Les pesticides et toxiques de guerre organophosphorés sont responsables d'intoxications qui se révèlent préoccupantes pour les autorités sanitaires. La recherche de solutions thérapeutiques pour pallier le manque de moyens efficaces pour contrer ces intoxications apparaît comme essentielle. L'acétylcholinestérase (AChE), enzyme de régulation de l'influx nerveux, en est la cible principale.Au cours de cette thèse, nous avons, d'une part, mis en place une stratégie de conception de molécules capables de réactiver les cholinestérases dites vieillies. Dans ce but, plusieurs dizaines de molécules ont été conçues et synthétisées. Leur évaluation in silico par docking moléculaire et in vitro par mesure d'affinité pour l'enzyme et par étude cristallographique n'a pas permis d'obtenir la réalkylation espérée, mais ce travail nous a offert quelques nouvelles perspectives.D'autre part, nos travaux de cristallographie de l'inhibition de la butyrylcholinestérase humaine par les agents V et le sarin montrent que cette cholinestérase a une énantiosélectivité altérée pour ces inhibiteurs chiraux par rapport à l'AChE humaine. Ceci implique la nécessité de quantités d'enzyme plus importantes pour atteindre la capacité protectrice désirée et donc un surcoût non négligeable. L'AChE humaine serait finalement un bioépurateur de neurotoxiques organophosphorés économiquement plus viable. / Organophosphate pesticides and chemical warfare are responsible for poisoning that pose to health security issues. The research of therapeutic solutions to overcome the lack of effective means to counter these poisonings is essential. Acetylcholinesterase (AChE), the enzyme involved in the regulation of nerve impulses, is the main target. ln this thesis, we have, first, set up a strategy for designing molecules that can reactivate aged cholinesterases. To this purpose, severa! dozen molecules have been designed and synthesized. Evaluation in silico by molecular docking and in vitro by rneasuring affinity for the enzyme and crystallographic study did not observe the desired realkylation. But this work opened new perspectives.Secondly, our crystallographic work on the inhibition of human butyrylcholinesterase by V-agents and sarin shows that cholinesterase has altered enantioselectivity for these chiral inhibitors of human AChE. This implies that larger amounts of enzyme are required for the desired protection and thus, a significant additional cost. Human AChE seems finally a more suitable neurotoxic bioscavenger.

Pesticidas organofosforados são amplamente usados e seu uso constitui um grave problema de saúde pública. A ação clássica destes compostos é a inibição irreversível da acetilcolinesterase, promovendo acúmulo de acetilcolina nas sinapses e hiperestimulação colinérgica. No entanto, as consequências da exposição a baixas doses podem se estender a outros mecanismos de ação e sistemas neurotransmissores. Considerando que crianças constituem um grupo particularmente vulnerável aos efeitos de pesticidas, neste trabalho investigamos os efeitos da exposição aos organofosforados metamidofós (MET) e clorpirifós (CPF) durante o desenvolvimento sobre os sistemas colinérgico e serotoninérgico e sobre o comportamento de camundongos. Para isso, camundongos suíços foram expostos a injeções subcutâneas de MET, clorpirifós ou veículo do terceiro (PN3) ao nono (PN9) dias de vida pós-natal. As doses de exposição foram previamente escolhidas através da construção de uma curva dose-resposta que identificou como mais adequadas para este estudo as doses de 1mg/kg de MET e 3mg/kg de CPF, as quais promoveram em torno de 20% de inibição da acetilcolinesterase. Em PN10, parte dos animais foi sacrificada e foram avaliados os sistemas colinérgico e serotoninérgico no tronco encefálico e córtex cerebral. De PN60 a PN63, os animais foram submetidos a uma bateria de testes comportamentais. Em seguida, estes animais também foram sacrificados tendo sido avaliados os sistemas colinérgico e serotoninérgico. Em PN10, MET e CPF causaram alterações que sugerem aumento da atividade colinérgica respectivamente no tronco e córtex em fêmeas. No sistema serotoninérgico, apenas CPF promoveu alterações, aumentando a ligação ao receptor 5HT1A e transportador 5HT em fêmeas e diminuindo na ligação ao 5HT2. Em PN63, a atividade da acetilcolinesterase foi reestabelecida em todos os grupos. Ainda assim, MET diminuiu a atividade da colina acetiltransferase no córtex e a ligação ao transportador colinérgico no tronco. Quanto aos efeitos do CPF, no tronco, houve redução da atividade da colina acetiltransferase em fêmeas e aumento em machos. Sobre o sistema serotoninérgico, MET e CPF promoveram diminuições no 5HT1A respectivamente no tronco e córtex das fêmeas e CPF aumentou a ligação no córtex de machos. A ligação ao 5HT2 foi aumentada após o tratamento com MET e ao transportador 5HT foi diminuída em fêmeas após o tratamento com clorpirifós. Sobre o comportamento, identificamos comportamento associado à depressão em animais expostos a MET e aumento dos níveis de ansiedade, além de prejuízo de aprendizado/memória após exposição à CPF. Desta forma, nossos resultados indicam que a exposição à metamidofós e clorpirifós durante o desenvolvimento é capaz de alterar, de diferentes formas, a atividade colinérgica e serotoninérgica, mesmo que as doses de exposição sejam toxicologicamente equivalentes. Foram verificados efeitos nas vias neuroquímicas logo após a exposição e após um longo período de interrupção do tratamento, indicando efeitos tardios em sistemas importantes que podem estar associados às alterações comportamentais. Finalmente, o presente estudo reforça a associação epidemiológica entre pesticidas e alterações psiquiátricas e a capacidade da programação de alterações a longo-prazo quando a exposição se dá durante o desenvolvimento. / Organophosphate pesticides are widely used and its use consist on a severe public health problem. The classic effect of these compounds involve irreversible inhibition of the enzyme acetylcholinesterase, causing an accumulation of acetylcholine at cholinergic synapses and, consequently, cholinergic hyperstimulation. However, when the doses of exposure are low, other the mechanisms of action may play a role and other neurotransmitter systems may be affected. Considering that children are particularly vulnerable to effects of these compounds, in this study we investigated the effects of methamidophos and chlorpyrifos organophosphate exposure during development on cholinergic and serotonergic systems and behavior. For this purpose, Swiss mice received subcutaneous injections of methamidophos or chlorpyrifos, or vehicle from the third to the nineth postnatal day (PN3 - PN9). Initially, a dose-response study was performed and the doses of 1mg/kg methamidophos and 3mg/kg chlorphrifos, which promoted 20% inhibition of acetylcholinesterase activity in brain were chosen to be used in the next set of experiments. At PN10, one day after exposure, a group of animals was sacrificed and the brainstem and cortex collected and stored to further analysis of cholinergic and serotonergic systems. From PN60 to PN63 the animals were submitted to behavioral tests in order to evaluate: anxiety, locomotor activity, decision making, depressive-like behavior and learning/memory. After the last test, the animals were sacrificed and the brainstem and cortex collected and stored to further analysis of cholinergic and serotonergic systems. At PN10, methamidophos and chlorpyrifos promoted alterations that suggest an increase of cholinergic activity respectively on the brainstem and cortex of females. As for the serotonergic system: only chlorpyrifos elicited alterations: There were increases in 5HT1A receptor and 5HT transporter binding in females and a decrease in 5HT2 receptor binding. At PN63, the activity of acetylcholinesterase had returned to control levels. Despite that, methamidophos elicited a decrease in the activity of choline acetyltransferase in the cortex and in choline transporter binding in the brainstem. As for the serotonergic system, methamidophos and chlorpyrifos promoted decreased 5HT1A receptor binding respectively in the brainstem and cortex of females and chlorpyrifos increased its binding in males. Methamidophos exposure elicited increased 5HT2 binding whereas chlorpyrifos exposure decreased female 5HT transporter binding. Methamidophos elicited behavioral alterations suggestive of increased depressive-like behavior while chlorpyrifos exposure was associated to increased anxiety levels and memory/learning deficits. Our results indicate that metamidophos and chlorpyrifos exposure during development distinctively affect the cholinergic and serotonergic systems even at toxicologically equivalent doses. There were immediate and late-emergent neurochemical effects that may play a role on the behavioral outcomes. Finally, the present study reinforces the epidemiologic association between pesticides exposure and mood disorders and suggest that organophosphate exposure during early development programs for late effects.

Genetically modified cotton (Gossypium hirsutum L.) acreage has increased dramatically over the last six years. Reports of variable results in fiber quality and yield have arisen in these cultivars. Some changes in production practices have occurred coincident with the introduction of transgenic technology, such as reduced use of broad-spectrum insecticides, including organophosphates (OP) that could potentially influence the growth and yield of cotton. One factor that might affect these parameters is the difference in the amount of foliarly-applied phosphorus (P) between an OP and non-phosphate (NP) insecticide regime. Therefore, a study was conducted to investigate selected growth characteristics, yield, and fiber quality of genetically modified and conventional cotton as influenced by OP and foliar phosphorus (FP) applications. A four replication strip-plot experimental design was utilized with cultivar serving as the whole plot and insecticide regime as the sub-plot. Three cultivars of the same recurrent parent (ST4892BR, ST4793R, and ST474) were planted in 2001 and 2002 under irrigated conditions in Burleson County, TX on a Weswood silty clay loam (fine-silty, mixed, thermic Fluventic Ustochrept). The insecticide regime consisted of NP, NP+FP, and OP treatments. The FP was applied at P2O5 weight equivalent to the P component in the concurrent OP application. ST4892BR had greater lint yield than ST4793R and ST474. The yield increase can be explained through plant mapping analysis which showed ST4892BR producing larger bolls and greater boll numbers. In addition, evaluation of fruiting distribution showed ST4892BR contained more lint on sympodial branches 6 through 10. The insecticide regime effect on lint yield resulted in higher yield (P=0.08) for the NP+FP regime. Examination of yield components revealed NP+FP increased second position bolls, predominantly at sympodial branches 6 through 10. Leaf tissue analysis revealed increased levels of P for the OP and NP+FP over that of the NP insecticide regime, which indicates a potential for plants to acquire P from OP insecticides. Furthermore, the considerable yield response to small amounts of FP is not clearly understood. While conclusive evidence exists regarding cultivar yield differences, this study does not provide sufficient evidence to conclude that OP insecticides influence growth, yield, or fiber quality characteristics of these cotton cultivars.

Genetically modified cotton (Gossypium hirsutum L.) acreage has increased dramatically over the last six years. Reports of variable results in fiber quality and yield have arisen in these cultivars. Some changes in production practices have occurred coincident with the introduction of transgenic technology, such as reduced use of broad-spectrum insecticides, including organophosphates (OP) that could potentially influence the growth and yield of cotton. One factor that might affect these parameters is the difference in the amount of foliarly-applied phosphorus (P) between an OP and non-phosphate (NP) insecticide regime. Therefore, a study was conducted to investigate selected growth characteristics, yield, and fiber quality of genetically modified and conventional cotton as influenced by OP and foliar phosphorus (FP) applications. A four replication strip-plot experimental design was utilized with cultivar serving as the whole plot and insecticide regime as the sub-plot. Three cultivars of the same recurrent parent (ST4892BR, ST4793R, and ST474) were planted in 2001 and 2002 under irrigated conditions in Burleson County, TX on a Weswood silty clay loam (fine-silty, mixed, thermic Fluventic Ustochrept). The insecticide regime consisted of NP, NP+FP, and OP treatments. The FP was applied at P2O5 weight equivalent to the P component in the concurrent OP application. ST4892BR had greater lint yield than ST4793R and ST474. The yield increase can be explained through plant mapping analysis which showed ST4892BR producing larger bolls and greater boll numbers. In addition, evaluation of fruiting distribution showed ST4892BR contained more lint on sympodial branches 6 through 10. The insecticide regime effect on lint yield resulted in higher yield (P=0.08) for the NP+FP regime. Examination of yield components revealed NP+FP increased second position bolls, predominantly at sympodial branches 6 through 10. Leaf tissue analysis revealed increased levels of P for the OP and NP+FP over that of the NP insecticide regime, which indicates a potential for plants to acquire P from OP insecticides. Furthermore, the considerable yield response to small amounts of FP is not clearly understood. While conclusive evidence exists regarding cultivar yield differences, this study does not provide sufficient evidence to conclude that OP insecticides influence growth, yield, or fiber quality characteristics of these cotton cultivars.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Pesticides are substances used in agricultural areas and public health programs to control pests and disease vectors. Among pesticides, organophosphates (OPs) are considered the most toxic to vertebrates. Diphenyl diselenide [(PhSe)2] is an organoselenium compound that presents pharmacological activities, among that the antioxidant effect. Therefore, the aim of this study was to evaluate the pharmacological effects of (PhSe)2 in acute models of toxicity induced by chlorpyrifos (CPF) and acephate (AC) in rats, as well as to investigate the hyperglycemic and hyperlipidemic effects of CPF which has not been described. In the first experimental protocol (article 1), the effect of (PhSe)2 on hepatic and hematological toxicity induced by CPF in rats was evaluated. The animals were pre-treated by intragastric route (p.o.) with (PhSe)2 (5 mg/kg) once a day for 7 days. On the 8th and 9th days, (PhSe)2 (5 mg/kg; p.o.) was administered to rats 30 min prior to subcutaneous (s.c.) injection of CPF (50 mg/kg). Twenty-four hours after the last CPF injection, rats were killed. The aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) and lactate dehydrogenase (LDH) activities were determined in plasma of rats. Lipid peroxidation, protein carbonyl and non-protein thiol (NPSH) levels as well as catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR) and gluthatione S-transferase (GST) activities were determined in livers of rats. Hematologic parameters were also assayed. CPF caused an increase in AST, ALT and LDH activities, an increase in lipid peroxidation and protein carbonyl levels, a decrease in NPSH levels and an inhibition of CAT, GPx, SOD and GST activities. In addition, CPF exposure caused hematologic toxicity, evidenced mainly by a decrease in total leukocytes levels. (PhSe)2 protected against toxic effects induced by CPF in rats. Moreover, (PhSe)2 increased per se NPSH levels and GST activity in livers of rats. In the second experimental protocol (article 2), the effect of (PhSe)2 on metabolic disorders induced by AC in rats was investigated. (PhSe)2 (10 or 30 mg/kg; p.o.) was administered to rats 1 hour prior to AC administration (140 mg/kg; p.o.). Two hours after AC administration, rats were killed. Glucose and corticosterone levels as well as the lipid status were determined in plasma of rats. Cardiovascular risk factor and the atherogenic index were calculated. Glycogen levels as well as tyrosine aminotransferase (TAT) and glucose-6-phosphatase (G6Pase) activities were determined in livers of rats. Cerebral acetylcholinesterase (AChE) activity was assayed. AC induced an increase in glucose, corticosterone and triglycerides (TG) levels, an increase in TAT and G6Pase activities and an inhibition of AChE activity. The cardiovascular risk factor [(TG/ high density lipoprotein (HDL)] was increased in AC exposed rats. (PhSe)2 attenuated these alterations, except for the increase of corticosterone levels and AChE activity inhibition. In the third experimental protocol (article 3), the hyperglycemic and hyperlipidemic effects of CPF in rats were investigated. The mechanisms involved in hyperglycemia induced by CPF were also studied. CPF was administered once to rats at the dose of 50 mg/kg, s.c. Animals were killed at 2, 4, 8, 12 e 24 hours after CPF administration. Glucose and corticosterone levels as well as lipid status and paraoxonase-1 (PON-1) activity were determined in plasma of rats. Cardiovascular risk factors and the atherogenic index were calculated. Glycogen levels as well as TAT and G6Pase activities were determined in livers of rats. Cerebral AChE activity was assayed. CPF caused an increase in glucose, glycogen, corticosterone, TG and low density lipoprotein (LDL) levels, an increase in TAT and G6Pase activities, a decrease in HDL levels and PON-1 activity and AChE activity inhibition. The cardiovascular risk factors and atherogenic index were increased in CPF exposed rats. The results of the present study demonstrated that (PhSe)2 protected against toxic effects induced by CPF and AC in rats. CPF exposure caused hyperglycemia and hyperlipidemia in rats. The gluconeogenesis pathway activation is involved in the hyperglycemic effect caused by CPF. Considering that the crescent use of OPs worldwide has been the cause of many severe human poisoning cases, the results of the present work are of great importance, since that (PhSe)2 may represent an alternative to alleviate the OPs-induced toxicity. / Os agrotóxicos são substâncias empregadas nas áreas agrícolas e em programas de saúde pública, para o controle de pragas e vetores que transmitem doenças. Dentre os agrotóxicos, os inseticidas organofosforados (OFs) são considerados os mais tóxicos aos vertebrados. O disseleneto de difenila [(PhSe)2] é um composto orgânico de selênio para o qual já foram descritas diversas propriedades farmacológicas, entre elas a atividade antioxidante. Dessa forma, este trabalho teve como objetivos avaliar os efeitos farmacológicos do (PhSe)2 em modelos de toxicidade aguda induzida por clorpirifós (CPF) e acefato (AC) em ratos, bem como, avaliar os efeitos hiperglicêmico e hiperlipidêmico do CPF, os quais não estão descritos na literatura. No primeiro protocolo experimental (artigo 1), avaliou-se o efeito do (PhSe)2 na toxicidade hepática e hematológica induzida por CPF em ratos. Os animais foram pré-tratados com (PhSe)2 (5 mg/kg) pela via intragástrica (p.o.) uma vez ao dia durante 7 dias. No 8º e 9º dias o (PhSe)2 (5 mg/kg; p.o.) foi administrado 30 min antes da administração subcutânea (s.c.) de CPF (50 mg/kg). Os animais foram mortos vinte e quatro horas após a última administração de CPF. A atividade das enzimas aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT) e lactato desidrogenase (LDH) foram determinadas no plasma dos ratos. Os níveis de peroxidação lipídica, carbonilação de proteínas e tióis não-protéicos (SHNP), bem como a atividade das enzimas catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR) e glutationa S-transferase (GST) foram determinados no fígado dos ratos. Os parâmetros hematológicos também foram analisados. O CPF causou aumento da atividade das enzimas AST, ALT e LDH, aumento dos níveis de peroxidação lipídica e carbonilação de proteínas, diminuição dos níveis de SHNP e inibição das enzimas CAT, GPx, SOD e GST. Além disso, a exposição ao CPF causou toxicidade hematológica, evidenciada principalmente pela diminuição dos níveis de leucócitos totais. O (PhSe)2 protegeu contra os efeitos tóxicos induzidos pelo CPF em ratos. Além disso, o (PhSe)2 aumentou per se os níveis de SHNP e a atividade da GST no fígado dos ratos. No segundo protocolo experimental (artigo 2), investigou-se o efeito do (PhSe)2 nos distúrbios metabólicos induzidos por AC em ratos. O (PhSe)2 (10 ou 30 mg/kg; p.o.) foi administrado aos animais 1 hora antes da administração de AC (140 mg/kg; p.o.). Os animais foram mortos duas horas após a administração de AC. Os níveis de glicose e corticosterona bem como o perfil lipídico foram determinados no plasma dos ratos. Os fatores de risco cardiovascular e o índice aterogênico foram calculados. Os níveis de glicogênio bem como a atividade das enzimas tirosina aminotransferase (TAT) e glicose-6-fosfatase (G6Pase) foram analisados no fígado dos ratos. A atividade da acetilcolinesterase (AChE) cerebral também foi determinada. O AC causou aumento dos níveis de glicose, corticosterona e triglicerídios (TG), aumento da atividade das enzimas TAT e G6Pase e inibição da AChE. O fator de risco cardiovascular [(TG/lipoproteína de alta densidade (HDL)] aumentou nos ratos expostos ao AC. O (PhSe)2 atenuou essas alterações, exceto para o aumento dos níveis de corticosterona e para a inibição da AChE. No terceiro protocolo experimental (artigo 3), investigou-se o efeito hiperglicêmico e hiperlipidêmico do CPF em ratos. Também foram estudados os mecanismos envolvidos no efeito hiperglicêmico do CPF. O CPF foi administrado uma única vez na dose de 50 mg/kg, s.c.. Os animais foram mortos em diferentes tempos após a administração de CPF (2, 4, 8, 12 e 24 horas). Os níveis de glicose e corticosterona bem como o perfil lipídico e a atividade da paraoxonase-1 (PON-1) foram determinados no plasma dos ratos. Os fatores de risco cardiovascular e o índice aterogênico foram calculados. Os níveis de glicogênio bem como a atividade das enzimas TAT e G6Pase foram analisados no fígado dos ratos. A atividade da AChE cerebral também foi determinada. O CPF causou aumento dos níveis de glicose, glicogênio, corticosterona, TG e lipoproteína de baixa densidade (LDL), aumento da atividade das enzimas TAT e G6Pase, diminuição dos níveis de HDL e da atividade da PON-1 e inibição da atividade da AChE. Os fatores de risco cardiovascular e o índice aterogênico aumentaram nos animais expostos ao CPF. Os resultados do presente trabalho demonstraram que o (PhSe)2 protegeu contra a toxicidade induzida por CPF e AC em ratos. A exposição ao CPF causou hiperglicemia e hiperlipidemia em ratos. A ativação da via da gliconeogênese está envolvida no efeito hiperglicêmico causado pelo CPF. Considerando-se que a exposição aos OFs é cada vez mais freqüente e que é a causa de diversas doenças, os resultados deste trabalho são de grande importância, uma vez que o (PhSe)2 pode representar uma alternativa para atenuar a toxicidade causada pelos OFs.

Pesticidas organofosforados são amplamente usados e seu uso constitui um grave problema de saúde pública. A ação clássica destes compostos é a inibição irreversível da acetilcolinesterase, promovendo acúmulo de acetilcolina nas sinapses e hiperestimulação colinérgica. No entanto, as consequências da exposição a baixas doses podem se estender a outros mecanismos de ação e sistemas neurotransmissores. Considerando que crianças constituem um grupo particularmente vulnerável aos efeitos de pesticidas, neste trabalho investigamos os efeitos da exposição aos organofosforados metamidofós (MET) e clorpirifós (CPF) durante o desenvolvimento sobre os sistemas colinérgico e serotoninérgico e sobre o comportamento de camundongos. Para isso, camundongos suíços foram expostos a injeções subcutâneas de MET, clorpirifós ou veículo do terceiro (PN3) ao nono (PN9) dias de vida pós-natal. As doses de exposição foram previamente escolhidas através da construção de uma curva dose-resposta que identificou como mais adequadas para este estudo as doses de 1mg/kg de MET e 3mg/kg de CPF, as quais promoveram em torno de 20% de inibição da acetilcolinesterase. Em PN10, parte dos animais foi sacrificada e foram avaliados os sistemas colinérgico e serotoninérgico no tronco encefálico e córtex cerebral. De PN60 a PN63, os animais foram submetidos a uma bateria de testes comportamentais. Em seguida, estes animais também foram sacrificados tendo sido avaliados os sistemas colinérgico e serotoninérgico. Em PN10, MET e CPF causaram alterações que sugerem aumento da atividade colinérgica respectivamente no tronco e córtex em fêmeas. No sistema serotoninérgico, apenas CPF promoveu alterações, aumentando a ligação ao receptor 5HT1A e transportador 5HT em fêmeas e diminuindo na ligação ao 5HT2. Em PN63, a atividade da acetilcolinesterase foi reestabelecida em todos os grupos. Ainda assim, MET diminuiu a atividade da colina acetiltransferase no córtex e a ligação ao transportador colinérgico no tronco. Quanto aos efeitos do CPF, no tronco, houve redução da atividade da colina acetiltransferase em fêmeas e aumento em machos. Sobre o sistema serotoninérgico, MET e CPF promoveram diminuições no 5HT1A respectivamente no tronco e córtex das fêmeas e CPF aumentou a ligação no córtex de machos. A ligação ao 5HT2 foi aumentada após o tratamento com MET e ao transportador 5HT foi diminuída em fêmeas após o tratamento com clorpirifós. Sobre o comportamento, identificamos comportamento associado à depressão em animais expostos a MET e aumento dos níveis de ansiedade, além de prejuízo de aprendizado/memória após exposição à CPF. Desta forma, nossos resultados indicam que a exposição à metamidofós e clorpirifós durante o desenvolvimento é capaz de alterar, de diferentes formas, a atividade colinérgica e serotoninérgica, mesmo que as doses de exposição sejam toxicologicamente equivalentes. Foram verificados efeitos nas vias neuroquímicas logo após a exposição e após um longo período de interrupção do tratamento, indicando efeitos tardios em sistemas importantes que podem estar associados às alterações comportamentais. Finalmente, o presente estudo reforça a associação epidemiológica entre pesticidas e alterações psiquiátricas e a capacidade da programação de alterações a longo-prazo quando a exposição se dá durante o desenvolvimento. / Organophosphate pesticides are widely used and its use consist on a severe public health problem. The classic effect of these compounds involve irreversible inhibition of the enzyme acetylcholinesterase, causing an accumulation of acetylcholine at cholinergic synapses and, consequently, cholinergic hyperstimulation. However, when the doses of exposure are low, other the mechanisms of action may play a role and other neurotransmitter systems may be affected. Considering that children are particularly vulnerable to effects of these compounds, in this study we investigated the effects of methamidophos and chlorpyrifos organophosphate exposure during development on cholinergic and serotonergic systems and behavior. For this purpose, Swiss mice received subcutaneous injections of methamidophos or chlorpyrifos, or vehicle from the third to the nineth postnatal day (PN3 - PN9). Initially, a dose-response study was performed and the doses of 1mg/kg methamidophos and 3mg/kg chlorphrifos, which promoted 20% inhibition of acetylcholinesterase activity in brain were chosen to be used in the next set of experiments. At PN10, one day after exposure, a group of animals was sacrificed and the brainstem and cortex collected and stored to further analysis of cholinergic and serotonergic systems. From PN60 to PN63 the animals were submitted to behavioral tests in order to evaluate: anxiety, locomotor activity, decision making, depressive-like behavior and learning/memory. After the last test, the animals were sacrificed and the brainstem and cortex collected and stored to further analysis of cholinergic and serotonergic systems. At PN10, methamidophos and chlorpyrifos promoted alterations that suggest an increase of cholinergic activity respectively on the brainstem and cortex of females. As for the serotonergic system: only chlorpyrifos elicited alterations: There were increases in 5HT1A receptor and 5HT transporter binding in females and a decrease in 5HT2 receptor binding. At PN63, the activity of acetylcholinesterase had returned to control levels. Despite that, methamidophos elicited a decrease in the activity of choline acetyltransferase in the cortex and in choline transporter binding in the brainstem. As for the serotonergic system, methamidophos and chlorpyrifos promoted decreased 5HT1A receptor binding respectively in the brainstem and cortex of females and chlorpyrifos increased its binding in males. Methamidophos exposure elicited increased 5HT2 binding whereas chlorpyrifos exposure decreased female 5HT transporter binding. Methamidophos elicited behavioral alterations suggestive of increased depressive-like behavior while chlorpyrifos exposure was associated to increased anxiety levels and memory/learning deficits. Our results indicate that metamidophos and chlorpyrifos exposure during development distinctively affect the cholinergic and serotonergic systems even at toxicologically equivalent doses. There were immediate and late-emergent neurochemical effects that may play a role on the behavioral outcomes. Finally, the present study reinforces the epidemiologic association between pesticides exposure and mood disorders and suggest that organophosphate exposure during early development programs for late effects.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:01:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao valeria de Lima Jardim 2010.pdf: 266263 bytes, checksum: 0a24700be4dcac6e853b3f6e041e4a78 (MD5) Previous issue date: 2010-08-23 / Brazil is one of the top pesticides using countries in the world, being the State of Goiás a potential contributor due to its large production of industrial tomatoes. Among the most widely used pesticides is the organophosphate Acephate with toxicological characteristics capable of infecting both living beings and the environment. There are several seeking solution studies to remediate xenobiotic compounds, being microorganisms an important biotechnological tool against them. The aim of this study was to select rot-white fungal that can produce oxidative enzymes under certain conditions, in the presence of Acephate, evaluating their effectiveness in reducing its toxicity. Thus, the study was divided into three parts: testing on solid medium under different nutritional conditions, tests in liquid culture medium under two different conditions (shaking and static) and development of analytical methodology to evaluate the decrease of Acephate toxicity. We defined two levels of Acephate, 10 and 50%, which were treated by the following species: Trametes versicolor, Trametes villosa, Pycnoporus sanguineus, Phanerochaete chrysosporium and Lentinus edodes. In solid medium all species showed mycelial growth and satisfying development in the presence of Acephate under standard nutritional conditions. The concentration of 50% Acephate caused limitation to Trametes villosa in solid and liquid medium cultivation. The opposite occurred to Pycnoporus sanguineus, which had good results in the development and production of enzymes in the presence of Acephate. Lignin Peroxidase in Phanerochaete chrysosporium was present with a 15.77U.mL-1 only in Acephate 50%, suggesting that the pesticide may induce its enzyme complex. The enzyme Laccase excelled in Pycnoporus sanguineus in the two culture conditions, being the largest peak 45.95 U.mL-1 in 50% Acephate in shaking. However, the best value for the production of Laccase from Trametes villosa was in the static condition: 73.55 U.mL-1 in Acephate 10%. The toxicity tests applied, NRU and Cholinesterase Enzyme Inhibition, proved that in these conditions there was no formation of the metabolite Methamidophos. The toxicological methodology developed to assess the toxicity reduction in the treated supernatant was efficient and promising to monitor and investigate environmental contamination. The samples treated by fungi showed 100% increase of Cholinesterase compared to the control group (no treatment) for T. villosa and 91.7% for P. sanguineus. These results showed that the enzyme complex of the fungi studied is capable to reduce Acephate toxicity, proving that well managed rot-white fungal can bring environmental benefits of mitigation. / O Brasil está entre os principais países consumidores de agrotóxicos, sendo o Estado de Goiás um colaborador em potencial devido à grande produção de tomate industrial. Dentre os agrotóxicos mais utilizados, destaca-se o organofosforado Acefato com características toxicológicas capazes de contaminar os seres vivos e o meio ambiente. Várias são as pesquisas que buscam soluções na remediação de compostos xenobióticos, sendo os microrganismos importantes ferramentas biotecnológicas para esse fim. O objetivo deste estudo foi selecionar fungos de decomposição branca capazes de produzir enzimas oxidativas em determinadas condições, na presença de Acefato, avaliando a sua eficiência em reduzir a sua toxicidade. Para tanto o estudo foi dividido em três partes: ensaios em meio de cultura sólido em diferentes condições nutricionais, ensaios em meio de cultura líquido sob duas condições distintas (agitação e estática) e desenvolvimento de metodologia analítica de avaliação da redução de toxicidade do Acefato. Foram definidas duas concentrações de Acefato, 10 e 50%, as quais foram submetidas ao tratamento pelas seguintes espécies: Trametes versicolor, Trametes villosa, Pycnoporus sanguineus, Phanerochaete chrysosporium e Lentinus edodes. Em meio de cultura sólido, todas as espécies apresentaram crescimento micelial e desenvolvimento satisfatórios na presença de Acefato em condição nutricional padrão. A concentração de 50% de Acefato causou limitação para Trametes villosa no cultivo em meio de cultura sólido e líquido. O oposto ocorreu com Pycnoporus sanguineus, que teve bons resultados de desenvolvimento e produção enzimática na presença de Acefato. Lignina Peroxidase esteve presente em Phanerochaete chrysosporium com 15,77U.mL-1 somente em Acefato 50%, sugerindo que o agrotóxico possa induzir seu complexo enzimático. A enzima Lacase se destacou em Pycnoporus sanguineus nas duas condições de cultivo, sendo o maior pico de 45,95 U.mL-1 na presença de 50% de Acefato em agitação. No entanto, o melhor valor para produção de Lacase foi de Trametes villosa na condição estática: 73,55 U.mL-1 em Acefato 10%. Nos testes de toxicidade aplicados, NRU e Inibição da Enzima Colinesterase, comprovou-se que não houve formação do metabólito Metamidofós, nestas condições. A metodologia toxicológica desenvolvida para avaliar a redução de toxicidade do sobrenadante tratado mostrou-se eficaz e promissora no monitoramento e investigação de contaminação ambiental. As amostras tratadas por fungos apresentaram 100% de aumento de Colinesterase em comparação com o Grupo Controle (sem tratamento) para T. villosa e 91,7% para P. sanguineus. Esses resultados mostram que o complexo enzimático dos fungos estudados é capaz de reduzir a toxicidade do Acefato, comprovando que os fungos de decomposição branca, se bem conduzidos, podem trazer benefícios ambientais de mitigação.

Made available in DSpace on 2016-08-19T12:56:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_FernandaGabrielleSoaresSilva.pdf: 1148440 bytes, checksum: 5fda93ea5a22fe5304a59aa6f8b2f3b0 (MD5) Previous issue date: 2016-06-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The quality control of soil and groundwater has become an increasing need because human activities have led to contamination of ecosystems and affected human health. Agriculture, for instance, has left ecosystems waste organophosphate insecticides (OFs), highly toxic. In order to make an analysis of the impacts of these compounds in agricultural areas, it is required to have reference values taken in undisturbed areas, presenting the same type of soil and groundwater. In this regard, the ideal is that these compounds are not present in these ecosystems. In this paper, an electrochemical biosensor based on the acetylcholinesterase enzyme, immobilized by crosslinking with glutaraldehyde in the presence of estuarine macroalgae, was used to analyze levels of OFs pesticides in soil and groundwater samples collected in areas without human interference, throughout the state of Maranhão, Brazil. Biosensors applied presented, after optimization, sensitivity with detection limit between 0,054 and 1,44 μg/L, reproducibility with variation coefficient, CVs, internal measure between 8.3 and 9% and stability, showing minor variation in responses after being stored for 3 months), which made them suitable to be used in the organophosphates monitoring in the environmental matrices. Were also analyzed some physico-chemical parameters of quality of waters and soils, it has been verified that these are within the standards of the Brazilian legislation. The monitoring of the presence of levels, using the biosensor described herein, enabled to discard contamination hypothesis by these pollutants, nevertheless it is known that such compounds can have high mobility in environmental compartments. / O controle da qualidade de solos e águas subterrâneas tem-se tornado uma necessidade cada vez maior, pois as atividades humanas têm levado à contaminação de ecossistemas e afetado a saúde humana. A agricultura, por exemplo, tem deixado nos ecossistemas resíduos de inseticidas organofosforados (OFs), altamente tóxicos. Para se fazer uma análise dos impactos provocados por esses compostos em áreas agrícolas, é necessário que se tenha valores de referência de qualidade tomados em áreas não antropizadas, que apresentem mesma tipologia de solos e águas subterrâneas. Nesse particular, o ideal é que estes compostos não estejam presentes nesses ecossistemas. No presente trabalho, um biossensor eletroquímico à base da enzima acetilcolinesterase, imobilizada por ligação cruzada com glutaraldeído em presença de uma macroalga estuarina, foi utilizado para analisar pesticidas OFs em amostras de solo e de águas subterrâneas coletadas em áreas sem interferência humana, em todo o Estado do Maranhão, Brasil. Os biossensores empregados apresentaram, após otimização, sensibilidade com limite de detecção entre 0,054 e 1,44 μg/L, reprodutibilidade com coeficientes de variação, CVs, intramedidas entre 8,3 e 9% e estabilidade, apresentando mínimas variações nas respostas após armazenados por 3 meses, o que os tornou adequados para serem utilizados no monitoramento de organofosforados nas matrizes ambientais. Também foram analisados alguns parâmetros físico-químicos de qualidade de águas e solos, tendo sido verificado que estes encontram-se dentro dos padrões da legislação brasileira. A monitoração da presença de OFs, empregando o biossensor aqui descrito, possibilitou descartar a hipótese de contaminação por esses poluentes, não obstante se saiba que tais compostos podem ter elevada mobilidade nos compartimentos ambientais.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Some chemicals have caused much damage to humans and the environment. Among these substances are chemical compounds like pesticides, often considered responsible for poisoning the workers, making it a public health problem. The aim of this study was to verify whether the organophosphate chlorpyrifos was influential in the vestibular system of guinea pigs in acute exposure. This was an experimental research. The research used 18 albino guinea pigs of the species Cavia porcellus, divided into three groups, with group I control the other, using distilled water and containing five animals. In Group II, six animals were administered 0.5 mg / kg / day of pesticide chlorpyrifos and group III, with seven animals at a dose of 1mg/kg/day of the same pesticide. The three groups were under experiment for 10 days. For analysis of the results was performed functional analysis of the vestibular system by electronystagmography (caloric test - with ice water) and histopathological analysis by scanning electron microscopy. The results showed no statistically significant difference for the variable frequency of appearance of nystagmus and angular velocity of the slow component in electronystagmography, and the number of ciliary tufts histologically by scanning electron microscopy. It was concluded that the organophosphate chlorpyrifos did not cause damage to the vestibular system of the guinea pigs at the doses tested in acute exposure. / Algumas substâncias químicas têm causado muitos danos ao ser humano e ao meio ambiente. Dentre estas substâncias encontram-se os compostos químicos do tipo agrotóxicos, frequentemente considerados como responsáveis por intoxicações a trabalhadores, tornando isto um problema de saúde pública. O objetivo geral deste estudo consistiu em verificar se o organofosforado clorpirifós teve influência no sistema vestibular de cobaias em exposição aguda. Tratou-se de uma pesquisa experimental. A pesquisa utilizou 18 cobaias albinas da espécie Cavia porcellus, divididas em três grupos; sendo o grupo I o controle dos demais, utilizando água destilada e contendo cinco animais. No grupo II, com seis animais, foi administrada a dose de 0,5mg/kg/dia de agrotóxico clorpirifós e no grupo III, com sete animais a dose de 1mg/kg/dia do mesmo agrotóxico. Os três grupos estiveram sob experimento durante 10 dias. Para análise dos resultados foi realizada a análise funcional do sistema vestibular através da eletronistagmografia (prova calórica com água gelada) e a análise histopatológica através da microscopia eletrônica de varredura. Os resultados não demonstraram diferença estatística significante para as variáveis frequência de aparecimento de nistagmo e velocidade angular da componente lenta na eletronistagmografia; e no número de tufos ciliares na análise histopatológica por microscopia eletrônica de varredura. Concluiu-se que o organofosforado clorpirifós não ocasionou dano ao sistema vestibular das cobaias nas doses testadas em exposição aguda.

[ES] La presente Tesis Doctoral tiene dos objetivos claramente diferenciados, siendo el primero de ellos la realización de un estudio de optimización de la síntesis de nanoestructuras de óxido de wolframio (WO3) mediante el uso de un diseño de experimentos, mientras que el segundo de ellos es el uso de estas nanoestructuras en la degradación fotoelectrocatalítica de 4 pesticidas organofosforados de diferentes subfamilias (diazinon, fosmet, clorfenvinfos y fenamifos). El uso del óxido de wolframio como fotocatalizador en el proceso fotoelectrocatalítico (FEC) despierta un gran interés, ya que se trata de un semiconductor con gran fotoestabilidad en electrolitos acuosos ácidos, excelente conductividad eléctrica, tiene la capacidad de absorber la parte azul del espectro visible además de la luz ultravioleta, y el borde superior de la banda de valencia es mayor que el potencial de oxidación de H2O/O2. Todo ello hace que el WO3 sea capaz de fotooxidar eficazmente una amplia gama de compuestos orgánicos. Las nanoestructuras estudiadas en la Tesis Doctoral se sintetizaron mediante anodizado electroquímico, ya que se trata de una técnica sencilla que permite un control de sus parámetros de manera fácil y efectiva, permitiendo obtener las nanoestructuras directamente sobre el propio sustrato metálico. Además, la necesidad de controlar y eliminar los contaminantes emergentes en el medio ambiente se ha vuelto cada vez más crucial durante las últimas décadas. Así, en esta Tesis se han degradado 4 pesticidas tóxicos y persistentes en el medioambiente mediante la técnica de fotoelectrocatálisis (FEC) utilizando las nanoestructuras de WO3. En esta técnica, los fenómenos electrolíticos y fotocatalíticos actúan juntos para mineralizar el contaminante orgánico. Además, la FEC está atrayendo la atención de los investigadores por su capacidad para degradar contaminantes orgánicos y transformarlos en compuestos inocuos con condiciones de trabajo no extremas. Por tanto, en el diseño de experimentos realizado en la Tesis Doctoral se modificaron 3 variables con tres niveles cada una, por tanto se escogió un diseño 33. Las variables que se modificaron fueron el electrolito utilizado durante el anodizado, la temperatura y atmosfera en el proceso de post-anodizado (tratamiento térmico), obteniendo de esta manera nanoestructuras con diferentes propiedades tanto estructurales como fotoelectroquímicas. Los resultados obtenidos mostraron que las nanoestructuras que presentan mejores propiedades morfológicas y fotoelectroquímicas, y con una estructura cristalina más adecuada fueron las obtenidas con el ácido metanosulfónico (CH4O3S) como electrolito y calentadas en el proceso de post-anodizado a 600 ¿C y en atmósfera de aire. Con estas nanoestructuras optimizadas, se realizó el proceso de degradación de los 4 pesticidas seleccionados mediante fotoelectrocatálisis. En este proceso, se partió de una concentración inicial de 20 ppm en todos los pesticidas, haciéndose un seguimiento del pesticida mediante UV-Visible y cromatografía líquida de ultra alto rendimiento acoplada a la espectrometría de masas (UHPLC-MS/Q-TOF). Tras 24 horas de ensayo se consiguió degradar el diazinón hasta 2 ppm (consiguiendo un 90% de degradación), el clorfenvinfos se degradó hasta 1 ppm (consiguiendo un 95% de degradación) y el fosmet y fenamifos se degradaron al 100%. Para cada uno de los pesticidas se ha propuesto una ruta de degradación según los compuestos intermedios identificados mediante el UHPLC-MS/Q-TOF, dando como resultado final moléculas más pequeñas y más inocuas para los seres humanos y para el medioambiente. / [CA] La present tesi doctoral té dos objectius clarament diferenciats, sent el primer la realització d'un estudi d'optimització de la síntesi de nanoestructures d'òxid de wolframi (WO3) mitjançant l'ús d'un disseny d'experiments, mentre que el segon és l'ús d'aquestes nanoestructures en la degradació fotoelectrocatalítica de quatre pesticides organofosforats de diferents subfamílies (diazinon, fosmet, clorfenvinfòs i fenamifòs). L'ús de l'òxid de wolframi com a fotocatalitzador en el procés fotoelectrocatalític (FEC) desperta un gran interès, ja que es tracta d'un semiconductor amb gran fotoestabilitat en electròlits aquosos àcids; amb una excel·lent conductivitat elèctrica; té la capacitat d'absorbir la part blava de l'espectre visible, a més de la llum ultraviolada, i la vora superior de la banda de valència és major que el potencial d'oxidació d'H2O/O2. Tot això fa que el WO3 siga capaç de fotooxidar eficaçment una àmplia gamma de compostos orgànics. Les nanoestructures estudiades en la tesi doctoral es van sintetitzar mitjançant anodització electroquímica, ja que es tracta d'una tècnica senzilla que permet un control dels seus paràmetres de manera fàcil i efectiva, i permet obtenir les nanoestructures directament sobre el mateix substrat metàl·lic. A més, la necessitat de controlar i eliminar els contaminants emergents en el medi ambient s'ha tornat cada vegada més crucial durant les últimes dècades. Així, en aquesta tesi s'han degradat quatre pesticides tòxics i persistents en el medi ambient mitjançant la tècnica de la fotoelectrocatàlisi (FEC) utilitzant les nanoestructures de WO3. En aquesta tècnica, els fenòmens electrolítics i fotocatalítics actuen junts per a mineralitzar el contaminant orgànic. La FEC està atraient l'atenció del personal investigador per la seua capacitat per a degradar contaminants orgànics i transformar-los en compostos innocus amb condicions de treball no extremes. Per tant, en el disseny d'experiments realitzat en la tesi doctoral es van modificar tres variables amb tres nivells cadascuna, per tant, es va triar un disseny 33. Les variables que es van modificar van ser: l'electròlit utilitzat durant l'anodització, la temperatura i l'atmosfera en el procés de postanodització (tractament tèrmic), i es van obtenir d'aquesta manera nanoestructures amb diferents propietats, tant estructurals com fotoelectroquímiques. Els resultats obtinguts van mostrar que les nanoestructures que presenten millors propietats morfològiques i fotoelectroquímiques, i amb una estructura cristal·lina més adequada, van ser les obtingudes amb l'àcid metanosulfònic (CH4O3S) com a electròlit, i calfades en el procés de postanodització a 600 ¿C i en atmosfera d'aire. Amb aquestes nanoestructures optimitzades, es va realitzar el procés de degradació dels quatre pesticides seleccionats mitjançant fotoelectrocatàlisi. En aquest procés, es va partir d'una concentració inicial de 20 ppm en tots els pesticides, i es va fer un seguiment del pesticida mitjançant UV visible i cromatografia líquida d'ultraalt rendiment acoblada a l'espectrometria de masses (UHPLC-MS/Q-TOF). Després de 24 hores d'assaig, es va aconseguir degradar el diazinon fins a 2 ppm (es va assolir un 90% de degradació), el clorfenvinfòs es va degradar fins a 1 ppm (es va assolir un 95% de degradació) i el fosmet i el fenamifòs es van degradar al 100%. Per a cadascun dels pesticides s'ha proposat una ruta de degradació segons els compostos intermedis identificats mitjançant l'UHPLC-MS/Q-TOF, que dona com a resultat final molècules més xicotetes i més innòcues per als éssers humans i per al medi ambient. / [EN] This Doctoral Thesis has two clearly differentiated objectives. The first objective is to carry out an optimization study of the synthesis of tungsten oxide nanostructures (WO3) using a design of experiments. The second objective is to use of these nanostructures in the photoelectrocatalytic degradation of 4 organophosphate pesticides of different subfamilies (diazinon, phosmet, chlorfenvinphos and fenamiphos). The use of tungsten oxide as a photocatalyst in the photoelectrocatalytic (PEC) process arouses great interest, since it is a semiconductor with great photostability in acidic aqueous electrolytes, excellent electrical conductivity, it has the ability to absorb the blue part of the visible spectrum in addition to ultraviolet light, and the upper edge of the valence band is greater than the oxidation potential of H2O / O2. All this makes WO3 capable of efficiently photo-oxidizing a wide range of organic compounds. The nanostructures studied in the Doctoral Thesis were synthesized using electrochemical anodization, since it is a simple technique that permits the control their parameters easily and effectively, allowing the nanostructures to be obtained directly on the metal substrate itself. Furthermore, the need to control and eliminate emerging pollutants in the environment has become increasingly crucial over the past decades. Thus, in this Thesis, 4 toxic and persistent pesticides in the environment have been degraded by the photoelectrocatalysis (PEC) technique using the WO3 nanostructures. In this technique, the electrolytic and photocatalytic phenomena act together to mineralize the organic contaminant. PEC is attracting the attention of researchers for its ability to degrade organic pollutants and transform them into harmless compounds under non-extreme working conditions. Therefore, in the design of experiments carried out in the Doctoral Thesis, 3 variables were modified with three levels each one, therefore a 33 design was chosen. The variables that were modified were the electrolyte used during the anodization, the temperature and the atmosphere in the post-anodization process (annealing treatment), thus obtaining nanostructures with different structural and photoelectrochemical properties. The results obtained showed that the nanostructures with the best morphological and photoelectrochemical properties, and with adequate crystalline structure werethose obtained with methanesulfonic acid (CH4O3S) as electrolyte and annealed in the post-anodization process at 600 ¿C and in an air atmosphere. With these optimized nanostructures, the degradation process of the 4 selected pesticides was carried out by photoelectrocatalysis. This process started from an initial concentration of 20 ppm in all pesticides, using UV-Visible and Ultra-High Performance Liquid Chromatography coupled to Mass Spectrophotometry (UHPLCMS / Q-TOF) to monitoring the process. After 24 hours of experiment, the diazinon was degraded to 2 ppm (achieving 90% degradation), chlorfenvinphos was degraded to 1 ppm (achieving 95% degradation) and phosmet and fenamiphos were 100% degraded. For each of the pesticides, a degradation route has been proposed according to the intermediate compounds identified by UHPLC-MS/Q-TOF, resulting in smaller and more innocuous molecules for humans and the environment. / Agradezco a la Generalitat Valenciana y al Fondo Social Europeo por la ayuda predoctoral recibida para la realización de la presente Tesis Doctoral (ACIF 159- 2018) así como para la realización de una estancia predoctoral en la Universidad de Lisboa. También quiero agradecer al Ministerio de Economía, Industria y Competitividad, por la concesión de los proyectos CTQ2016-79203-R (2016) y PID2019-105844RB-I00 (2019) en los cuales he podido participar durante la Tesis Doctoral. / Roselló Márquez, G. (2021). Eliminación de pesticidas organofosforados mediante fotoelectrocatálisis con fotoánodos de WO3 [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/174712 / TESIS