Les mélanomes malins (MM) constituent le deuxième type de cancer le plus fréquent chez les jeunes adultes canadiens (entre 20 et 44 ans) ainsi qu’un des rares cancers dont l’incidence augmente annuellement. À moins que les MM ne soient excisés à temps par chirurgie, les chances de survie des patients sont pratiquement nulles puisque ce type de tumeur est très réfractaire aux traitements conventionnels. Il est bien connu que l’exposition aux rayons ultraviolets (UV), induisant des photoproduits génotoxiques, est une déterminante majeure dans l’acquisition de MM. À cet effet, la réparation par excision de nucléotides (NER) est la ligne de défense principale contre le développement des mélanomes puisqu’elle est la voie de réparation prépondérante en ce qui a trait aux dits photoproduits. Malgré cela, la contribution potentielle de défauts de la NER au développement des MM dans la population normale n’est toujours pas bien établie. Notre laboratoire a précédemment développé une méthode basée sur la cytométrie de flux qui permet de mesurer la NER en fonction du cycle cellulaire. Cette méthode a déjà mise en évidence qu’une déficience de l’activité de la protéine ATR peut mener à une déficience de la NER exclusive à la phase S dans des fibroblastes humains. Pareillement, nous avons démontré que plusieurs lignées cellulaires cancéreuses modèles comportent une déficience en NER en phase S, suggérant qu’une telle déficience puisse caractériser certains types de cancers. Nous avons voulu savoir si une déficience en NER en phase S pouvait être associée à une proportion significative de mélanomes et si le tout pouvait être attribuable à une diminution de l’activité d’ATR. Nos objectifs ont donc été de : (i) mesurer l’efficacité de la NER en fonction du cycle cellulaire dans les MM en comparaison avec les mélanocytes primaires, (ii) vérifier si le niveau d’activité d’ATR corrèle avec l’efficacité de la NER en phase S dans les lignées de MM et (iii) voir si un gène fréquemment muté dans les mélanomes (tels PTEN et BRAF) pouvait coopérer avec ATR pour réguler la NER en phase S dans les mélanomes. Nous avons démontré que 13 lignées de MM sur 16 ont une capacité grandement diminuée à réparer les photoproduits induits par UV spécifiquement en phase S. De plus, cette déficience corrèle fortement avec une réduction de l’activation d’ATR et, dans plusieurs lignées de MM, avec une phosphorylation d’Akt plus importante. L’utilisation d’ARN interférent ou d’un inhibiteur du suppresseur de tumeurs PTEN, a permis, en plus d’augmenter la phosphorylation d’Akt, de réduire la réparation des photoproduits et l’activation d’ATR dans les cellules en phase S. En addition, (i) l’expression ectopique de la protéine PTEN sauvage dans des lignées déficientes en PTEN (mais pas d’une protéine PTEN sans activité phosphatase) ou (ii) l’inhibition pharmacologique d’Akt a permis d’augmenter la réparation en phase S ainsi que l’activation d’ATR. En somme, cette étude démontre qu’une signalisation d’ATR dépendante de PTEN/Akt amenant à une réparation déficiente des photoproduits génomiques causés par les UV en phase S peut être déterminante dans le développement des mélanomes induits par UV. / Malignant melanoma (MM) is the second most frequent neoplasia among young Canadian adults (aged 20-44); moreover the incidence of this disease continues to rise annually at an alarming rate. Unless primary melanoma is diagnosed early and promptly resected the patient prognosis is dismal since this deadly tumour type metastasizes extremely aggressively and is highly refractory to conventional treatment protocols. It is well established that exposure to UV light, and subsequent induction of genotoxic DNA photoproducts, is a primary determinant in the initiation of MM. Furthermore nucleotide excision repair (NER) clearly represents a critical frontline defence against MM because it is the only human pathway designed to remove the aforementioned DNA photoproducts. Despite this, the potential contribution of NER defects to sporadic MM development in the general population has remained unclear. Our laboratory previously developed a novel flow cytometry-based assay to evaluate the efficiency of NER as a function of cell cycle. This method was employed to demonstrate that functional ATR kinase is strictly required for NER during S phase in primary human fibroblasts. Intriguingly we also reported that many model tumour cell lines are deficient in NER uniquely in S phase populations, raising the possibility that such a defect might be characteristic of certain types of cancers. We therefore hypothesized that a significant proportion of human MM cell lines may exhibit reduced NER capacity specifically during S phase, and that this in turn might be attributeable to reduced ATR signaling. To test this hypothesis, three major specific aims were proposed: (i) To measure the efficiency of NER as a function of cell cycle among a panel of human MM cell lines and in primary melanocytes; (ii) To investigate whether any correlation exists between NER status and ATR activity during S phase in human MM cell lines; (iii) To investigate whether frequently mutated genes in melanoma (eg., PTEN, BRAF) might cooperate with ATR to regulate S phase-specific NER in MM cell lines. We were able to demonstrate that, in fact, 13/16 MM cell lines display remarkably diminished capacity to remove UV-induced DNA photoproducts specifically during S phase. Furthermore this defect correlates strongly with reduced activation of ATR kinase and, for a majority of MM, higher Akt phosphorylation levels. RNAi-mediated knockdown of the PTEN tumour suppressor, while stimulating Akt phosphorylation as expected, also engenders reductions in both photoproducts repair and ATR activation in S phase cells. In addition, (i) ectopic expression in PTEN-null strains of wild type PTEN but not of PTEN variants deficient in phosphatase activity, or (ii) pharmacological inhibition of Akt, significantly rescue S phase-specific repair as well as ATR activation. Our data indicate that reduced PTEN/Akt-dependent ATR signaling leading to defective repair of UV DNA photoproducts uniquely during S phase may represent an heretofore unrecognized major determinant in sunlight-induced melanoma development.

Les découvertes de traces de vie primitive, fossiles et biosignatures, suggèrent que celle-ci serait apparue il y 4,3 à 3,7 milliards d’années. Cette émergence est le résultat d’étapes menant des plus simples molécules organiques aux premières formes de vie unicellulaire.Ce travail de thèse examine l’hypothèse de l’apparition de la vie dans un environnement hydrothermal, dans lequel la pression, les gradients de température et de pH, la diversité des surfaces minérales et l’abondance d’énergie chimique auraient permis l’accumulation et la complexification de la matière organique. Il s’intéresse particulièrement aux étapes de concentration des nucléotides et de polymérisation des acides aminés, respectivement briques élémentaires du matériel génétique et des protéines, inhérentes au vivant.Cette thèse présente d’abord une étude des interactions de surfaces entre nucléotides en solution et minéraux en feuillets en conditions contrôlées de température, de pH et de salinité. Dans une deuxième partie, elle récapitule les résultats obtenus par l’observation in situ de l’effet des conditions hydrothermales et des surfaces minérales sur la polymérisation des acides aminés non activés.Ce travail suggère que les minéraux en feuillets, et plus particulièrement les argiles gonflantes, augmentent la concentration locale en nucléotide de trois ordres de grandeurs au moins en présentant un comportement très dépendant des conditions physicochimiques du milieu. De plus, il reconfirme l’importance de la température dans la polymérisation des acides aminés en solution, mais montre également que la pression et la présence de surfaces minérales ont une influence majeure sur la réactivité de ces molécules. Les environnements hydrothermaux semblent donc favorables à la concentration, la préservation et la complexification de la matière organique, étapes essentielles à l’émergence des propriétés du vivant. / The discovery of traces of primitive life, such as fossils and biosignatures, suggests that life may have appeared some 4.3 to 3.7 billion years ago. This emergence resulted from a chemical evolution with steps leading from simple organic molecules to the first single-celled organisms.This thesis tests the hypothesis of a hydrothermal origin of life. In such geochemical settings, pressure, temperature and pH gradients, mineral surfaces diversity and abundant chemical energy would have favored the accumulation and complexification of organic matter. This work focuses on the concentration of nucleotides and the polymerization of amino acids, which are the building blocks of genetic material and proteins, respectively.The first part of this thesis presents a large study of the interactions between nucleotides in aqueous solutions and phyllosilicates under controlled conditions of temperature, pH and salinity. The second part describes an in situ study of the effects of hydrothermal conditions and mineral surfaces in the polymerization of non-activated amino acids.This work suggests that sheet minerals, and especially swelling clays, increase the local concentration of nucleotides by three orders of magnitude and exhibit an adsorption behavior that is very dependent on the physical and chemical conditions of the environment. Moreover, this work confirms that the polymerization of amino acids in aqueous solutions is sensitive to temperature and it also underlines that pressure and mineral surfaces have a major role on the reactivity of these molecules. Hydrothermal environments thus favor the concentration, preservation and complexification of organic matter. These are crucial steps for the emergence of the properties of life in the chemical evolution.

Lors d’uvéite non infectieuse (UNI), des événements environnementaux vont provoquer une rupture de la tolérance immune périphérique et une activation des cellules résidentes oculaires. Plusieurs données attestent de l’importance du rôle joué par les signaux de danger lors de ces deux phases clefs d’activation pathologique. Si une place capitale a été donnée aux signaux de danger exogènes, notamment microbiens, l’importance des signaux de danger endogènes commence à émerger. A ce titre, les nucléotides constituent une famille importante de signaux de danger endogènes puisque en situation pathologique, ils vont être libérés de façon massive dans l’espace extracellulaire où ils peuvent avoir de nombreux effets en activant des récepteurs P2X et P2Y. Le but de ce travail est d’investiguer si les récepteurs P2Y2 jouent un rôle de récepteurs de danger lors d’UAI. Pour ce faire, nous avons d’abord étudié in vitro l’effet des nucléotides extracellulaires sur la production d’IL-8 (cytokine connue pour son rôle chimiotactique lors d’UNI) par des cellules de l’EPR. Nous avons pu montrer que les nucléotides ATPγS, UTP et UDP, stimulent la sécrétion d’IL-8 tant basale qu’induite par le TNFα en activant la voie intracellulaire d’ERK1/2 via l’activation des récepteurs P2Y2 et P2Y6. Ensuite, in vivo, nous avons comparé le développement d’uvéites autoimmunes expérimentales entre des souris génétiquement déficientes pour le récepteur P2Y2 (P2Y2-/-) et des souris sauvages (P2Y2+/+) et avons pu montrer que le groupe P2Y2-/- était moins affecté par la maladie que le groupe sauvage contrôle. De même, après transfert adoptif de lymphocytes T autoréactifs semi-purifiés, les souris P2Y2-/- étaient moins malades que les souris P2Y2+/+ et le transfert adoptif de lymphocytes T autoréactifs semi purifiés de souris P2Y2-/- induisait moins de maladie que le transfert adoptif de cellules contrôles. En accord avec ces dernières données, nous avons mis en évidence que les LT autoréactifs semi-purifiés issus des souris P2Y2-/- immunisées proliféraient moins et sécrétaient moins de cytokines proinflammatoires que ceux issus des souris P2Y2+/+. Une série de co-cultures nous a permis de démontrer que ce déficit de prolifération provenait d’un défaut au niveau des CPA des souris P2Y2-/-. En conclusion, notre travail de thèse a mis en évidence que la stimulation des récepteurs P2Y augmente l’activation de l’EPR et des lymphocytes T autoréactifs, favorisant ainsi le développement d’UNI. / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les nucléotides, et tout particulièrement l’ATP, sont capables de moduler la fonction de l’un des principaux acteurs de la réponse immunitaire à savoir les cellules dendritiques (DC). Les DC expriment à leur surface de nombreux récepteurs P2X et P2Y dont le P2Y11, couplé à la voie de l’AMP cyclique (AMPc) et impliqué dans l’immunomodulation. L’ATP est capable, par son action sur le P2Y11, d’induire une semi-maturation des DC caractérisée entre autre par une diminution de la sécrétion d’IL-12 et une augmentation de la sécrétion d’IL-10. De plus, des données antérieures obtenues au laboratoire montrent que l’ATP confère également des propriétés immunosuppressives aux DC en stimulant l’expression de la thrombospondine-1 (TSP-1) et de l’indoléamine-2,3-dioxygénase (IDO).<p><p>Dans ce contexte, notre projet visait à établir un profil d’expression génique en réponse à l’ATP dans des DC humaines issues de monocytes (MoDC) afin d’avoir une vue globale de l’action de l’ATP sur les DC. Dans un premier temps, nous avons donc réalisé une étude cinétique comparant les profils d’expression génique en réponse à l’ATPγS, un agoniste plus stable que l’ATP, et à la prostaglandine E2 (PGE2), un activateur de l’AMPc induisant une semi-maturation des DC, par la technique de microarray. L’analyse de ces profils a mis en évidence une action précoce et large de l’ATPγS sur les MoDC. Un grand nombre de régulations obtenues ont confirmé les effets déjà connus de l’ATP sur les DC. Par ailleurs, nous avons confirmé par différentes techniques plusieurs nouvelles cibles de l’ATP impliquées dans l’inflammation et la réponse immunitaire (ex. CSF-1, NRP-1, VEGF).<p><p>En analysant plus en détail ces profils, nous avons observés la régulation de plusieurs gènes dont VEGF, AREG, EREG et HB-EGF, intervenant dans les processus d’angiogenèse et de tumorigenèse. Parmi ceux-ci, le gène AREG codant pour l’amphiréguline, un ligand de l’EGF récepteur (EGFR) était le gène le plus régulé dans notre profil microarray. Pour la première fois, nous avons démontré que les DC traitées à l’ATPγS en présence de LPS constituaient une importante source d’amphiréguline capable de stimuler la croissance de cellules musculaires lisses et de cellules tumorales LLC (Lewis Lung Carcinoma) in vitro. <p>Parallèlement, nous avons étudié l’implication des cellules dendritiques traitées à l’ATPγS sur la croissance tumorale in vivo. Pour ce faire, nous avons coinjecté, à des souris C57 black/6, des cellules tumorales LLC avec des surnageants issus de BMDC traitées au LPS ou au LPS+ATPγS. De cette façon, nous avons mis en évidence que des surnageants issus de BMDC traitées au LPS+ATPγS induisaient une augmentation significative de la masse tumorale par rapport aux surnageants issus de BMDC traités au LPS seul. Au moyen d’un anticorps bloquant anti-amphiréguline, nous avons démontré que cette augmentation de la masse tumorale était due à l’importante sécrétion d’amphiréguline par les BMDC traitées au LPS+ATPγS. De plus, nous avons observé une augmentation du nombre de vaisseaux positifs pour l’α-SMA, un des marqueurs des cellules musculaires lisses, dans les tumeurs issues de la coinjection de cellules LLC avec des surnageants de BMDC traitées au LPS+ATPγS. Pour finir, nous avons montré que les DC au sein des tumeurs LLC expriment non seulement le récepteur EGFR mais également l’amphiréguline. Ces différents résultats observés mettent en avant l’importance de l’ATP extracellulaire dans la croissance tumorale par son action sur les DC. <p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Notre travail a permis tout d’abord d’investiguer les effets des nucléotides extracellulaires sur les cellules<p>dendritiques (DCs) qui sont des cellules présentatrices d’antigènes capables d’initier et de réguler la<p>réponse immunitaire. Afin d’avoir une vue globale de l’action des nucléotides extracellulaires sur les DCs,<p>un profil d’expression génique de l’ATPgS – dérivé stable de l’ATP - a été réalisé par microarray dans les<p>cellules dendritiques dérivées de monocytes (MoDCs).<p>Notre groupe a préalablement montré que malgré que l’ATP est considéré comme un signal de danger, il<p>confère des propriétés immunosuppressives aux DCs (Marteau et al, 2005). Nous nous sommes focalisés<p>sur des régulations géniques pouvant être mises en relation avec un action anti-inflammatoire de l’ATP.<p>Nous avons ainsi démontré que l’ATP était capable d’inhiber la sécrétion des chimiokines MCP-1 et MIP-<p>1a initiée par l’action du LPS, ce qui a pour conséquence de diminuer la capacité des DCs à recruter des<p>monocytes ou d’autres DCs. Ce travail a fait l’objet d’une publication en tant que premier auteur<p>(Horckmans et al, 2005).<p>Un grand nombre d’autres gènes régulés liés à la réponse immune et à l’inflammation a été identifiée<p>dans le profil microarray de l’ATPgS. Nous avions notamment pu identifier une augmentation de la<p>sécrétion de VEGF-A en réponse à l’ATP, amplifiée en présence de LPS. Cette régulation est extrêmement<p>intéressante au vu de l’action immunosuppressive du VEGF sur les DCs. Par ailleurs, cette régulation<p>pourrait constituer un lien entre les DCs et l’angiogénese. Ce travail a fait l’objet d’une publication en tant<p>que premier co-auteur dans la revue Journal of Immunology (Bles et al, 2007).<p>En conclusion, nos données nous ont ainsi permis de montrer que les nucléotides adényliques peuvent<p>avoir par leur action sur les cellules dendritiques une action anti-inflammatoire voire pro-angiogénique,<p>en inhibant le recrutement leucocytaire et une action immunosuppressive en stimulant la sécrétion de<p>VEGF.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La signalisation purinergique participe à de nombreux processus physiopathologiques dans le système cardiovasculaire. Alors que les nucléotides extracellulaires sont considérés comme des « signaux de danger » ; la NTPDase1(CD39), ectonucléotidase à l’origine de leur hydrolyse, permet de maintenir l’homéostasie vasculaire par ses actions anti-thrombotiques etimmuno-modulatrices. Le rôle de CD39 dans la fonction vasculaire liée à l’hypertension artérielle(HTA) reste méconnu. L’HTA, facteur de risque majeur de complications cardiovasculaires, est caractérisée par un remodelage structurel(hypertrophie, fibrose) et fonctionnel (hypercontractilité, dysfonction endothéliale) des vaisseaux, causées notamment par un stress oxydatif et une inflammation périvasculaire. L’objectif de notre projet a consisté à étudier l’évolution de CD39 ainsi que son rôle potentiel dans la condition vasculaire pathologique de l’HTA. Nous mettons en évidence une diminution de l’expression et de l’activité du CD39 vasculaire dans l’HTA. Une diminution de l’activité ADPase du CD39 soluble a également été observée au niveau circulant. L’étude des éléments à l’origine de cette diminution montre une sensibilité du transcrit vasculaire de CD39 à certaines cytokinespro- et anti-inflammatoires, mais également à une tension mécanique. Une étude in vivo du potentiel rôle de CD39 (souris déficientes pour le gène de CD39 (Entpd1) et traitement à l’apyrase) dans un modèle d’HTA à l’Angiotensine-II a également été réalisée. L’ensemble de ces données suggère qu’une diminution du CD39 vasculaire et circulant pourrait contribuer à majorer les altérations vasculaires contemporaines de l’HTA. / Purinergic signaling is involved in numerous physiopathological processes in cardiovascular system. While extracellular nucleotides are considered as « danger signals » ; the NTPDase1(CD39), ectonucleotidase responsible for their hydrolysis, preserves vascular homeostasis by itsanti-thrombotic and immunomodulatory actions.The role of CD39 in vascular function related to arterial hypertension remains unknown. Hypertension, the major risk factor of cardiovascular complications, is characterized by structural remodeling (hypertrophy, fibrosis) and functional (hypercontractility, endothelial dysfunction) of vessels caused in particular by perivascular oxidative stress and inflammation.Our aim was to investigate the evolution of CD39 expression / function and its potential contribution in the pathological vascular condition of hypertension. We highlighted a decrease invascular CD39 expression and activity in the context of hypertension. A decrease in soluble ADPase activity specific to CD39 was also observed in blood circulation. Investigation of elements responsible for this decrease reveals asensitivity of vascular CD39 transcription to several pro- and anti-inflammatory cytokines and to mechanical tension. In vivo study of potential role of CD39 (mice deficient for CD39 gene (Entpd1) and treatment with apyrase) in Angiotensin-II model of hypertension was also carried out. All these data suggest that a decrease in circulating and vascular CD39 may contribute to vascular changes associated with hypertension.

Les nucléotides, terme regroupant les nucléosides monophosphate, diphosphate et triphosphate, sont impliqués dans de nombreux processus cellulaires. Ils représentent les éléments constitutifs des acides nucléiques, fournissent de l'énergie à des réactions métaboliques, jouent le rôle de transporteurs et seconds messagers. L'exploration des pools nucléotidiques apparaît indispensable afin de connaître leur rôle précis dans des situations physiologiques ou pathologiques. Nous avons développé une méthode de dosage des nucléotides endogènes (formes mono-, di- et triphosphate) par extraction en ligne sur colonne WAX couplée à la LC-MS/MS. La séparation analytique est réalisée sur colonne Hypercarb, sans agent de paire d'ions dans la phase mobile. Grâce à l'utilisation d'un triple quadripôle et une ionisation en mode positif, les nucléotides endogènes sont identifiés sans équivoque, y compris ceux possédant la même masse molaire. L'extraction et la séparation des nucléotides sont réalisées en 20 min. L'ensemble de la méthode, en comptant la ré- équilibration des colonnes, dure 37 min. La méthode de dosage a été validée pour les formes mono- et triphosphate et est applicable à des séries d'une vingtaine d'échantillons biologiques. D'autre part, dans une étude pré-analytique basée sur les plans d'expériences, nous avons comparé les conditions de préparation d'échantillons en vue du dosage de nucléotides intracellulaires dans 4 lignées cellulaires : 2 adhérentes (Messa et NCI-H292) et 2 en suspension (RL et L1210). Nous avons montré que les conditions pré-analytiques optimales dépendent de la lignée cellulaire soulignant ainsi l'importance de cette phase dans l'analyse des nucléotides. Enfin, l'expérience et les connaissances acquises lors du développement de la méthode de dosage des nucléotides ainsi que la large palette de molécules analysables avec cette méthode (nucléosides, nucléotides sucrés, autres métabolites), nous ont permis de développer des collaborations dans le domaine de la cancérologie avec différentes équipes de recherche. Par exemple, nous avons étudié l'implication des pools nucléotidiques dans le stress réplicatif induit par le stress oxydant et dans la reprogrammation cellulaire observée dans les cellules cancéreuses. Ainsi, les informations apportées par notre approche analytique, complémentaires des autres approches utilisées, ont montré l'implication des pools nucléotidiques dans la tumorigénèse. En conclusion, ce travail a permis de développer une technique analytique et de mettre en place une méthode de travail pour le dosage des nucléotides endogènes dans différents milieux biologiques / Nucleotides, term including nucleoside mono-, di- and triphosphates, are endogenous compounds playing various roles in biology. They are components of nucleic acids, provide energy to metabolic reactions and act as carriers or second messenger. The study of endogenous nucleotides has become of great interest in physiological and pathological conditions. We developed a method for the quantification of endogenous nucleotides, using an on-line extraction on a WAX column coupled with LC-MS/MS. Analytical separation is performed on a Hypercarb column, without ion pairing agent in the mobile phase. The use of a triple quadrupole mass spectrometer following positive mode ionization allows the unambiguous identification of nucleotides presenting the same mass. Extraction and separation of nucleotides are achieved within 20 min and the method including re-equilibration of the two columns within 37 min. The method was validated for the quantification of nucleoside mono- and triphosphates, and could be applied to series of more than twenty biological samples. Secondly, in a study based on design of experiments, pre-analytical parameters influencing results of intracellular nucleotides were compared in four cell lines. We demonstrated that optimal pre-analytical parameters depend on cell lines. This clearly highlights the importance of pre- analytical conditions for the quantification of intracellular nucleotides to be as representative as possible of the real levels in cells. Then, thanks to experience acquired during the development and the validation of the analytical method, scientific collaborations have been established with several cancer research teams. For example, implication of nucleotide metabolism in replicative stress induced by oxidative stress or in the metabolic reprogramming in cancer cells was studied. Results obtained by our analytical approach were complementary to those obtained by other techniques. To conclude, our work consisted on the study of the entire workflow for the analysis of endogenous nucleotides in various biological samples

Dans un premier chapitre, nous avons présenté un historique succinct de la chimiothérapie antivirale et l'utilisation d'analogues nucléos(t)idiques. Nous nous sommes focalisés en particulier sur les nucléosides phosphonates acycliques (ANP) en tant qu'antiviraux potentiels. Dans un second chapitre, nous avons décrit la synthèse de β-céto, β-hydroxylamino et β-O-(benzyl)hydroxylamino ANP dérivés de l'adénine et de la cytosine. Les isomèrs (R) et (S)-β-hydroxy-ANP ont été préparés par dédoublement du racémique correspondant avec le (S)-MPA et l'attribution des configurations absolues a été effectuée par RMN et calculs de modélisation moléculaire. Nous avons aussi développé une méthodologie de synthèse de β-azido-ANP, ces derniers étant utilisés pour la préparation de β-amino-ANP par hydrogénation catalytique. Dans un troisième chapitre, nous avons présenté la synthèse des 2H-azirine et cis-aziridne-ANP et examiné lʹ ouverture de cycle comme voie d'accès à des ANP α,β-fonctionnalisés. Les propriétés biologiques de ces nouveaux ANP ont été évaluées en culture cellulaire sur un certain nombre de virus à ADN et ARN. / In the first chapter, we presented a brief history of antiviral chemotherapy and use of nucleos(t)ide analogues, especially acyclic nucleoside phosphonates as potential antiviral agents. In the chapter-II we have successfully synthesized ¦Â-keto, ¦Â-hydroxylamino and ¦Â-O-(benzyl)hydroxylamino ANPs of adenine and cytosine derivatives. Then (R) and (S)-¦Â-hydroxy-ANPs were prepared via chiral resolution of racemic ¦Â-hydroxy-ANPs with (S)-MPA and assignment of absolute configuration was achieved using NMR and molecular modeling studies. We also developed a methodology for the synthesis of ¦Â-azido-ANPs and those were used for the preparation of ¦Â-amino-ANPs by catalytic hydrogenation. In third chapter, we synthesized 2H-azirine and cis-aziridine-ANPs and explored their ring opening to functionalized ¦Á,¦Â-ANPs. The novel ANPs obtained during this study were evaluated for their inhibitory effect on a number of DNA and RNA viruses in cell culture experiments.

La voie de réparation par excision de nucléotides (NER) répare les lésions qui distordent la double hélice d’ADN notamment ceux induits par l’irradiation UV. Le NER est subdivisé en deux sous-voies : GG-NER (Global Genome Repair) et TC-NER (Transcription-Coupled Repair). La sous-voie GG-NER enlève les dommages à l’ADN dans l’ensemble du génome. La sous-voie TC-NER répare les dommages sur le brin transcrit qui interfèrent avec la progression de l’ARN Pol II. Les défauts de la voie NER peuvent conduire à l’apparition de pathologies graves. Par exemple, des mutations dans le gène XPG, codant une 3’ endonucléase impliquée dans la voie NER, peuvent mener au xeroderma pigmentosum (XP) associé ou non au syndrome de Cockayne (CS).Récemment, le laboratoire a découvert un lien fonctionnel entre Rad2, homologue chez la levure Saccharomyces cerevisiae de la protéine XPG humaine, et le Médiateur (Eyboulet et al., 2013). Le Médiateur est un complexe multiprotéique nécessaire à la régulation de la transcription dépendante de l’ARN Pol II. Cette étude a suggéré que le Médiateur est impliqué dans la sous-voie TC-NER en facilitant le recrutement de Rad2 au niveau des régions transcrites.Mon projet de thèse visait à étudier les mécanismes moléculaires qui lient la transcription et la réparation de l’ADN. Plus précisément, d’investiguer le lien fonctionnel entre le Médiateur et la machinerie du NER chez S. cerevisiae.Lors du TC-NER, l’ARN Pol II est le premier facteur signalant le dommage à l’ADN. De plus, le Médiateur et Rad2 interagissent avec l’ARN Pol II. Pour déterminer le lien fonctionnel entre ces composants, nous avons utilisé des approches de génétique et génomique dans les mutants de TFIIH (kin28), de l’ARN Pol II (rpb9) and du Médiateur (med17). Nos résultats nous ont permis de proposer un modèle dans lequel Rad2 est recruté au niveau des régions régulatrices enrichies par le Médiateur, et Rad2 est ensuite transféré au niveau des régions transcrites de manière dépendante à l’ARN Pol II. De plus, ces résultats suggèrent que le rôle du Médiateur dans la transcription est fortement lié à son rôle dans la réparation de l’ADN.Ensuite, nous avons montré que le lien entre le Médiateur et la machinerie du NER peut être étendu à d’autres protéines du NER notamment en démontrant une interaction physique entre le Médiateur et Rad1/XPF, Rad10/ERCC1 ou Rad26/CSB, en l’absence des UV. Tout comme Rad2, nous avons démontré que Rad1 et Rad10 n’ont pas de rôle majeur dans la transcription. Pour approfondir le lien entre ces protéines du NER et le Médiateur, des expériences de ChIP-sequencing ont été réalisées. Nous avons observé que le Médiateur est présent au niveau de certaines régions qui sont aussi enrichies par ces protéines du NER. Après l’induction des dommages par UV, les interactions entre le Médiateur et la machinerie du NER reste inchangées par rapport aux conditions en l’absence des UV. De plus grâce à nos expériences de ChIP, nous avons observé un changement de la liaison à la chromatine des protéines du NER et du Médiateur après l’irradiation aux UV. Des expériences de ChIP-sequencing seront réalisées pour avoir une vue globale de ces changements.En conclusion, nous avons solidifié le lien fonctionnel entre Rad2, le Médiateur et l’ARN Pol II par rapport à la réparation couplée à la transcription. Nous avons aussi démontré que le Médiateur interagit avec d’autres protéines du NER (Rad1/XPF, Rad10/ERCC1 et Rad26/CSB) et colocalise avec eux sur certaines régions de la chromatine. En somme, notre projet place le Médiateur à l’interface de la transcription et de la réparation de l’ADN, deux processus essentiels dont les défauts peuvent mener à des pathologies graves. / Nucleotide excision repair (NER) is a well conserved pathway that removes helix-distorting DNA lesions such as those arising upon UV irradiation. Global genome repair subpathway (GG-NER) removes the DNA lesions in the genome overall, and transcription-coupled repair (TC-NER) removes the DNA lesions interfering with Pol II progression through actively-transcribed regions. Defects in the NER pathway may lead to severe human pathologies. For instance, mutations in human XPG gene, encoding a 3’ endonuclease essential for NER, give rise to xeroderma pigmentosum (XP) sometimes associated with Cockayne syndrome (CS). Recently, the laboratory discovered a functional link between Rad2/XPG and Mediator in Saccharomyces cerevisiae (Eyboulet et al., 2013). Mediator is a large multisubunit complex essential for transcription regulation. We suggest that Mediator is involved in TC-NER by facilitating Rad2 recruitment to transcribed genes.My PhD work aimed at addressing the molecular mechanisms of this link between transcription and DNA repair, especially by investigating the functional interplay between Mediator and the NER machinery in yeast Saccharomyces cerevisiae.RNA Pol II is the first complex of TC-NER that encounters the DNA damage. Moreover, both Mediator and Rad2/XPG interact with Pol II. However, a functional interplay between all these components related to TC-NER remained to be determined. Using genetic and genomic approaches, in particular ChIP-sequencing in TFIIH (kin28), RNA Pol II (rpb9) and Mediator (med17) mutants, our work led us to propose a model where Rad2 shuttles between Mediator on upstream activating sequence (UAS) and RNA Pol II on transcribed regions (Georges, Gopaul et al., under review). Our results also suggest that Mediator functions in transcription and DNA repair are closely related.Moreover, we showed that Mediator’s link to NER can be extended to other NER proteins. Indeed, we identified a physical interaction between Mediator and other NER proteins, including Rad1/XPF, Rad10/ERCC1 and Rad26/CSB in the absence of UV irradiation. Similarly to Rad2, we demonstrated that Rad1 and Rad10 do not have a major role in yeast transcription. To further study the functional link between Mediator and the NER machinery, we obtained the genomic distribution of different NER proteins by ChIP-sequencing. We found that some promoter regions are co-occupied by Mediator and these NER proteins, and that relationships between Mediator and these NER proteins are more complex than between Mediator and Rad2. We also investigated if physical interactions between Mediator and NER proteins are modified after UV, we did not observe any significant change. Furthermore, we observed that the chromatin binding profiles of NER proteins and Mediator are modified after UV-irradiation. ChIP-sequencing will be carried out to get a genome-wide view of their chromatin binding profiles.In conclusion, we have strengthened the link between Rad2/XPG, Mediator and RNA Pol II, providing mechanistic insights into functional interplay between these components related to transcription-coupled repair, and showed that the link between Mediator and the NER machinery can be extended to other proteins. Taken together, our results suggest a close relation between Mediator functions in transcription and in NER, two fundamental processes dysfunction of which leads to human diseases.

La méthylation de l’uridine sur son carbone 5 est apparue au cours de l’évolution sous plusieurs formes. Tout d’abord, les thymidylate synthases permettent la synthèse de novo du dTMP, un précurseur essentiel de l’ADN des trois règnes du vivant. Deux familles de thymidylate synthases sont connues à ce jour : ThyA et la flavo-enzyme ThyX, codées par des gènes hétérologues et ayant des structures et mécanismes réactionnels radicalement différents. En outre, cette méthylation de l’uridine est apparue (probablement plus tard) sous forme de modifications post-transcriptionnelles des ARNt et ARNr. Cette thèse vise à questionner les contraintes évolutives ayant menés indépendament à ces quatres types de méthylation de l’uridine.Une première partie décrit l’identification d’une voie métabolique permetant la complémentation du phénotype d’auxotrophie pour la thymidine par des analogues nucléotidiques chez Escherichia coli. Une approche de biologie synthétique en vue d’établir une voie alternative de biosynthèse du thymidylate a aussi été mise en œuvre. Une technique de sélection de gènes de complémentation du phénotype d’auxotrophie pour la thymidine, issus de mutagénèse aléatoire, a pu être développée. Dans une seconde partie, des études biochimiques et sppectroscopiques ont été réalisées sur la méthyle-transférase flavine-dépendante TrmFO, responsable de la méthylation post-transciptionnelle de l’uridine 54 des ARNt de certains microorganismes.L’implication de certains résidus dans la fixation du substrat a pu être déterminée d’une part, et certains intermédiaires réactionnels potentiels ont été caractérisés spectralement d’autre part. Ces dernières observations s’appuient, en outre, sur des études en cours de spectroscopie résolue en temps et des simulations de dynamique moléculaire afin de mieux comprendre les flavoprotéines en général et les méthyle transférases flavine-dépendantes en particulier. / Enzymes catalyzing the methylation of uridine at its carbon 5 position have appeared independently in different forms across evolution. Thymidylate synthases ThyA and the flavoprotein ThyX catalyze the de novo synthesis of dTMP, an essential DNA precursor in the three domains of life. They are encoded by heterologous genes and have drastically different structures and reaction mechanisms. On the other hand, this uridine methylation is also performed by tRNA and rRNA post-transcriptional modification enzymes.This thesis assesses the question of the evolutionary constraints that have led independently to four kinds of uridine methylation. The first part describes the identification of a metabolic pathway allowing the complementation of thymidine auxotrophy by non-natural nucleotide analogs in Escherichia coli. A synthetic biology approach, aiming to establish an alternative pathway for thymidylate biosynthesis, was also implemented and a selection strategy for thymidine auxotrophy-complementing genes, could be developed.In a second part, biochemical and spectral studies where realised on the flavin-dependent methyltransferase TrmFO, responsible for the post-transcriptional methylation of uridine at the invariant position 54 of tRNA in several microorganisms. The involvement of specific amino acid residues in substrate fixation and in stabilization of potential reaction intermediates was demonstrated. Their spectral characterization supports previously proposed reaction schemes for flavin-dependent thymidylate forming enzymes. These observations are currently being pursued by parallel approaches combining time-resolved spectroscopy and molecular dynamics simulations, aiming to further our understanding of how flavin mediates the transfer of carbon molecules from folate to uracil rings.