La poly(A) polymérase (PAP) est une enzyme essentielle pour le métabolisme de la cellule qui catalyse l'ajout d'une longue séquence de polyadénosines à l'extrémité 3' des ARNm. Cet ajout, effectué par un large complexe multi-protéique de clivage et de polyadénylation est nécessaire pour la stabilité, le transport et la traduction des ARNm. L'ATP est la molécule qui sert de source d'énergie à la PAP et représente aussi son unique substrat pour la réaction de polyadénylation. La PAP est une enzyme hautement conservée de la levure à l'humain et est même encodée dans le génome de certains virus. En effet, elle est aussi retrouvée chez les eucaryotes inférieurs, comme les levures, et même certains virus à ADN encodent une enzyme jouant le même rôle. Le champignon Candida albicans , source d'infections sévères surtout chez les patients immunodéprimés, encode sa propre PAP. L'étude de cet organisme tantôt levure unicellulaire, tantôt champignon mycellaire demeure essentielle en raison de la perte d'efficacité des antibiotiques actuellement disponibles découlant de l'émergence de souches multi-résistantes. La PAP représente une nouvelle cible thérapeutique fort intéressante due à son implication directe dans les étapes de maturation des ARNm, processus essentiel à tout organisme eucaryote. L'étude présentée dans ce mémoire se concentre sur l'étude du site actif de la PAP de C. albicans , plus précisément au niveau des interactions moléculaires associées à la sélection du substrat par l'enzyme. Le but final est de déterminer les groupements fonctionnels favorisant la reconnaissance de l'ATP au niveau du substrat nucléotidique, mais aussi de déterminer les acides aminés de la protéine qui sont potentiellement impliqués dans cette sélection moléculaire. Pour ce faire, une gamme d'analogues de nucléotides, principalement de purines, a été testée pour évaluer la capacité de ceux-ci à compétitionner avec le substrat pour le site actif de l'enzyme. Du côté de la protéine, plusieurs mutants ponctuels ont été produits afin d'évaluer la discrimination de ces mutants envers les différents nucléotides et/ou analogues de nucléotides. La sélection des acides aminés mutés s'est basée sur le modèle bioinformatique de la PAP de C. albicans généré à partir de la radiocristallographie de la PAP d'un autre organisme eucaryote effectué en présence d'ATP et d'ARN, Saccharomyces cerevisiae . Les résultats ont en effet démontré que la présence d'un groupement donneur de pont hydrogène en position 6 d'une purine permet sa liaison au site actif de l'enzyme et son transfert subséquent sur le brin d'ARN. En effet, ceci explique en grande partie la discrimination entre l'ATP et le GTP par la protéine. Aussi, l'apport de certains acides aminés tels Asn-222, Met-306 et Cys-307 dans ce mécanisme de distinction des nucléotides a été démontré. De manière insoupçonnée, certains analogues se sont avérés de bons substrats pour la PAP malgré leur modification chimique, donnant lieu à une queue poly(A) modifiée chimiquement. L'impact de cette modification sur la stabilité et l'efficacité de traduction d'ARNm portant divers types de modification sur la queue poly(A) a donc été évalué en cellules. Il s'avère que la stabilité semble négativement affectée de manière générale alors que l'efficacité de traduction s'est vu être dépendante du type de modification chimique.

Résumé: Suivant un stress inflammatoire, les cellules épithéliales intestinales (CE1s) relâchent des nucléotides extracellulaires, des molécules pro-inflammatoires qui activent les récepteurs purinergiques P2Y qui sont impliqués dans l'inflammation intestinale. Hormis les récepteurs P2Y, la famille des transporteurs MRP joue aussi un rôle dans l'inflammation intestinale et les maladies en découlant. Plus spécifiquement, MRP2 joue un rôle important dans l'expert de molécules inflammatoires et de drogues cytotoxiques hors des CEIs. Dans cette perspective, nous avons caractérisé en quoi la coopération du transporteur MRP2 avec les récepteurs P2Y pouvait influencer les fonctions des CEIs dans le cancer colorectal. La lignée cellulaire Caco-2 a été stimulée à l'aide de 100 p.M d'ATP ou d'UTP pendant 3 à 18 heures et l'expression de MRP2 et de P2Y2 a été mesurée par qPCR et par immunobuvardage. Nous avons par la suite vérifié s'il existe une relation entre l'expression de MRP2 et celle de P2Y2 dans les échantillons de tumeurs colorectales obtenus à partir de biopsies. D'un point de vue physiologique, nous nous sommes demandés si la modulation de l'expression de MRP2 par l'ATP pouvait conférer aux CEIs une résistance accrue face à divers agents chimiothérapeutiques. Nous avons également entamé une étude dans le but d'établir par quelle voie de signalisation l'activation du récepteur P2Y2 pouvait stimuler l'expression de MRP2. Nous avons démontré que la stimulation des CEIs par les nucléotides extracellulaires augmente l'expression de MRP2. La modulation de l'expression de MRP2 passe par l'activation du récepteur P2Y2 et semble impliquer la voie de signalisation MEK/ERK. De façon surprenante, nous avons observé que l'expression de l'ARNm de MRP2 est augmentée dans les tumeurs de cancer colorectal comparé au tissu sain, tandis que celle de P2Y2 est diminuée. Nous avons également démontré que la stimulation des CEIs par l'ATP augmente la résistance des cellules à l'étoposide et que l'invalidation du transporteur MRP2 diminue la survie des CEIs face à l'étoposide, le cisplatin et la doxorubicine. Finalement, notre analyse de l'expression de l'ARNm de P2Y2 nous a démontré que celle-ci est augmentée dans les CEls où MRP2 est invalidé. Ces résultats montrent clairement l'implication et la coopération du récepteur P2Y2 et du transporteur MRP2 dans le développement et la progression du cancer colorectal. Ils sont concordants avec les rôles de ce récepteur dans la prolifération cellulaire et l'inflammation intestinale, ainsi que ceux de MRP2 dans l'export de drogues cytotoxiques. // Abstract: Following an inflammatory stress, intestinal epithelial cells (IECs) release extracellular nucleotides, notably ATP and UTP, pro-inflammatory molecules that activate P2Y purinergic receptors that are involved in intestinal inflammation as well as a variety of cancers. Apart from P2Y receptors, the family of MRP transporters also plays a role in intestinal inflammation and in pathologies deriving from it. More specifically, MRP2 plays an important role in the export of inflammatory molecules and cytotoxic drugs from IECs. In this perspective, we studied the involvement and cooperation of MRP2 with P2Y 2 receptor in colorectal cancer. The Caco-2 cell line was stimulated with 100 µM ATP and UTP for a period of 3, 6 and 18 hours, whereafter the expression of MRP2 and P2Y2 was measured by real-time quantitative PCR and western blot. We then verified if there was a correlation between the mRNA expression of MRP2 and P2Y2 in biopsies obtained from patients with colorectal cancer. From a physiological standpoint, we wondered if the modulation of MRP2 expression by ATP could confer an increased resistance to IECs against chemotherapeutic agents. In this context, we began a study with the aim to establish by which signalization cascade the activation of P2Y 2 receptor could stimulate the expression of MRP2. We have demonstrated in this study that the stimulation of IECs with ATP and UTP increases the expression of MRP2, both at the transcriptional and protein level. The modulation of MRP2 expression occurs via the activation of the P2Y 2 receptor upon its stimulation with its agonists ATP and UTP, and the signaling cascade MEK/ERK seems to be implicated. In a surprising manner, we observed that the mRNA expression of MRP2 is increased in tumors of colorectal cancer compared to the healthy tissue while that of P2Y 2 is decreased. We have also demonstrated that the stimulation of IECs with ATP increases the resistance of cancer cells to the drug etoposide. On the contrary, the invalidation of MRP2 by shRNA decreases the survival of IECs against the chemotherapeutic agents etoposide, cisplatin and doxorubicin. Finally, our analysis of the mRNA expression of P2Y 2 has demonstrated that it is increased in IECs that are invalidated for the expression of MRP2. These results demonstrate an evident involvement and cooperation between extracellular nucleotides, P2Y2 receptor and MRP2 transporter in the development and progression of colorectal cancer. They are concordant with the role of this receptor in intestinal inflammation as well as that of MRP2 in the export of a variety of drugs. [symboles non conformes]

Les nucléotides, en tant que seconds messagers (AMPc et GMPc) et qu’agonistes des récepteurs purinergiques (ADP, ATP, UDP et UTP) jouent de nombreux rôles dans la régulation des processus physiologiques et pathologiques. Bien que les réponses physiologiques impliquant les nucléotides ne se limitent pas aux maladies cardiovasculaires, ce projet s’est focalisé sur celles-ci, en particulier sur l’athérosclérose, le dysfonctionnement endothélial et l’anévrisme cérébral étant donné que notre laboratoire s’intéresse de près aux phénomènes inflammatoires liés à ces pathologies. Il est par exemple reconnu que les variations des taux d’AMPc et de GMPc peuvent réguler la fonction de la barrière endothéliale (via les phosphodiestérases qui les hydrolysent respectivement en AMP et GMP inactives et via les cyclases qui les synthétisent à partir des nucléotides triphosphates) et donc causer le dysfonctionnement endothélial qui est une cause sous-jacente de plusieurs conditions pathologiques telle que l’athérosclérose. Mais aussi, que le relargage de l’ATP par les fibres sympathiques dans les cellules musculaires lisses peut causer une augmentation de la pression sanguine et qu’une augmentation de l’ADP extracellulaire mène à l’agrégation plaquettaire (via les récepteurs purinergiques). Ces deux phénomènes sont associés au développement de l’athérosclérose et des anévrismes. Il est également avéré que l’ATP et l’UTP libérés par les globules rouges lors de lésions de ceux-ci permettent une vasodilatation par l’activation de la NO synthase endothéliale. L’UTP libéré peut également être métabolisé en UDP, un agoniste des récepteurs P2Y6 impliqué dans l’activation des macrophages et dans la production de NO. Suite à toutes ces implications des nucléotides dans les processus inflammatoires et le fait que la littérature n’offrait aucune méthode permettant le dosage et la séparation simultanée des neufs nucléotides étudiés dans ce travail, il semblait essentiel de développer et de valider une nouvelle méthode LC-MS/MS permettant ce dosage. Dans un premier temps, deux méthodes d’extraction des nucléotides ont été mises au point, à savoir une méthode par de l’EtOH à froid suivi d’une lyophilisation puis d’une reprise par de l’H2O milliQ ;alternativement, nous avons utilisé une méthode d’extraction par du PCA 8 %. Une méthode analytique LC-MS/MS a été développée et validée pour neuf nucléotides :AMP, vi ADP, ATP, UMP, UDP, UTP, GMP, AMPc et GMPc avec l’avantage de quantifier ces neufs nucléotides simultanément en moins de 10 minutes. Dans un deuxième temps, les résultats obtenus avec la méthode LC-MS/MS pour trois des nucléotides (AMPc, ADP et ATP) ont été comparés à ceux obtenus avec des kits vendus dans le commerce (cAMP Enzyme Immunoassay kit, ADP Assay kit, ATP Bioluminescent Assay kit) pour appuyer la validation de cette méthode de quantification. Les résultats ont montré une erreur relative allant de 6,8 à 11,7 % par rapport aux valeurs obtenues avec les kits qui sont des références en la matière quant à la quantification de ces nucléotides. Dans un troisième temps, la méthode a été testée in vitro sur des cellules endothéliales EA.Hy926 stimulées par du TNF-α, des Ox-LDLs, des LDLs natives ou des Mox-LDLs en présence ou non d’inhibiteurs de phosphodiestérases, et in vivo sur du plasma et des globules rouges de donneurs sains avant et après stase veineuse et de patients atteints d’anévrisme cérébral avant et après la pose d’un stent. Ces analyses ont été possibles grâce à la validation préalable de la méthode et ont permis de nouvelles observations quant à la variation des taux de nucléotides lors de processus inflammatoires. En conclusion, ce travail nous a permis de mettre au point deux méthodes d’extraction des nucléotides et de développer une méthode LC-MS/MS précise, sensible et exacte pour la quantification de neufs nucléotides impliqués dans des phénomènes inflammatoires de pathologies cardiovasculaires. Ce projet a également permis l’analyse in vitro et in vivo de ces neufs nucléotides dans différentes matrices et dans différentes conditions physiopathologiques menant effectivement à des variations des taux de ceux-ci. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L'exposition aux rayons ultraviolets (UV) est essentielle à la vie et bénéfique pour la santé humaine. Cependant, la surexposition aux UV solaires, en particulier aux UVB, rayons les plus énergétiques atteignant la surface terrestre, peut entrainer des cancers de la peau chez l'être-humain comme les cancers de la peau de type non-mélanome (NMSC). La capacité des UVB à initier des NMSC provient principalement de leurs habilités à causer des dommages directs à l'ADN, tels que les dimères cyclobutyliques de pyrimidine (CPD) et les produits pyrimidine-pyrimidone (6-4PP), qui sont pris en charge par le mécanisme de réparation par excision de nucléotide (NER). L'incidence croissante de NMSC chez les patients déficients pour l'une des protéines de la NER souligne l'importance d'un processus fonctionnel. Par conséquent, une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de la NER permettrait de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques pour la prévention ou le traitement des cancers de la peau. L'une des premières réponses cellulaires aux dommages CPD/6-4PP induits par UVB dans la peau des mammifères est l'activation de l'enzyme nucléaire poly(ADP-ribose) polymérase-1 (PARP1) qui catalyse la formation de polymères d'ADP-ribose. Les précédents travaux de notre laboratoire et d'autres équipes ont démontré que PARP1 et son activité enzymatique facilitent la NER en collaboration avec la protéine UV-damaged DNA binding protein 2 (DDB2), qui va aussi s'accumuler rapidement aux sites CPD/6-4PP pendant la phase de reconnaissance des dommages à l'ADN de la NER. Cependant, plusieurs aspects des interactions de PARP1 avec DDB2 et avec les dommages directs à l'ADN sont inconnus. Ainsi, le premier objectif de mon projet de doctorat a été de caractériser précisément la nature de la liaison de PARP1 aux dommages CPD/6-4PP induits par UV vis-à-vis la protéine DDB2. Mes recherches ont mis en évidence l'empreinte asymétrique formée par PARP1 de -12 à +9 nucléotides de chaque côté des dommages CPD/6-4PP en présence ou en absence de DDB2. Nous avons également démontré que PARP1 augmente l'affinité de DDB2 pour les dommages CPD/6-4PP. De plus, les résultats de notre étude indiquent un rôle de PARP1 indépendant de DDB2 pendant la phase de reconnaissance des dommages à l'ADN. Cibler PARP1 et son rôle dans les voies de réparation des dommages à l'ADN est l'une des stratégies les plus efficaces développées ces dernières années pour le traitement des cancers des ovaires et du sein. L'application translationnelle de mon projet de doctorat a alors été de comprendre le rôle de PARP1 dans la NER dans le contexte des NMSC. À cet égard, nous avons développé un modèle PARP1-KO dans la lignée de souris SKH-1, qui est un modèle largement adopté pour étudier les NMSC induits par UVB. Puisque les souris SKH-1 développent principalement des carcinomes spinocellulaires (CSC) cutanés après une exposition chronique aux UVB, notre étude rapporte le rôle de PARP1 dans le développement des CSC. En utilisant les souris nouvellement créées SKH-1 PARP1-KO et les souris SKH-1 PARP1-WT avec ou sans application topique d'inhibiteurs de PARP, nous avons mis en évidence que l'absence de PARP1 ou de son activité dans la peau des souris SKH-1 mâles et femelles réduit significativement le fardeau tumoral des CSC et prolonge la période de latence du développement tumoral. L'étude hebdomadaire de l'apparition et de la croissance de tumeurs tout au long du protocole révèlent aussi que cibler PARP1 est très efficace pour ralentir, à l'étape pré-maligne, le développement de CSC. Nos résultats sont surprenants à la lumière des propriétés onco-suppressives rapportées de PARP1 et de son activité catalytique dans des cas de cancérogenèse induits par des dommages à l'ADN causés par des agents alkylants, ainsi que de la susceptibilité croissante des souris knock-out pour d'autres protéines de la NER à développer des CSC induits par UVB. Le rôle de PARP1 dans les mécanismes cellulaires induits par UVB autres que la NER, comme la mort cellulaire et les modulations immunes, pourrait expliquer nos observations. Alors que d'autres analyses sont nécessaires pour comprendre le rôle de PARP1 dans ces mécanismes, notre étude met en avant l'utilisation potentielle d'inhibiteurs de PARP comme nouvel agent chimiopréventif contre les CSC induits par UVB. / The exposure to solar ultraviolet radiation (UV) is essential to life and beneficial to human health. However, an overexposure to terrestrial solar UV, especially its most energetic component UVB, can cause skin cancers including the non-melanoma skin cancers (NMSC) in humans. The NMSC initiating properties of UVB arise predominantly from their ability to cause direct DNA damage such as cyclobutane pyrimidine dimers (CPD) and 6-4photoproducts (6-4PP), which are repaired via nucleotide excision repair (NER) pathway. The increased incidence of NMSC in patients with hereditary defects in NER pathway proteins underscores the importance of efficient NER in humans. Therefore, detailed understanding of the molecular operation of NER pathway can provide novel therapeutic targets for the prevention or treatment of skin cancers. One of the earliest responses of the mammalian skin cells to UVB-induced CPD or 6-4PP is the activation of the nuclear enzyme poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP1), which catalyzes the formation of polymers of ADP-ribose (PAR). The previous work from other teams and our laboratory have shown that PARP1 and its enzymatic activity facilitate NER in collaboration with UV-damaged DNA binding protein 2 (DDB2), which also rapidly accumulates at the CPD/6-4PP site during the DNA damage recognition stage of NER. However, many aspects of interaction of PARP1 with DDB2 and direct DNA damage are not understood. Therefore, the first aim of my doctoral project was to characterize the precise nature of binding of PARP1 vis-à-vis DDB2 at UV-induced CPD/6-4PP. My doctoral research demonstrates that PARP1 casts asymmetric footprint from −12 to +9 nucleotides on either side of the CPD/6-4PP in presence or absence of DDB2. We also demonstrated that PARP1 facilitates the binding of DDB2 to CPD/6-4PP. Moreover, our study reports DDB2-independent role of PARP1 during the DNA damage recognition phase in NER. Targeting the role of PARP1 in DNA strand break repair pathways has emerged as one of the successful strategies for the treatment of ovarian and breast cancers in last decade. Consequently, the ultimate translational goal of my doctoral project was to understand the implication of NER facilitating role of PARP1 in NMSC. In this regard, we first developed a PARP1-KO model in the albino hairless SKH-1 mouse strain, which is a widely adopted mouse model to study UVB-induced NMSC. Since SKH-1 mice mainly develop cutaneous squamous cell carcinoma (SCC) upon chronic UVB-exposure, our present study reports the role of PARP1 in development of SCC. Using the newly developed PARP1-KO and PARP1-WT SKH-1 mice with or without topical application of PARP inhibitor, we report that the absence of PARP1 or its activity in skin of both male and female SKH-1 mice significantly reduces the SCC tumor burden and prolongs the tumor latency period. The analyses of appearance and growth of individual tumors on a weekly basis during this protocol also revealed that targeting of PARP1 was most effective in suppressing the premalignant stage of the SCC development. Our results are surprising in light of the reported onco-suppressive property of PARP1 and its catalytic activity in alkylating DNA damage-induced tumorigenesis and the increased susceptibility of other NER protein knock-out mice to UVB-induced SCC. We reason that the roles of PARP1 in UVB-induced cellular processes other than NER, such as cell death and immune modulations, can account for our observation. While further studies are required to understand these roles of PARP1 in UVB-induced cellular processes, our study underscores the potential for use of PARP inhibitors as a novel chemopreventive agents against UVB-induced SCC.

La rétinite pigmentaire (RP) résulte en une dégénération progressive de la rétine et représente une cause importante de cécité. La transmission de cette maladie se fait selon différents processus d'hérédité dont une forme liée au chromosome X pour la protéine retinitis pigmentosa 2 (RP2) et une forme autosomique récessive dans le cas de la phosphodiesterase 6 (PDE6). RP2 est une protéine qui stimule la réaction d'hydrolyse du GTP et est probablement impliquée dans le transport des protéines. C'est une protéine de 350 acides aminés qui possède deux sites d'acylation et est localisée principalement à la membrane plasmique. Il existe quelques mutations perturbant cette localisation dont la deletion de la serine 6 qui résulte en une RP. Dans la cascade signalétique visuelle, l'activation de la rhodopsine par un photon mène à l'activation de la (PDE6). La PDE6 activée hydrolyse ensuite le GMPc, ce qui mène à la fermeture des canaux GMPc dépendants et à l'hyperpolarisation de la membrane du photorécepteur. La PDE6 est un tétramère d'environ 220 kDa et est acylée, ce qui permet sa liaison à la membrane. On la retrouve, tout comme la RP2, en partie dans les microdomaines résistant aux détergents. Ces microdomaines, aussi appelés radeaux lipidiques, sont riches en phospholipides saturés et en cholestérol. Toutefois, la liaison préférentielle de la PDE6 et de la RP2 à des phospholipides saturés n'a jamais été démontrée. L'objectif de cette thèse est de caractériser les propriétés de liaison membranaire de ces protéines en utilisant des monocouches de Langmuir. Pour ce faire, une RP2 recombinante a été produite et la PDE6 fut extraite de photorécepteur bovin. L'analyse de l'interaction de RP2 avec le modèle membranaire met en évidence l'affinité particulière de RP2 pour les lipides saturés et une liaison préférentielle au domaine liquide condensé. La PDE6 montre aussi une discrimination face aux phospholipides. De plus, les résultats obtenus en spectroscopie infrarouge montrent différentes orientations de sa structure secondaire en fonction de l'environnement lipidique. En somme, les résultats présentés dans cette thèse permettent de postuler de nouvelles hypothèses concernant l'importance de l'interaction membranaire de la RP2 et la PDE6 en ce qui concerne leur implication dans les différents processus impliqués dans les mécanismes de la vision.

L'exposition aux rayons ultraviolets (UV) est essentielle à la vie et bénéfique pour la santé humaine. Cependant, la surexposition aux UV solaires, en particulier aux UVB, rayons les plus énergétiques atteignant la surface terrestre, peut entrainer des cancers de la peau chez l'être-humain comme les cancers de la peau de type non-mélanome (NMSC). La capacité des UVB à initier des NMSC provient principalement de leurs habilités à causer des dommages directs à l'ADN, tels que les dimères cyclobutyliques de pyrimidine (CPD) et les produits pyrimidine-pyrimidone (6-4PP), qui sont pris en charge par le mécanisme de réparation par excision de nucléotide (NER). L'incidence croissante de NMSC chez les patients déficients pour l'une des protéines de la NER souligne l'importance d'un processus fonctionnel. Par conséquent, une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de la NER permettrait de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques pour la prévention ou le traitement des cancers de la peau. L'une des premières réponses cellulaires aux dommages CPD/6-4PP induits par UVB dans la peau des mammifères est l'activation de l'enzyme nucléaire poly(ADP-ribose) polymérase-1 (PARP1) qui catalyse la formation de polymères d'ADP-ribose. Les précédents travaux de notre laboratoire et d'autres équipes ont démontré que PARP1 et son activité enzymatique facilitent la NER en collaboration avec la protéine UV-damaged DNA binding protein 2 (DDB2), qui va aussi s'accumuler rapidement aux sites CPD/6-4PP pendant la phase de reconnaissance des dommages à l'ADN de la NER. Cependant, plusieurs aspects des interactions de PARP1 avec DDB2 et avec les dommages directs à l'ADN sont inconnus. Ainsi, le premier objectif de mon projet de doctorat a été de caractériser précisément la nature de la liaison de PARP1 aux dommages CPD/6-4PP induits par UV vis-à-vis la protéine DDB2. Mes recherches ont mis en évidence l'empreinte asymétrique formée par PARP1 de -12 à +9 nucléotides de chaque côté des dommages CPD/6-4PP en présence ou en absence de DDB2. Nous avons également démontré que PARP1 augmente l'affinité de DDB2 pour les dommages CPD/6-4PP. De plus, les résultats de notre étude indiquent un rôle de PARP1 indépendant de DDB2 pendant la phase de reconnaissance des dommages à l'ADN. Cibler PARP1 et son rôle dans les voies de réparation des dommages à l'ADN est l'une des stratégies les plus efficaces développées ces dernières années pour le traitement des cancers des ovaires et du sein. L'application translationnelle de mon projet de doctorat a alors été de comprendre le rôle de PARP1 dans la NER dans le contexte des NMSC. À cet égard, nous avons développé un modèle PARP1-KO dans la lignée de souris SKH-1, qui est un modèle largement adopté pour étudier les NMSC induits par UVB. Puisque les souris SKH-1 développent principalement des carcinomes spinocellulaires (CSC) cutanés après une exposition chronique aux UVB, notre étude rapporte le rôle de PARP1 dans le développement des CSC. En utilisant les souris nouvellement créées SKH-1 PARP1-KO et les souris SKH-1 PARP1-WT avec ou sans application topique d'inhibiteurs de PARP, nous avons mis en évidence que l'absence de PARP1 ou de son activité dans la peau des souris SKH-1 mâles et femelles réduit significativement le fardeau tumoral des CSC et prolonge la période de latence du développement tumoral. L'étude hebdomadaire de l'apparition et de la croissance de tumeurs tout au long du protocole révèlent aussi que cibler PARP1 est très efficace pour ralentir, à l'étape pré-maligne, le développement de CSC. Nos résultats sont surprenants à la lumière des propriétés onco-suppressives rapportées de PARP1 et de son activité catalytique dans des cas de cancérogenèse induits par des dommages à l'ADN causés par des agents alkylants, ainsi que de la susceptibilité croissante des souris knock-out pour d'autres protéines de la NER à développer des CSC induits par UVB. Le rôle de PARP1 dans les mécanismes cellulaires induits par UVB autres que la NER, comme la mort cellulaire et les modulations immunes, pourrait expliquer nos observations. Alors que d'autres analyses sont nécessaires pour comprendre le rôle de PARP1 dans ces mécanismes, notre étude met en avant l'utilisation potentielle d'inhibiteurs de PARP comme nouvel agent chimiopréventif contre les CSC induits par UVB. / The exposure to solar ultraviolet radiation (UV) is essential to life and beneficial to human health. However, an overexposure to terrestrial solar UV, especially its most energetic component UVB, can cause skin cancers including the non-melanoma skin cancers (NMSC) in humans. The NMSC initiating properties of UVB arise predominantly from their ability to cause direct DNA damage such as cyclobutane pyrimidine dimers (CPD) and 6-4photoproducts (6-4PP), which are repaired via nucleotide excision repair (NER) pathway. The increased incidence of NMSC in patients with hereditary defects in NER pathway proteins underscores the importance of efficient NER in humans. Therefore, detailed understanding of the molecular operation of NER pathway can provide novel therapeutic targets for the prevention or treatment of skin cancers. One of the earliest responses of the mammalian skin cells to UVB-induced CPD or 6-4PP is the activation of the nuclear enzyme poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP1), which catalyzes the formation of polymers of ADP-ribose (PAR). The previous work from other teams and our laboratory have shown that PARP1 and its enzymatic activity facilitate NER in collaboration with UV-damaged DNA binding protein 2 (DDB2), which also rapidly accumulates at the CPD/6-4PP site during the DNA damage recognition stage of NER. However, many aspects of interaction of PARP1 with DDB2 and direct DNA damage are not understood. Therefore, the first aim of my doctoral project was to characterize the precise nature of binding of PARP1 vis-à-vis DDB2 at UV-induced CPD/6-4PP. My doctoral research demonstrates that PARP1 casts asymmetric footprint from −12 to +9 nucleotides on either side of the CPD/6-4PP in presence or absence of DDB2. We also demonstrated that PARP1 facilitates the binding of DDB2 to CPD/6-4PP. Moreover, our study reports DDB2-independent role of PARP1 during the DNA damage recognition phase in NER. Targeting the role of PARP1 in DNA strand break repair pathways has emerged as one of the successful strategies for the treatment of ovarian and breast cancers in last decade. Consequently, the ultimate translational goal of my doctoral project was to understand the implication of NER facilitating role of PARP1 in NMSC. In this regard, we first developed a PARP1-KO model in the albino hairless SKH-1 mouse strain, which is a widely adopted mouse model to study UVB-induced NMSC. Since SKH-1 mice mainly develop cutaneous squamous cell carcinoma (SCC) upon chronic UVB-exposure, our present study reports the role of PARP1 in development of SCC. Using the newly developed PARP1-KO and PARP1-WT SKH-1 mice with or without topical application of PARP inhibitor, we report that the absence of PARP1 or its activity in skin of both male and female SKH-1 mice significantly reduces the SCC tumor burden and prolongs the tumor latency period. The analyses of appearance and growth of individual tumors on a weekly basis during this protocol also revealed that targeting of PARP1 was most effective in suppressing the premalignant stage of the SCC development. Our results are surprising in light of the reported onco-suppressive property of PARP1 and its catalytic activity in alkylating DNA damage-induced tumorigenesis and the increased susceptibility of other NER protein knock-out mice to UVB-induced SCC. We reason that the roles of PARP1 in UVB-induced cellular processes other than NER, such as cell death and immune modulations, can account for our observation. While further studies are required to understand these roles of PARP1 in UVB-induced cellular processes, our study underscores the potential for use of PARP inhibitors as a novel chemopreventive agents against UVB-induced SCC.

L’ATP est l’agoniste naturel du récepteur P2Y11. Ce nucléotide ne peut cependant pas être utilisé comme agent thérapeutique car, in vivo, il s’hydrolyse rapidement en ADP ou en AMP qui ne possèdent qu’une faible activité pour le récepteur. D’où l’intérêt de disposer d’analogues de synthèse moins sensibles à l’hydrolyse et possédant une affinité égale ou supérieure à celle de l’ATP.<p><p>Le premier objectif que nous nous sommes fixés au cours de notre thèse de doctorat fut de mettre au point un schéma de synthèse permettant d’obtenir des analogues de l’adénosine-5’-triphosphate [1] portant un motif thioalkyle ou thioaryle en position 2 de la base ainsi qu’un groupement dichlorométhylène entre les phosphores b et g & / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Cette thèse s’inscrit dans le cadre de l’étude de la relation structure-activité d’analogues de ligands naturels de récepteurs nicotiniques et purinergiques. Ce travail se divise en deux parties. Dans la première partie de cette thèse, nous avons réalisé la synthèse d’analogues de la 11-homosédinone, alcaloïde isolé de la plante Sedum acre, qui présente une activité agoniste sur différents récepteurs nicotiniques du système nerveux central. Les différents analogues ont été synthétisé par application de la méthoxylation anodique pour introduire succesivement deux substituants en postion 2 et 6 d’un noyau pipéridinique. Les analogues synthétisés se différencient par la nature du noyau aromatique, la présence d’un groupement méthyle sur l’atome d’azote de la pipéridine et l’oxydation du sustituant en position 2. Ce travail a notamment permis de montré l’importance du groupement N-méthyle vis-à-vis de l’activité des analogues. Nous avons également pu mettre en évidence que l’introduction d’un halogène sur le noyau aromatique diminuait l’activité de l’analogue sur le récepteur a7 tout en augmentant l’acitivité sur le récepteur a4b2 et que l’introduction d’un noyau furanique permettait d’augmenter la sélectivité vis-à-vis du récepteur a4b2 tandis que l’introduction sur le noyau aromatique d’un groupement nitro ou méthoxy conduit à une perte totale de l’activité. Dans la seconde partie de cette thèse, nous avons réalisé la synthèse d’analogues de la dATP, afin d’évaluer leur effet agoniste sur le récepteur P2Y11, impliqué dans différents mécanismes de différentiation cellulaire, dont notamment celui de la maturation des cellules leucémiques HL60 en cellules de type neutrophile. Les analogues synthétisés se différencient de la dATP par la présence d’un groupement méthylène ou dichlorométhylène entre les phosphores b et g de la chaîne polyphosphate, ainsi que par l’estérification de l’alcool en position 3’ du sucre. Ce travail a pu confirmer que les analogues en série 2’-désoxy conduisent à de meilleures activités que ceux de la série 2’-OH. Nous avons également pu montrer que l’estérification de la position 3’ conduit à une diminution de l’activité agoniste, à l’exception du groupement a-naphtoyle qui conduit à une augmentation significative de l’activité sur P2Y11.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Résumé : Les télomères sont des structures nucléoprotéiques spécialisées qui assurent la stabilité du génome en protégeant les extrémités chromosomiques. Afin d’empêcher des activités indésirables, la réparation des dommages à l’ADN doit être convenablement régulée au niveau des télomères. Pourtant, il existe peu d’études de la réparation des dommages induits par les ultraviolets (UVs) dans un contexte télomérique. Le mécanisme de réparation par excision de nucléotides (NER pour « Nucleotide Excision Repair ») permet d’éliminer les photoproduits. La NER est un mécanisme très bien conservé de la levure à l’humain. Elle est divisée en deux sous voies : une réparation globale du génome (GG-NER) et une réparation couplée à la transcription (TC-NER) plus rapide et plus efficace. Dans notre modèle d’étude, la levure Saccharomyces cerevisiae, une forme compactée de la chromatine nommée plus fréquemment « hétérochromatine » a été décrite. Cette structure particulière est présente entre autres, au niveau des régions sous-télomériques des extrémités chromosomiques. La formation de cette chromatine particulière implique quatre protéines nommées Sir (« Silent Information Regulator »). Elle présente différentes marques épigénétiques dont l’effet est de réprimer la transcription. L’accès aux dommages par la machinerie de réparation est-il limité par cette chromatine compacte ? Nous avons donc étudié la réparation des lésions induites par les UVs dans différentes régions associées aux télomères, en absence ou en présence de protéines Sir. Nos données ont démontré une modulation de la NER par la chromatine, dépendante des nucléosomes stabilisés par les Sir, dans les régions sous-télomériques. La NER était moins efficace dans les extrémités chromosomiques que dans les régions plus proches du centromère. Cet effet était dépendant du complexe YKu de la coiffe télomérique, mais pas dépendant des protéines Sir. La transcription télomériques pourrait aider la réparation des photoproduits, par l’intermédiaire de la sous-voie de TC-NER, prévenant ainsi la formation de mutations dans les extrémités chromosomiques. Des ARN non codants nommés TERRA sont produits mais leur rôle n’est pas encore clair. Par nos analyses, nous avons confirmé que la transcription des TERRA faciliterait la NER dans les différentes régions sous-télomériques. / Abstract : Telomeric DNA is made of short tandem repeats located at the ends of chromosomes and their maintenance is critical to prevent genome instability. DNA lesions constitute a serious risk to genome integrity. Thus, DNA repair mechanisms are required for continuous and unabridged cell divisions. The nucleotide excision repair (NER) pathway removes bulky DNA lesions such as UV-induced photoproducts, like the cyclobutane pyrimidine dimers (CPD). NER is divided in two sub-pathways: global genome repair (GGR) and the faster transcription-coupled repair (TCR), which only differ in how they recognize UV-induced lesions. In eukaryotes, NER must find and repair DNA lesions that are buried in nucleosomes. In the yeast S. cerevisiae, genes positioned close to telomeres are silenced by a heterochromatin-like structure that is formed by silent information regulator proteins (Sir). To determine if nucleosomes and chromatin in subtelomeric regions affect the efficiency of NER, we studied the repair of photoproducts in different telomere-associated regions in both, WT and SIR genes deleted cells (sirΔ). We found that NER efficiency was modulated by the presence of nucleosomes on the subtelomeric type X element. In addition, in absence of Sir proteins, NER efficiency increased and was not modulated by nucleosomes, indicating that nucleosome positioning was less defined in sirΔ cells. Remarkably, in telomeric restriction fragment, NER was less efficient at telomeres than in the subtelomere type Y’ element. We suggest that low NER efficiency at the very end of chromosomes results from attachment sites to the nuclear periphery. Our data indicate that NER in sub-telomeric chromatin is modulated by Sir proteins stabilized-nucleosomes, and that NER is inhibited in telomeric chromatin by the presence of YKu, independently from the presence of Sir proteins. It was recently shown that the chromosome ends are transcribed and a non-coding RNA, called TERRA, is produced. Currently the precise functions of TERRA are not understood. Our second goal is to help understand the function of TERRA. We think that transcription at the chromosome ends could facilitate the removal of DNA lesions from heterochromatin by TCR, which would prevent the formation of mutations and, ultimately, chromosome shortening. Our data showed that TC-NER is effective in Y’ element and the telomere. Without Sir proteins, TERRA transcription is found in a particular region at the end of the X element. The transcription of TERRA could improve the repair of UV-induced lesions.