’étudier la fonction du gène pkc-2, on a analysé l’expression du gène avec les construits différents in vivo et a utilisé la technique de double-hybride dans la levure. De plus, le crible par EMS (éthane méthyle sulfonâtes) a identifié une molécule sérotonine (5-HT) qui est un neuromédiateur, et supprime partiellement la dégénérescence musculaire des doubles mutants dys-1; hlh-1. La sérotonine a aussi un effet fort sur le mutant pkc-2(ok328), puisqu’elle provoque un phénotype blister. Ça nous permet de rechercher le lien entre la signalisation sérotoninergique et pkc-2. Le crible génétique peut contribuer à la connaissance du rôle pkc-2. […]. Elle sert aussi de plate-forme de voie de signalisation intracellulaire. L’identification de Y59A8A.3 propose la possibilité que pkc-2 modifie la filamin A par l’intermédiaire de la filamin A interacting protéine 1. Le crible génétique par EMS pour rechercher des suppresseurs de l’effet blister de la sérotonine sur les mutants pkc-2(ok328) a donné 8 candidats sur 5000 F1s : cx253, cx254, cx259, cx263, cx267, cx268, cx270, cx276. Les mutations ont été localisées sur les chromosomes par SNP mapping avec une souche de C. elegans très polymorphe, mais le temps a manqué pour leur identification exacte. L’expérience valide notre approche à étudier le lien entre la signalisation sérotoninergique et pkc-2. En résumé, le but de la thèse était de rechercher la fonction du gène pkc-2 dans les mécanismes moléculaires conduisant à la nécrose musculaire en absence de dystrophine. Les résultats présentés dans la thèse apportent des réponses aux questions fondamentales sur pkc-2 et aussi demandent des expériences supplémentaires afin de élucider plus avant les mécanismes de la dégénérescence musculaire dystrophine-dépendante. / Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked progressive muscle disease which is caused by mutations in the dystrophin gene. Until now, there is no effective therapy for DMD. As the largest gene in human beings, it produces a 427-kDa cytoskeleton protein: Dystrophin. Dystrophin links actin and dystrophin associated protein complex (DAPC) in muscles. Currently, there are 3 hypotheses to explain the mechanisms of DMD. They suggest that the absence of dystrophin could lead to periodic muscle cell membrane ruptures, or affect the distribution and function of ion channels, or perturb signal transduction pathways. In Caenorhabditis elegans, there is only one homologue of mammalian dystrophin gene named dys-1, and the nematode protein DYS-1 presents 37% similar to the human one. The double mutant dys-1; hlh-1 exhibits a severe progressive muscle degeneration. The protein composition of the sarcomere has been studied and it has revealed a high degree of similarity with mammalian sarcomere. These allow C. elegans be a relevant animal model to study DMD.To understand why the lack of dystrophin induces muscle degeneration in mammals and worms, and to find new drugs that might help in reducing muscle degeneration, L. Ségalat and his coworkers performed several screens for drugs and genes suppressing muscle degeneration. An interesting gene pkc-2 came out and was considered as a possible regulator in the process of muscle degeneration in C. elegans. The protein that is encoded by this gene in C. elegans is an orthologous of the human gene Protein Kinase C Alpha (PKC), which belongs to the family of serine/threonine specific protein kinases. To study the function of pkc-2, we generated different recombinant constructs, analyzed the expression pattern of pkc-2 with immunocytochemistry, and performed yeast two-hybrid to search for PKC-2 binding partners. In addition, a neurotransmitter serotonin (5-HT) was found by drug screening to be an active blocker of striated muscle degeneration. As C. elegans lacking PKC-2 displays a severe blister phenotype in exogenous 5-HT, studying the correlation between PKC-2 and 5-HT therefore seems to be an opportunity to explore the reasons of muscle degeneration. A genetic screen with EMS (ethane methyl sulfonate) to search serotonin resistant mutant in strain pkc-2 (ok328) would help us study further about the role of pkc-2.In this thesis, different clones myo3::pkc-2 and pkc-2::gfp were made to inject into wild-type animals. The results revealed that pkc-2 expressed intensely in neurons and pharynx, but was not found in body-wall muscles. Mutants dys-1;hlh-1 fed with pkc-2 RNAi did not reduce muscle degeneration statistically comparing to triple mutant pkc-2;dys-1;hlh-1. This indicated that PKC-2 may be dominantly acting in neurons. A yeast two-hybrid screen identified the gene Y59A8A.3, which is a homologue to mammalian filamin A interacting protein 1 isoform 3, as a binding partner of PKC-2. Filamin A is a cytoskeleton protein, anchoring various trans-membrane proteins to the actin cytoskeleton and may also function as an important signaling scaffold. The result suggested that PKC-2 may therefore modulate filamin A activity through the filamin interacting protein 1. Genetic screen by EMS presented 8 candidates named cx253, cx254, cx259, cx263, cx267, cx268, cx270, cx276, which were mapped on chromosomes by SNP mapping using a polymorphic C. elegans strain, but time was too short to identify these genes formally. The experiment also offered possibilities of searching links between PKC-2 and serotonin pathways.In summary, this work studied the gene pkc-2 in order to reveal the function of PKC-2 and its involvement in muscle degeneration. The present results answered some questions about pkc-2, and needed further researches to elucidate the in vivo role of PKC-2 protein and its interaction with other proteins in the mechanism of muscle dystrophy in C. elegans.

Les travaux présentés dans cette thèse font suite à celle de Melle LE GOFF. Ils se concentrent sur la technologie HIFI brevetée et développée pendant ses travaux. Une première partie du travail présenté dans ce manuscrit concerne le test HIFI Blood 96™ et plus particulièrement les améliorations et les évolutions apportées au test afin d'en faire un véritable outil de génotypage, multiparamétrique et haut-débit pouvant être installé dans les banques de sang dans le but de constituer des inventaires de sang génotypé de façon étendue, participant ainsi à améliorer la sécurité transfusionnelle. Il permet de caractériser 96 échantillons sur 15 polymorphismes (divisés en deux panels) associés aux groupes sanguins en approximativement 4h30. Cette plateforme a fait l'objet d'une étude de validation à moyenne échelle sur 583 donneurs pour le panel 1 et 190 donneurs pour le panel 2. La deuxième partie des travaux décrit l'adaptation de la technologie HIFI appliquée au diagnostic des pathologies respiratoires, avec le développement d'une autre plateforme, ReSynPlex, en partenariat avec 3 équipes de recherche de Grenoble / The work reported in this thesis follows the one undertaken by Ms LE GOFF. It is focused on HIFI technology, which is patented and developed during her thesis. The first part of this work concerns the HIFI Blood 96™ test, and particularly the improvements and developments adduced to the test to make it a real diagnostic tool, multiparametric and high-throughput which can be implemented in blood banks in order to constitute negative antigen inventories, thus contributing to improve blood safety. It allows to characterize 96 samples on 15 polymorphisms (divided in two panels) associated to blood group systems in approximately 4.5 hours. A mesoscale validation study has been conducted on 583 samples for panel 1 and 190 samples for panel 2. The second part of this work describes the adaptation of HIFI technology applied to diagnosis of respiratory tract infections, with the development of another platform, ReSynPlex, in partnership with 3 research teams in Grenoble

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Les transporteurs membranaires sont des éléments importants dans le devenir, l’efficacité, et la toxicité du médicament. Ils influencent la pharmacocinétique et la pharmacodynamie de ces derniers. Plusieurs interactions médicamenteuses observées cliniquement sont attribuables à la fois aux enzymes responsables du métabolisme des médicaments et aux transporteurs membranaires. Il est connu qu’une variabilité existe entre différents individus dans la réponse à un médicament et les polymorphismes génétiques retrouvés dans les gènes codant pour les transporteurs membranaires peuvent partiellement expliquer cette variabilité. OATP1A2 est un transporteur membranaire exprimé sur des organes importants, comme le cerveau et le rein. Plusieurs médicaments utilisés en clinique sont des substrats d’OATP1A2 et l’expression localisée de ce transporteur suggère un rôle important dans le devenir du médicament. Donc, mon projet de doctorat consistait à caractériser l’activité d’OATP1A2 en relation avec ses substrats et inhibiteurs, et de plus, à évaluer l’impact de différents variants génétiques d’OATP1A2 sur leur transport. Dans le premier article, la rosuvastatine a été utilisée comme substrat-type pour étudier le transport d’OATP1A2. Les expériences ont été menées en introduisant la rosuvastatine en compétition avec différent β-bloqueurs, une classe de médicaments rapportée dans la littérature comme substrats d’OATP1A2. Parmi les β-bloqueurs évalués, le carvédilol était l’inhibiteur le plus puissant. Dans la deuxième partie de l’étude, des médicaments ayant une structure similaire au carvédilol, tels que les antidépresseurs tricycliques, ont été évalués quant à leur potentiel d’inhibition sur OATP1A2. Une relation structure-activité a été définie à l’aide de ces données. Nous avons démontré que des composés tricycliques avec une courte chaîne aliphatique pouvaient inhiber OATP1A2. Dans le deuxième article, OATP1A2 a été étudié en considérant son expression et son rôle au sein de la barrière hémato-encéphalique (BHE). Des études précédentes ont démontré qu’OATP1A2 est exprimé sur la membrane luminale des cellules endothéliales formant la BHE. Nos données démontrent que les triptans, une classe de médicaments couramment utilisées pour traiter la crise migraineuse, sont des substrats d’OATP1A2 et que les composés tricycliques identifiés comme inhibiteurs d’OATP1A2 dans nos études précédentes peuvent inhiber le transport des triptans par OATP1A2. Ces résultats sont importants puisque: 1) il a été suggéré que les triptans peuvent agir au niveau du système nerveux central en se liant aux récepteurs trouvés sur les neurones centraux; 2) comme les triptans sont des molécules hydrophiles, un mécanisme de transport facilité est nécessaire pour qu’ils pénètrent la BHE et OATP1A2 pourrait être l’élément clé; 3) l’inhibition d’OATP1A2 par les composés tricycliques pourrait limiter l’accès des triptans à leur site d’action. Le troisième article caractérise l’activité associée à deux variants génétiques d’OATP1A2 (OATP1A2*2 et *3). Leur capacité à transporter les triptans et leur potentiel d’inhibition par les médicaments tricycliques ont été évalués. Des résultats supplémentaires caractérisant OATP1A2, mais sans liens directs avec les trois articles, seront présentés en annexe. Dans l’ensemble, les résultats présentés dans cette thèse servent à caractériser le transporteur membranaire OATP1A2 en relation avec ses substrats et inhibiteurs, et en fonction de ses variants génétiques. / Drug transporters are important determinants in drug disposition, efficacy, and toxicity. They influence the pharmacokinetics and pharmacodynamics of drugs. Several clinically-observed drug-drug interactions are mediated through drug metabolizing enzymes and drug transporters. It is well known that there is an interindividual variability in the response to medications and polymorphisms found in genes encoding for drug transporters partially account for it. OATP1A2 is a membrane drug transporter expressed on important organs, such as the brain and the kidney. A wide spectrum of drugs used in the clinic are substrates of OATP1A2. Its localisation suggests an essential role in drug disposition. Thus, my PhD project consisted of characterizing the activity of OATP1A2 in regards to its substrates, inhibitors, and different protein variants due to genetic polymorphisms. In the first article, rosuvastatin was used as the probe substrate to study OATP1A2 transport activity. Experiments were conducted by putting rosuvastatin in competition with different β-blockers, a class of drugs known in the literature to be transported by OATP1A2. One of the drugs evaluated, carvedilol, inhibited OATP1A2 with much more potency than the others. In the second part of the study, drugs with a structure similar to carvedilol, such as tricyclic antidepressants, were tested for their potential to inhibit OATP1A2. A structure-activity relationship was defined using the data. It was demonstrated that drugs composed of a tricyclic ring with a short aliphatic amine chain were potent OATP1A2 inhibitors. In the second article presented, OATP1A2 was studied in the context of its localization at the blood-brain barrier (BBB). OATP1A2 expression at the luminal membrane of the endothelial cells making up the BBB was demonstrated in the literature. Our article showed that triptans, a class of commonly used anti-migraine drugs, were OATP1A2 substrates. The tricyclic drugs previously evaluated were shown to potently inhibit triptan transport through OATP1A2. These findings are important for three reasons: 1) it has been postulated that triptans may act at the central nervous system by binding to receptors found on central neurons; 2) as triptans are hydrophilic molecules, a facilitated transport mechanism is required for them to penetrate the BBB and OATP1A2 may be the key player; and 3) the inhibition of OATP1A2 by the tricyclic drugs may limit the entrance of triptans to their site of action. The third article characterized the transport activity of two OATP1A2 protein variants (OATP1A2*2 and *3). Their capacities to transport triptans and their potential of being inhibited by tricyclic drugs were evaluated. Additional data characterizing OATP1A2 but considered out of the scope of the three articles will be presented in appendices. In overall, the central theme of this thesis looks into the characterization of the OATP1A2 membrane drug transporter in regards to its substrates, inhibitors, and proteins variants.