Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2008. / Submitted by Jaqueline Oliveira (jaqueoliveiram@gmail.com) on 2008-12-15T15:42:29Z No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_KarineFigueiredoAndrade.pdf: 2642799 bytes, checksum: b0e5e80dabb84b6d64996da26c9f430b (MD5) / Approved for entry into archive by Georgia Fernandes(georgia@bce.unb.br) on 2009-02-26T16:49:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_KarineFigueiredoAndrade.pdf: 2642799 bytes, checksum: b0e5e80dabb84b6d64996da26c9f430b (MD5) / Made available in DSpace on 2009-02-26T16:49:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_KarineFigueiredoAndrade.pdf: 2642799 bytes, checksum: b0e5e80dabb84b6d64996da26c9f430b (MD5) / Os receptores nucleares (NRs) são de grande importância para o mercado mundial de fármacos por estarem envolvidos em mecanismos que influenciam diversas doenças que afetam a humanidade como, por exemplo, o Diabetes Mellitus (DM2), dislipidemia, aterosclerose, obesidade. Dentre os NRs, os Receptores Ativados por Proliferadores Peroxissomais (PPARs) e os Receptores do Hormônio Tireoideano (TRs) controlam importantes ações fisiológicas como regulação de processos inflamatórios, homeostase de glicose e lipídios (PPAR), diferenciação e crescimento celular e metabolismo (TR). Atualmente, o tratamento do DM2 é feito majoritariamente com tiazolidinadionas (TZD), classe de fármacos que diminui a resistência insulínica. A terapia com hormônio tireoideano (HT) para reduzir o colesterol sérico apresenta limitações terapêuticas e efeitos cardíacos indesejáveis. Os compostos sintetizados nesse trabalho: (4-formil-3,5-dimetilfenóxi)-acetoacetato de etila (KF01), (2-formil-3,5-dimetilfenóxi)-acetoacetato de etila (KF02) e o (3,5-dimetilfenóxi)-acetoacetato de etila (KF03) foram submetidos a ensaios para avaliar sua atividade biológica. No ensaio de toxicidade utilizando larvas de Artemia salina, todos os compostos avaliados apresentaram atividade e o composto KF03 mostrou-se 5,7 vezes mais ativo que o padrão positivo (K2Cr2O7). Esse resultado indica que KF01, KF02 e KF03 possuem atividade citotóxica contra larvas de Artemia salina. Os ensaios de transfecção e generepórter em culturas de células U937, mostraram que KF02 apresentou ação panagonista mediada pelas três isoformas do PPAR (α, β/δ e γ), além de efeito sinérgico na presença de bezafibrato e de rosiglitazona (agonistas sintéticos do PPAR), KF03 apresentou um duplo agonismo na transcrição mediada por PPARα e PPARγ, e atuou sinergicamente com os ligantes sintéticos desses receptores. Nos receptores do hormônio tireoideano (TRα e TRβ), foi verificada ação agonista de KF02 e efeito sinérgico de KF01, KF02 e KF03 na presença do hormônio tireoideano (T3). KF02 e KF03 mostraram-se promissores quanto à atividade biológica mediada por PPAR e TR e contribuem para trabalhos futuros no desenvolvimento de pan e duplo agonistas de PPAR e ainda na busca de tiromiméticos β-seletivos capazes de atuar no controle do DM2, obesidade, aterolsclerose e dislipidemia. ________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Nuclear receptors (NRs) are of great importance for the worldwide drug market since they are involved in mechanisms which influence several diseases that affect humanity like, for instance, diabetes mellitus (DM2), obesity, dislypemia and atherosclerosis. Peroxisome Proliferator-Activated Receptors (PPAR) and Thyroid Hormone Receptors (TR) control important physiologic actions as the regulation of inflammatory processes, glucose and lipid homeostasis (PPAR), differentiation and cellular growth and metabolism (TR). Currently, the DM2 treatment is carried mainly by thiazolidinediones (TZD), a pharmacon category that reduces the insulin resistance. The therapy with thyroid hormone (TH) to reduce the serum cholesterol shows therapeutical limitations and undesirable cardiac effects. The compounds synthesized in this project: (4-phormyl-3,5- dimethylphenoxi)-acet ethyl acetate (KF01), (2-phormyl-3,5-dimethylphenoxi)-acet ethyl acetate (KF02) and (3,5-dimethylphenoxi)-acet ethyl acetate (KF03), were submitted to trials to evaluate its biological activity. In the cytotoxicity test, using Artemia salina larvae, all compounds evaluated presented activity and the compound KF03 showed itself 5.7 more active then the positive pattern (K2Cr2O7). This result indicates that KF01, KF02 and KF03 have antitumor activity. In the transfection and reporter gene trials in cell culture (U937 cells), the results showed that KF02 presented a pan-agonist action mediated by the three PPAR isoforms (α, β/δ and γ), besides a synergic effect in the presence of bezafibrate and rosiglitazone (PPAR synthetic ligants), KF03 presented a double agonism in the transcription mediated by PPARα and γ, and acted synergically with the synthetic ligants of these receptors. In the thyroid hormone receptors (TRα and TRβ), it was verified an agonist action of KF02 and a synergic effect of KF01, KF02 and KF03 in the presence of the thyroid hormone (T3). The B fragment derivatives (KF02 and KF03) showed themselves promising due to their biological activity mediated by PPAR and TR and these findings contribute to future studies in the development of pan and double PPAR agonists and also in the search for β-selective thyromimetic substances able to act in the metabolic syndrome control.

Obesity-related comorbidities, including type 2 diabetes mellitus (T2DM) and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) have become a major public health concerns. These complications primarily arise in response to cellular changes in white adipose tissue (WAT). In particular, when a majority of fat cells become hypertrophic it promotes a metabolically unhealthy phenotype, which is characterized by chronic low-grade inflammation, insulin resistance, and ectopic lipid accumulation. Research has implicated synthetic (i.e., Bisdehydrodoisynolic acid, BDDA) and natural (i.e., genistein and daidzein) xenoestrogens in the protection against obesity-related pathologies. Bisdehydrodoisynolic acid (BDDA) reduced weight gain and adiposity, as well as improved lipid homeostasis in obese rodents. Alternatively, phytoestrogens, such as genistein and daidzein were reported to induce adipocyte differentiation through potential interactions with PPARγs, canonical WNT proteins, and estrogen receptors (ER) signaling. The current investigation was conducted to test the effects of synthetic and natural estrogenic compounds (BDDA, daidzein, and genistein) for their effects on the induction of adipogenic signaling, which may potentially improve WAT morphology by reducing adipocyte hypertrophy.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2015. / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2017-01-03T12:32:34Z No. of bitstreams: 1 2015_PriscillaSouzaAlves.pdf: 4434623 bytes, checksum: 8dca546d6c0b549962bd5a0df3257d9e (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2017-01-03T15:48:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_PriscillaSouzaAlves.pdf: 4434623 bytes, checksum: 8dca546d6c0b549962bd5a0df3257d9e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-03T15:48:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_PriscillaSouzaAlves.pdf: 4434623 bytes, checksum: 8dca546d6c0b549962bd5a0df3257d9e (MD5) / A doença de Crohn (DC) é uma doença inflamatória intestinal, cujo processo inflamatório transmural e segmentar pode acometer qualquer parte do trato gastrointestinal. Embora a etiologia da DC ainda não tenha sido completamente estabelecida, a maioria dos estudos converge para a associação de vários fatores, dentre os quais destacam-se a desregulação do sistema imune. Neste contexto, este trabalho descreve o planejamento, a síntese e a avaliação biológica de novos compostos inibidores da atividade de p300 e agonistas PPAR-α e PPAR-γ como potencial estratégia multialvo para o tratamento da DC, assim como para o tratamento de outras patologias inflamatórias. A partir do ácido anacárdico, um lipídeo fenólico do liquido da casca da castanha de caju com atividade anti-inflamatória, foram sintetizados 30 derivados-alvo em rendimentos que variaram de 35% a 98%. A avaliação da atividade biológica in vitro dos compostos-alvo frente à enzima p300 revelou que os derivados ácidos LDT11 (16), LDT13 (17) e LDT30 (20) foram capazes de inibir mais de 50% da atividade enzimática na concentração de 50 μM, apresentando IC50 de 3,0 μM (16 e 17) e 10,0 μM (20). Os estudos preliminares do perfil frente a PPAR-α e PPAR-γ foram finalizados para a primeira série. Os valores de EC50 variaram de 1,5 μM a 32,0 μM para PPAR-α. e 12,4 μM, 12,1 μM, respectivamente. Considerando PPAR-γ, os derivados LDT11 (16) e LDT13 (17) mostraram-se equipotentes com EC50 em torno de 12,0 μM. As análises SAR evidenciaram o íon carboxilato e aceptor de ligação de hidrogênio como grupos farmacofórico e moduladores reconhecimento molecular e ativação de ambos PPAR-α e PPAR-γ, bem como inibição de p300. O planejamento de novos derivados, a otimização dos rendimentos das reações, bem como a avaliação de todas as séries frente à inibição NF-κB in vitro e posteriormente em modelos de colite in vivo constituem as perspectivas deste trabalho. / Crohn’s disease is an inflammatory bowel disease, whose transmural and segmental inflammatory process can affect any part of gastrointestinal tract. Although aetiology is unknown, most studies converge to an interplay of many factors, including a deregulated immune system. In this context, this work describes the design, synthesis and biological evaluation of new p300 inhibitors also PPAR-α and PPAR-γ agonists as a multi-target strategy for the treatment of Crohn’s disease and also of others inflammatory pathologies. From anacardic acid, an anti-inflammatory phenolic lipid of the cashew nutshell liquid, were synthesized 30 derivatives in yields ranging from 35% to 98%. The in vitro evaluation of p300 inhibition profile showed that the acids derivatives LDT11 (16), LDT13 (17) and LDT30 (20) were able to inhibit over than 50% of enzymatic activity at the concentration of 50 μM, with IC50 of 3.0 μM (16 and 17) and 10.0 μM (20). Preliminary studies about the PPAR activation profile were concluded to the first serie, with EC50 ranging from 1.5-32.0 μM to PPAR-α. Considering PPAR-γ, LDT11 (16) and LDT13 (17) also showed potent EC50 arround 12.0 μM. SAR studies exhibited carboxylate ion and hydrogen bond acceptor as pharmacophoric groups and molecular recognition modulators for PPAR-α/PPAR-γ activation and p300 inhibition. This work’s perspectives include new derivatives design, reaction yields optimization and the evaluation of NF-κB inhibition in vitro and posteriorly in vivo colitis models.

O receptor CD40 e seu ligante CD40L possuem um papel importante na interface entre a resposta imune inata e a adaptativa. Disfunções desta via de sinalização são descritas em doenças de origem inflamatória e autoimunes. Em Lúpus eritematoso sistêmico (LES) foi descrito um aumento nos níveis séricos de CD40L solúvel, que participa na produção de autoanticorpos. Receptores ativados por proliferadores de peroxisomos (PPARs) são fatores de transcrição que inicialmente foram descritos como envolvidos apenas no metabolismo lipídico, mas que atualmente são também descritos como atuantes no controle da resposta imune. Com isso, nosso objetivo é determinar se a ativação dos PPARs modula o processo inflamatório através da interação com CD40/CD40L in vitro ou in vivo. Células de linhagem monocítica humana THP-1 foram tratadas por 24 horas com forbol-éster (PMA, 40 nM) e posteriormente estimuladas com CD40L recombinante (rhCD40L, 1 g/ml) por diferentes períodos. Transcritos de mRNA foram analisados por real time PCR e os resultados expressos como razão da expressão do gene housekeeping GAPDH. As células THP-1 apresentam um aumento na expressão de PPAR e após 16 e 2 horas de estímulo com rhCD40L, respectivamente. Estas células também foram estimuladas com LPS (10 g/ml) e LPS+rhCD40L para sabermos se a resposta obtida anteriormente era específica ao estímulo com rhCD40L. O resultado mostra que há uma diminuição na expressão de PPAR e após o estimulo com LPS ou LPS+rhCD40L, indicando que nessas condições a modulação da expressão de PPARs é especifica para a via de sinalização CD40/CD40L. Foi medida também a expressão de CD36, que é descrito na literatura como um indicador da atividade de PPARs. O resultado mostra que o estímulo com CD40L promove um aumento de CD36, o que indica indiretamente que o PPAR estava ativo neste modelo experimental. Para mostrar a interação direta destas duas vias de sinalização, silenciamos o gene de PPAR por siRNA e posteriormente anlisamos a expressão de CD80, cuja expressão encontra-se aumentada logo após a ativação do CD40 de acordo com a literatura. O resultado mostra que, com o silenciamento de PPAR , há um aumento de CD80 logo após a ativação do CD40, evidenciando assim a interação entre essas duas vias de sinalização. A fim de verificar se os achados encontrados in vitro poderiam ser observados in vivo, foi isolada a fração mononuclear de sangue periférico de pacientes com LES com a doença em atividade (n=17), a doença inativa (n=21) ou doadores saudáveis (n=12) e foi medida a expressão de PPAR e por real time PCR. PPAR apresenta um aumento em pacientes com a doença ativa ou inativa em comparação aos doadores saudáveis. Já a expressão de PPAR apresenta aumento apenas em lúpicos em atividade quando comparados com lúpicos inativos ou doadores saudáveis. Quando considerado nesta análise o efeito do tratamento dos pacientes com corticosteróides nos níveis de PPAR, obsevou-se que a expressão de PPAR apresenta o mesmo padrão anterior. Estes resultados sugerem a hipótese de que PPAR seja um possível marcador de atividade de LES. Para confirmar esta especificidade, foram adicionadas à analise células mononucleares retiradas de pacientes com tuberculose e com infecções agudas. Os dados mostram que os níveis elevados de PPAR se mantém apenas em pacientes com lúpus ativo, o que confirma nossa hipótese. Nossos achados sugerem que PPAR e são regulados especificamente em reposta a ativação da via do CD40/CD40L, em monócitos em cultura e em células obtidas de pacientes com LES. Podemos também sugerir que PPAR possa ser um marcador para a atividade de LES. Estes resultados podem representar um novo mecanismo de controle da via de sinalização do CD40/CD40L, participando no controle da resposta inflamatória em cultura e em células de pacientes lúpicos / The membrane receptor CD40 and its ligand CD40L play an important role in the interface between innate and acquired immunity. Dysfunction of this signaling pathway was described in inflammatory and autoimmune diseases. In systemic lupus erythematosus (SLE), increased serum levels of soluble CD40L have been detected, where it plays a significant role in the generation of auto-antibodies. Peroxisome proliferator activator receptors (PPARs) are transcription factors originally described in lipid metabolism. More recently, they were also characterized as inflammatory modulators. Therefore, our objective was to determine whether the activation of PPARs may modulate the inflammatory process through interaction with the CD40/CD40L signaling pathway in vitro and in vivo. Macrophages derived from the human monocytic cell line THP-1 by 24h-treatment with PMA (40 nM) were stimulated with human recombinant CD40L (rhCD40L, 1 g/ml) for different periods. Messenger RNA (mRNA) transcripts for PPAR , and were determined by real time PCR and expressed as a ratio of the housekeeping gene GAPDH transcripts. THP-1 cells express a basal level of PPAR and gene transcription, which is increased 16 and 2 hours after exposure to rhCD40L, respectively. We also stimulated the THP-1 cells with LPS (10 g/ml) and LPS+rhCD40L to see if the increase of PPAR was a response specific to the rhCD40L stimuli. The data show that there is a decrease in PPAR and genes expression upon LPS or LPS+rhCD40L stimulation, indicating that in these times (2 and 16 hours) the response is specific for the CD40/CD40L signaling pathway. Increased expression of CD36 is known as an indicator of PPARs activity. We measured CD36 and saw an increase of this receptor after rhCD40L stimulus, indicating indirectly that PPARs were active in this experimental model. To prove the direct interaction between CD40/CD40L and PPAR , we silenced the PPAR gene by siRNA and analyzed the expression of CD80, which is known to increase after CD40 activation. The results show an increase in CD40L-stimulated CD80 expression upon silencing of PPAR , showing that there is an interaction between these signaling pathways. To confirm whether these findings also occur in vivo, mononuclear cells were isolated from whole blood samples from SLE patients with active (n=17) and inactive disease (n=21), and healthy donors (n=12). The mRNA transcripts for PPARs were detected by real time PCR. In both active and inactive SLE patients, monocytes show an increase in PPAR mRNA expression, as compared to healthy donors. PPAR mRNA is increased only in active patients when compared to healthy donors and inactive lupus patients. Further in this analysis, when we separated the patients with and without the administration of corticosteroids, PPAR displayed the same pattern as above. These results suggested that PPAR may be a marker for lupus activity. To validate this hypothesis, we compared the results obtained from patients with tuberculosis and acute infections. Results showed that only active-lupus patients have an increase in PPAR , confirming the specificity of this phenomenon and hence our hypothesis Our findings suggest that PPAR and are up-regulated specifically in response to CD40/CD40L activation, in both cultured macrophages and in monocytes obtained from SLE patients. We could also suggest that PPAR may be marker for lupus activity. Our results may represent a new control mechanism of the CD40/CD40L signaling pathway and seem to be implicated in the control of the inflammatory response in both human macrophages in vitro and SLE patients

Chez les mammifères, deux types de tissu adipeux (TA) sont présents: le TA blanc, qui est l'organe de stockage et de libération des lipides, et le TA brun, qui est un organe spécialisé dans la production de chaleur grâce à l'expression de la protéine découplante mitochondriale UCP1.Chez l'homme, la présence d'un TA brun métaboliquement actif est inversement corrélée à l'obésité et au diabète de type 2. Ce TA brun est composé de deux types distincts de cellules thermogéniques, les adipocytes bruns classiques présents dans des dépôts spécifiques et les adipocytes "brite " (brown-in-white). Chez la souris, les adipocytes " brite " apparaissent dans le TA blanc lors d'une exposition au froid et sont protecteurs contre l'insulinorésistance induite par l'obésité. Ainsi le "brunissement " du TA blanc ouvre la voie à de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre les pathologies associées à l'obésité. Toutefois, la capacité des adipocytes blancs humains à acquérir un métabolisme brun/brite reste méconnue. Notre étude cherche donc à identifier les changements moléculaires et métaboliques associés à la conversion d'adipocytes blancs humains différenciés en adipocytes " brite ", après un traitement par des agonistes des récepteurs nucléaires PPARgamma ou PPARalpha. Dans un premier temps, nous avons montré in vitro que les cellules hMADS(adipocytes humains dérivés des cellules souches mésenchymateuses), différenciées en adipocytes blancs sont convertis en adipocytes " brites " par les agonistes PPARgamma et PPARalpha. Ces adipocytes brites ont une activité mitochondriale élevée et expriment la protéine découplante UCP1. Dans un deuxième temps, nous avons mis en évidence que le brunissement s'accompagne d'un profond changement métabolique. La mise en place d'un cycle futile lipolyse/ré-estérification couplé à une augmentation de l'oxydation des acides gras permet de fournir les substrats nécessaires à la thermogenèse mitochondriale. A l'inverse, le transport et l'oxydation du glucose sont diminués notamment suite à l'inhibition de la pyruvate déshydrogénase par la protéine PDK4. A la place le glucose va être dirigé vers la voie de la glycéronéogenèse pour fournir le glycérol-3-phosphate nécessaire à la synthèse des triglycérides. Ainsi, l'ensemble du métabolisme des adipocytes " brite " est réorganisé vers l'utilisation des acides gras comme source principale d'énergie. Enfin, nous avons validé l'implication de PPARalpha dans les mécanismes de brunissement in vivo grâce à l'utilisation de souris dont le gène codant pour PPARalpha a été invalidé. L'induction du brunissement par un agoniste betea3-adrénergique nous a permis de confirmer que PPARalpha est nécessaire à l'expression optimale des gènes thermogéniques et au brunissement du tissu adipeux blanc. L'ensemble de ces données permet d'affirmer que chez l'homme, les adipocytes blancs sont capables de se convertir en adipocytes " brite ". Cette conversion s'accompagne de changements métaboliques qui favorisent l'utilisation intracellulaire des acides gras, ce qui pourrait diminuer leur niveau plasmatique limitant ainsi leur stockage ectopique dans les tissus insulinosensibles. / Two types of adipose tissue are present in mammals, white and brown adipose tissue. White adipose tissue (WAT) is specialized in storage and release of lipids, and brown adipose tissue (BAT) is specialized in energy dissipation as heat through the mitochondrial uncoupling protein 1 (UCP1).In humans,thermogenically-competent brown adipose tissue is negatively associated with body mass index and diabetes. BAT is composed of two distinct types of thermogenic cells, classical brown adipocytes located in specific depots and brite adipocytes (brown-in white). In mice, these cells appear in WAT upon cold exposure and are protective against obesity-induced insulin resistance. Therefore, fighting obesity through "browning" of white adipose tissue emerges as a promising strategy. However, the ability of human white adipocytes to acquire a brown/brite phenotype is not yet understood. Here, we aimed at identifying the molecular and metabolic changes associated with the white-to-brown conversion of human mesenchymal adipose-derived stem (hMADS) cells following treatment by agonists of the nuclear receptor PPARgamma or PPARalpha. First, we demonstrated in vitro that PPARgamma or PPARalpha agonists similarly induce white-to-brown conversion of hMADS cells into brite adipocytes that possess high mitochondrial content and express UCP1. Second, we showed that browning is associated with profound metabolic changes. The lipolytic machinery and fatty acid re-esterification was stimulated by the two treatments, resulting in a futile cycle. These adaptations combined with an increase of fatty acid betaoxidation provide substrates to sustain the high level of mitochondrial thermogenesis. In contrast, glucose uptake and oxidation are decreased through inactivation of the pyruvate dehydrogenase by PDK4. Consequently, glucose-carbons are redirected towards glyceroneogenesis to provide the glycerol-3-phosphate backbone necessary for triglyceride esterification. Thus, brite adipocyte metabolism is modified to promote fatty acid utilization as the main energy source. In order to confirm the involvement of PPARalpha in inducing browning in vivo, we treated mice with inactivation of the PPARalpha gene with a beta3-adrenergic agonist. In subcutaneous WAT, expression of BAT- and brite-specific markers was lower in PPARalpha knock out than in wild type mice, confirming that PPARa is required for WAT browning. Altogether, this study shows that PPARgamma and PPARalpha activation in human white adipocytes promotes browning associated with an increase in fatty acid utilization without enhancement of glucose metabolism. These metabolic changes favor intra-adipose fatty acid utilization and thus could diminish plasma fatty flux for ectopic storage into insulin-sensitive tissues.

A NAFLD é uma das principais patologias de fígado. Estudos reportam o exercício físico como um dos principais alvos terapêuticos para esta doença. Verificamos se o treinamento melhora a resistência à insulina, inflamação e esteatose hepática causados pela dieta hiperlipídica (HF) e se o PPAR-alpha está envolvido neste processo. Animais selvagens C57BL6 (WT) e knockout para PPARα (KO) foram alimentados com dieta padrão ou HF durante 12 semanas e treinados por 8 semana. Metade dos animais KO treinados receberam rosiglitazona. A dieta HF aumentou TAG hepático, e resistência periférica à insulina levando a NALFD. O treinamento foi eficiente em reduzir esses parâmetros em ambos genótipos. O desenvolvimento da NAFLD não foi associado à inflamação hepática, entretanto animais KO treinados apresentaram uma resposta inflamatória exacerbada, causada pela redução de PPARγ. Quando eles receberam rosi apresentaram melhora no quadro inflamatório hepático e na resistência à insulina. O exercício diminuiu os danos causados pela dieta HF independente do PPARα; a ausência do PPARα junto com exercício leva a queda na expressão de PPARγ, e a uma resposta inflamatória exacerbada, que é revertida pela administração da rosiglitazona. / NAFLD is one of the main liver diseases. Studies have shown the beneficial effects of exercise on reverse NAFLD. We verify whether exercise improve insulin resistance, liver inflammation and steatohepatitis caused by a high fat diet (HF) and whether PPARα is involved in these actions. C57BL6 wild type (WT) and PPAR-α knockout (KO) mice were fed with a standard (SD) or HF during 12 weeks and trained on a treadmill during 8 weeks, half of KO trained animals received 15mg/kg/day of rosiglitazone. HF diet increased TAG in the liver and peripheral insulin resistance leading to NAFLD. Exercise reduced all this parameters in both animals genotype. NAFLD was not associated with inflammation, however KO mice when trained presented an inflammatory response that was caused by a decrease on PPARγ. When these mice were treated with rosiglitazone, they presented decrease on inflammatory cytokines as well as improvement on insulin sensitivity. Exercise improved the damage caused by a HF independently of PPARα and the absence of PPARα together with exercise leads to decrease on PPARγ expression and an inflammatory response, which was attenuated by rosiglitazone administration.

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Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2016-2017. / L’obésité et ses complications telles le diabète et la stéatose hépatique non alcoolique sont des enjeux de santé qui prennent de plus en plus d’ampleur partout sur la planète et la compréhension approfondie des mécanismes physiopathologiques impliqués est essentielle pour mieux contrer ces maladies. La protéine peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPARγ) est reconnue pour ses propriétés antiinflammatoires, insulino-sensibilisantes et pro-adipogéniques. Des résultats antérieurs ont démontré qu’en l’absence de la protéine tyrosine phosphatase Src homology region 2 domain-containing phosphatase- 1 (Shp1), l’activité de PPARγ est augmentée. L’activation de PPARγ par ses agonistes, les thiazolidinediones (TZD), est favorable au contrôle du diabète, mais entraîne certains effets indésirables. Nos recherches ont porté sur l’investigation d’une nouvelle voie de régulation de PPARγ. Nous avons montré que Shp1 et PPARγ interagissent et que PPARγ est phosphorylé sur ses résidus tyrosine. Les résultats suggèrent que la déphosphorylation de PPARγ par Shp1 diminue son activité. Des analyses de modélisation moléculaire suggèrent que cette interaction entre Shp1 et PPARγ dépend de la présence de phosphorylation sur un acide aminé particulier, la tyrosine 355. Ce même résidu est aussi important dans la liaison avec la rosiglitazone, médicament de la classe des TZD. Des expériences de mutagénèse ont montré que l’absence de phosphorylation sur la tyrosine 355 diminue grandement l’activité de la protéine et, qu’à l’inverse, la présence de phosphorylation tend à augmenter son activité. Bien que plusieurs modifications post-traductionnelles aient été décrites dans la littérature, la phosphorylation sur tyrosine de PPARγ demeure très peu étudiée. Nos résultats suggèrent une nouvelle voie de régulation de PPARγ qui pourrait mener à l’élaboration de nouveaux ligands qui exploitent ce mécanisme afin de favoriser les propriétés bénéfiques de ce facteur transcriptionnel pour mieux traiter le diabète de type 2 et diminuer les risques d’effets secondaires. / Obesity and its complications such as type 2 diabetes and non-alcoholic fatty liver disease are becoming worldwide health concerns and more insights into the underlying physiopathological mechanisms are necessary to improve the treatment of these conditions. Peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPARγ) protein is well known for its anti-inflammatory, insulin sensitizing and pro-adipogenic roles. Previous results showed that in absence of the protein tyrosine phosphatase Src homology region 2 domain-containing phosphatase-1 (Shp1), PPARγ activity is increased. PPARγ activation by thiazolidinediones (TZD) is used in the control of diabetes but is also linked to unwanted side effects. We investigated a new mechanism of regulation of PPARγ activity. We show that Shp1 and PPARγ interact and that PPARγ is tyrosine phosphorylated. Our results suggest that Shp1-mediated dephosphorylation of PPARγ reduces its activity. Molecular modeling analyses further suggest that the interaction between Shp1 and PPARγ depends upon the phosphorylation of one specific residue, tyrosine 355. This residue is also important for the binding with rosiglitazone, a member of the TZD drug class. Mutagenesis experiments showed that the absence of phosphorylation on tyrosine residue 355 decreases PPARγ activity, while its phosphorylation tends to increase it. Despite the fact that many post-translational modifications have been reported in the literature, tyrosine phosphorylation of PPARγ remains mostly unexplored. These results suggest a new PPARγ regulating mechanism that could be exploited to elaborate new PPARγ ligands to improve the treatment of type 2 diabetes and to limit side effects.

Acredita-se que a diminuição progressiva da massa de células observada durante a evolução do diabetes mellitus tipo 2 (DM 2) ocorra por apoptose deste tipo celular. As tiazolidinedionas (TZDs), uma classe de medicamentos utilizada no tratamento do DM 2, atuam como ligantes dos receptores ativados por proliferadores de peroxissomos (PPAR) e e promovem diminuição da resistência periférica à insulina. Embora existam estudos controversos, tem se especulado que as TZDs possam exercer efeitos diretos sobre as células pancreáticas, prevenindo a perda por apoptose e melhorando a sua viabilidade. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos diretos da Pioglitazona (PIO) na concentração de 10 M sobre a viabilidade funcional e o índice de apoptose de ilhotas pancreáticas isoladas de ratos Wistar expostas a concentrações fisiológica (5,6 mM) e suprafisiológica (23 mM) de glicose durante 24, 48 e 72 horas. A viabilidade funcional foi avaliada pela análise da secreção de insulina estimulada por glicose e do conteúdo total de insulina nas ilhotas. O índice de apoptose foi avaliado pela medida da fragmentação do DNA, da expressão do RNAm dos genes Bcl2 (anti-apoptótico) e Bax (pró-apoptótico) e da atividade proteolítica da caspase-3 em ilhotas tratadas e não tratadas com a PIO. Em 5,6 mM de glicose, não se observou efeito significativo sobre a secreção de insulina, mas a avaliação do conteúdo total de insulina evidenciou uma diminuição transitória nas ilhotas tratadas com PIO por 24 horas, seguida por um aumento no conteúdo de insulina quando as ilhotas foram cultivadas por 48 e 72 horas em presença da droga. Em relação à avaliação da apoptose, observou-se uma diminuição na expressão do RNAm do gene Bax nas ilhotas tratadas com PIO por 24 horas, entretanto, após 48 e 72 horas, houve um aumento da expressão do RNAm deste gene nas ilhotas tratadas com a droga. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas na expressão do RNAm do gene Bcl2 em nenhum dos tempos estudados e a avaliação da apoptose determinada pela medida da fragmentação do DNA somente demonstrou uma diminuição do índice de apoptose após 48 horas de tratamento com a PIO. Em 23 mM de glicose, a PIO promoveu um aumento transitório na secreção de insulina estimulada por glicose e no conteúdo total de insulina (após 48 horas), no entanto, após 72 horas, observou-se diminuição significativa no conteúdo total de insulina. Em relação à apoptose, o tratamento com PIO determinou um aumento do índice de apoptose medido pela fragmentação do DNA e da atividade proteolítica da caspase-3 após 48 e 72 horas e uma diminuição da expressão do RNAm do gene Bcl2 nos tempos 24 e 48 horas. Os resultados do presente estudo sugerem que os efeitos diretos da PIO sobre as ilhotas pancreáticas murídeas em cultura variam de acordo com a concentração de glicose a qual as ilhotas estão expostas: em concentração fisiológica de glicose, a PIO parece exercer efeitos diretos benéficos, enquanto em concentração suprafisiológica de glicose, ela exerce efeitos diretos deletérios sobre a viabilidade funcional e o índice de apoptose de ilhotas pancreáticas murídeas em cultura. / The progressive decrease in -cell mass observed during the evolution of type 2 diabetes (T2DM) is believed to occur due to cell apoptosis. Thiazolidinediones (TZDs), a class of agents used for the treatment T2DM, act as ligands of the peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) and and decrease peripheral insulin resistance. Although still controversial, some studies have shown a direct effect of TZDs on pancreatic -cell, preventing cell loss due to apoptosis and improving their viability. The objective of this study was to evaluate the direct effects of 10 M Pioglitazone (PIO) on functional viability and apoptosis rate of islets isolated from Wistar rats exposed to physiological (5.6 mM) and supraphysiological (23 mM) glucose concentrations during 24, 48 and 72 hours. The functional viability was evaluated by the analysis of insulin secretion after glucose challenge and of islet total insulin content. Apoptosis rate was evaluated by measurement of DNA fragmentation, of Bcl2 (antiapoptotic) and Bax (proapoptotic) mRNA expression and of proteolytic activity of caspase-3 in pancreatic islets treated or not with PIO. At 5.6 mM glucose concentration, no significant effects in insulin secretion were observed, while a transitory decrease (after 24 hours) followed by an increase in total insulin content was observed in islets treated with PIO for 48 and 72 hours. Regarding apoptosis, a lower expression of Bax mRNA was detected in islets treated with PIO for 24 hours, followed, however, by an increase in the expression of this gene after 48 and 72 hours of drug exposition. PIO treatment did not promote significant changes in Bcl2 mRNA expression, while decreased the apoptosis rate measured by DNA fragmentation only after 48 hours of exposition. At 23 mM glucose concentration, PIO treatment elicited a transitory increase in insulin secretion after glucose challenge and in islet total insulin content after 48 hours followed by a decrease in the islet total insulin content after 72 hours. Concerning apoptosis, PIO treatment determined an increase in the apoptose rate measured by DNA fragmentation and by proteolytic activity of caspase-3 after 48 and 72 hours and a decrease in Bcl2 mRNA expression after 24 and 48 hours. These findings suggest that the direct effects of PIO on pancreatic islets depend on glucose concentration to which they are exposed: while under physiological glucose concentration the direct effects seem to be beneficial, under supraphysiological glucose concentration, PIO exerts direct deleterious effects on the functional viability and on the apoptosis rate of murine pancreatic islets.

A atividade dos receptores ativados por proliferadores de peroxissoma (PPAR) e receptor X hepático (LXR) são regulados por ácidos graxos. Entretanto, o papel do LNO2, um produto endógeno da nitração do ácido linoléico por espécies reativas derivadas de óxido nítrico (•NO), na via de sinalização que regula a ativação destes receptores ainda não está elucidada. Assim, considerando a propriedade do LNO2 como doador de •NO, nós investigamos a participação da via de sinalização p21Ras/Raf/ERK na ativação de PPAR e LXR por LNO2. Os resultados obtidos demonstraram que LNO2, na concentração de 0.01µM, foi um potente ativador de PPAR quando comparado ao ligante natural ácido linoléico, o qual apresentou ativação equivalente do PPAR na concentração de 10µM. O LNO2, contudo não teve efeito na ativação de LXR. LNO2 foi um potente ativador de p21Ras quando comparado ao ácido linoléico. A ativação de Ras ocorreu após 5 minutos de incubação com LNO2 em células parentais. Entretanto, em células transfectadas com p21RasC118S, o LNO2 não foi capaz de ativar Ras. A ativação de Ras e PPAR foi dependente da liberação de •NO a partir de LNO2, o que foi evidenciado na presença de C-PTIO, um seqüestrador de •NO. LNO2 ativou ERK, mas não demonstrou efeito relevante na ativação de p38 MAP kinase. A utilização de um inibidor específico de MEK, PD09895, inibiu a ativação de ERK induzida por LNO2, sugerindo que existe uma conexão entre ERK e a ativação de PPAR. Nós concluímos que a ativação do receptor nuclear PPAR por LNO2 é dependente de •NO e da via de sinalização p21Ras/Raf/ERK, a qual é capaz de ativar os subtipos α, &$946; e γ do PPAR, modulando, desse modo, a expressão de genes responsivos a este fator de transcrição. / Fatty acids bind to and regulate the activity of peroxissome proliferator-activated (PPAR) and liver X receptors (LXR). However, the role of LNO2, an endogenous product of the nitration of linoleic acid by nitric oxide (•NO)-derived reactive species, on signalling pathways regulating these nuclear receptors is poorly understood. Thus, considering the properties of LNO2 as •NO donor, we investigated the role of p21RasMAP kinases signaling pathway in the activation of PPARs and LXR by LNO2. LNO2 at physiologically relevant concentrations (0.01 µM) activates PPAR. By contrast, linoleic acid, a natural ligand for PPAR, only activated the receptor at much higher concentrations (10µM). However, it did not affect LXR activation. LNO2 is a more potent activator of p21 Ras than linoleic acid at the same conditions. Ras activation occurred within the first 5 minutes after LNO2 addition to parental cells. However, in p21RasC118s transfected cells, were unable to detect activation of Ras. Ras and PPAR activation depends on •NO released from LNO2 as evidenced by the inhibitory effect of C-PTIO, a •NO scavenger. LNO2 activated ERK but displayed no effects relevant on p38 MAP kinase. In addition, the use of specific inhibitors to MEK, PD09895, blocked PPAR activation and ERK phosphorylation by LNO2, suggesting a connection between ERK and the activation of PPAR. We conclude that LNO2 induced THP-1 cells activating Ras by S-nitrosation and recruiting the MAP kinase ERK, a downstream element of this signalling cascade and activated PPAR (α, β and γ).