To date, studies into sex determination and gonadal development have focused on the regulatory mechanisms governing development of the male or female phenotype. However, the formation of the testis and ovary from the bipotential gonad also present a fascinating model of tissue organisation which has been largely overlooked. When seeking to understand tissue organisation during gonadal development, the formation of testis cords takes center stage. However, despite a growing understanding of the cellular events in testis development, a number of key questions about the formation of testis cords remain unanswered. Specifically, I aimed to investigate the role of cell migration in testis organization, and the structure and morphogenesis of testis cords in three dimensions. To address these aims experimentally, I investigated the early morphogenesis of testis cords and the dependence of cord formation on cell migration from the mesonephros. I found that virtually all of the migrating cells express endothelial markers, indicating that endothelial, not peritubular myoid cells underlie the dependence of cord formation on cell migration. Further, disruption of endothelial cell migration and vascular organisation using a blocking antibody to VE-cadherin, also disrupted the development of testis cords. These data reveal that migrating endothelial cells are required for testis cord formation, consistent with increasing evidence of a broader role for vasculature in establishing tissue architecture during organogenesis. To address the question of cord structure and morphogenesis, I developed and applied a novel fluorescence-based three-dimensional modeling approach to show that Sertoli cells coalesce into irregular groups surrounding germ cells, and that these groups are remodeled to form highly regular toroidal loops, joined by a flattened plexus at the dorsal side. This plexus is punctured by blood vessels as they ingress from the mesonephros, and contracts during maturation to form part of the rete testis. Variation in cord number and position demonstrates that cord establishment is not a stereotypic process. However, a tightly regulated modeling mechanism must contribute to uniformity on cord diameter and orientation as these parameters remain consistent across samples of the same age. These data clarify questions of cord structure and organisation, establish that cord formation is a variable process, and demonstrate novel structural features within the network of testis cords. Finally, to investigate an in vivo model where vascularisation and cord formation may be disrupted, I analysed gonads from embryos lacking Cited2. Consistent with a previous study, I found that testis development was delayed in Cited2-/- gonads, but found that despite the reported transcriptional recovery after the delay, testis vascular and cord structure was permanently disrupted. To investigate the defects in cord formation I assayed cell migration and found that migration was not disrupted in XY gonads, or mesonephroi lacking Cited2. However, ectopic cell migration was observed in the XX gonad in a dose-dependent response to loss of functional Cited2 alleles. Correspondingly, the female pathway was initially delayed but rallied for a late recovery, implicating Sf1 in the initiation of ovarian differentiation. These data underscore the fragility of the molecular control of sex determination as absence of Cited2 in the male permanently disrupts testis morphology, whereas in the female, promoters of the male pathway are not sufficiently suppressed. From these studies I construct an integrated model of testis cord formation and conclude that testis cord formation is a novel form of tubulogenesis. This morphogenesis is unique and offers insights into cell and tissue organisation, vascular interactions in organogenesis, and mechanisms of tube formation. Further study of cord formation is likely to lead to a broader understanding of tissue morphogenesis during development.

The establishment and germination in vitro can supply a high amount of explants to develop morphogenesis protocols necessary for flowering induction in vitro, haploid and double-haploid plant production, clonal propagation, somatic embryogenesis among other applications. The objective was to develop protocols for the establishment and germination in vitro of bottle gourd (Lagenaria siceraria (Mol.) Standl.) and squash (Cucurbita pepo L.) species to effort morphogenesis studies. Seed disinfection treatments were done with ethanol 70% and NaOCl. Seed germination in vitro was evaluated changing medium-osmotic pressure, light availability, tegument and auxin presence, imbibition s time and scarification methods. Cotyledonary explants were used to induce direct organogenesis. Apical and nodal segments were grown in MS medium without growth regulators. Bottle gourd seeds did not germinate in culture medium, but it occurred on four layers of germitest paper and distilled water in the proportion of 1:7.5 (w/w). Light is not necessary for bottle gourd seed germination. Osmotic pressure reduction did not increase bottle gourd and squash germination. Bottle gourd apical and nodal segments regenerate in culture medium without growth regulators. Cotyledonary explants of bottle gourd and squash induce aerial growth, but in a low proliferation rate / O estabelecimento e a germinação in vitro suprem explantes em grande quantidade para a organização de experimentos em morfogênese, a qual apresenta muitas aplicações, tais como a indução de flores in vitro, a obtenção de plantas haplóides e duplo-haplóides, a propagação clonal em massa, a embriogênese somática, entre tantas outras. O objetivo deste trabalho foi desenvolver protocolos que permitam o estabelecimento e a germinação in vitro das espécies de porongo (Lagenaria siceraria (Mol.) Standl.) e mogango (Cucurbita pepo L.) para subsidiar pesquisas em morfogênese. Foram realizados testes com álcool 70% e NaOCl (Hipoclorito de sódio) para a desinfestação de sementes e investigados vários fatores envolvidos na germinação in vitro, tais como pressão osmótica, fotoblastismo, presença do tegumento, adição de auxinas, tempo de embebição e escarificação. Explantes cotiledonares foram utilizados para a indução de organogênese direta. Ápices caulinares e segmentos nodais foram cultivados em meio MS sem a adição de reguladores de crescimento. Nenhum dos tratamentos utilizados foi eficiente para permitir a germinação de sementes inteiras de porongo em meio de cultura, porém houve germinação em papel germitest umidecido com 7,5 vezes a massa do papel. Não foi verificado fotoblastismo para o porongo. A redução da pressão osmótica não aumentou o percentual de germinação de porongo e mogango. Ápices caulinares e segmentos nodais de porongo regeneram sem a adição de reguladores de crescimento. Explantes cotiledonares podem ser utilizados para a indução de brotações adventícias, em porongo e mogango, porém a taxa de proliferação é baixa

O crescente aumento no uso da micropropagação de teca como forma de produção de clones com qualidades genotípicas e fenotípicas selecionadas a partir de árvores de elite, determinou a importância desse método, pois origina plantações com maior qualidade e uniformidade, agregando maior valor ao preço da madeira no mercado. O uso de sementes para a obtenção de mudas é uma técnica menos onerosa, porém resulta em plantas com tamanhos desiguais e não há um padrão na qualidade da madeira, essa técnica depende também da época de produção de sementes e, portanto é restrita a um período do ano. A micropropagação permite a clonagem em larga escala das árvores de elite em tempo e espaço reduzidos, podendo ser realizada em qualquer época do ano, além disso, permite a formação de mudas totalmente livres de pragas e patógenos. Faz-se necessário, maiores estudos com meio de cultura para Tectona grandis, pois os materiais relacionados a esse assunto são escassos. Para que a técnica do cultivo in vitro da teca seja incrementada, objetivou-se nesse experimento, otimizar o crescimento dos explantes de três clones diferentes, testando a eficiência de 6 meios de cultura com diferentes formulações nutricionais e constatar qual deles apresenta a melhor resposta para cada clone. O estudo contou com 6 tratamentos (MS, Básico, M1, M2, M3 e M4), durante oito épocas de avaliação (0, 7, 14, 21, 28, 35, 42 e 49 dias), para três clones de Tectona grandis (61, 62 e 68), com três repetições por tratamento/clone, utilizando o delineamento experimental inteiramente casualizado. A avaliação do crescimento foi feita por meio do peso de matéria fresca (PMF), matéria seca (PMS) e a taxa de crescimento relativo (TCR) proporcionado pelos meios. O PMF foi usado para obtenção do PMS e cálculo da TCR. Baseado nos valores do PMS obtidos, para o clone 61, constatou-se a formulação do meio Básico (PMS = 0,38 g), como a mais eficiente. Para o clone 62, o meio mais responsivo foi M4 (PMS = 0,47 g) e no clone 68, destacou-se o meio M3 (PMS = 0,71 g). Quanto a TCR, não foi encontrada diferença estatística significativa para nenhum dos 6 meios de cultura levando-se em conta os três clones. / The increasing use of teak micropropagation as a way of producing clones with genotypic and phenotypic qualities selected from elite trees, established the importance of this method, it leads to higher crop quality and consistency, adding more value to the price of wood business. The use of seeds to obtain seedlings has a less cost, but it results in plants with unequal sizes and wood quality without a pattern. This technique also depends on the time of seed production and therefore is restricted to a year period. Micropropagation allows cloning elite trees in large-scale and reduced time and space. It can be performed at any time of year, in addition, allows the formation of plants totally free of pests and pathogens. It is necessary more studies with culture medium for Tectona grandis, because the materials related to this subject are scarce. To increase the technique of teak in vitro cultivation, this experiment aimed to optimize the growth and development of explants from three different clones, testing the effectiveness of six culture media with different nutritional formulations and find which one offers the best answer to each clone. The study included six treatments (MS, Basic, M1, M2, M3 and M4) for eight periods (0, 7, 14, 21, 28, 35, 42 and 49 days) for three clones of Tectona grandis (61, 62 and 68) with three replicates per treatment/clone, in a randomized experimental design. The growth assessment was performed by the fresh matter weight (FMW), dry matter weight (DMW) and relative growth rate (RGR) provided by the media. The FMW was used to obtain the DMW and to calculate RGR. Based on DMW values obtained for clone 61, was found that the formulation of Basic medium (DMW = 0.38 g) was the most efficient. For clone 62, the most responsive medium was M4 (DMW = 0.47 g) and to clone 68, M3 (DMW = 0.71 g) was the highlighted medium. As the RGR, it was found no statistically significant difference for any of the six culture media taking into account the three clones.

A família Bromeliaceae apresenta importância ecológica e econômica, desta forma, o desenvolvimento de protocolos para a micropropagação de espécies dessa família, faz-se necessário, a fim de suprir sua demanda comercial e mesmo ecológica. A escolha do meio de cultura e do explante utilizado durante a micropropagação são fundamentais para um protocolo eficaz. Nesse contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar as diferenças quantitativas e qualitativas no desenvolvimento de explantes de Neoregelia sp em meios de cultura e monitorar as vias morfogênicas dos propágulos obtidos em explantes foliares. Para tanto, brotos de microcepas e explantes foliares procedentes de um micro jardim clonal, foram transferidos para os meios de cultura de multiplicação MS, ½ MS e WPM, todos suplementados com 0,050 mg.L-1 ANA e 0,50 mg.L-1 de BAP, onde foram mantidos por 120 dias e submetidos a diversas análises morfofisiológicas. Paralelamente, explantes foliares foram mantidos em meio de cultura MS de multiplicação para o monitoramento das vias morfogênicas durante os processos regenerativos. Para os experimentos com brotos de microcepas verificou-se que o meio de cultura MS proporcionou a melhor taxa de multiplicação, maior crescimento dos brotos, obtendo os valores mais elevados de peso de matéria fresca e seca, além disso, apresentaram maior acúmulo de nitrogênio total e proteico. No entanto, os meios de cultura ½ MS e WPM promoveram uma taxa de multiplicação semelhante a do MS, mas com brotos menores e menos vigorosos, porém, mais homogêneos, com isso, na dependência do objetivo do cultivo in vitro, não deve ser desconsiderada a possibilidade de utilização dos meios de cultura ½ MS e WPM. Os explantes foliares não se desenvolveram bem no meio de cultura WPM, não havendo diferença entre os meios MS e ½ MS, visto que ambos apresentaram resultados satisfatórios. As análises histológicas e histoquímicas identificaram células parenquimáticas, que atuam como células-tronco, manifestando capacidade morfogênica para toti ou pluripotência, dando origem respectivamente a embriões somáticos e gemas adventícias, em resposta aos estímulos in vitro. / The Bromeliaceae family has an ecological and economic importance, therefore, the protocols development for micropropagation of species of this family becomes necessary in order to meet its business and even its ecological demand. The choice of culture medium and the explant used during micropropagation are essential for an effective protocol. Thus, the aim of this study was to evaluate the quantitative and qualitative differences in the explants development of Neoregelia sp in the culture media and monitor the morphogenetic pathways of obtained propagules from leaf explants. Consequently, shoots and leaf explants coming from microcloning garden were transferred to the MS, ½ MS and WPM multiplication culture media, all supplemented with 0.050 mg.L-1 NAA and 0.50 mg.L-1 BAP, where they were held for 120 days and submitted to morphological and physiological analysis. Therefore, leaf explants were kept on MS-medium multiplication for monitoring morphogenetic pathways during the regenerative processes. Furthermore, MS medium showed the best multiplication rate for the sprouts of the microstumps, increased growth of shoots, obtaining the highest values of fresh and dry matter weight, and also showed higher accumulation of total nitrogen and protein. However, the ½ MS and WPM culture media promoted a similar multiplication rate to the MS medium, with the development of the smaller and less vigorous shoots, but with greater homogeneity. This way, depending on the purpose of in vitro culture, their use in the micropropagation for this species should not be disregarded. The leaf explants are not well developed in WPM medium, and don\'t had significant difference between the MS and ½ MS culture medium, as both showed satisfactory results. The histological and histochemical analysis identified the presence of the parenchymatic cells, which act as stem cells, expressing morphogenic ability for toti or pluripotency, leading respectively to somatic embryogenesis or adventitious organogenesis in response to in vitro stimuli.

A transformação genética vem sendo, cada vez mais, incorporada em programas de melhoramento genético de diversas espécies. Esta técnica permite a incorporação de gene(s) exógeno(s) no genoma das plantas, modificando características específicas. Assim, apresenta-se como uma importante ferramenta de auxílio ao melhoramento convencional de citros, que possui uma série de limitações impostas pela sua biologia reprodutiva. Entretanto, a transformação genética requer o estabelecimento prévio de sistemas de regeneração de plantas in vitro como requisito essencial para sua execução. Portanto, o objetivo deste trabalho foi estabelecer as condições de cultivo in vitro para organogênese e transformação genética de laranja 'Hamlin', laranja 'Pera', laranja 'Valência', laranja 'Natal' (Citrus sinenis L. Osbeck) e limão 'Cravo' (Citrus limonia L. Osbeck), realizando-se a caracterização anatômica do processo. Buscou-se, inicialmente, otimizar o processo de organogênese e regeneração de plantas in vitro, a partir de segmentos de epicótilo. Explantes foram introduzidos em meio de cultura MT suplementado com BAP, nas concentrações 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 ou 4,5 mg.L -1 . Avaliaram-se o percentual de explantes responsivos e o número de brotações maiores ou iguais a 1,0 cm por explante responsivo. As brotações obtidas foram transferidas para meios de enraizamento, que se constituíram do MT + 1,0 mg.L -1 de NAA, MT + 1,0 mg.L -1 de IBA e MT na ausência de auxina. A concentração de BAP que melhor favoreceu a indução da organogênese foi 1,0 mg.L -1 para as laranjas doces e 0,5-2,5 mg.L -1 para o limão 'Cravo'. O meio de enraizamento com melhor resposta foi o MT + 1,0 mg.L -1 de IBA, para todos os cultivares estudados. Procedeu-se análise anatômica da organogênese in vitro, nas condições ótimas obtidas no trabalho anterior. As gemas adventícias tiveram origem endógena, formando-se a partir de zonas meristemáticas do câmbio vascular, caracterizando-se em organogênese direta. Desenvolveram-se, também, experimentos para estudar a transformação genética, via Agrobacterium, em segmentos de epicótilo de laranja 'Natal', laranja 'Valência' e limão 'Cravo'. Neste caso, estudou-se o tempo de inoculação com Agrobacterium, o período de co-cultivo, a utilização de acetoseringona e a temperatura de incubação durante o co-cultivo e o seccionamento do explante. Plantas transgênicas foram obtidas utilizando-se um período de inoculação de 20 minutos com Agrobacterium tumefaciens (EHA-105), co-cultivo por 3 dias na ausência de acetoseringona no meio de cultura e temperatura de co-cultivo de 23-27 °C. Finalmente, desenvolveu-se um estudo da indução da organogênese, análise histológica e transformação genética, a partir de segmentos internodais de plantas adultas das laranjas 'Hamlin', 'Pera', 'Valência' e 'Natal'. A organogênese foi induzida em meio de cultura DBA3, modificado, suplementado com 1,0 mg.L -1 de BAP e 0,5 mg.L -1 de NAA. Em função dos cortes histológicos concluiu-se que as gemas adventícias formaram-se na superfície do calo, o qual originou-se de sucessivas divisões celulares do câmbio, caracterizando-se em organogênese indireta. Plantas transgênicas de tecido adulto de laranja 'Hamlin' e laranja 'Valência' foram obtidas utilizando-se um dia de co-cultivo a 24 ºC, com ou sem o seccionamento do explante para Hamlin e apenas com o seccionamento do explante para Valência. / Genetic transformation has been more frequently associated with conventional genetic breeding programs of different species. It allows for the introduction of exogenous gene(s) into the plant genome, with the possibility of altering specific characteristics. Thus, it can be an important tool for Citrus conventional breeding programs, which present several limitations imposed by the characteristics of the reproductive biology of this genus. For the success of the transformation system, however, the previous establishment of an efficient in vitro regeneration system is required. The objective of this research was to define in vitro culture conditions for the organogenesis and genetic transformation of Hamlin, Pera, Valencia and Natal sweet oranges (Citrus sinensis L. Osbeck) and Rangpur lime (Citrus limonia L. Osbeck) with the anatomical characterization of the process. Initially, the optimization of the in vitro organogenesis process and plant recovery was attempted using epicotyl segments as explants. For organogenesis induction, the explants were placed in MT culture medium supplemented with BAP (0.0; 0.5; 1.0; 1.5; 2.0; 2.5; 3.0; 3.5; 4.0 or 4.5 mg.L -1 ). The percent of responsive explants and the number of adventitious shoots per explant (> 1.0 cm) were evaluated. The shoots were transferred to rooting media, consisting of MT medium supplemented with NAA or IBA, or absence of auxin. The best BAP concentration for organogenesis induction was 1.0 mg.L -1 for the sweet oranges and between 0.5 and 2.5 mg.L -1 for Rangpur lime. The best rooting medium was MT with 1.0 mg.L -1 IBA for all the cultivars. Anatomical analysis was done to describe the optimized culture conditions. Adventitious buds originated endogenously from meristematic regions of the vascular cambium, characterizing a direct organogenesis. Studies were also done to analyze the genetic transformation of the sweet orange cultivars Natal and Valencia and Rangpur lime via Agrobacterium. Several experiments were installed to define the period of Agrobacterium inoculation and co-cultivation, the presence or absence of acetoseryngone, the temperature of incubation and the explant condition (with or without a longitudinal cut). Transgenic plants were obtained using an inoculation period of 20 minutes and co-cultivation for 3 days at 23-27 °C in absence of acetoseryngone in the culture medium. Finally, a study of organogenesis induction, histological characterization and genetic transformation from internodal segments of mature plants of sweet orange cultivars Hamlin, Pera, Valencia and Natal was conducted. Organogenesis was induced in DBA3 modified medium supplemented with 1.0 mg.L -1 BAP and 0.5 mg.L -1 NAA. Histological analysis showed that the adventitious buds formed indirectly from the callus formed by successive cell divisions from the vascular cambium. Transgenic plants from mature tissue of Hamlin and Valencia sweet oranges were obtained using one day of co-cultivation at 24°C with or without the longitudinal sectioning of the explant for Hamlin and only when the explant was longitudinally sectioned for Valencia.

O óxido nítrico (NO) tem se mostrado um sinalizador presente em muitas fases do desenvolvimento vegetal e elemento essencial nas respostas aos estresses bióticos e abióticos em plantas. Entretanto, poucos estudos correlacionam esse radical à organogênese vegetal. Folhas de Ananas comosus (Bromeliaceae) podem ser consideradas um modelo interessante para o estudo da organogênese, pois sua região basal possui um conjunto de células que, sob cultivo in vitro e balanço adequado de certos reguladores de crescimento, dá início à proliferação celular e formação de meristemas adventícios. Primeiramente, formam-se estruturas denominadas protuberâncias que, depois, se desenvolvem em novos eixos caulinares, sem formação intermediária de calos. A relação ótima dos reguladores de crescimento para a indução da organogênese adventícia é 0,53 uM de ácido naftalenoacético e 8,87 uM de benziladeninapurina e sabe-se que o balanço hormonal entre auxinas e citocininas endógenas é alterado nesses explantes, encontrando-se um pico desses hormônios no terceiro dia da indução. Esse trabalho teve como objetivo verificar se o NO participaria da cascata de sinalizações que leva à organogênese adventícia, utilizando bases foliares de abacaxizeiro cultivadas in vitro. A quantificação do NO foi determinada pela técnica de quimiluminescência durante um período de 7 dias a partir da obtenção dos explantes. Essa produção foi dosada em fluxo contínuo com medições feitas a cada 10 segundos. O tratamento indutor de organogênese mostrou um aumento significativo na produção de NO em comparação aos explantes incubados em meio de cultura sem reguladores de crescimento, indicando uma possível participação do óxido nítrico no processo da organogênese. Houve um pico de NO no primeiro dia logo nas primeiras horas de cultivo em meio indutor. Além disso, foi realizada a dosagem de peróxido de hidrogênio (H2O2) e foi encontrada uma correlação com a produção de óxido nítrico durante a fase clara do fotoperíodo. A produção de H2O2 aumentou em seguida ao incremento de NO no primeiro dia de cultivo no meio de cultura com reguladores de crescimento. Finalmente, o tratamento com L-NAME mostrou ser a enzima NOS uma possível rota de síntese de NO, já que reduziu significativamente o número de novos meristemas adventícios e, conseqüentemente, de novos eixos caulinares formados após 60 dias de cultivo em meio não indutor da organogênese. A localização in situ do NO pareceu indicar que o aumento da produção estaria mais relacionado com células do parênquima foliar e dos feixes vasculares. Assim, esta pesquisa permitiu incluir temporalmente dois novos possíveis sinalizadores (NO e H2O2) à cascata de sinalização da organogênese adventícia em folhas de abacaxizeiro. A sinalização parece iniciar-se com o NO e logo em seguida, ainda no primeiro dia, viria o aumento de H2O2 e dos hormônios auxinas e citocininas no terceiro dia (resultados anteriores do grupo) do período de indução. / The nitric oxide (NO) was shown to be an ubiquitous molecule for many phases of the development of a plant and an important element for biotic and abiotic stress responses. However, few studies correlate this radical with the organogenesis in plants. Ananas comosus> (Bromeliaceae) leaves can be considered an interesting model for the organogenesis studies, because the basal region have a set of cell which, under in vitro cultivation and fine growth regulators balance, start cell division and form adventitious meristems. Firstly, structures named protuberances are formed, which develop forming new buds, without the intermediary formation of callus. The optimum rate of the growth regulators for the induction to organogenesis is 0.53 uM of naphthalene acetic acid and 8.87 uM of benziladeninepurine. It is known that the endogenous hormonal balance between auxins and cytokinins is altered in these explants, and a peak of these hormones is found at the third day of induction. This work intended to verify whether the NO would participate on the signaling cascade that led to the adventitious organogenesis, using basal leaves of pineapple cultivated in vitro. The nitric oxide quantification was made by chemiluminescence for a period of 7 days after the explants obtainment. The production was dosed in continuous flow air with measurements made every 10 seconds. The inductive treatment to organogenesis showed a significant rise in NO production in comparison to the explants incubated in medium culture without growth regulators, indicating a possible participation of NO at the organogenesis process. There was a NO peak at the first day, soon at the first hours of cultivation at inductive medium. Besides, the dosage of hydrogen peroxide (H2O2) was done and a correlation was found to the NO production at the light phase of the photoperiod. The H2O2 production rose after the increase of NO at the first day of cultivation in medium containing growth regulators. Finally, the treatment with L-NAME showed the NOS enzyme as a possible pathway involved with the NO production, since the number of new adventitious meristems reduced significantly and subsequently, of new shoots after 60 days of cultivation in inductive to organogenesis medium. The in situ localization of NO seemed to indicate that the rise in production could be related to the cells of the leaf parenchyma and vascular tissues. Thus, this research permitted to include temporally two new possible signals (NO and H2O2) to the signalization cascade of the adventitious organogenesis in pineapple leaves. The signalization seems to initiate with NO followed by H2O2 at the first day and by the auxins and cytokinins hormones at the third day (previous results of the group) of the induction period.

Orientador: Sebastião Roberto Taboga / Texto em português e inglês / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T04:58:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Biancardi_ManoelFrancisco_D.pdf: 15374332 bytes, checksum: b70012fe11a604131b1622adb07d2654 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Pesquisas recentes tem mostrado que a predisposição às desordens prostáticas tem origem nos momentos iniciais da vida. Portanto, o entendimento detalhado da organogênese prostática e dos mecanismos envolvidos na predisposição à estas desordens são de fundamental importância para se compreender a etiologia das patologias prostáticas. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a organogênese prostática normal e a influência da exposição à testosterona durante a vida intrauterina e puberal sobre a próstata de fêmeas e machos senis do gerbilo da Mongólia. Para isto, o presente trabalho foi dividido em duas etapas. Na primeira, grupos de fêmeas grávidas de gerbilo receberam injeções subcutâneas de testosterona (500 µg/dose) 4 dias antes do parto (grupos TG e TG + T) e/ou durante a vida pós-natal (grupos C + T e TG + T). Os filhotes destas mães envelheceram até serem mortos com 1 ano de idade. Na segunda etapa, foi realizado um estudo normativo da organogênese do lobo ventral da próstata de machos. Para isto, fetos machos de 20 a 24 dias de gestação (E20 - E24), além de recém nascidos de 1 dia de idade (P1), foram empregados no estudo. Todos os fragmentos teciduais foram dissecados e fixados em metacarn ou paraformaldeído 4%, sendo processados para inclusão em parafina. Posteriormente, as seções teciduais foram submetidas à análises biométricas, morfológicas, estereológicas, imuno-histoquímicas, de imunofluorescência e de reconstrução tridimensional. Os resultados mostraram que somente os machos velhos do grupo TG + T foram acometidos por hiperplasia adenomatosa associada à inflamação, embora nos animais dos outros grupos experimentais também foram observados focos hiperplásicos na próstata. Já as fêmeas expostas à testosterona na fase pré-natal (grupos TG e TG + T) apresentaram uma maior heterogeneidade de alterações em decorrência do tratamento, que envolveram desde malformações do sistema reprodutor até a formação de tecido ectópico ao redor da vagina, além da presença de lesões prostáticas também caracterizadas por focos hiperplásicos adenomatosos. Estes resultados mostram que a exposição anormal à testosterona afeta a organogênese prostática tanto em machos quanto em fêmeas, alterando os processos normais do desenvolvimento e aumentando a suscetibilidade ao desenvolvimento de doenças ao longo do envelhecimento. Em relação ao estudo da organogênese prostática, foi observado que os brotos ventrais emergem do epitélio uretral entre o 20º e o 21º dia de vida pré-natal, atingindo o pé mesenquimal ventral (VMP) e iniciando o processo de morfogênese de ramificação no primeiro dia de vida pós-natal. Os achados também demonstraram que a camada de musculatura lisa parece ter um papel central neste processo, a qual pode atuar como uma barreira física à expansão dos brotos em direção ao VMP. Em relação aos receptores nucleares, o receptor de andrógeno apresentou uma expressiva imunomarcação no mesênquima periuretral, enquanto que células com marcação para receptor alfa de estrógeno foram identificadas tanto nos brotos como no mesênquima periuretral. Por fim, os resultados demonstram que a organogênese prostática, além de envolver uma série de eventos finamente regulados, é um processo extremamente sensível e determinante para a saúde da glândula ao longo da vida / Abstract: Recent researches have been shown that the predisposition to prostatic disorders has its origin during moments of early life. Therefore, the detailed understanding of prostate organogenesis and the mechanisms underlying in predisposing to these disorders are extremely important in order to highlight the etiology of prostatic pathologies. Thus, the aim of this work was to evaluate the normal prostate organogenesis and the influence of testosterone exposure during prenatal and pubertal life on the prostate of male and female Mongolian gerbil. To this, the present work was divided into two phases. First, groups of pregnant female received subcutaneous injections of testosterone (500 µg/dosage) four days before the parturition (groups TG and TG + T) and/or during postnatal life (groups C + T and TG + T). The offspring of these mothers aged, being killed with one-year-old. In a second moment, we realized a normative study of the organogenesis of male ventral prostate lobe. To this, male fetus with 20 and 24 (E20 - E24) days of gestation, besides newborn with one-day-old (P1), were employed in this study. All tissue fragments were dissected and fixed in methacarn or 4% paraformaldehyde, being processed for paraffin embedding. Following, tissue sections were submitted to biometrical, morphological, stereological, immunohistochemical, immunofluorescence and three dimensional reconstruction analyses. The results showed that only the old males of TG + T group were affected by adenomatous hyperplasia associated with inflammation, although in other male experimental groups we also observed hyperplastic foci in the prostate. The female exposed to testosterone during prenatal phase (TG and TG + groups) have demonstrated a higher heterogeneity of alterations due treatment, being characterized by reproductive system malformations, formation of ectopic prostatic tissue surrounding vaginal wall, besides the presence of prostatic lesions characterized by adenomatous hyperplasic foci. These findings show that abnormal prenatal exposure to testosterone affect the prostate morphogenesis in both male and female, disrupting normal developmental processes and increasing the susceptibility to the development of prostatic diseases during aging. Regarding the prostate organogenesis study, it was observed that the first ventral buds emerge from the ventral urethral epithelium between the 20th and 21th day of prenatal life, reaching the ventral mesenchymal pad (VMP) and initiating the branching process at the first day of postnatal life. We also noted that the smooth muscle layer seems to have a central play during this process, which may act as physical barrier to the buds heading to VMP. Regarding the nuclear receptors, the androgen presented a high immunomarking at the periurethral mesenchyme, whereas cells with positive marking for estrogen receptor alpha were identified either in the periurethral mesenchyme or in the buds. Finally, the results demonstrate that the prostate organogenesis, besides involving a series of events finely regulated, is an extremely sensitive and crucial to the health of the gland throughout the life / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Abstract The embryonic urogenital system (UGS) generates the metanephric kidney, gonad and the adrenal gland. It is well known that the development of the UGS is regulated by sequential and reciprocal epithelial and mesenchymal tissue interactions but the secreted mediators involved are still poorly known. The action of such inductive signals is typically regulated by specific antagonists. The Sprouty (Spry) proteins compose one family of cytoplasmic regulators that typically repress the function of the receptor tyrosine kinase (RTK) signal transduction pathways. The DAN/Cerberus (Cer) family that encodes secreted proteins bind and antagonize the Bmp, Wnt and Nodal signals. In this study the roles of Spry and Cer1 was addressed during mouse UGS development by targeted expression of SPROUTY2 (SPRY2) and Cer1 in the ureteric bud and Wolffian duct under the Pax2 promoter. Changes induced in the UGS assembly process were analyzed in detail to reveal the normal developmental roles of these proteins. SPRY2 expression led to either complete lack of the kidney, reduction in the kidney size or formation of unilateral kidney with reduced size. The SPRY2 mediated reduction in kidney size was accompanied by inhibition of expression of genes that are known to regulate kidney development. The results indicated that the Spry may take part in kidney development by coordinating the reciprocal cell signaling between the ureteric bud, the mesenchymal cells and stromal cells. In addition to the kidney, the gain of SPRY2 function revealed an important role in the control of male gonadogenesis. SPRY2 over expression in the Wolffian duct malformed the Wolffian duct derivatives, diminished the number of seminiferous tubules and the amount of the interstitial tissue associated with reduced mesonephric cell migration to the testis. Exogenous FGF9 rescued mesonephric cell migration inhibited by SPRY2. It was concluded that Spry protein contribute to male sexual organogenesis by antagonizing Fgf9 signaling. When the Cer1 gene was over expressed in the ureteric bud this lead unexpectedly to increased kidney size. The Cer1 mediated promotion of kidney size was demonstrated to involve enhanced ureteric bud morphogenesis. At the molecular level Cer1 protein function lead to inhibition of Bmp4 gene expression and concurrent upregulation of Gdnf and Wnt11 expression. Notably, excess BMP4 reduced the Cer1 stimulated ureteric bud branching and downregulated normally expression of Gdnf and Wnt11 in the embryonic kidney. Based on the presented data it is proposed that the establishment of mammalian organ size is under the control of both systemic and the intrinsic factors. Together the work demonstrates significant roles for the proteins that typically inhibit growth factor signaling or signal transduction. Hence organogenesis is controlled by coordination between positive and negative growth factor regulator signals.

Durante esse trabalho de pesquisa verificou-se que a aquisição de competência para conversão de ápices radiculares de Catasetum fimbriatum em gemas caulinares aumentava à medida que as plantas envelheciam. Esse processo esteve relacionado ao estabelecimento do crescimento determinado das raízes e com a parada da atividade e re-organização estrutural do meristema apical radicular (MAR). Este, quando ainda jovem e destituído de competência para a conversão em gemas, apresentava uma organização do tipo fechada, ao passo que em estágios avançados do envelhecimento este padrão transformou-se em um tipo aberto, marcado pela diferenciação e predominância de células parenquimáticas. Tais alterações, aparentemente, ocorreram com a concomitante perda das características e funções do centro de quiescente (CQ). De maneira complementar, constatou-se que a aquisição de competência do MAR para conversão em gemas estava correlacionada a uma série de alterações metabólicas, as quais, supostamente, participaram de uma condição fisiológica favorável a esse processo. Com base no conjunto de dados obtidos, pode-se observar que os teores endógenos de importantes participantes na progressão de divisões celulares, tais como auxinas, citocininas e formas reduzidas de ascorbato e glutationa tenderam a diminuir durante o envelhecimento das raízes. Por outro lado, durante esse mesmo período, o conteúdo de alguns hormônios envolvidos na sinalização de condições de estresse ou diferenciação celular, tais como etileno, ácido abscísico e giberelinas tenderam a aumentar. As concentrações relativas de importantes sinalizadores secundários, tais como óxido nítrico e cálcio citossólico também apresentaram aumento conspícuo na região do MAR durante o envelhecimento. Agregando elementos a estas constatações, verificou-se que o transporte polar de auxina seria um importante sinal posicional para a manutenção das características e função do MAR, uma vez que o seu bloqueio em plantas jovens foi suficiente para causar a aquisição da competência do MAR, no entanto, o processo de conversão não era consolidado enquanto os ápices radiculares permaneceram ligados às plantas. A aplicação de etileno em plantas jovens, por sua vez, desencadeou efeitos similares; no entanto, além de induzir a competência, esse hormônio também proporcionou a conversão dos MARs em gemas via aumento nos teores endógenos de citocininas. O tratamento de ápices radiculares jovens com diferentes tipos de citocininas revelaram que citocininas do tipo isopenteniladenina (iP e iPR) mostraram-se mais de perto relacionadas à retenção de características radiculares, ao passo que as do tipo zeatina (Z e ZR) apresentou maior influência e presença em condições em que as características radiculares foram perdidas. Por outro lado, a aplicação de substâncias moduladoras do balanço redox em ápices radiculares jovens mostrou que o estresse oxidativo proporcionou a aquisição de competência do MAR para conversão em gemas. Essa mesma tendência foi observada com a aplicação de concentrações relativamente elevadas de substâncias indutoras da elevação dos teores de óxido nítrico e cálcio citossólico nos tecidos. Os ápices radiculares com competência parcialmente estabelecida, analisados logo nas primeiras horas após o isolamento, revelaram que sua separação da planta-mãe acelerava as mudanças morfológicas que naturalmente ocorrem no MAR em estágios avançados do envelhecimento. Durante esse mesmo período, verificou-se uma queda rápida nos teores endógenos de citocininas (principalmente do tipo iP), proporcionando a predominância de citocininas do tipo Z durante a maior parte do primeiro dia de isolamento dos explantes, a qual coincidiu com a mudança no padrão de organização do MAR do tipo intermediário-aberto para o totalmente aberto. O avanço das modificações no ápice radicular após esse período desencadeou o estabelecimento do meristema caulinar, cujo evento esteve relacionado a uma tendência de aumento nos teores de citocininas e de ascorbato após o primeiro dia de isolamento. Dessa forma, os estágios mais avançados do envelhecimento radicular, bem como a separação de ápices radiculares com competência parcialmente estabelecida, parecem desencadear e aumentar a competência do MAR para conversão por meio de modificações morfológicas e fisiológicas muito similares nos ápices radiculares. Essas alterações envolveram a perda das características radiculares, a qual parece depender de alterações no controle exercido pelo CQ sobre o desenvolvimento das demais células no MAR. Esses eventos na região do CQ se revelaram condição sine qua non para a complementação da aquisição de competência do MAR, sendo esta dependente da intensidade das perturbações sobre o controle da organização do MAR. Dessa forma, a conversão do meristema apical radicular de C. fimbriatum em gemas caulinares parece decorrer da formação de um novo grupo de células na antiga região do CQ do MAR alterado. Essas células pareceram competentes para responder a diferentes estímulos que as direcionariam a uma nova rota do desenvolvimento que, nesse caso, seria o estabelecimento de um meristema caulinar com conseqüente desenvolvimento de uma gema vegetativa. / During this research work, it was noticed that competence acquisition for the conversion of Catasetum fimbriatum root tips into buds was related to the plant ageing. This process seems to be coupled with the establishment of the determinate root growth and with the cessation in the activity and structural re-organization of the root apical meristem (RAM). Young and non-competent root tips showed a closed RAM architecture, and the ageing process stimulated the establishment of an open organization in the RAM, as indicated by a higher level of differentiation and a predominance of parenchymatic cells in the old root apices. These alterations were concomitant with the modifications on the characteristics and functions of quiescent center (QC). In agreement with these observations, the competence acquisition to the conversion of the MAR into buds was linked to a series of metabolic alterations, which probably play a role in this process. Based on the data obtained, it was observed that the endogenous levels of important components of the cell division progression, such as auxins, cytokinins and the reduced forms of ascorbate and glutathione showed a tendency of decrease during the root ageing. On the other hand, during this same period, the content of some hormones involved in signalling events of stress conditions or cellular differentiation, such as ethylene, abscisic acid and gibberellins exhibited a pattern of increase. The relative concentrations of important second messengers, such as nitric oxide and cytosolic calcium also displayed a marked increased in the RAM region during the ageing. Additionally, it was noticed that the auxin polar transport represents an important positional signal for the maintenance of the RAM characteristics and functions, once treatments that blocked the transport of this hormone promoted the MAR competence acquisition even in young plants, although, the conversion process did not complete while the root tips were maintained attached to the plants. The treatment of young plants with ethylene, on the contrary, caused similar effects; however, besides inducing the competence, this hormone also promoted the RAM conversion into buds via the elevation in the endogenous levels of cytokinins. The treatment of young root tips with different types of cytokinins indicated that iP-type cytokinins (iP and iPR) were more closely associated to the preservation of the root characteristics, while the Z-type cytokinins (Z and ZR) showed a higher importance when the root characteristics were lost. Furthermore, the treatment of young root apices with compounds that cause alterations in the cellular redox status indicated that the oxidative stress stimulated the competence acquisition for the RAM conversion into buds. This same tendency was observed with the application of relatively high concentrations of compounds that induce elevations in the levels of nitric oxide and cytosolic calcium in the tissues. The analyses carried out during the first hours after the isolation of partially competent root apices indicated that the detachment of the root tips from the original plants accelerated the morphological modifications that naturally occur at advanced stages of ageing. During this same period, it was observed a rapid decrease in the endogenous levels of cytokinins (specially of the iP-type), leading to a predominance of the Z-type cytokinins during the first day after the isolation of the explants, which coincided with the alteration of the RAM architecture from the intermediate-open type to the completely open type. After the first day of isolation, the progress in the root apices modifications resulted in the establishment of the shoot meristem, which was accompanied by an elevation in the endogenous levels of cytokinins and ascorbate. Therefore, advanced stages of root ageing, as well the isolation of the partially competent root apices, seem to increase the competence for the RAM conversion into buds via similar morphological and physiological changes in the root apices. These alterations involved the loss of the root characteristics, which possibly resulted from modifications in the control of the QC on the development of the other cells in the RAM. These events in the QC represent a sine qua non condition for the completion of the MAR competence acquisition, which is affected by the intensity of the perturbations on the control of the RAM organization. Therefore, the conversion of root apical meristem of C. fimbriatum into buds probably results from the formation of a new group of cells in the region of the QC of the altered RAM. These cells seem to be competent to respond to different stimulus that would directionate them to a new developmental route that, in this case, consists in the establishment of a shoot meristem.

Experiments were carried out with the objectives of developing propagation protocols for Uapaca kirkiana and Pappea capensis tree species of southern Africa, and evaluating the graft compatibility within U. Kirkiana tree clones, provenances and species. Reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC), Folin-Ciocalteau reagent, fluorescence microscopy and callus fusion methodologies were used to diagnose graft compatibility. Results indicated that U. Kirkiana culture asepsis was achieved with 0.1% w/v mercuric chloride HgCl2) and using pre-conditioned grafted trees. Sodium hypochlorite (NaOCl) improved P. Capensis seed asepsis and germination, and discarding floating seeds improved germination. Murashige and Skoog (MS) medium with 2.0 mg l-1 benzylaminopurine (BAP) and 0.3 mg l-1 casein hydrolysate (CH) was superior in shoot multiplication and 0.5 mg l-1 indole-3-butyric acid (IBA) for rooting of P. Capensis microshoots. For somatic embryogenesis, three quarter strength MS medium with 0.05 mg l-1 thidiazuron (TDZ) and 0.3 mg l-1 CH, or 0.2 mg l-1 BAP with 0.3 mg l-1 CH, were effective in germination of P. Capensis somatic embryos. For U. Kirkiana lateral shoot explants, shoot multiplication was superior on three quarter strength MS medium with 0.1 mg l-1 BAP and 0.3 mg l-1 CH. Rooting of micro-cuttings (36%) was achieved on ½ MS with 2.5 mg l-1 IBA. RP-HPLC, fluorescence microscopy and callus fusion studies showed that phenolic compounds play a major role in U. Kirkiana graft incompatibility. Less graft compatible combinations showed an increase in phenol deposits above the union and graft incompatibility was more pronounced above the union than below the union. Proliferation of parenchymatous tissues was better below the union than above the union. Fluorescence microscopy showed presence of flavonoids and polymers above the union of less graft compatible combinations. The chromatograms showed that ferulic acid was abundant and responsible for wood discolouration. The chromatograms also isolated ρara-coumaric acids which were predominant above the union of the less compatible combinations. Therefore, ρara-coumaric acids, flavonoids and polymers were implicated in graft incompatibility of U. kirkiana trees. Copyright / Thesis (PhD)--University of Pretoria, 2008. / Plant Production and Soil Science / unrestricted