Les maladies inflammatoires intestinales (MII) sont caractérisées par des périodes d’inflammation chronique entrecoupées de périodes de rémission. Les cellules épithéliales intestinales (CÉI) participent activement à l’élaboration de la réponse immune innée. Les nucléotides extracellulaires sont reconnus comme des molécules immunoactives. Cette thèse s’intéresse aux rôles de l’UDP et de son récepteur PDY[indice inférieur 6] dans l’expression et la sécrétion de CXCL8 par les CÉI et à leurs implications dans le recrutement des neutrophiles lors des maladies inflammatoires intestinales. Premièrement, la stimulation du récepteur PDY[indice inférieur 6] sur les CÉI, active une cascade de signalisation intracellulaire impliquant la phospholipase C (PLC), la protéine kinase Cð (PKCð) et la MAP kinase ERK1/2. La phosphorylation de c-fos par ERK1/2 induit la formation d’un dimère c-fos/c-jun. Le complexe AP-1 ainsi formé lie le promoteur de la chimiokine CXCL8 et stimule la transcription de celle-ci. La chimiokine est par la suite sécrétée dans le milieu extracellulaire. Deuxièmement, la présence d'UDP chez la souris, lors de l'induction d’une colite aigüe par le DSS aggrave les signes d'inflammation. L'UDP aggrave l'index de la sévérité de la maladie (DAI), le score histologique, la perméabilité de la muqueuse et le recrutement des intervenants cellulaire tel que les cellules T, les cellules dendritiques, les macrophages et les neutrophiles. Troisièmement, l'administration d'UDP aux souris en rémission dans un modèle de colite chronique est suffisante pour déclencher les symptômes d'inflammation. L'UDP aggrave le DAI, le score histologique et la perméabilité de la muqueuse. L'activation du récepteur P2Yð durant la colite chronique est responsable du recrutement différentiel des neutrophiles au détriment des cellules dendritiques tolérogéniques et des macrophages, ce qui somme toute aggrave la colite. Finalement, in cellulo, l'antagoniste du récepteur P2Y[indice inférieur 6], le MRS2578 réduit la relâche de la CXCL8 par les CÉI. In vivo, l'administration de MRS2578 dans le modèle aigu et chronique de colite réduit les signes d'inflammation. Cette thèse démontre l’importance du récepteur P2Y[indice inférieur 6] dans la réponse inflammatoire des cellules épithéliales intestinales, notamment dans la stimulation de la relâche de CXCL8 et dans le recrutement des cellules immunes tel que les neutrophiles. De plus, elle met en évidence le potentiel thérapeutique de l'administration d'antagoniste du récepteur P2Y[indice inférieur 6] lors des maladies inflammatoires intestinales.

Dans les trois domaines du vivant, que constituent les bactéries, les eucaryotes et les archées, une molécule a la capacité souveraine de gouverner la vie, la mère à l’origine de tous les mécanismes biologiques, l’ADN. S’il est évident de dire que le maintien de l’intégrité des génomes est essentiel à la vie, il existe deux systèmes qui le permettent, la réplication et la réparation de l’ADN. La fidélité de ces derniers est finement influencée par la disponibilité (ratio et balance) des précurseurs nucléotidiques désoxyribonucléotides (dNTPs) et ribonucléotides (rNTPs) au cours du cycle cellulaire. Même si la concentration intracellulaire en nucléotides est largement documentée chez les eucaryotes et les bactéries, ça n’est malheureusement pas le cas chez les archées. En ce qui concerne l’étude de la maintenance génomique, un groupe d’archées a intéressé les chercheurs de par leurs capacités à survivre dans des milieux dits extrêmes. Pyrococcus abyssi est l’une d’entre elles qui depuis de nombreuses années sert de modèle biologique pour répondre aux questions de la stabilité de l’ADN à haute température. Cette étude est centrée sur cette thématique et particulièrement sur les caractéristiques fonctionnelles des ADN polymérases: PolD, PolB et le complexe p41/p46. Initialement, le contenu en nucléotides a été évalué dans des cellules en phase exponentielle de croissance par la technique de chromatographie couplée à une double détection en spectrométrie de masse (zicHILIC-MS-MS). Les résultats montrent que le contenu en rNTPs est de 20 fois supérieur à celui en dNTPs. Pour cette raison, la discrimination sélective des dNTPs par les ADN polymérases est mise à l’épreuve. Même si, des mécanismes permettent d’exclure les rNMPs durant la synthèse de l’ADN, de récentes études ont montrées que des rNMPs étaient incorporés par des ADN pols. Ainsi, le ratio en nucléotides obtenu a été utilisé pour l’analyse de son effet sur la synthèse d’ADN par les ADN Pols et les extraits cellulaires de P. abyssi. Les résultats démontrent clairement que les rNMPs sont incorporés par l’ADN polymérase PolD. Puis, les conséquences de la présence des rNMPs dans l’ADN sur la réplication ont été étudiées et ont mis en évidence que les extraits cellulaires, tout comme les ADN Pols de P. abyssi étaient capables de « passer » un rNMP présent dans l’ADN. Pour finir, une étude de l’incorporation préférentielle de chaque dNMP et rNMP a été menée démontrant que la complémentarité des bases était respectée même lors de l’incorporation de rNMPs. Enfin, la caractérisation de la petite sous-unité, DP1, de PolD a permis de montrer sa capacité à retirer des rNMPs grâce à son activité de relecture, suggérant un premier rempart à la présence de rNMPs dans l’ADN. Pour conclure, ces résultats montrent que la présence de rNMPs dans l’ADN est un phénomène conservé dans les trois domaines du vivant. / In the three domains of life that include Bacteria, Eukarya and Archaea, one molecule has the sovereign ability to govern life, and not the least one, the mother of all biological mechanisms, DNA. Maintaining the integrity of genomes is obviously essential for life, and faithful DNA replication and repair are the guarantees. The fidelity of these two processes may vary depending on the availability and levels (balance and ratio) of deoxyribonucleotides (dNTPs) and ribonucleotides (rNTPs) during the cell-cycle. Even if intracellular concentration of nucleotides is largely documented in Eukarya and Bacteria, it remains limited in Archaea. From many years one group of Archaea is of great interest for studying genomic maintenance, because of its ability to survive in extremes environments. Pyrococcus abyssi is one of them that is used as biological model for deciphering the stability of DNA at elevated temperature in LM2E. The present work focuses on genomic integrity and particularly on the functional characterization of the three DNA polymerases: PolD, PolB and the p41/p46 complex. Initially, the nucleotide pool has been evaluated in exponentially growing cells using the highly sensitive method that combined chromatography and mass spectrometry (zicHILIC-MS-MS). The results show that rNTPs content is 20-fold higher than dNTPs. For that reason, fidelities of DNA polymerases are challenged to select the correct dNTP over the most abundant rNTP during DNA synthesis. Despite the fact that some mechanisms allow the exclusion of rNTPs from entry to the Pol active site, recent findings indicate that ribonucleotides are incorporated by different DNA Pols with surprisingly high frequency. In this work, the obtained intracellular balance and ratio of rNTPs and dNTP have been used to analyze their effect on DNA synthesis by P. abyssi DNA Pols and cell-free extracts. Our results clearly demonstrate that rNTP incorporation is detectable with distinct efficiencies among DNA pols. Secondly, the consequences of the presence of rNMPs in a DNA template on DNA polymerisation has been examined and highlights that cell-free extracts are able to bypass a single rNMP as well as replicative DNA polymerases. To strengthen that study, single nucleotide incorporation opposite rNMP or dNMP has been carried out and the results demonstrate that replicative Pyrococcus abyssi DNA Pols can basepair the complementary rNTPs opposite dNMPs, and vice-versa, the complementary dNTPs opposite rNMPs.Furthermore, the preliminary results obtained about the nucleolysis activities of the PolD small subunit, DP1, show that the DNA polymerase D is able to remove rNMPs from a DNA strand, suggesting a first level of protection against ribonucleotide contamination of DNA. Definitely, these data indicate that the presence of transient embedded rNMPs in genomic DNA represents a universally conserved phenomenon across Archaea, Bacteria and Eukarya.

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) possèdent deux propriétés fondamentales : l'auto-renouvellement et la capacité de se différencier en lignées hématopoïétiques de tout type. Les CSH se maintiennent dans la moelle osseuse et se renouvellent par division asymétrique. En revanche, les divisions symétriques caractérisent les cellules qui s'engagent dans la différenciation. L'environnement pauvre en oxygène de la moelle osseuse favorise la glycolyse anaérobique et l'oxydation des acides gras, préservant, respectivement, la quiescence et les divisions asymétriques. Que l'engagement des CSH vers la différenciation lymphoïde, myéloïde ou érythroïde dépende ou entraîne une reprogrammation métabolique n'est toujours pas connu. En effet, de nombreuses études ont montré que cytokines et contacts cellulaires sont indispensables pour l'engagement des CSH vers une lignée donnée, alors que l'impact potentiel des nutriments et du métabolisme sur ce processus reste très peu étudié. La différenciation est associée à une prolifération qui nécessite des besoins métaboliques accrus pouvant être supportés par diverses sources d'énergie, telles que le glucose, les acides gras, le lactate ou la glutamine. Le glucose et la glutamine sont des précurseurs de l'ATP, des lipides et des nucléotides. Toutefois, leurs contributions relatives aux voies métaboliques contrôlant l'engagement des CSH n'ont pas été évaluées. Pour autant, nos études ainsi que celles menées par d'autres laboratoires ont montré que l'expression du transporteur de glucose Glut1 n'augmente qu'au cours des dernières étapes de la différenciation érythroïde, suggérant l'implication potentiel d'autres nutriments dans la régulation des étapes précoces de l'engagement vers la voie érythroïde. Ainsi, mon travail de thèse a consisté à déterminer si la disponibilité et l'utilisation des nutriments régulent la différenciation des CSH vers la lignée érythroïde. De fait, j'ai montré que le transporteur de glutamine ASCT2 est hautement exprimé dans les CSH et que la répression d'ASCT2 ou le blocage du métabolisme de la glutamine empêche la différenciation érythroïde des CSH, les détournant vers la voie myéloïde, même en présence d'érythropoïétine. Dans ces conditions, nous avons montré que la différenciation érythroïde ne pouvait pas être restaurée par l'ajout d'intermédiaires du cycle de Krebs, alors que qu'elle était dépendante de la biosynthèse de novo de nucléotides. Étonnamment, le 2-désoxyglucose (2-DG), un analogue du glucose inhibant la glycolyse, accélérait l'érythropoïèse. Nous avons aussi mis en évidence in vivo, en condition de stress érythropoïétique, des influences différentes du catabolisme de la glutamine et celui du glucose dans la modulation de l'érythropoïèse. Afin de mieux élucider les mécanismes par lesquels la glutamine module la différenciation érythroïde des CSH, nous avons étudié les voies métaboliques qu'elle emprunte. Des expériences de suivi de la glutamine marquée ont montré que l'entrée de la glutamine dans le cycle de Krebs est requise pour une érythropoïèse efficace. Par contre, nous avons montré que la synthèse de novo des nucléotides était l'étape limitante de la différenciation érythroïde. De plus, nous avons observé que la différenciation érythroïde accélérée en présence du 2-DG était associée à une augmentation importante du niveau des pentoses phosphates, précurseurs des nucléotides. Ainsi, l'utilisation de la voie des pentoses phosphates par le glucose, plutôt que la glycolyse, était essentielle pour l'érythropoïèse. En conclusion, mon travail de thèse a montré que la production de nucléotides via le métabolisme coordonné du glucose et de la glutamine est la condition sine qua non pour l'engagement des CSH vers la lignée érythroïde. / Hematopoietic stem cells (HSCs) possess two fundamental characteristics; self-renewal capacity and the ability to give rise to all blood cell lineages. Before their commitment to a specific lineage, these cells are maintained in a quiescent state in the bone marrow. Asymmetric division is essential for the maintenance of the stem cell compartment while symmetric division results in HSC differentiation. The hypoxic environment of the bone marrow is conducive to anaerobic glycolysis and fatty acid oxidation, preserving stem cell quiescence and asymmetric division, respectively. However, it is not known whether the commitment of an HSC to a lymphoid, myeloid or erythroid lineage fate, is regulated by a metabolic switch. Indeed, while much research has shown a critical role for cytokines and cell-cell contacts in the commitment of HSCs to distinct hematopoietic lineages, the possibility that nutrient entry and metabolism may contribute to this process was not considered until very recently. Cell differentiation is associated with proliferation resulting in increased metabolic requirements that can be met by energy sources such as glucose, fatty acids, lactate, or glutamine, amongst others. While glucose and glutamine are both precursors for the production of ATP, lipids and nucleotides, their relative contributions to metabolic pathways driving HSC lineage commitment have not been evaluated. Interestingly, we and others previously found that the Glut1 glucose transporter is highly upregulated only during the final mitoses of HSC-driven erythroid differentiation, suggesting that other nutrients may regulate early stages of erythroid lineage commitment. During my PhD, I was interested in determining whether nutrient availability and utilization regulate HSC differentiation to the erythroid lineage. Interestingly, I found that the ASCT2 glutamine transporter is expressed at high levels on HSCs. Downregulation of ASCT2 or blocking glutamine metabolism abrogated erythroid differentiation of HSCs and diverted erythropoietin-signaled HSCs towards a myeloid fate. Under conditions where glutamine utilization was blocked, erythroid differentiation was not restored by directly replenishing the tricarboxylic acid cycle but rather, was dependent on de novo nucleotide biosynthesis. Surprisingly, 2-deoxyglucose, a glucose analogue that inhibits glycolysis, enhanced erythropoiesis. Glutamine and glucose catabolism also differentially modulated erythropoiesis in vivo, under stress conditions. To better elucidate the mechanism(s) via which glutamine supports the erythroid lineage specification of HSCs, we evaluated the metabolic pathways fueled by glutamine. Carbon/nitrogen-labeled glutamine tracing experiments showed that the rate-limiting step in EPO-induced erythroid differentiation is glutamine-dependent de novo nucleotide biosynthesis while glutamine entry into the TCA cycle (anaplerosis) is not required. Furthermore, the accelerated erythroid differentiation in the presence of 2-DG was associated with a striking increase in pentose phosphates, precursors of nucleotides. Notably, the shunting of glucose into the pentose phosphate pathway (PPP), rather than glycolysis, was essential for erythropoiesis. In conclusion, my research shows that the coordinated redirection of glucose and glutamine into the production of nucleotides is the sine qua non condition for the erythroid differentiation of HSCs.

Les nucléotides cycliques possèdent un rôle indéniablement important dans les diverses facettes de la physiologie du follicule ovarien. Les nucléotides cycliques servent d’intermédiaires pour la transmission des signaux extracellulaires à l’intérieur de la cellule. Ces seconds messagers sont synthétisés à l’intérieur de la cellule suite à l’activation des récepteurs couplés à des cyclases. La durée et l’intensité de ces signaux sont non seulement modulées par la synthèse via les adénylyl et guanylyl cyclases, mais par l’action des membres de la famille des phosphodiestérases (PDE) qui inactivent les nucléotides cycliques en hydrolysant le lien phosphodiestère entre le groupement phosphate et la position 3’ du désoxyribose. Malgré le partage d’une fonction commune, les 11 types connus de PDE permettent d’obtenir une finesse de régulation des signaux externes par les variations spatio-temporelles du profil d’expression, par les modes de régulation de l’activité et par leur distribution intracellulaire. Ainsi, pour faire avancer notre compréhension de la modulation des signaux utilisant les nucléotides cycliques dans le follicule ovarien, la caractérisation des PDE dans le complexe ovocyte-cumulus dans un contexte de maturation in vitro (MIV) a été entreprise. Dans un premier temps, nous avons entrepris de caractériser la nature des PDE présentes dans l’ovocyte afin d’illustrer leur rôle de dégradation de l’adénosine monophosphate 3’5’-cyclique (AMPc) dans le déroulement de la maturation nucléaire. Tout d’abord, la presque totalité de l’activité de dégradation d’AMPc présente dans l’ovocyte a été attribuée à PDE3A, quoiqu’aucune variation n’ait été mesurée au cours de la MIV. L’utilisation d’un inhibiteur spécifique à la famille des PDE3 pendant la MIV nous a permis de définir une période se situant entre 15 à 21 heures de MIV où l’ovocyte s’engage irréversiblement dans sa maturation nucléaire. L’inhibition de PDE3 nous a également montré son implication dans le déroulement de la méiose stimulée par un inhibiteur de protéine phosphatase 1/2A. Ces résultats ont démontré le rôle fonctionnel de PDE3A dans la gestion de l’AMPc dans l’ovocyte porcin tout au long de sa MIV. Dans un deuxième temps, la caractérisation des PDE dans les cellules du cumulus pendant la MIV a été réalisée. Nos résultats démontrent que PDE3A subit une augmentation d’expression de l’ARNm et d’activité pendant les 10 premières heures de MIV, soit 5 heures avant l’engagement irréversible de l’ovocyte dans sa maturation nucléaire. De plus, cette augmentation d’expression est dépendante de la présence de choriogonadotrophines équines. L’augmentation a été reproduite par deux facteurs stimulant la production d’AMPc ; la forskoline, et la prostaglandine E2. Cette augmentation a été empêchée par un inhibiteur de la protéine kinase dépendante de l’AMPc (PKA). Ces résultats démontrent la présence d’une voie d’autorégulation de l’AMPc présente dans les cellules du cumulus pendant la MIV qui serait dépendante de la voie de signalisation de l’AMPc et de PKA. Dans un troisième temps, la communication intercellulaire entre les cellules du complexe ovocyte-cumulus (COC) pendant la MIV a été étudiée pour avancer notre compréhension de l’influence mutuelle que les deux types cellulaires exercent un sur l’autre. En outre, la communication intercellulaire utilisant les jonctions communicantes serait augmentée dans le COC par une augmentation d’expression de connexine 43 (Cx43) indépendante des gonadotrophines et stimulée par la rupture du contact entre le COC et les cellules de la granulosa murale. Après une période plateau de haute communication, il se produirait une coupure dramatique de la communication intercellulaire simultanément avec la maturation nucléaire de l’ovocyte. Cette coupure serait stimulée par les gonadotrophines et accompagnée par le recrutement de la Cx43 dans des microdomaines lipidiques de la membrane cellulaire. Dans un dernier temps, la dégradation de la guanosine monophosphate 3’5’-cyclique (GMPc) a été étudiée dans le COC pendant la MIV. Les résultats suggèrent la présence d’une PDE hydrolysant le GMPc sensible à Zaprinast et à Sildenafil, deux inhibiteurs spécifiques aux PDE de la famille 5 et 6. Cette activité est augmentée après 24 heures de maturation in vitro et demeure élevée jusqu’à 48 heures. En conclusion, nos études démontrent un profil d’expression de phosphodiestérases ainsi qu’une variation de la communication intercellulaire particulièrement intéressante dans le COC porcin. Ce portrait permet une avancée fondamentale dans notre vision de la gestion des nucléotides cycliques pendant la MIV. Le meilleur contrôle des niveaux de nucléotides cycliques pendant la MIV pourrait nous permettre d’améliorer les techniques de reproduction assistée en permettant un meilleur support de la maturation in vitro des ovocytes chez les espèces domestiques. / Cyclic nucleotides are of paramount importance in diverse aspects of the physiological functions of the ovarian follicle. These secondary messengers are the intracellular intermediates of extracellular signals transmitted by the central nervous system, other endocrine tissues and the ovary itself. The length and intensity of these signals are modulated by the members of the phosphodiesterases (PDE) family, that inactivate cyclic nucleotides by hydrolysing the phosphodiester bond linking the phosphate group to the 3’ position of the desoxyribose moiety. Although they share a common function, the 11 types of PDE are achieving the delicate interpretation of external signals by their spatio-temporal variations of their expression patterns, by their unique activity modulation mecanisms and unique intracellular targeting. To further understand the modulation of cyclic nucleotides-mediated signals in the ovarian follicle, the functional characterization of PDE in the cumulus-oocyte complex (COC) was carried out in a well defined in vitro maturation (IVM) system. First, the PDE expressed in the oocyte were characterized to illustrate their potential role in 3’5’ cyclic adenosine monophosphate (cAMP) degradation during IVM. Nearly all cAMP degradation activity present in the oocyte was attributed to PDE3A, although no variation was measured during IVM. By delaying PDE3-specific inhibitor addition to the media, an oocyte meiotic resumption commitment period was determined from 15 to 21 hours. It has also demonstrated that PDE3A could be implicated in protein phosphatase 1/2A inhibitor-stimulated meiosis progression. These results have allowed us to precise the role of PDE3A in modulating cAMP in porcine oocyte during IVM. However, the absence of PDE3A activity variation in the oocyte during IVM has led us to believe to an active participation of the cumulus cells in the modulation of cAMP in the period preceding oocyte meiotic resumption. Second, the characterization of PDE in cumulus cells during IVM was undertaken. Our results demonstrate that PDE3A undergoes an upregulation after the first 10 hours of IVM, which is 5 hours before oocyte meiotic resumption commitment. Moreover, this upregulation was dependant of pregnant mare serum gonadotropins. The upregulation was also mimicked by cAMP-stimulation agents forskolin and prostaglandin E2 and has been inhibited by a cAMP-dependant protein kinase (PKA). These results suggest the presence of an autoregulatory loop of cAMP in cumulus cells that is activated following the stimulation of the cAMP/PKA signalling pathway during IVM. Third, intercellular communication between the cells of the cumulus-oocyte complex (COC) during IVM was studied to improve our understanding of the influence that the two cell types exert on each other. Gap-junction-mediated intercellular communication is increased in the COC by a gonadotropins-independent connexin 43 (Cx43) upregulation that is triggered by the rupture between cumulus cells and mural granulosa cells. After a sustained high level of communication, it dramatically drops simultaneously with oocyte meiotic resumption between 18 and 22 hours. This communication breakdown is stimulated by gonadotropins and accompanied by Cx43 recruitment to membrane lipid raft microdomains Finally, the degradation activity of 3’5’ cyclic guanosine monophosphate (cGMP) was studied in the COC during IVM. Our results revealed that a cGMP-hydrolysing PDE is present in the COC and it is sensitive to zaprinast and sildenafil, two PDE5- and PDE6-specific inhibitors. This activity was increased after 24 hours of IVM and remained high up to 48 hours. In conclusion, our studies have demonstrated a PDE profile and intercellular communication variations in the COC that is unique to the pig. This portrait brings further the edge of our fundamental knowledge of cyclic nucleotides modulation and transit during IVM. A better control of cyclic nucleotides during IVM could allow the improvement of assisted reproduction technologies and their efficacy in domestic mammals.

Les nucléotides cycliques sont des seconds messagers intracellulaires possédant une grande importance dans la signalisation cellulaire du follicule ovarien. Les niveaux intracellulaires en nucléotides cycliques tel que l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) dépendent de leur synthèse, assurée par l'adenylyl-cyclase (AC) ainsi que leur dégradation par les phosphodiéstérases (PDE). Ces dernières appartiennent à la superfamille des métalophosphohydrolases, elles hydrolysent le groupement phosphate en 3' des nucléotides cycliques pour produire un nucléotide 5' phosphate. Dans les cellules ovariennes, plusieurs familles de PDE ont été identifiées, agissant comme modulateurs des taux intracellulaires de nucléotides cycliques. Dans le présent projet, nous nous attarderons à étudier la signalisation cellulaire chez les cellules ovariennes impliquant l'AMPc. La régulation de ses concentrations intracellulaires affecte plusieurs processus physiologiques. Le projet s'intéresse particulièrement à une famille d'enzyme de dégradation de l'AMPc, la phosphodiestérase8A (PDE8A). Nous voulons donc valider la présence fonctionnelle de la famille de PDE8A dans les cellules ovariennes ainsi que la mitochondrie afin de comprendre l'implication de cette enzyme dans la physiologie cellulaire en s'attardant à la stéroïdogenèse, étant donné que les mitochondries sont un organite cellulaire essentiel pour la stéroïdogenèse parce qu'elles représentent le site de synthèses de plusieurs hormones stéroïdiennes. En effet, des récents travaux ont montré la famille PDE8 comme un régulateur de la stéroïdogenèse dans les cellules de Leydig. Dans cette étude, nous avons montré que le transcrit de PDE8A ainsi que sa protéine étaient exprimés dans les cellules de la granulosa, les cellules du cumulus et l'ovocyte chez le porc. Ainsi, la protéine PDE8a a été détectée par western blot dans des mitochondries isolées à partir des cellules de granulosa et des complexe ovocyte-cumulus (COC). Une co-localisation entre le signal immunoréactive de la PDE8A et le marquage réalisé par mitotracker a été observée dans les cellules de granulosa et des mitochondries isolées. De plus, la présence fonctionnelle de la PDE8 mesurée en tant qu'activité AMPc-PDE sensible au PF-04957325 a été détectée dans des cellules de la granulosa et des mitochondries isolées supportant la présence fonctionnelle de la PDE8A dans les mitochondries isolées. De ce fait, cette observation soutient encore la localisation fonctionnelle mitochondriale de la PDE8A. Une association entre la mitochondrie et la PDE8A a aussi été démontrée par immunomicroscopie électronique qui a confirmé l'ancrage de la protéine sur la membrane mitochondriale externe. Pour évaluer l'implication de la mitochondrie dans la stéroïdogenèse, l'effet de PDE8A sur la production de progestérone a été mesuré dans les complexes ovocyte-cumulus en utilisant le PF-04957325 comme un inhibiteur spécifique de PDE8. Lorsque les COC sont cultivés sans FSH, un niveau basal de progestérone est mesuré. Par contre en présence de FSH une augmentation significative de sécrétion de progestérone est observée. En utilisant un inhibiteur spécifique de la PDE8 (PF-04957325) avec la FSH nous avons obtenu une augmentation encore plus importante de la sécrétion de progestérone. Ces résultats démontrent la présence fonctionnelle de PDE8A dans les cellules de la granulosa et les complexes ovocyte-cumulus. Puisque les mitochondries sont l'une des localisations de PDE8A, l'effet de l'inhibiteur spécifique de PDE8 sur la sécrétion de progestérone soutient la contribution mitochondriale de PDE8 dans la stéroïdogenèse.

Les mélanomes malins (MM) constituent le deuxième type de cancer le plus fréquent chez les jeunes adultes canadiens (entre 20 et 44 ans) ainsi qu’un des rares cancers dont l’incidence augmente annuellement. À moins que les MM ne soient excisés à temps par chirurgie, les chances de survie des patients sont pratiquement nulles puisque ce type de tumeur est très réfractaire aux traitements conventionnels. Il est bien connu que l’exposition aux rayons ultraviolets (UV), induisant des photoproduits génotoxiques, est une déterminante majeure dans l’acquisition de MM. À cet effet, la réparation par excision de nucléotides (NER) est la ligne de défense principale contre le développement des mélanomes puisqu’elle est la voie de réparation prépondérante en ce qui a trait aux dits photoproduits. Malgré cela, la contribution potentielle de défauts de la NER au développement des MM dans la population normale n’est toujours pas bien établie. Notre laboratoire a précédemment développé une méthode basée sur la cytométrie de flux qui permet de mesurer la NER en fonction du cycle cellulaire. Cette méthode a déjà mise en évidence qu’une déficience de l’activité de la protéine ATR peut mener à une déficience de la NER exclusive à la phase S dans des fibroblastes humains. Pareillement, nous avons démontré que plusieurs lignées cellulaires cancéreuses modèles comportent une déficience en NER en phase S, suggérant qu’une telle déficience puisse caractériser certains types de cancers. Nous avons voulu savoir si une déficience en NER en phase S pouvait être associée à une proportion significative de mélanomes et si le tout pouvait être attribuable à une diminution de l’activité d’ATR. Nos objectifs ont donc été de : (i) mesurer l’efficacité de la NER en fonction du cycle cellulaire dans les MM en comparaison avec les mélanocytes primaires, (ii) vérifier si le niveau d’activité d’ATR corrèle avec l’efficacité de la NER en phase S dans les lignées de MM et (iii) voir si un gène fréquemment muté dans les mélanomes (tels PTEN et BRAF) pouvait coopérer avec ATR pour réguler la NER en phase S dans les mélanomes. Nous avons démontré que 13 lignées de MM sur 16 ont une capacité grandement diminuée à réparer les photoproduits induits par UV spécifiquement en phase S. De plus, cette déficience corrèle fortement avec une réduction de l’activation d’ATR et, dans plusieurs lignées de MM, avec une phosphorylation d’Akt plus importante. L’utilisation d’ARN interférent ou d’un inhibiteur du suppresseur de tumeurs PTEN, a permis, en plus d’augmenter la phosphorylation d’Akt, de réduire la réparation des photoproduits et l’activation d’ATR dans les cellules en phase S. En addition, (i) l’expression ectopique de la protéine PTEN sauvage dans des lignées déficientes en PTEN (mais pas d’une protéine PTEN sans activité phosphatase) ou (ii) l’inhibition pharmacologique d’Akt a permis d’augmenter la réparation en phase S ainsi que l’activation d’ATR. En somme, cette étude démontre qu’une signalisation d’ATR dépendante de PTEN/Akt amenant à une réparation déficiente des photoproduits génomiques causés par les UV en phase S peut être déterminante dans le développement des mélanomes induits par UV. / Malignant melanoma (MM) is the second most frequent neoplasia among young Canadian adults (aged 20-44); moreover the incidence of this disease continues to rise annually at an alarming rate. Unless primary melanoma is diagnosed early and promptly resected the patient prognosis is dismal since this deadly tumour type metastasizes extremely aggressively and is highly refractory to conventional treatment protocols. It is well established that exposure to UV light, and subsequent induction of genotoxic DNA photoproducts, is a primary determinant in the initiation of MM. Furthermore nucleotide excision repair (NER) clearly represents a critical frontline defence against MM because it is the only human pathway designed to remove the aforementioned DNA photoproducts. Despite this, the potential contribution of NER defects to sporadic MM development in the general population has remained unclear. Our laboratory previously developed a novel flow cytometry-based assay to evaluate the efficiency of NER as a function of cell cycle. This method was employed to demonstrate that functional ATR kinase is strictly required for NER during S phase in primary human fibroblasts. Intriguingly we also reported that many model tumour cell lines are deficient in NER uniquely in S phase populations, raising the possibility that such a defect might be characteristic of certain types of cancers. We therefore hypothesized that a significant proportion of human MM cell lines may exhibit reduced NER capacity specifically during S phase, and that this in turn might be attributeable to reduced ATR signaling. To test this hypothesis, three major specific aims were proposed: (i) To measure the efficiency of NER as a function of cell cycle among a panel of human MM cell lines and in primary melanocytes; (ii) To investigate whether any correlation exists between NER status and ATR activity during S phase in human MM cell lines; (iii) To investigate whether frequently mutated genes in melanoma (eg., PTEN, BRAF) might cooperate with ATR to regulate S phase-specific NER in MM cell lines. We were able to demonstrate that, in fact, 13/16 MM cell lines display remarkably diminished capacity to remove UV-induced DNA photoproducts specifically during S phase. Furthermore this defect correlates strongly with reduced activation of ATR kinase and, for a majority of MM, higher Akt phosphorylation levels. RNAi-mediated knockdown of the PTEN tumour suppressor, while stimulating Akt phosphorylation as expected, also engenders reductions in both photoproducts repair and ATR activation in S phase cells. In addition, (i) ectopic expression in PTEN-null strains of wild type PTEN but not of PTEN variants deficient in phosphatase activity, or (ii) pharmacological inhibition of Akt, significantly rescue S phase-specific repair as well as ATR activation. Our data indicate that reduced PTEN/Akt-dependent ATR signaling leading to defective repair of UV DNA photoproducts uniquely during S phase may represent an heretofore unrecognized major determinant in sunlight-induced melanoma development.

Introduction Les lésions induites par les rayons UV peuvent causer des blocages dans la réplication de l'ADN. Ces dommages sont éliminés par le processus moléculaire très conservé de réparation par excision de nucléotides (NER). Nous avons précédemment démontré que la protéine ATR, une kinase majeure impliquée dans le stress réplicatif, est requise pour une NER efficace, et ce exclusivement durant la phase S. Des résultats subséquents ont suggéré que ce prérequis n’était pas lié à la réponse induite par ATR, mais plutôt d’une conséquence globale causée par la présence de stress réplicatif. En ce sens, nous mettons l’emphase qu’après irradiation UV, le complexe RPA joue un rôle crucial dans l'activation des mécanismes de NER ainsi que dans le redémarrage des fourches de réplication bloquées. Hypothèses: En général, les mutations qui confèrent une augmentation du stress réplicatif engendrent une séquestration excessive du facteur RPA aux fourches de réplication bloquées ce qui réduit son accessibilité pour le NER. Méthodes et résultats: Le modèle de la levure a été choisi pour vérifier cette hypothèse. Nous avons développé un essai de NER spécifique à chacune des phases du cycle cellulaire pour démontrer que les cellules déficientes en Mec1, l’homologue d’ATR, sont défectives dans la réparation par excision de nucléotides spécifiquement en phase S. De plus, plusieurs autres mutants de levure, caractérisés par un niveau de dommages spontanés élevé, ont aussi exhibé un défaut similaire. Ces mutants ont démontré une fréquence et une intensité de formation de foyers de RPA plus élevée. Finalement, une diminution partielle de RPA dans les levures a induit un défaut significatif dans le NER spécifiquement durant la phase S. Conclusion: Nos résultats supportent la notion que la séquestration de RPA aux fourches de réplication endommagées durant la phase S prévient son utilisation pour la réparation par excision de nucléotides ce qui inhibe fortement l'efficacité de réparation. Cette étude chez la levure facilite l’élucidation du phénomène analogue chez l’humain et, ultimement, comprend des implications majeures dans la compréhension du mécanisme de développement des cancers UV-dépendants. / Introduction Replication-blocking UV-induced DNA adducts are removed by the highly-conserved nucleotide excision repair (NER) pathway. We previously demonstrated that ATR kinase, a preeminent responder to replicative stress, is required for efficient NER exclusively during S phase. Subsequent data suggested that this requirement is not a manifestation of ATR signaling per se, but rather more broadly reflects some consequence of replication stress. In this respect we emphasize that after UV treatment, heterotrimeric RPA plays essential and independent roles in both NER and restart of blocked replication forks. Hypothesis: In general, mutations which confer increased replicative stress engender excessive sequestration of RPA at blocked replications forks which in turn reduces the availability of this factor for NER. Methods and Results: The powerful yeast model was chosen to address this hypothesis. We developed a cell-cycle-specific DNA repair assay to demonstrate that cells deleted for Mec1, the yeast ATR homolog, are defective in S phase-specific NER. Moreover several other yeast mutants, i.e., ones characterized by elevated levels of spontaneous DNA damage, exhibited a similar defect. These mutants also displayed increased frequency and intensity of RPA focus formation. Finally, degron-mediated depletion of RPA in wild-type cells resulted in significant inhibition of NER uniquely during S. Conclusion: Our data support the notion that RPA sequestration at blocked replication forks in yeast undergoing high levels of replication stress abrogates NER during S phase. This work in yeast facilitates elucidation of the analogous phenomenon in humans and, ultimately, harbours implications for undestanding the mechanism of UV-associated skin cancer development.

Cette thèse a premièrement permis le développement d’une méthode de détection non-enzymatique de l’ADN. Les techniques enzymatiques couramment utilisées, comme la Polymerase Chain Reaction (PCR), échouent souvent dans l’analyse d’échantillons anciens ou transformés. L’ADN subit en effet de nombreuses dégradations post mortem, parmi lesquelles certaines bloquent les enzymes ADN-polymérases. Notre méthode combine hybridation et détection par SERRS (Surface Enhanced Resonant Raman Scattering), permettant la détection et la quantification de séquences d’ADN dégradées réfractaires à l’analyse par PCR. De nouvelles perspectives s’ouvrent donc en paléogénétique. Cette thèse aborde également le rôle des surfaces minérales dans l’origine des acides nucléiques. Les surfaces minérales pourraient avoir piégé et concentré les briques élémentaires de ces biopolymères, contribuant ainsi à leur construction. Les travaux existants se sont concentrés sur des minéraux comme la montmorillonite, qui n’était cependant pas abondante à l’Hadéen/Archéeen. La minéralogie de la Terre primitive aurait plutôt été dominée par les phyllosilicates ferromagnésiens. Nous avons étudié l’adsorption de nucléotides sur des minéraux plus cohérents avec le contexte géologique, en variant les paramètres environnementaux. Ce travail permet de préciser le mécanisme d’adsorption des nucléotides sur les surfaces minérales, ainsi que les conditions de l’origine du matériel génétique. / The first goal of this thesis was the development of a non-enzymatic DNA detection method. Current enzymatic techniques such as Polymerase Chain Reaction (PCR) often fail in analyzing ancient or processed samples. Indeed DNA undergoes numerous post-mortem degradations, among which some are known to block the bypass of DNA-polymerases. Our method combines hybridization and SERRS (Surface Enhanced Resonant Raman Scattering) spectroscopy, and allows the detection and quantification of degraded DNA sequences that are refractory to PCR analysis. This novel detection method therefore opens new perspectives, especially in paleogenetics. This thesis also aims at studying the role of mineral surfaces in the origin of nucleic acids. Mineral surfaces might have trapped and concentrated the elementary bricks of those biopolymers, thus contributing in their formation. Previous work has focused on minerals such as montmorillonite, although it might not have been abundant during the Hadean/Archean. The primitive Earth’s mineralogy would have been preferentially dominated by Fe-Mg rich phyllosilicates. We have therefore studied the adsorption of nucleotides on minerals we think are relevant to the geological context, and have varied the environmental conditions. This work allows characterizing the adsorption mechanism of nucleotides on mineral surfaces, as well as environmental conditions of the origin of genetic material.

Les virus de l'Immunodéficience Humaine de type 1 et 2 (HIV-1 et HIV-2) et de l'Hépatite B (HBV) représentent un intérêt particulier en santé publique. En effet, on estime à plus de 33 millions le nombre de personnes infectées par le virus HIV dans le monde et 360 millions par HBV. La transcriptase inverse (RT) est une enzyme nécessaire à leur réplication et constitue donc une cible majeure des drogues antivirales. Parmi les NRTI commercialisés, les analogues de nucleotides de type phosphonates acyclique, comme l'Adefovir (HEPSERA®, Gilead) et le Tenofovir (VIREAD®, Gilead) sous forme prodrogue, ont révolutionné les traitements contre les virus HBV et HIV. Devant l'emmergence de virus résistants, il est urgent de développer de nouveaux antiviraux plus puissants et surtout actifs sur ces souches afin d'optimiser les multithérapies antivirales. Dans ce but, nous avons conçu des analogues thiophosphonates dérivés de l'Adefovir (PMEA) et du Tenofovir (PMPA), non toxiques pour la cellules et actifs contre HIV-1, HIV-2 et HBV en culture de cellules infectées. Ces composés, baptisés Adethiovir et Tenothiovir, ont été synthétisés selon une méthode originale et ont fait l'objet d'un dépôt de brevet. Nous avons synthétisé les formes diphosphates correspondantes : incorporés par la RT, terminateurs de chaîne, ils contournent la résistance associée au mutant K65R. Notre objectif est donc de les pousser plus loin dans le « pipe-line » du développement de médicaments antiviraux. / The Human Immunodeficiency Virus type 1 and type 2 (HIV-1 and HIV-2) and Hepatitis B (HBV) constitue a special interest in public health. Indeed, it is estimated that more than 33 million people infected with HIV worldwide and 360 million with HBV. Reverse transcriptase (RT) is an enzyme required for their replication and is therefore a key target for antiviral drugs. Among the NRTI marketed, nucleotide analogues like acyclic phosphonates, such as adefovir (Hepsera ®, Gilead) and Tenofovir (VIREAD ®, Gilead) as a prodrug form, have revolutionized the treatment against HBV and HIV. With the emmergence of resistant virus, there is a need to develop new antiviral compounds that are targetting especially these to optimize antiviral combination therapies. For this purpose, we designed analogues thiophosphonates derivatives Adefovir (PMEA) and tenofovir (PMPA), that are non-toxic in cells and active against HIV-1, HBV and HIV-2 infected cell cultures. These compounds, named Adethiovir Tenothiovir, were synthesized according to an original method and were the subject of a patent. We synthesized the corresponding diphosphates forms: incorporated by RT, chain terminators, they bypass the resistance associated with the K65R mutant. Our goal is to push them further in the "pipeline" development of antiviral drugs.

L'effet protecteur des HDL sur les pathologies cardio-vasculaires est principalement attribué à leur rôle central dans le Transport Retour du Cholestérol (TRC). Ce processus assure l'efflux du cholestérol excédentaire des cellules périphériques vers le foie, au niveau duquel il est éliminé dans les sécrétions biliaires. Dans ce contexte, notre équipe a identifié à la surface des cellules hépatiques la présence d’un complexe enzymatique, très proche de l’ATP synthase mitochondriale, comme étant un récepteur de haute affinité pour l’apoA-I (protéine majoritaire des HDL). Cette ATP synthase de surface, également appelée ecto-F1-ATPase, joue un rôle clé dans l’endocytose hépatique des HDL. En effet, la liaison de l’apoA-I stimule l’activité ATPasique de l’enzyme, entrainant la production d’ADP extracellulaire puis l’activation spécifique du récepteur nucléotidique P2Y13, aboutissant in fine à l’endocytose des HDL. Ainsi, l’équipe a montré le rôle clé de la voie ecto-F1-ATPase/P2Y13 dans l’endocytose hépatique des HDL et par conséquent dans les effets protecteurs de ces derniers dans l’athérosclérose.Les travaux de thèse présentés ici visent à déterminer les mécanismes de régulation de cette ecto-F1-ATPase. Compte tenu de l’importance de la régulation des taux d’ADP et d’ATP extracellulaires dans l’endocytose des HDL, nous nous sommes intéressés dans un premier temps aux acteurs moléculaires qui pourraient réguler le métabolisme nucléotidique à la surface cellulaire. Nous avons mis en évidence la présence, à la surface des cellules HepG2, de l’adénine nucléotide translocase (ANT), une autre protéine classiquement localisée à la mitochondrie. Nous avons montré que l’ecto-ANT est impliquée dans la régulation des taux des nucléotides adényliques ADP et ATP extracellulaires et que son fonctionnement est lui-même dépendant du taux de ces derniers dans le milieu extracellulaire. / The cardioprotective effect of high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) is mostly attributed to their metabolic functions in reverse cholesterol transport (RCT), a process whereby excess cell cholesterol is taken up from peripheral cells and processed in HDL particles, and later delivered to the liver for further metabolism and bile excretion. ATP synthase, classically known to be located in the mitochondrial inner membrane, has been unexpectedly found expressed at the plasma membrane of hepatocytes, as a receptor for apoA-I, playing a role in HDL-cholesterol uptake. On hepatocytes, apoA-I binding to ecto-F1-ATPase stimulates extracellular ATP hydrolysis into ADP, which subsequently activates a P2Y13-mediated HDL endocytosis pathway. The strict dependence of HDL endocytosis on extracellular ADP level led us to study first, whether other plasma membrane proteins than ecto-F1-ATPase could regulate extracellular ADP level. We highlighted the presence on hepatocytes cell surface of Adenine Nucleotide Translocase (ANT), another transmembrane protein of the inner mitochondrial membrane. We showed that ecto-ANT activity could increase or reduce extracellular ADP level, depending on the extracellular ADP/ATP ratio. Furthermore, we demonstrated that pharmacological inhibition of ecto-ANT activity increased extracellular ADP level when ecto-F1-ATPase was activated by apoA-I. This increase in the bioavailability of extracellular ADP accordingly translated into an increase of HDL endocytosis in human hepatocytes. We then sought to explore the molecular mechanisms involved in targeting ecto-F1-ATPase to the plasma membrane. Indeed, F1-ATPase ectopic expression at the plasma membrane has been described on several cell types and has been related to several physiological and pathophysiological processes however, the pathway involved in its transport to the cell surface remains unknown.