O peixe-zebra (Danio rerio) é um pequeno teleósteo pertencente à família Cyprinidae, o qual vem sendo estudado em diferentes áreas científicas. Essa espécie apresenta genes evolutivamente conservados, diversos sistemas de neurotransmissão já caracterizados e um amplo repertório comportamental , os quais podem ser modulados por diversas drogas. Portanto, a presente tese tem por objetivo estudar parâmetros bioquímicos em peixe-zebra com ênfase nos sistemas de sinalização purinérgico e colinérgico, bem como avaliar o comportamento de animais submetidos à tarefa do open tank e investigar os efeitos promovidos pelo tratamento com taurina no modelo de exposição aguda ao etanol. Nós demonstramos que o tratamento agudo (1h) com taurina nas concentrações de 150 e 400 mg/L aumentou a hidrólise de AMP e levou a uma diminuição significativa na desaminação de adenosina em membranas cerebrais, sendo que o último efeito também foi observado nos ensaios in vitro. Entretanto, não foram observados efeitos sobre a hidrólise dos nucleotídeos tri e difosfatados, promovida pelas NTPDases. Estudos relacionados à hidrólise dos nucleotídeos ATP e ADP em cérebro, fígado e coração de peixe-zebra demonstraram um perfil diferencial nos respectivos tecidos. O efeito distinto promovido por inibidores apontou que diferentes membros das NTPDases poderiam estar contribuindo para a atividade enzimática detectada, o que foi sugerido por estudos de bioinformática e ensaios de expressão gênica. Além disso, verificamos que, no modelo de exposição aguda ao etanol, a taurina foi capaz de prevenir as alterações promovidas pelo álcool sobre a atividade da AChE e das defesas antioxidantes enzimáticas. Contudo, o pré-tratamento com taurina demonstrou ser mais efetivo na prevenção do estresse oxidativo, visto que, diferentemente do co-tratamento, aumentou o conteúdo total de tióis reduzidos cerebral e diminuiu o dano lipídico. A fim de caracterizar o repertório comportamental espaço-temporal dos animais no teste do open tank, nós elaboramos um protocolo que avaliava o efeito do confinamento prévio a estímulos naturalísticos (ambientes claro, escuro e transparente). Os resultados demonstraram que os peixes previamente confinados em um ambiente naturalmente aversivo (claro) apresentaram uma habituação intrasessão mais rápida em comparação aos grupos escuro e transparente, avaliada pelas transições e tempo de permanência na região superior do aparato. O perfil exploratório espaço-temporal foi analisado através de plots representativos, sendo proposto um etograma descritivo para a tarefa do open tank. A partir do repertório comportamental determinado, o efeito promovido pelo pré-tratamento com taurina nas alterações comportamentais induzidas pelo etanol foi investigado. Nossos achados demonstraram que o etanol diminuiu a atividade locomotora dos animais, sendo que as concentrações de taurina testadas (42, 150 e 400 mg/L) preveniram essa modificação. Contudo, o pré-tratamento com 150 mg/L de taurina não preveniu as alterações na exploração da área superior do aparato, sugerindo que diferentes mecanismos poderiam estar envolvidos na resposta comportamental observada. Em suma, nossos resultados possibilitam uma maior compreensão das respostas neuroquímicas e comportamentais em peixe-zebra, contribuindo para novas estratégias relacionadas a estudos translacionais. / The zebrafish (Danio rerio) is a small teleost fish that belongs to the Cyprinidae family, which has been studied in different scientific areas. This species has evolutively conserved genes, several neurotransmitter systems characterized, and a wide behavioral repertoire, which may be modulated by distinct drugs. Thus, this thesis aims to study biochemical parameters in zebrafish, emphasizing the purinergic and cholinergic signaling, as well as to evaluate the behavior of animals in the open tank task and to investigate the effects of taurine treatment in the acute ethanol exposure model. We showed that acute taurine treatment (1h) at 150 and 400 mg/L increased the AMP hydrolysis and significantly decreased the adenosine deamination in brain membranes. The latter effect was also observed in the enzyme assays performed in vitro. However, the tri and diphosphonucleoside hydrolysis promoted by NTPDases was unaffected by taurine. Studies related to ATP and ADP hydrolysis in zebrafish brain, liver, and heart demonstrated a differential profile in the respective tissues. The distinct effect promoted by inhibitors pointed that different NTPDase members could play a role in the enzyme activity detected, as suggested by bioinformatic analysis and gene expression assays. Moreover, we observed that, in the acute ethanol exposure model, taurine prevents the alterations induced by ethanol in AChE and in enzymatic antioxidant defenses activities. However, taurine pretreatment has shown to be more effective in the prevention of oxidative stress, considering that, differently from the cotreatment, it increased the total reduced thiol content and decreased lipid peroxidation in zebrafish brain. To characterize the spatio-temporal behavioral repertoire of animals subjected to the open tank task, we described a protocol which evaluated the effect promoted by the previous confinement using natural stimuli (bright, dark, and transparent environments). The results showed that fish previously confined into an aversive environment (brightly one) presented a faster intra-session habituation response when compared to dark and transparent groups, evaluated by transitions and time spent in the top area of the tank. The spatio-temporal exploratory profile was assessed by representative plots with the proposal of a descriptive ethogram to the behavioral task. Considering these behaviors, the effect promoted by taurine pretreatment on the behavioral changes induced by ethanol was investigated. Our findings demonstrated that ethanol significantly decreased the locomotor activity and that the taurine concentrations tested (42, 150, and 400 mg/L) prevented this modification. Nevertheless, the pretreatment with 150 mg/L taurine did not prevent the alterations on the exploratory profile for the top area of apparatus, suggesting that different mechanisms could be involved in the behavioral response observed. In conclusion, our data help to a better understanding of the neurochemical and behavioral responses in zebrafish, contributing for new strategies related to translational studies.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-10-06T04:06:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 334702.pdf: 1926534 bytes, checksum: e711854e530b3173555ba9ad179c9cfd (MD5) Previous issue date: 2015 / O glifosato é um herbicida utilizado para inibir o crescimento de plantas daninhas. Este herbicida é solúvel em água e, quando aplicado em sistemas terrestres, infiltra no solo atingindo os ecossistemas aquáticos e consequentemente, afetando organismos não-alvo. O objetivo deste estudo foi caracterizar os efeitos de 65 µg/L glifosato sobre a organização estrutural e ultraestrutural das células somáticas e germinativas durante a espermatogênese de Danio rerio. A concentração de glifosato utilizada corresponde ao limite máximo estabelecido pelo CONAMA para águas de abastecimento par consumo humano. Os resultados mostram aumento significativo de micronúcleos, além de aumento significativo no índice gonadossomático (IGS) nos machos expostos por 360 h. A análise estrutural permitiu o reconhecimento em todos grupos de três estágios de cistos germinativos organizados próximos a parede dos testículos, que correspondem aqueles compostos por: (i) espermatogônias, (ii) espermatócitos, (iii) espermátides (iniciais e tardias); além da presença de espermatozoides no lúmen do túbulo seminífero. Na análise ultraestrutural observou-se alterações nas células de Sertoli, com perda da densidade do citoplasma e das organelas, bem como o aparecimento de estruturas com aspecto vesicular. Além dessas, foram observadas alterações das interações entre células de Sertoli e células germinativas e perda das pontes citoplasmáticas entre as células germinativas. Na análise de expressão da proteína envolvida no estresse celular foi observado no grupo exposto por 144 h, aumento significativo de HSP70 induzível, a qual não foi mais observado em 360 h. Na quantificação de FASL, envolvida na indução à apoptose, observou-se aumento significativo nos machos expostos por 360 h. Embora neste estudo, tenha sido reconhecido uma aumento de FASL, não foram observadas modificações na expressão nenhuma das proteínas de ativação à apoptose investigadas (BCL2, BAK e caspase 3). Os efeitos adversos do glifosato sobre os testículos, principalmente sobre células de Sertoli, são um importante indicativo sobre as consequências na reprodução de peixes, que podem abranger desde o nível celular, sistêmico e populacional. Por fim, este estudo demonstrou a importância de se investigar a toxicidade do glifosato sobre a reprodução masculina, utilizando testículos de peixe como modelo experimental.<br> / Abstract : Glyphosate is herbicide used to inhibit the growth of weeds. This herbicide is soluble in water, and when applied in terrestrial systems, glyphosate infiltrates into the soil, reaching aquatic ecosystems and consequently affecting nontarget organisms. The aim of this study was to characterize the effect of 65 µg/L glyphosate on the structural and ultrastructural organization of somatic and germ cells during Danio rerio spermatogenesis. Glyphosate concentration used corresponds to the maximum level stated by CONAMA for waters for human consumption. Our results showed significant increase of the micronuclei, as well as, significant increase in GSI on males exposed to glyphosate for 360 h. Structural analysis allowed the recognition in all groups of three germ cysts stages, organized near to the testes wall, that correspond to those that contains: (i) spermatogonia, (ii) spermatocytes (iii) spermatids (early and late), and the presence of sperm in the lumen of the seminiferous tubule. On the ultrastructural analysis, alterations were observed in Sertoli cells, with density loss of the cytoplasm and organelles, as well as, the appearence of structures with vesicular aspect. Moreover, alterations on interactions between Sertoli and germ cells and loss of cytoplasmic bridges between the germ cells. On the analysis of protein expression involved in cell stress, was observed after 144 h a significant increase in the inducible HSP70 protein, which is no observed at 360 h. In the quantification of FASL, involved in apoptosis induction, there was a significant increase in males exposed for 360 h. Although in this study has been recognized a FASL increasing, there was no observed modifications on expression of the investigated proteins that activate apoptosis (BCL2, BAK and Caspase 3). The adverse effects of glyphosate on the testicles, mainly on Sertoli cells, are an important indicative of the consequences on fish reproduction, which may include from the cellular, systemic and population levels. Finally, this study demonstrated the importance of investigating the glyphosate toxicity on male reproduction, using fish testicles as experimental model.

Made available in DSpace on 2012-09-06T01:10:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 904.pdf: 6815748 bytes, checksum: 41a7b3159cb917021032a3da8b9c6920 (MD5) Previous issue date: 2007 / A alteração do comportamento animal pode ser interpretada como a resposta da interação de processos fisiológicos com estímulos ambientais sendo, desta forma, uma ferramenta eficiente para detecção de contaminantes relacionados a efeitos tóxicos. Neste estudo foram realizados testes comportamentais utilizando a atividade natatória do peixe Danio rerio como bioindicador de concentrações subletais. (...) O biomonitoramento em tempo real em laboratório mostrou-se um método não-invasivo e prático e poderá ser utilizado para analisar a toxicidade crônica de efluentes industriais ou substâncias químicas específicas em laboratório, pois tem sensibilidade elevada comparável com outros testes toxicológicos e gera respostas rapidamente

O consumo desenfreado de etanol traz consequências negativas, que envolvem problemas fisiopatológicos e de socialização do indivíduo, além de questões de saúde pública. Seu consumo por mulheres grávidas acarreta em danos ao desenvolvimento e formação cerebral do feto, causando a Síndrome Alcoólica Fetal (SAF). Uma forma mais abrangente deste distúrbio é a FASD (Fetal Alcohol Spectrum Disorder), que inclui formas brandas de SAF, bem como qualquer desordem neurológica ou congênita em decorrência do etanol. O objetivo do estudo é avaliar as alterações comportamentais e neuroquímicas em peixezebra adulto após a exposição a diferentes concentrações de etanol na fase inicial do seu desenvolvimento. Para a indução desta desordem, utilizamos ovos de peixe-zebra com 24h pós-fertilização, expostos a diferentes concentrações de etanol: 0%, 0,1%, 0,25%, 0,5% e 1%, durante duas horas. Acompanhamos o desenvolvimento destes animais até a fase adulta (4 meses), onde foram realizadas diferentes tarefas comportamentais: exploração do aparato novel tank e interação social, além de captação de glutamato, como medida neuroquímica. Como resultados mais relevantes, destacam-se a exploração de todo o aparato pelo grupo controle e uma diminuição concentração-dependente da exploração pelos grupos expostos previamente ao etanol; maior permanência no fundo do novel tank nas concentrações elevadas de etanol; uma diminuição concentração-dependente do tempo de permanência próximo ao cardume de acordo com o aumento da concentração de etanol. Quanto às análises bioquímicas, a captação de glutamato mostrou uma diminuição significativa na função de transporte deste neurotransmissor nos animais tratados com concentrações mais elevadas de etanol. A posterior intervenção farmacológica com buspirona reverteu o perfil comportamental previamente observado pelo efeito do etanol. Considerando as análises bioquímicas, a captação de glutamato mostrou uma diminuição significativa na função de transporte deste neurotransmissor nos animais tratados com concentrações intermediárias (0.25 e 0,5%)de etanol. Concluímos que a exposição prévia a diferentes concentrações de etanol na fase embrionária leva a alterações comportamentais na fase adulta, tais como diminuição de exploração frente a novidades, ansiedade e diminuição de interação social. / The excessive consumption of ethanol has negative consequences, which involve pathophysiological and individual socialization issues, and public health issues. Its consumption by pregnant women causes damage to brain development and formation of the fetus, causing fetal alcohol syndrome (FAS). A broader form of this disorder is the FASD (Fetal Alcohol Spectrum Disorder), which includes milder forms of FAS, as well as any neurological disorder or congenital due to ethanol. This project proposes to assess the behavioral and neurochemical alterations in adult zebrafish after exposure to different concentrations of ethanol in the initial phase of its development. To induce this disorder, we use zebrafish eggs and 24h post-fertilization exposed to different concentrations of ethanol, 0%, 0.1%, 0.25%, 0.5% and 1%, for two hours. We observed the development of these animals to juvenile and adulthood, which will be performed different behavioral tasks: exploration of novel apparatus tank and social interaction, as well as glutamate uptake, as measured neurochemistry. Among the most relevant results, we highlight the exploration of the whole apparatus for the control group and a concentration-dependent decrease of exploration by groups previously exposed to ethanol. It was observed high time spent in the bottom of the novel tank in high concentrations of ethanol. Furthermore, elevated spend time close to social interaction chamber was observed, with a dose-dependent decrease of this time in accordance with the increase of ethanol concentration. Further pharmacological intervention with buspirone reversed the behavioral profile previously observed the effect of ethanol. Considering biochemical analysis, glutamate uptake showed a significant decrease in the transport function of this neurotransmitter in animals treated with intermediated doses of ethanol. We conclude that prior exposure to different concentrations of ethanol in infancy leads to behavioral changes in adulthood, such as decreased operating front the news, anxiety and decreased social interaction.

A Doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais comum, afetando em média 2-3% dos indivíduos com idade superior a 65 anos. Além dos sintomas motores altamente debilitantes, os sintomas não-motores podem preceder em muitos anos o aparecimento dos sintomas motores, podendo caracterizar uma fase prodrômica da DP. Uma potencial estratégia farmacológica é a introdução de agentes neuroprotetores no estágio inicial da doença, a fim de prevenir a morte neuronal decorrente do progresso da neurodegeneração. A N-acetilcisteína (NAC) é um antioxidante, anti-inflamatório e modulador glutamatérgico que mostrou vários benefícios terapêuticos em transtornos psiquiátricos. Neste estudo, foi avaliado o efeito da NAC na prevenção dos danos induzidos por 6-Hidroxidopamina (6-OHDA) sobre parâmetros motores, cognitivos e morfológicos em um modelo de DP em larvas de peixes-zebra. Nossos resultados mostraram que NAC foi capaz de prevenir os déficits motores e cognitivos e as alterações morfológicas causadas pela exposição a 6-OHDA, o que reforça a relevância de seus efeitos neuroprotetores. Por atuar em diferentes alvos relevantes na fisiopatologia da DP, NAC é um potencial candidato para prevenção e tratamento de DP. / Parkinson’s disease (PD) is the second most common neurodegenerative disorder, affecting on average 2-3% of the individuals older than 65 years. In addition to its highly debilitating motor symptoms, non-motor symptoms may precede by many years their motor counterparts, which may characterize a prodromal phase of PD. A potential pharmacological strategy is to introduce neuroprotective agents at an earlier stage in order to prevent further neuronal death. N-acetylcysteine (NAC) is an antioxidant, anti-inflammatory and glutamatergic modulator that has shown various therapeutic benefits in brain disorders. In this study, it was evaluated the effect of NAC to prevent the damage induced by 6-OHDA on motor, cognitive and morphological parameters in a PD model in larval zebrafish. NAC was able to prevent the motor and cognitive deficits and morphological alterations caused by exposure to 6-OHDA, which reinforce the relevance of its neuroprotective effects. By acting on different relevant targets in the pathophysiology of PD, NAC is a potential candidate for prevention and treatment of PD.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The zebrafish (Danio rerio) is a small teleost widely used in several scientific researches. Among the characteristics that make zebrafish an attractive model organism when compared to rodents, we highlight the easy maintenance, manipulation, and the feasibility for the evaluation of neurochemical aspects that influence animal behavior. The zebrafish genes have been already sequenced and present a high degree of homology in relation to their human counterparts, which allows the use of this species in translational studies of stress and defensive behavior. In fish, exposure to alarm substance from conspecifics is an experimental model that induces fear, naturally mimicking the chemical communication that occur during the attack of predators. In the literature, the behavioral analysis of two zebrafish strains (wild type WT and leopard leo ) showed that leo presents an exacerbation of anxiety-like behaviors. This aspect could be an important characteristic for assessing the defensive behaviors triggered by alarm substance in distinct experimental approaches. Thus, the goal of this work was to evaluate the behavioral profile of WT and leo acutely exposed to alarm substance from conspecifics (5 min) at three contexts: during the alarm substance exposure period (Experiment 1); after exposure, in habituation to novelty (Experiment 2); or after exposure, in the light-dark test (Experiment 3). Furthermore, we verified the influence of alarm substance on pigment response. During the alarm substance exposure (Experiment 1), leo increased the vertical drifts, as well as the number and duration of erratic movements, while WT increased the number of erratic movements and the latency to enter the upper area of the apparatus. Both strains did not present significant changes on pigment response. In the novel tank test (Experiment 2), WT presented increased fear responses. On the other hand, leo increased the vertical exploration, indicating differences on habituation to novelty. In the light-dark test (Experiment 3), the alarm substance promoted a significant increase in the number of erratic movements, but elicited different responses in scototaxis, in the latency to enter the dark compartment, and in the number of risk assessment episodes. Principal component analyses suggested that burst swimming, anxiety-like behaviors, and locomotion/exploration were the main factors that contributed to the results obtained in the Experiments 1, 2, and 3, respectively. Altogether, the behavioral responses of alarm substance from conspecifics in zebrafish are strain- and context-dependent. / O peixe zebra (Danio rerio) é um pequeno teleósteo amplamente utilizado em pesquisas científicas nas diferentes áreas do conhecimento. Dentre as características que tornam o peixe zebra um atrativo organismo modelo quando comparado com roedores podemos citar a facilidade de manutenção, a manipulação e a viabilidade para a avaliação de aspectos neuroquímicos que influenciam o comportamento animal. O genoma do peixe zebra já foi totalmente sequenciado e sua alta homologia com genes humanos possibilita a utilização da espécie em estudos translacionais de estresse e comportamento defensivo. Em peixes, a exposição à substância de alarme de co-específicos é um modelo experimental capaz de induzir medo, mimetizando de modo natural a comunicação química que ocorre em situações de ataque de predadores. Na literatura, a análise comportamental de duas linhagens de peixe zebra (selvagem WT e leopardo leo ) demonstrou que leo apresenta uma exacerbação do comportamento tipo ansiedade, o que poderia ser um importante aspecto para a investigação dos comportamentos defensivos desencadeados pela substância de alarme em diferentes situações experimentais. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o padrão comportamental das linhagens de peixe zebra WT e leo expostas agudamente à substância de alarme (5 min) em três contextos: durante o período de exposição (Experimento 1); após a exposição, em respostas de habituação à novidade (Experimento 2); ou após a exposição, na preferência claro-escuro (Experimento 3). Além disso, verificamos a influência da substância de alarme sobre a resposta pigmentar de ambas as linhagens. Durante a exposição à substância de alarme (Experimento 1), a linhagem leo aumentou o nado vertical, bem como o número e a duração de movimentos erráticos, enquanto que WT aumentou o número de movimentos erráticos e a latência para entrada na área superior do aparato. Ambas as linhagens não apresentaram variação no padrão de pigmentação. No teste do tanque novo (Experimento 2), a linhagem WT apresentou mais respostas relacionadas ao medo. Por outro lado, leo apresentou um aumento das transições e do tempo gasto no topo, indicando diferenças na habituação. A substância de alarme aumentou o número de movimentos erráticos no teste claro-escuro (Experimento 3), mas desencadeou diferentes respostas na escototaxia, na latência para entrada no compartimento escuro e nos episódios de avaliação de risco. A análise principal de componentes sugeriu que o nado acelerado, comportamentos tipo ansiedade e locomoção/exploração foram os fatores que mais contribuíram para os resultados obtidos nos Experimentos 1, 2 e 3, respectivamente. Em suma, a substância de alarme apresenta uma resposta dependente de linhagem e contexto em peixe zebra.

A poluição ambiental causada por resíduos de metais tóxicos é muito relevante pelo seu amplo uso em processos industriais e agrícolas, sendo que muitos efluentes chegam ao ambiente aquático sem qualquer tratamento. A contaminação da água com estes poluentes tornaram-se iminentes e, consequentemente efeitos adversos são inevitáveis em humanos, plantas e animais, onde um dos táxons mais atingidos são os peixes. O peixe zebra (Danio rerio) é uma espécie muito utilizada como modelo experimental em diversas áreas, como neurociências e toxicologia. Evidências demonstram que nucleotídeos e nucleosídeos da adenina exercem efeitos sinalizadores no espaço extracelular por meio da ativação de receptores específicos. A inativação do sinal mediado pelo ATP extracelular é realizada por uma família de enzimas denominadas ectonucleotidases, na qual se destacam as NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases) e a ecto-5'-nucleotidase. Após hidrólise pelas ectonucleotidases, o ATP produz o nucleosídeo adenosina. A adenosina pode ser desaminada pela enzima adenosina desaminase (ADA), gerando inosina. Evidências demonstram que o ATP é coliberado com a acetilcolina em terminais colinérgicos. A acetilcolina é uma molécula transmissora que age nos receptores muscarínicos e nicotínicos e seu catabolismo é promovido pela enzima acetilcolinesterase (AChE). Nosso laboratório já demonstrou a presença de diferentes membros da família das NTPDases e da família da ADA, além de uma ecto-5'-nucleotidase em cérebro de peixe zebra. A presença da enzima AChE também já foi descrita nesta espécie. No capítulo I foi testado o efeito in vitro do zinco e cádmio na atividade da AChE e das ectonucleotidases em cérebro de peixe zebra. Ambos os metais não alteraram a atividade da AChE. A hidrólise de ATP teve um aumento na presença de 1 µM de zinco (17 %) e a hidrólise de AMP teve um aumento dose dependente nas concentrações 0,5 e 1 µM de zinco (188 % e 199 %). Após a exposição a 0,5 e 1 µM de cádmio, a atividade ATPásica foi aumentada significativamente (53 % e 48 %). O cádmio na faixa de 0,25 a 1 µM inibiu a hidrólise de ADP de forma dose-dependente (13,4 - 69 %). A atividade da ecto-5'-nucleotidase foi inibida (38 %) apenas na presença de 1 µM de cádmio. No capítulo II foi investigado o efeito da exposição ao alumínio na atividade da AChE cerebral e em parâmetros comportamentais em peixe zebra. A exposição in vivo a 50 µg/L de AlCl3 durante 96 h a pH 5,8 aumentou significativamente (36 %) a hidrólise de acetiltiocolina em cérebro de peixe zebra. Não foram observadas mudanças na atividade da AChE quando os peixes foram expostos a mesma concentração de AlCl3 em pH 6,8. RT-PCR semi-quantitativo não demonstrou alterações significativas nos níveis de expressão do RNAm do gene da ache em cérebro de peixe zebra. Concentrações in vitro de AlCl3 variando de 50 a 250 µM aumentaram a atividade da AChE (28 a 33 %). Além disso, animais expostos ao AlCl3 em pH 5,8 apresentaram uma diminuição na atividade locomotora, avaliada pelo número de cruzamentos (25 %), distância viajada (14,1 %) e velocidade máxima (24 %). No capítulo III, foi verificado o efeito de metais tóxicos na atividade e expressão da ADA em frações solúveis e de membrana em cérebro de peixe zebra. Dos metais testados, apenas o mercúrio foi capaz de inibir a desaminação da adenosina em ambas as frações in vitro. A inibição foi observada de 5 a 250 µM de HgCl2 (84,6 - 92,6 %) na fração solúvel enquanto nas frações de membrana a inibição variou de 50 a 250 µM (20,9 - 26 %). A exposição in vivo do peixe zebra a 20 µg/L de HgCl2 foi avaliada após exposição aguda (24 h) e subcrônica (96 h). A atividade da ADA na fração solúvel foi inibida após a exposição aguda (24,5%) e subcrônica (40,8%) enquanto que a atividade da ADA na fração de membrana foi inibida somente após a exposição subcrônica (21,9 %). Em contraste, não foram observadas mudanças na expressão dos genes da ADA após os tratamentos. Nossos resultados apresentados demonstraram que as enzimas envolvidas na degradação de nucleotídeos e nucleosídeos (NTPDase, 5'-nucleotidase e ADA) e a acetilcolinesterase são afetadas por metais tóxicos em cérebro de peixe zebra. Além de serem possíveis alvos da neurotoxicidade dos metais, a alteração destas atividades enzimáticas pode ser utilizada como bioindicador da presença ambiental destes poluentes. / The environmental pollution caused by toxic metals is relevant due to its widespread use in industrial and agricultural process, and many effluents enter in the aquatic environment without treatment. The contamination of water by toxic metals has become imminent and, consequently, adverse effects are inevitable in humans, plants, and animals, which fish are one of the most affected taxons. Zebrafish (Danio rerio) is a specie consolidated as a model system in many research areas, including neuroscience and toxicology. Evidence has show that nucleotides and nucleosides exert signaling effects at the extracellular space by the activation of specific receptors. The inactivation of extracellular ATP signaling is promoted by a family of enzymes named ectonucleotidases, whivh inlude NTPDases (nucleoside triphosphate diphosphohydrolases) and ecto-5'-nucleotidase. After hydrolysis promoted by ectonucleotidases, ATP forms the nucleoside adenosine. The adenosine could be deaminated by the enzyme adenosine deaminase (ADA). Evidence demonstrates that ATP is coreleased with acetylcholine in cholinergic terminals. Acetylcholine is a transmitter molecule that acts on muscarinic and nicotinic receptors and its catabolism is promoted by acetylcholinesterase (AChE) activity. Our laboratory has already characterized NTPDases, ecto-5'-nucleotidase and ADA activity in zebrafish brain. The AChE activity has been reported in this specie. In chapter I we tested the in vitro effect of zinc and cadmium on AChE and ectonucleotidase (NTPDase and ecto-5-nucleotidase) activities in zebrafish brain. Both zinc and cadmium treatments did not alter significantly the zebrafish brain AChE activity. ATP hydrolysis presented a significant increase at 1 mM zinc (17 %) and the AMPase activity had a dose-dependent increase at 0.5 and 1µM zinc exposure (188 % and 199 %). After cadmium treatment, ATPase activity was significantly increased (53 % and 48 %) at 0.5 and 1 µM, respectively. Cadmium, in the range 0.25-1 µM, inhibited ADP hydrolysis in a dose-dependent manner (13.4-69 %). Ecto-5-nucleotidase activity was only inhibited (38 %) in the presence of 1 µM cadmium. In chapter II we have investigated the effect of aluminum exposure on brain AChE activity and behavior parameters in zebrafish. In vivo exposure of zebrafish to 50 µg/L AlCl3 during 96 h at pH 5.8 significantly increased (36 %) acetylthiocholine hydrolysis in zebrafish brain. There were no changes on AChE activity when fish were exposed to the same concentration of AlCl3 at pH 6.8. Semi-quantitative RT-PCR has not shown significant alterations on the expression levels of ache mRNA gene in zebrafish brain. In vitro concentrations of AlCl3 varying from 50 to 250 µM have increased AChE activity (28 to 33 %, respectively) Moreover, we observed that animals exposed to AlCl3 at pH 5.8 presented a significant decrease in locomotor activity, as evaluated by the number of line crossings (25 %), distance traveled (14.1 %) and maximum speed (24 %). In chapter III we have investigated the effects of toxic metals on soluble and membrane ADA activity and gene expression in zebrafish brain. Regarding the metals tested, only HgCl2 was able to inhibit the adenosine deamination in vitro in both fractions. The inhibition was observed from 5 to 250 µM HgCl2 (84.6 - 92.6 %) in soluble fraction while in membrane fractions the inhibition varied from 50 to 250 µM (20.9 - 26 %). The in vivo exposure of zebrafish to 20 µg/L of HgCl2 was evaluated after acute (24 h) and subchronic (96 h) treatments on ADA activity in soluble and membrane fractions. The ADA activity from soluble fraction was inhibited after both acute (24.5 %) and subchronic (40.8 %) exposures whereas the ADA activity from brain membranes was inhibited only after subchronic exposure (21.9 %). In contrast, semi-quantitative RT-PCR analysis showed that HgCl2 was not able to modulate the ADA gene expression. Our results have show that the enzymes involved in the degradation of nucleotides and nucleosides (NTPDase, 5'-nucleotidase and ADA) and AChE are modulated by toxic metals in zebrafish brain. Besides been a possible target in the neurotoxicity mediated by metals, the alteration of these enzyme activities can be used as bioindicator of the environmental presence of these pollutants.

O zebrafish (Danio rerio) é uma espécie utilizada como modelo experimental em diversas áreas, tais como neurociências toxicologia. Seu genoma já está praticamente sequenciado e estudos demonstraram que muitos genes deste peixe são similares aos de mamíferos. Além disso, o zebrafish é um excelente modelo para estudar a função de diferentes sistemas de neurotransmissão. O consumo do etanol exerce diversas mudanças na coordenação motora, percepção sensorial e cognição promovendo um amplo espectro de alterações bioquímicas e fisiológicas nas células nervosas. Aqui, nós investigamos o efeito promovido pela exposição crônica de etanol nos sistemas purinérgico e glutamatérgico, e níveis de BDNF no SNC de zebrafish. Os transportadores de alta afinidade de aminoácidos (EAAT) regulam os níveis extracelulares de glutamato. Nós identificamos e descrevemos o padrão de expressão dos genes relacionados aos transportadores e as propriedades de captação de glutamato nas três importantes estruturas cerebrais de zebrafish (telencéfalo, tecto óptico e cerebelo). As pesquisas nos bancos de dados do seu genoma através de análise filogenética confirmaram a presença de diversos EAATs (EAAT2, EAAT3, três EAAT1 parálogos e duas sequências parálogas para EAAT5). Também, a captação de glutamato dependente de sódio foi significativamente maior no tecto óptico, indicando diferenças funcionais entre as estruturas cerebrais. Os EAATs pertencem à família dos carreadores de soluto 1 (SLC1), que constitui os transportadores de alta afinidade de aminoácidos e transportadores de aminoácidos neutros. Recentemente, foi demonstrada uma análise filogenética e clonagem dos genes SLC1/EAAT identificando distintos membros desta família de transportadores. No sentido de unificar a designação dos genes SLC1/EAAT em zebrafish, foi proposta uma nomenclatura comum para estes grupos. O etanol promoveu uma diminuição significativa na captação de glutamato após 7 e 14 dias de exposição (30% e 54%, respectivamente), enquanto que após 28 dias, não foram observadas alterações. Na,K-ATPase, a enzima responsável pelo controle do gradiente iônico, não teve sua atividade alterada após todos os períodos de exposição testados. Além disso, os peixes expostos ao etanol durante 7 e 14 dias tiveram uma redução nos níveis de mRNA para SLC1A1/EAAT3. Entretanto, a expressão gênica do SLC1A8a,b/EAAT6a,b aumentou após todos os períodos testados, enquanto que SLC1A3a,b/EAAT1b aumentou somente após 28 dias. A prolongada exposição ao etanol não foi capaz de alterar as atividades da glutamina sintetase e glutaminase. Da mesma forma, etanol não alterou a hidrólise de ATP e GTP. Entretanto, foi verificada uma diminuição na hidrólise de ADP (46% e 34%) e GDP (48% e 36%) após 7 e 14 dias respectivamente. Após 7 e 14 dias de exposição ao etanol, também foi observada uma significativa alteração na hidrólise de AMP (48% e 36%), enquanto que a hidrólise de GTP foi inibida somente após 7 dias (46%). Os níveis de transcritos das nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase (NTPDases) foram alteradas após 7, 14 e 28 dias. Em contraste, a expressão da 5′-nucleotidase não foi alterada. A atividade da adenosina deaminase (ADA) na fração solúvel não foi modificada, mas uma redução da atividade na fração de membrana após 28 dias de exposição ao etanol (44%) foi observada. A análise da expressão gênica demonstrou que ADA1 permaneceu inalterada, enquanto que os transcritos de ADAL, ADA2-2, ADA2-1, e sua isoforma truncada de ―splicing‖ alternativo (ADA2-1/T) foram alteradas após a ação prolongada do etanol. Após 14 e 28 dias, etanol aumentou a expressão gênica do BDNF, mas não alterou os níveis de transcritos para trkB. A determinação da proteína BDNF através dos métodos de ELISA indicou um aumento de (51%), sendo confirmando imunohistioquímicamente. Estes resultados sugerem que a homeostase da função neurotrófica pode ser alterada pelo prolongado consumo de etanol. Esta tembém inclui uma revisão sobre o papel de diferentes neurotransmissores excitatórios e inibitórios em zebrafish, tais como, dopaminérgico, serotoninérgico, colinérgico, glutamatérgico, purinérgico, histaminérgico, nitrérgico, glicinérgico, gabaérgico, enfatizando aspectos farmacológicos e toxicológicos. Em suma, esta tese demonstra o efeito da exposição crônica ao etanol afeta o sistema glutamtérgico e purinérgico, expressão de BDNF em cérebro de zebrafish. O aumento do conhecimento global sobre os sistemas de neurotransmisão em zebrafish e o esclarecimento de efeitos farmacológicos e toxicológicos poderia contribuir para novas estratégias de pesquisa em ciências básicas e biomédicas. / The zebrafish (Danio rerio) is a species used as experimental models in various fields such as neurosciences, toxicology. Its genome has already been sequenced and studies have shown that many genes are similar to those of mammals. Furthermore, zebrafish provides an excellent model to study the function of different neurotransmitter systems. The ethanol consumption exerts several changes in motor coordination, sensory perception and cognition, promoting a wide-spectrum of biochemical and physiological alterations on nervous cells. Here we investigated the effects promoted by chronic ethanol exposure on glutamatergic and purinergic systems, and BDNF levels in zebrafish CNS. High-affinity excitatory amino acid transporters (EAATs) regulate extracellular glutamate levels. We identified and described the expression profile of EAATs-related genes and the functional properties of glutamate uptake in three major brain structures from zebrafish (telencephalon, optic tectum and cerebellum). Searches on zebrafish genome databases and a phylogenetic analysis confirmed the presence of several EAAT-related genes (EAAT2, EAAT3, three EAAT1 paralogs and two EAAT5 sequences). Moreover, the glutamate uptake was significantly higher in optic tectum, which indicates functional differences within zebrafish brain structures. EAATs belong to the solute carrier family 1 (SLC1), that constitute high-affinity glutamate and neutral amino acid transporters. Recently, the phylogenetic analysis and cloning reporting of SLC1/EAAT genes from zebrafish identified distinct members of this transporter family. In order to unify the nomenclature of SLC1/EAAT genes in zebrafish, it was proposed a common nomenclature for these groups. The actions of ethanol on glutamate uptake showed a significant decrease in glutamate transport (30% and 54%) after 7 and 14 days of exposure, whereas after 28 days, no significant changes were detected. Na,K-ATPase, the enzyme responsible to generate ion gradients, did not alter after all exposure periods. Moreover, fish exposed to ethanol during 7 and 14 days exhibit a decrease of mRNA levels for SLC1A1/EAAT3. However, the gene expression of SLC1A8a,b/EAAT6a,b increased after all exposure periods, whereas SLC1A3a,b/EAAT1b increased only after 28 days. The prolonged ethanol exposure did not significantly change the glutamine synthetase and glutaminase activities. In the same way, ethanol did not alter the ATP and GTP hydrolysis. However, a decrease in ADP (46% and 34%) and GDP (48% and 36%) hydrolysis was verified after 7 and 14 days, respectively. After 7 and 14 days of ethanol exposure, a significant decrease in AMP hydrolysis (48% and 36%) was also observed, whereas GMP hydrolysis was inhibited only after 7 days (46%). Furthermore, nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (NTPDase) transcript levels were altered after 7, 14, and 28 days. In contrast, 5′-nucleotidase expression was not altered. Adenosine deaminase (ADA) activity from soluble fraction was not modified, but a decrease of ADA activity in membrane fraction after 28 days (44%) of ethanol exposure was observed. Gene expression analysis demonstrated that ADA1 remained unaltered, whereas ADAL, ADA2-2, ADA2-1 transcripts, and its truncated alternative splice isoform (ADA2-1/T) were altered after prolonged ethanol exposure. After 14 and 28 days, ethanol increased the BDNF gene expression, but did not change the levels of trkB transcripts. The measurement of BDNF protein through ELISA kit anti-BDNF showed increased amounts after 28 days of exposure (51%), which was also confirmed by immunohistochemstry. These results suggest that the homeostasis of neurotrophic functions may be altered by prolonged ethanol consumption. Moreover, we present a review about the role of different excitatory and inhibitory neurotransmitters systems in zebrafish, such as dopaminergic, serotoninergic, cholinergic, glutamatergic, purinergic, histaminergic, nitrergic, glycinergic, and GABAergic systems, emphasizing pharmacological and toxicological aspects. In conclusion, this thesis demonstrates that chronic ethanol exposure affects the glutamatergic and purinergic systems, and BDNF expression in zebrafish brain. The significant increase in the global knowledge about the neurotransmitters systems in zebrafish and the elucidation of pharmacological and toxicological effects could lead to new strategies and appropriate priorities in research in order to support complementary insights on basic sciences and biomedical research.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Currently, the zebrafish (Danio rerio) is widely used in research related to anxiolytic properties and pharmacological mechanisms of alcoholism. Previous research has shown its effects on several behavioral parameters, similar to that already observed in exposure to anxiolytic drugs, as well as attenuation of fear responses against the predator. The detection of the presence of predator can occur in a visual way, and threatened fish has the ability to communicate about risk to other individuals through the release of a chemical called disturbance substance. The predatory threat causes physiological adjustments as a result of the stress response, which aims to maintain the homeostasis of the animal, and the secretion of the hormone cortisol, the main endocrine indicator of this response. As ethanol can affect the reactions of fear, we evaluated its possible effects on cortisol levels in zebrafish as a result of exposure to the visual perception of predator and disturbance substance. Finally, our study demonstrated for the first time the interference of low doses of ethanol (0.25%, 0.50%, and 1%) for acute exposure on the stress response triggered by the presence of the predator, blocking cortisol secretion in both fish: donors and receivers. In the absence of ethanol, we detected stress response with an increase in cortisol levels in fish tissue disturbance substance of donor fish due to the presence of predators, as well as in fish receptors due to the perception of chemical information. Therefore, we postulate that ethanol may interfere with the visual perception of both predator and/or secretion of disturbance substance, as well as the ability to detect this substance. / Recentemente o peixe zebra (Danio rerio) tem sido amplamente utilizado em pesquisas ligadas as propriedades ansiolíticas e mecanismos farmacológicos do alcoolismo. Pesquisas anteriores tem demonstrado seus efeitos em diversos parâmetros comportamentais, similares aos já verificados na exposição a drogas ansiolíticas. Atenuação das reações de medo, ocasionadas pela presença do predador também tem sido demonstradas, em decorrência da exposição ao etanol. A detecção da presença do predador pode ocorrer de maneira visual, onde o peixe ameaçado tem a capacidade de comunicar demais indivíduos sobre o risco, através da liberação de substância química, denominada substância distúrbio. A ameaça predatória ocasiona ajustes fisiológicos em consequência da resposta de estresse, que tem por objetivo manter a homeostase do animal, sendo a secreção do hormônio cortisol o principal indicador desta resposta. Uma vez que o etanol pode afetar as reações de medo, avaliamos seus possíveis efeitos no aumento dos níveis de cortisol de peixes zebra, em consequência da exposição visual ao predador e percepção da substância distúrbio. Finalmente, nosso trabalho demonstrou por primeira vez a interferência de baixas doses de etanol (0,25%, 0,50% e 1%) em exposição aguda, na resposta de estresse desencadeada pela presença do predador, bloqueando a secreção de cortisol tanto em peixes zebra doadores como peixes zebra receptores da substância distúrbio. Na ausência de etanol, detectamos resposta de estresse com aumento dos níveis de cortisol tecidual em peixes doadores de substância distúrbio devido a presença do predador, assim como em peixes receptores devido a percepção da informação química. Tendo isto em conta, postulamos que o etanol pode interferir na percepção visual do predador e/ou a secreção de substância distúrbio, assim como na capacidade de detecção desta substância por peixes receptores.

O conteúdo de zinco (Zn) reativo cerebral é importante para o equilíbrio da sinaptofisiologia neural. A prova disto é que um aumento nos seus níveis, após evento hipóxico-isquêmico, resulta em neurotoxicidade, o que tem estimulado o tratamento desta disfunção cerebral com quelantes de Zn, tal como o dietilditiocarabamato (DEDTC). No caso do DEDTC, o uso deste composto sobre esta disfunção deve ser analisado com cuidado, pois ele também apresenta muitos efeitos colaterais sobre o sistema nervoso central. Desta forma, para atender este propósito, é necessário antes obter uma concentração de DEDTC com menores efeitos colaterais. Por esta razão, no presente trabalho, nós decidimos usar um modelo vertebrado mais simples, tal como o peixe-zebra, o qual permitiria a triagem, em larga escala, dos efeitos de DEDTC sobre o Zn reativo. Entretanto, jamais foi mostrada a presença de Zn reativo no cérebro de peixe-zebra. Com isto, através de marcações histológicas, nós conseguimos mostrar pela primeira vez a distribuição citoarquitectônica de Zn reativo em neurônios glutamatérgicos, bem como o número desses neurônios contendo Zn no cérebro de peixe-zebra. Isto nos permitiu avaliar o efeito de diferentes concentrações de DEDTC sobre o conteúdo de Zn cerebral do peixe-zebra, o qual foi intensamente quelado por elevadas quantidades do composto, induzindo comportamentos tipo-crise. Neste mesmo estudo nós obtemos também uma concentração de DEDTC com poucos efeitos colaterais que poderia exercer neuroproteção sobre o aumento de Zn reativo induzido pela hipóxia-isquemia. Assim, após a padronização de um modelo de hipóxia em peixe-zebra, que demonstra danos relacionados à isquemia, nós testamos se essa concentração de DEDTC poderia ser neuroprotetora sobre este modelo. Contudo, DEDTC apresentou efeitos pró-oxidantes, embora ele tenha atenuado o elevado conteúdo de Zn reativo induzido pela hipóxia. Portanto, mesmo que o DEDTC tenha falhado, este modelo, agora, está apto para a triagem de outros fármacos com potencial ação sobre o alterado conteúdo de Zn reativo que ocorre em eventos hipóxicos-isquêmicos. / The content of brain reactive zinc (Zn) is important for the synaptophysiology in the central nervous system (CNS). This is evidenced in hypoxic-ischemic events, when an increase in their levels results in neurotoxicity. Consequently, this has stimulated the treatment of cerebral ischemia with Zn chelators, such as diethyldithiocarbamate (DEDTC). In the case of DEDTC, the use of this compound in this dysfunction should be examined carefully, because it also has many side effects on the (CNS). Thus, to meet this, it is necessary first to obtain a concentration of DEDTC with negligible side effects. Here, we decided to use a simpler vertebrate model, such as zebrafish, which would allow large-scale screening of DEDTC effects on reactive Zn. However, the presence of reactive Zn has never been shown in zebrafish brain. Then, using histological markers, we were able to show for the first time the cytoarchitectonic distribution of reactive Zn in glutamatergic neurons as well as the number of these neurons containing Zn in the zebrafish brain. This allowed us to evaluate the effect of different DEDTC concentrations on the brain content of Zn in zebrafish. As a result, high levels of the compound did strongly chelate the metal, inducing seizure-like behaviors. In this study we also obtained a DEDTC concentration with few side effects that could exert neuroprotection on the increased reactive Zn induced by hypoxia-ischemia. Then, after the standardization of an ischemic-sensitive model of hypoxia in zebrafish, we tested if this DEDTC concentration could be neuroprotective on this model. Nevertheless, DEDTC showed pro-oxidant effects, though it had mitigated the elevated content of reactive Zn induced hypoxia. Therefore, despite the DEDTC have failed as neuroprotective drug, this model enables the screening of other chemical agents with potential action on the increased content of reactive Zn that occurs in hypoxic-ischemic events.