A paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica e endêmica em diversos países da América Latina, é um importante problema de saúde pública. Embora exista tratamento, o mesmo é prolongado e casos de recidiva são comuns. Nesse sentido, o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas, como as vacinas, são importante. Além disso, é imprescindível compreender a participação de algumas células na resposta vacinal. Desse modo, o objetivo dessa tese foi comprovar se os neutrófilos são importantes para a resposta vacinal utilizando modelo experimental de paracoccidioidomicose. Nós observamos que a vacina terapêutica reduziu a carga fúngica pulmonar em animais com 15 ou 30 dias de infecção. Além disso, foi observado redução de neutrófilos e formação de NETs nos pulmões dos animais infectados por 15 dias. Assim, nós concluímos que a vacina pode alterar a infiltração dos neutrófilos no local da infecção e isso parece depender do tempo de infecção. Além disso, nós observamos que os neutrófilos parecem ter um envolvimento durante o momento em que a vacina é administrada. / Paracoccidioidomycosis, a systemic mycosis and endemic in several Latin American countries, is an important public health problem. Although there is treatment, it is prolonged and cases of relapse are common. In this sense, the development of new therapeutic approaches, such as vaccines, are important. In addition, it is imperative to understand the participation of some cells in the vaccine response. Thus, the aim of this thesis was to verify if neutrophils are important for the vaccine response using an experimental model of paracoccidioidomycosis. We observed that the therapeutic vaccine reduced lung fungal load in animals with 15 or 30 days of infection. In addition, neutrophil reduction and NET formation were observed in the lungs of infected animals for 15 days. Thus, we conclude that the vaccine may alter the infiltration of neutrophils at the site of infection and this seems to depend on the time of infection. In addition, we note that neutrophils appear to be involved during the time the vaccine is administered.

Paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença sistêmica granulomatosa causada pelo fungo termo-dimórfico Paracoccidioides brasiliensis. A gp43 é o principal antígeno diagnóstico que contém o peptídeo de 15 aminoácidos designado como P10, que desenvolve a resposta imune do tipo Th1 dependente de IFN-<font face=\"Symbol\">g. No presente trabalho, comparamos a efetividade de diferentes adjuvantes em camundongos BALB/c infectados intratraquealmente com o isolado virulento Pb18. Alúmen, Adjuvante Completo e Incompleto de Freund, FliC flagelina e o lipídeo catiônico, foram testados em associação ou não com P10. Após 52 dias de infecção, o lipídeo catiônico mostrou os melhores resultados, com o menor número de UFCs, redução de fibrose e baixo número de células fúngicas no tecido pulmonar, além do incremento significativo de IFN-<font face=\"Symbol\">g e TNF-<font face=\"Symbol\">a e a redução dos níveis de IL-4 e IL-10. Estes resultados sugerem que a interação do peptídeo P10 com o lipídeo catiônico pode gerar uma melhor resposta imune mediada por células do tipo Th1, evitando a rápida disseminação da PCM experimental. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous disease caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis. The gp43 is the major diagnostic antigen that contains the peptide P10. This peptide has 15 amino acids and develops a Th1- dependent IFN-<font face=\"Symbol\">g immune response. In this work, we compare the effectiveness of different adjuvants in BALB/c mice infected intratracheally with virulent isolate Pb18. Alum, Complete Adjuvant and Incomplete Freund\'s adjuvant, fliC flagellin from Salmonella enterica and cationic lipid were tested in combination or not with P10. After 52 days of infection, the cationic lipid showed the best results with the least number of colony forming units, reduction of fibrosis, low number of fungal cells in lung tissue and the significant increase of IFN-<font face=\"Symbol\">g and TNF-<font face=\"Symbol\">a with reduced levels of IL-4 and IL-10. These results suggest that, the interaction of peptide P10 with cationic lipids can lead to a better immune response mediated by Th1 type cells by avoiding the rapid spread of experimental PCM.

Glicoesfingolipídios (GSLs) podem se inserir em regiões específicas das membranas (lipid rafts) quando adicionados em culturas celulares, modulando sua função. Nós avaliamos se GSLs de Paracoccidioides brasiliensis, glucosilceramida (CMH) e glicoinositolfosfoceramida (GIPC) possuem atividade imuno-moduladora. Foram estudados indivíduos com (grupo curado) ou sem histórico de paracoccidioidomicose (grupo controle). CMH elevou a expressão de CD80 e CD86 em monócitos, a linfoproliferação em PBMCs no grupo controle e reduziu a capacidade de DCs em induzir linfoproliferação. No grupo curado, CMH inibiu proliferação em culturas com CMA e gp43, reduziu a produção de IL-10 por DCs e aumentou a produção de IL-12. Já GIPC aumentou a produção de citocinas Th1, elevou a fagocitose de leveduras, reduziu a maturação de DCs e sua capacidade de induzir linfoproliferação. A avaliação de células iNKT não mostrou diferença no número de células, na expansão e produção de citocinas entre os grupos. Em conclusão, GSLs de P. brasiliensis alteram a função de células do sistema imune. / Glycosphingolipids (GSL) may insert into specific membrane regions (lipid rafts) when added to cell culture, modulating its function. We evaluated whether glucosylceramide (CMH) and glycoinositol-phosphoceramide (GIPC), extracted from Paracoccidioides brasiliensis, are able to modulate immune cells functions of cured paracoccidioidomycosis (PCM) patients (control group) or individuals who never had PCM (cured group). CMH increased CD80 and CD86 expression on monocytes, increased lymph-proliferation on PBMCs and reduced lympho-proliferation in co-cultures with dendritic cells (DCs). In cured groups, CMH decreased gp43 and CMA- induced lymph proliferation, reduced IL-10 and increased IL-12 production by DCs. GIPC increased phagocytic capacity, reduced the maturation levels on DCs and DC capacity to induce lymph-proliferation. iNKT cells were analyzed and there were no differences in iNKT cells number, expansion capacity and cytokines production among the groups. In conclusion, GSL extracted from P. brasiliensis are able to modulate immune cells functions.

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença sistêmica de caráter granulomatoso, causada pelo fungo termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis. A PCM é endêmica nas Américas do Sul e Central. Vacina de DNA é uma abordagem promissora e atual na imunoterapia. O peptídeo P10 contem um epítopo da gp43 reconhecido por linfócitos T-CD4+ e é protetor contra a PCM experimental. No presente trabalho analizamos o uso de vacinas de DNA usando vetores de expressão de P10, IL-12 e HSP60 em camundongos infectados intratraquealmente (i.t.) com P. brasiliensis. Esquema Profilático: camundongos BALB/c foram imunizados com pCDNA3 com sequências codificadoras de P10, HSP60 ou IL-12 e foram infectados i.t com 3x105 leveduras do isolado Pb18. Esquema Terapêutico: Camundongos BALB/c e B10.A foram infectados i.t. e após 30 dias foram submetidos à imunização por 4 semanas, ou 5 meses somente para B10.A, com pCDNA3 codificando P10 e/ou IL-12. Níveis de anticorpos, unidades formadoras de colônias (UFC) e produção de citocinas foram analizados. Foi observada redução significativa de UFC nos pulmões dos camundongos imunizados com vetor contendo P10/IL-12. A histopatologia dos pulmões mostrou áreas preservadas e redução de inflamação nestes animais. O nível de citocinas nos pulmões mostrou aumento de IFN-g e IL-12 caracterizando uma resposta Th1. Tratamento de animais B10. A com pP10 até 5 meses, reduziu o número de leveduras infectantes perto de esterilização. / Paracoccidiodomycosis (PCM) is a systemic granulomatous disease caused by the thermo-dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis. It is widespread in South and Central America. Gene therapy is a promising approach to Ag-specific immunotherapy. Peptide 10 contains the T-cell epitope of gp43 and is protective against experimental infection in mice. Presently, we analyzed the used of DNA-based vaccine encoding P10, IL-12 and HSP60 in mice intratracheally infected with P. brasiliensis. Prophylactic protocol: BALB/c mice were immunized with pCDNA3 encoding P10, HSP60 or IL-12 prior to intratracheal infection with 3x105 yeast cells of isolate Pb18. Therapeutic protocol: BALB/c and B10. A mice were infected and after 30 days, they were immunized for 4 weeks, or 5 months for B10.A only, with pCDNA3 encoding P10 and/or IL-12. Antibody titers in sera, colony forming units (CFU) and cytokine production were measured. A significant reduction of CFU in the lungs of mice immunized with plasmid encoding P10/IL-12 was observed. The lung histopathology confirmed the results showing preserved areas and reduction of inflammation in vaccinated animals. The cytokine levels in lungs showed enhanced levels of IFN-g and IL-12 characterizing a Th1 response. Further treatment of B10.A mice up to 5 months with pP10 reduced the number of infective yeasts close to sterilization.

Cetaceans are sentinels of the marine environment, currently threatened by many factors, mainly anthropogenic. The most easily identified compromising conditions are those affecting the skin and external mucosae - good indicators of the cetaceans health status. Cutaneous and mucocutaneous lesions have been extensively reported in wild and captive cetaceans, but little is known about the involved etiological factors, evolution of the dermatological lesions and their systemic consequences. Viruses are the most commonly involved agents in cutaneous and mucocutaneous lesions, especially herpesviruses (HV) and, associated with skin and mucosal lesions with varying morphologies, and cetacean poxviruses (CePV), mainly associated with characteristic tattoo or ring skin lesions. In addition, fungal agents are also recognized as causative agents of dermatological disease in cetaceans, especially in the process known as paracoccidioidomycosis ceti, observed as raised proliferative whitish lesions, caused by non cultivable yeast of Paracoccidioides brasiliensis (order Onygenales). Despite being reported worldwide, the occurrence of these etiological agents in southern Atlantic cetaceans is still poorly understood. The goal of this study was to identify and characterize selected cutaneous and mucocutaneous pathogens (HV, CePV and P. brasiliensis) of free-ranging cetaceans from Brazil, and to design more sensitive diagnostic methods for their detection. All the studied cetaceans stranded along the coast of Brazil, between 2005 and 2015, except three wild riverine dolphins that were physically contained and released after sample collection. In order to achieve our goals, we employed molecular, histopathological, and occasionally immunohistochemical and electron microscopy techniques. The presence of HV and CePV was evaluated in cutaneous, and oral and genital mucosal samples from 115 specimens and skin samples from 113 individuals, respectively; whereas the presence of members of the genus Onygenales sp. was evaluated in four specimens presenting macroscopic compatible lesions. Skin or oral mucosal samples from four animals were HV PCR-positive: a whitish ulcerated skin lesion from a Guiana dolphin (Sotalia guianensis), a lingual sample from an Atlantic spotted dolphin (Stenella frontalis), ulcerative lesions and healthy skin samples from a dwarf sperm whale (Kogia sima), and a proliferative skin lesion from a Bolivian river dolphin (Inia boliviensis). The tree first animals were infected with alphaherpesvirus. A sequence more similar to gammaherpesvirus was obtained from the Bolivian river dolphins proliferative skin lesion. The Bolivian river dolphin sequence could possibly be a member of a new gammaherpesvirus genus. Additionally, all other available tissue samples from HV-positive specimens, aside from skin and oral mucosa, were also tested by PCR and histologically evaluated. A different alphaherpesvirus sequence was found in the stomach and in a mesenteric lymph node of the dwarf sperm whale. Microscopic findings in two HV-positive animals (chronic proliferative dermatitis in Bolivian river dolphin and Guiana dolphin) were compatible with HV. CePV was identified in tattoo skin lesions of an Atlantic bottlenose dolphin and a Guiana dolphin by established molecular methods, and poxviral particles were observed by electron microscopy. CePV-positive animals presented epidermal ballooning degeneration and occasionally small, pale eosinophilic or amphophilic intracytoplasmic inclusions, compatible with CePV. Specific amino acid motifs for all CePV were also identified, reinforcing the suggestion of the new Cetaceanpoxvirus genus. We also designed novel SYBR&reg; Green real-time and conventional CePV PCR methods significantly more sensitive than those currently available in the literature. An additional Guiana dolphin, previously negative based in established PCR methods was diagnosed positive for CePV through these new techniques. Refractile yeasts (49 &micro;m in diameter) were observed under light microscopy in mild granulomatous and necrotic skin lesions of four Atlantic bottlenose dolphin, and for the first time, in a skeletal muscle abscess (the former possibly indicating the invasive potential of the agent). Onygenales sp. yeasts were identified in skin lesions by immunohistochemistry and a sequence of P. brasiliensis, more similar (100% nucleotide identity) to the one described in an Atlantic bottlenose dolphin from Cuba than to human or any other terrestrial mammals cases in Brazil, was obtained from the skin lesion of one of the specimens, confirming the etiological agent of these type of lesions. Herein we report the first molecular identification of HV in South American cetaceans and in riverine dolphins worldwide. This study also describes the first amplification of CePV and P. brasiliensis in odontocetes from South America. Four of the five novel herpesvirus sequences herein identified are possibly novel species, tentatively named Delphinid HV-10, Kogiid HV-2, Kogiid HV-3 and Iniid HV-1. / Cetáceos são sentinelas do ambiente marinho, atualmente ameaçados por diversos fatores, principalmente antropogênicos. Os processos de pele e mucosas externas são os mais facilmente identificados, bons indicadores do estado de saúde em cetáceos. Lesões cutâneas e mucocutâneas já foram amplamente relatadas em cetáceos de vida livre e de cativeiro, mas pouco se sabe a respeito dos fatores etiológicos envolvidos, evolução das lesões dermatológicas e suas consequências sistêmicas. Vírus são os agentes mais comumente envolvidos em lesões cutâneas e mucocutâneas, especialmente os herpesvírus (HV), associados a lesões de morfologias variáveis em mucosas, e poxvírus dos cetáceos (Cetacean Poxvirus CePV), principalmente associados a lesões de pele tatuagem ou anel características. Agentes fúngicos também podem causar doenças dermatológicas em cetáceos, como por exemplo a paracoccidioidomicose ceti, caracterizada por lesões esbranquiçadas elevadas e proliferativas, causada por leveduras não-cultiváveis de Paracoccidioides brasiliensis (ordem Onygenales). Apesar de mundialmente reportados, a ocorrência desses agentes etiológicos em cetáceos do Atlântico Sul ainda é pouco compreendida. O objetivo desse estudo foi identificar e caracterizar patógenos cutâneos e mucocutâneos selecionados (HV, CePV e P. brasiliensis) de cetáceos brasileiros de vida livre e desenhar métodos diagnósticos mais sensíveis para sua detecção. Todos os animais estudados encalharam ao longo da costa brasileira, entre 2005 e 2015, exceto por três botos-cor-de-rosa que foram fisicamente imobilizados e liberados após a coleta de amostras. Para atingir tais objetivos, empregamos técnicas moleculares e histológicas, e ocasionalmente de imunohistoquímica e microscopia eletrônica. A presença de HV e CePV foi avaliada, respectivamente, em amostras cutâneas e de mucosa oral e genital de 115 espécimes, e amostras de pele de 113 indivíduos; enquanto a presença de membros da ordem Onygenales foi avaliada em quatro espécimes que apresentavam lesões macroscópicas compatíveis. Amostras de pele ou de mucosa oral de quatro animais foram positivas para a PCR de HV: uma lesão ulcerada de pele de coloração esbranquiçada de um boto-cinza (Sotalia guianensis), uma amostra de tecido lingual de um golfinho-pintado-do-Atlântico (Stenella frontalis), lesões ulcerativas e amostras de pele saudável de um cachalote-anão (Kogia sima), e uma lesão proliferativa de pele em boto-vermelho-boliviano (Inia boliviensis). Os primeiros três animais estavam infectados com alphaherpesvirus. Uma sequência mais similar com gammaherpesvírus foi obtida da lesão proliferativa de pele do boto-vermelho-boliviano. A sequência do boto-vermelho-boliviano possivelmente pertence a um novo gênero de gammaherpesvírus. Ademais, todas as outras amostras de tecidos disponíveis dos espécimes HV-positivos, à parte de pele e mucosa oral, também foram avaliadas por técnicas de PCR e histológicas. Uma sequência diferente de alphaherpesvírus foi encontrada no estômago e em um linfonodo mesentérico do cachalote-anão. Achados microscópicos em dois animais HV-positivos (dermatites proliferativas em boto-vermelho-boliviano e boto-cinza) eram compatíveis com HV. CePV foi identificado em lesões de pele do tipo tattoo de um golfinho-nariz-de-garrafa (Tursiops truncatus) e de um boto-cinza por meio de técnicas moleculares estabelecidas, e observação de partículas de poxvírus por microscopia eletrônica. Animais CePV-positivos apresentavam degeneração balonosa epidérmica e ocasionais inclusões intracitoplasmáticas anfofílicas ou eosinofílicas compatíveis com CePV. Motivos aminoácidos específicos para todos os CePVs também foram identificados, reforçando a sugestão de um novo gênero, chamado Cetaceanpoxvirus. Nesse estudo também foram desenvolvidas novas técnicas de PCR convencional e real-time com SYBR&reg; Green, significativamente mais sensíveis do que os métodos atualmente disponíveis em literatura. Um boto-cinza, inicialmente negativo segundo os métodos de PCR previamente conhecidos foi diagnosticado positivo para CePV por meio das novas técnicas aqui descritas. Leveduras refratáveis (49 &micro;m de diâmetro) foram observadas á microscopia sob a forma de lesões de pele granulomatosas moderadas e necróticas em quatro golfinhos-nariz-de-garrafa, e pela primeira vez, em um abscesso muscular (esse último um indício do potencial invasivo desse agente). Leveduras de Onygenales sp. foram identificadas em lesões de pele por meio de imunohistoquímica e uma sequência de P. brasiliensis mais semelhante (100% de identidade de nucleotídeos) áquela descrita em um gofinho-nariz-de-garrafa de Cuba do que a casos de humanos e mamíferos descritos no Brasil, foi encontrada em lesões de pele de um dos espécimes. Esse estudo relata a primeira identificação molecular de HV em cetáceos da América do Sul e em golfinhos de rio no mundo. Além disso, descrevemos a primeira amplificação de CePV e P. brasiliensis em odontocetes da América do Sul, confirmando a etiologia desse tipo de lesões. Quatro das cinco novas sequências de HV identificadas são possivelmente novas espécies, provisoriamente chamadas Delphinid HV-10, Kogiid HV-2, Kogiid HV-3 e Iniid HV-1.

A paracoccidioidomicose é uma micose sistêmica de natureza profunda que afeta preferencialmente o tecido pulmonar podendo disseminar via linfo-hematogênica para outros órgãos e tecidos, sendo causada principalmente pelo Paracoccidioides brasiliensis, fungo que apresenta dimorfismo térmico. O sistema imune inato mediado por macrófagos é extremamente importante para o controle de infecções e está envolvido na indução e regulação da resposta imune/inflamatória. Estas células são capazes de reconhecer patógenos por meio de receptores de reconhecimento de padrões (PRRs), tais como receptores Toll-like (TLR). Além desses PRRs, recentemente, demonstrou-se a importância da via de sinalização Notch no sistema imune inato e na regulação da atividade dos macrófagos. Nossos dados demonstram que a cepa Pb18 do P. brasiliensis é capaz de ativar o receptor Notch1 em macrófagos J774. A ativação desse receptor concomitante com a ativação de TLR 4 (via LPS) induz a produção de IL-6, e apresenta elevada carga fúngica e menor fagocitose, o que favorece a patogenia. Ao utilizarmos um inibidor farmacológico da &#947;-secretase (DAPT) para inibir a ativação do receptor Notch1 em macrófagos, é possível observar diminuição da carga fúngica, diminuição de IL-6, aumento de TNF-&#945; e aumento da fagocitose. Entretanto, a ausência do receptor TLR 4 em macrófagos derivados de medula óssea de camundongos TLR 4-/-, na presença de DAPT, percebe-se diminuição da capacidade fagocítica desses macrófagos e também diminuição da carga fúngica, evidenciando a relação entre TLR 4 e Notch1. Em adição, realizamos um tratamento em camundongos BALB/c com DAPT previamente à infecção com Pb18. Nossos resultados evidenciaram que animais com este tratamento apresentaram diminuição da carga fúngica dos pulmões, diminuição de IL-6, ativação de macrófagos e aumento de IgG, após 45 dias de infecção, indicando um perfil de cura desses animais. O mesmo tratamento foi realizado em camundongos BALB/c NUDE, seguido da infecção com Pb18. Nestes animais, verificamos que há maior produção de citocinas pró-inflamatórias no pulmão, aumento de células CD19+ e a carga fúngica dos animais tratados manteve-se similar ao dos animais não tratados, indicando que o perfil protetor observado em animais com DAPT é dependente da resposta das células T. Juntos, esses resultados evidenciam que o Pb18 é capaz de ativar o receptor Notch1 em macrófagos e utiliza a via de sinalização Notch-TLR 4 como um possível mecanismo de escape, podendo fornecer uma nova abordagem de estudo da imunidade envolvida na paracoccidioidomicose experimental. / Paracoccidioidomycosis is a systemic mycosis of deep nature that primarily affects the lung and can spread via lymphatic and hematogenous to other organs and tissues. It is mainly caused by Paracoccidioides brasiliensis fungus which exhibit thermal dimorphism. The innate immune system mediated by macrophages is extremely important for the control of infection and is involved in the induction and regulation of immune/inflammatory response. These cells are able to recognize pathogens through pattern recognition receptors (PRRs) such as Toll-like receptors (TLR). Beyond these PRRs, the importance of Notch signaling has recently been demonstrated in the innate immune system and the regulation of macrophage activity. Our data demonstrate that the Pb18 strain of P. brasiliensis is able to activate the Notch1 receptor in J774 macrophages. Activation of this receptor with also activation of TLR 4 (via LPS) induces IL-6 production, induces phagocytosis and decreases fungal burden, which favors the pathogenesis. By using a &#947;-secretase pharmacological inhibitor (DAPT) for inhibiting the activation of Notch1 receptor on macrophages, it is possible to observe decreased fungal burden, less production of IL-6, and increased TNF-&#945; and phagocytosis. However, due to the absence of TLR 4 receptor in bone marrow derived macrophages from TLR 4-/- mice, these macrophages showed decreased phagocytic ability and also reduced fungal burden in the presence of DAPT, showing a relationship between TLR 4 and Notch1. In addition, we made a treatment with DAPT in BALB/c mice prior to infection with Pb18. And our results showed that DAPT-treated animals exhibited a decrease of fungal burden in the lungs, and a decrease of IL-6. Furthermore, we observed an increase of IgG after 45 days of infection, indicating probably a healing of these animals. Same treatment was made in BALB/c NUDE mice, followed by infection with Pb18. In these animals, we observed an increased production of proinflammatory cytokines in the lung and increased CD19+ cells, but fungal burden was similar in both group (treated and untreated), which indicates that treatment with DAPT is dependent on T cell response. Taken together, these results showed that Pb18 is able to activate the Notch 1 receptor on macrophages and uses the Notch-TLR 4 signaling pathway as a possible escape mechanism, and may provide a new immunity study approach in experimental paracoccidioidomycosis.

O Paracoccidioides brasiliensis é o agente causador da paracoccidioidomicose, a micose sistêmica mais prevalente na América Latina. Este trabalho teve como objetivo atenuar a forma leveduriforme do P. brasiliensis por irradiação gama para estudos posteriores na pesquisa de vacina. Atualmente não há nenhuma vacina eficaz. As culturas do P.brasiliensis (cepa Pb-18) foram irradiadas com doses entre 0,5 e 8,0kGy. Depois de cada dose os fungos foram plaqueados e após 10 dias as unidades formadoras de colônias (UFC) contadas. A viabilidade das células irradiadas foi avaliada utilizando-se os corantes verde Janus e azul de metileno. A síntese de proteína foi analisada pela incorporação 35S- Metionina. A comparação entre o perfil antigênico das leveduras controle e irradiadas foi feita através do Western blot e a atenuação da virulência foi analisada através da inoculação dessas leveduras em camundongos C57Bl/J6 and Balb/c. Mudanças morfológicas nas leveduras irradiadas foram avaliadas por microscopia eletrônica (transmissão e varredura), e a integridade do DNA foi avaliada por eletroforese em gel de agarose. Na dose de 6,5kGy as leveduras perderam a capacidade reprodutiva. A viabilidade e a incorporação de 35S- Metionina foi similar nos controles e nas células irradiadas com 6,5kGy, mas nesta dose as leveduras secretaram 40% menos proteína. O DNA apresentou-se degradado e esse dano não foi reparado O perfil do Western blot das leveduras controle, foi idêntico aos das leveduras irradiadas com 6,5kGy. Nenhuma UFC foi recuperada dos tecidos dos camundongos infectados com a levedura radioatenuada. A microscopia eletrônica de transmissão mostrou significativas alterações no núcleo das células irradiadas. A microscopia eletrônica de varredura mostrou que duas horas após a irradiação as células apresentavam-se colapsadas e com dobras profundas na superfície das células, entretanto esses danos foram reversíveis. Concluiu-se que para as células leveduriformes do P. brasiliensis foi possível encontrar uma dose na qual o patógeno perdeu sua capacidade reprodutiva e virulência, enquanto reteve sua viabilidade, atividade metabólica e perfil antigênico. / Paracoccidioides brasiliensis is the agent of paracoccidioidomycosis, the most prevalent mycosis in Latin America, and currently there is no effective vaccine. The aim of this work was to attenuate the yeast form of P. brasiliensis by gamma irradiation for further studies on vaccine research. P. brasiliensis (strain Pb-18) cultures were irradiated at doses between 0.5 and 8.0kGy. After each dose the fungal cells were plated and after 10 days the colony forming units (CFU) counted. The viability of the irradiated cells was measured using the dyes Janus green and methylene blue, and protein synthesis by incorporation of L 35S methionine. The comparison between the antigenic profile of irradiated and control yeast was made by Western blot and the virulence evaluated by the inoculation in C57Bl/J6 and Balb/c mice. Morphological changes in irradiated yeast were evaluated by electronic microscopy and DNA integrity by electrophoresis in agarose gel. At 6.5kGy the yeast lost the reproductive capacity. The viability and the incorporation of L-35S methionine were the same in control and up to 6.5kGy irradiated cells, but 6.5kGy irradiated yeast secreted 40% less proteins. The Western blot profile was clearly similar in control and 6.5kGy irradiated yeast. No CFU could be recovered from the tissues of the mice infected with the radioattenuated yeast. At the dose of 6.5kGy the DNA was degraded and this damage was not repaired. The transmission electronic microscopy showed significant alterations in the nucleus of the irradiated cells. The scanning electronic microscopy showed that two hours after the irradiation the cells were collapsed or presented deep folds in the surface, however these injury were reversible. We concluded that for P. brasiliensis yeastcells it was possible to find a dose in which the pathogen loses its reproductive ability and virulence, while retaining its viability, metabolic activity and the antigenic profile.

Paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença granulomatosa sistêmica causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis. Aproximadamente 10 milhões de pessoas que vivem em áreas endêmicas estão infectadas com P. brasiliensis e até 2% destas podem desenvolver a PCM. Períodos extensos de quimioterapia são necessários e problemas de recidiva da doença são frequentes. Vacinas anti-PCM ainda não estão disponíveis para uso em humanos, porém, nos últimos anos, testes em modelo animal mostram que estratégias vacinais são viáveis. Formulações vacinais baseadas na proteína gp43 e no peptídeo P10 específico para células T CD4+ mostram-se promissores como antígenos vacinais. No presente trabalho, testamos as propriedades de uma formulação vacinal terapêutica baseada no peptídeo P10 combinado com flagelina de S. enterica, associada ou não a quimioterapia, como tratamento da PCM experimental. Os resultados indicaram que animais tratados apenas com a vacina, combinada ou não com os quimioterápicos, não demonstraram uma redução significativa da carga fúngica no pulmão. No entanto granulomas mais organizados foram observados no pulmão dos animais que receberam a formulação vacinal. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous disease caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis. Approximately 10 million people living in endemic areas may be infected with this fungus and up to 2% of them may develop the disease. Extended periods of chemotherapy are often necessary to treat PCM and relapses occur frequently. PCM vaccines are not yet available for use in humans, but in recent years tests in animal models showed that vaccine strategies are viable. Vaccine formulations based in protein gp43 and a derived peptide P10, representing a CD4+ T cell-specific epitope, have showed promising results as vaccine antigens. In the present work, we tested the properties of a vaccine formulation based on the P10 peptide admixed with the S. enterica flagellin, in combination or not with chemotherapy, as a PCM therapeutic treatment. Treated mice, combined or not with chemotherapy, showed no significant reduction in lung fungal burden. Nonetheless, more organized lung granulomas were observed in animals that received the vaccine formulation.

Como a imunoproteção na Paracoccidioidomicose (PCM) é principalmente mediada por células T, investigamos o impacto da deficiência de CD28, molécula co-estimulatória de linfócitos T, na gravidade da infecção primária e secundária pelo Paracoccidioides brasiliensis. Quando comparados a camundongos C57Bl/6 normais (WT), camundongos CD28-deficientes (CD28KO) apresentaram infecção mais grave associada à produção diminuída de anticorpos e citocinas. Além disso, a pré-imunização de animais deficientes e normais resultou em imunoproteção equivalente. Inesperadamente, a sobrevida de animais CD28KO foi significativamente maior que a dos WT, apesar da sua elevada carga fúngica tecidual. Em conclusão, nosso trabalho mostrou que a deficiência de CD28 resulta em PCM mais grave, porém não letal, associada a resposta imune deficiente. Além disso, verificamos que carga fúngica elevada, na ausência da imunidade adaptativa efetora, não ocasiona diminuição de sobrevida, revelando que a resposta imune na PCM pode tanto proteger como ser deletéria aos hospedeiros. / As immunoprotection in Paracoccidioidomycosis (PCM) is mainly mediated by T cells, and CD28 is a costimulatory molecule for T lymphocytes, we investigated the influence of CD28 deficiency in primary and secondary PCM. Compared with normal C57BL/6 mice, CD28-deficient (CD28KO) mice developed a more severe infection associated with impaired antibody and cytokine production. In addition, CD28KO and WT mice previously immunized by the s.c. route developed equivalent immunoprotection when challenged by the pulmonary route. Interestingly, CD28KO mice presented increased mean survival time despite their elevated fungal loads in the lungs. In conclusion, our work showed, for the first time, that CD28-deficiency results in more severe, but not overwhelming, PCM. Furthermore, in the absence of effector adaptative immunity, elevated fungal loads do not cause lethal infections, revealing the protective and deleterious effects of immune responses to Paracoccidioides brasiliensis infected hosts.

O fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis, é o agente etiológico da paracoccidioidomicose, uma das micoses sistêmicas humanas mais prevalentes na América Latina. Componentes da cadeia respiratória mitocondrial são potenciais alvos quimioterapêuticos. Nesse sentido, em nosso trabalho demonstramos diferenças entre a cadeia respiratória do fungo P. brasiliensis e do hospedeiro mamífero. A respiração, potencial de membrana e fosforilação oxidativa mitocondrial de esferoplastos de P. brasiliensis foram avaliados in situ, os quais demonstraram a presença de uma cadeia respiratória funcional. A adição de ADP induziu a transição da respiração do estado de repouso para o fosforilativo, em esferoplastos energizados com succinato, NADH, NAD+ e substratos ligados ao complex I. A presença de uma NADH-ubiquinona oxidoredutase foi demonstrada pela capacidade das células oxidarem NADH exógeno, assim como, pela respiração insensível a rotenona e sensível a flavona. Além disso, a respiração mantida por NAD+ foi sensível a rotenona e flavona, sugerindo que vias metabólicas citosolicas contribuem para a produção de NADH e substratos ligados ao complexo I. Foi demonstrado também que os níveis de expressão do complexo I e da NADH desidrogenase alternativa alternam-se durante a curva de crescimento de leveduras de P. brasiliensis. A respiração induzida por NADH ou succinato foi parcialmente inibida por KCN ou antimicina A e sensível à inibição por BHAM, indicando a presença de uma oxidase alternativa. A fim de se caracterizar esta enzima oxidase alternativa, o seu gene foi clonado e expressado em xii S. cerevisiae e E. coli, o qual conferiu uma respiração resistente a cianeto e sensível a BHAM. S. cerevisiae expressando oxidase alternativa mostraram uma menor taxa de multiplicação celular e diminuição na geração de EROs. Nós também observamos que inibidores da cadeia transportadora de elétrons retardaram a transição de micélio para levedura em culturas de P. brasiliensis. Além disso, estes inibidores e outras drogas geradoras de EROs aumentaram a expressão do gene da oxidase alternativa, assim como a produção de EROs em leveduras de P. brasiliensis. / Paracoccidioides brasiliensis, a thermically dimorphic fungus, is the etiological agent of endemic paracoccidioidomycosis, one of the most prevalent human systemic mycosis in Latin America. Components of the respiratory chain constitute potential pharmacological targets, and here are reported differences between the respiratory chain of the mammalian host and the fungus P. brasiliensis. Respiration, membrane potential and oxidative phosphorylation of mitochondria from P. brasiliensis spheroplasts were evaluated in situ, which demonstrated the existence of a functional respiratory chain. Adenosine 5\'-diphosphate (ADP) induced a transition from resting to phosphorylating respiration in mitochondria energized by succinate, NADH, NAD+ and complex I linked substrates. The presence of an alternative NADH-ubiquinone oxidoreductase was indicated by: the ability of the fungus to oxidize exogenous NADH; the insensitivity substrate-supported respiration to rotenone and sensitivity of this respiration to flavone. In addition, the sensitivity of NAD+-supported respiration to rotenone and flavone suggest that citosolic pathways contribute to NADH and complex I linked substrates production. Moreover, it was demonstrated that expression levels of complex I and alternative NADH dehydrogenase change during P. brasiliensis growth curve. The partial sensitivity of NADH or succinate-supported respiration to antimycin A and cyanide, as well as the sensitivity to BHAM, indicates the presence of an alternative oxidase. Therefore, to characterize the alternative oxidase its gene was cloned and heterologously xii expressed in S. cerevisiae and E. coli, wich confered, a cyanide resistant respiration and BHAM sensitivity. Moreover, S. cerevisiae that expressed alternative oxidase showed slower growth rate and decreased ROS generation. We also observed that electron transport pathways inhibitors delayed the P. brasiliensis mycelium to yeast transition in cultures. Besides, these inhibitors and other ROS generated drugs increase the ROS production and altenative oxidase expression.