This study investigated the interaction between polychlorinated biphenyls (PCBs) and selenium to explain the mechanism involved that could affect selenium metabolism and its anti-cancer property. PCBs congeners and mixtures were previously found to reduce hepatic Se and Se-dependent glutathione peroxidase activity. I hypothesized that certain PCB congeners affect selenium metabolism in the rat liver resulting in diminished antioxidant capacity of selenoproteins, which could alter the ability of Se to protect against PCBs induced tumor promotion. In the first study, the influence of 3,3,4,4-tetrachlorobiphenyl (PCB 77) on hepatic Se and glutathione peroxidase (GPx1) activity as well as cytochrome P450 1A1 induction was examined by employing a time-course study, which showed that PCB 77 significantly reduced the hepatic selenium level and GPx1 activity and that this effect was influenced by gender. The next study explored how PCB 77 could deplete hepatic selenium by determining selenium concentrations in different tissues, feces and urine. This study demonstrated that PCB-77 decreased hepatic Se by increased excretion of Se in urine but not in feces. Unlike glutathione peroxidase, thioredoxin reductase activity was not affected by PCB 77. The third study investigated the effect of selenium supplementation on the tumor promoting activity of PCB 77 and 2,2,4,4,5,5-hexaclorobiphenyl (PCB 153) using a 2-stage carcinogenesis model. Se supplementation did not diminish the induction of altered hepatic foci by coplanar PCB 77 or ortho-substituted PCB 153. Instead of protection, the number of foci per cubic centimeter and per liver among the PCB-77 treated rats was increased as the selenium dietary level increased. PCB 153 did not show the same selenium dose-response effect; nevertheless, selenium supplementation did not confer protection against foci development. On the other hand, supranutritional selenium reduced the mean focal volume. Supranutritional selenium or PCBs did not affect cell proliferation or thioredoxin reductase activity. Lastly, the use of the Zeeman graphite furnace atomic absorption spectrometry (GFAAS) method and closed microwave digestion technique for selenium determination of biological samples was compared with the neutron activation analysis and fluorometry methods. I found that GFAAS was not as reliable as the other methods.

Orientador: Rubens Monti / Banca: Olga Luiza Tavano / Banca: Valdecir Farias Ximenes / Banca: Hermane da Silva Barud / Banca: Jose Paschoal Batistuti / Resumo: As peroxidases (EC 1.11.1.7) são hemoproteínas que catalisam processos redox e durante a oxidação são gerados radicais livres, formando produtos poliaromáticos insolúveis em água, facilitando sua remoção do meio aquoso. O objetivo deste trabalho foi extrair as peroxidases da casca de soja e do chuchu, realizar aminação na superfície da estrutura terciária das enzimas e imobilizarem estas enzimas nos suportes alternativos de celulose vegetal (pó de sabugo de milho) e de celulose bacteriana ativada e utilizar os derivados obtidos para descoloração do azul de bromofenol 0.01 mM. A quantidade de proteínas nos extratos foram determinada por Bradford com valores médios de 0,235 mg mL -1 para soja e 0,290 mg mL -1 para o chuchu, a atividade específica de peroxidase foi determinada com ABTS 1 mM em presença de H2O2 100 mM em λ= 430nm, obtendo-se os valores médios de 86,06 μmol min -1 mg -1 e 9,04 μmol min -1 mg -1 respectivamente, em tampão acetato de sódio 100 mM, pH 4,0. Aminação das peroxidases solúveis foram feitas em tampão etilenodiamina pH 4,75 e carbodiimida, 10 e 50 mM, a funcionalização das celuloses e imobilização covalente multipontual foram semelhantes às descritas para agarose (Guisan). 19 As peroxidases aminadas 10 e 50 mM foram imobilizadas covalentemente nos suportes ativados SM-glioxil e CB-glioxil. Para a descoloração do azul de bromofenol 0.01 mM, utilizou-se os derivados estabilizados em presença de H2O2 em λ= 590nm. Os derivados foram reutilizados por cinco reciclos, mantendo-se a propriedade catalítica, sugerindo que estes derivados são uma alternativa de baixo custo, não só para o tratamento de águas residuais como também com potenciais usos em outros processos industriais / Abstract: The peroxidases (EC 1.11.1.7) are hemoproteins that catalyze redox processes; during the oxidation the generated free radicals are forming poly-aromatic products insoluble in water, facilitating their removal from aqueous medium. The objective of this study was to extract peroxidases from the coat soybean and the chuchu (Sechium edule L), to make aminations on the tertiary structure of the enzymes surface, and immobilize these enzymes in the alternative supports of plant cellulose (powdered corn cob) and active bacterial cellulose, to use the derivatives obtained for the discoloration of the bromophenol blue 0.01 mM. The amount of protein in the extracts were determined by Bradford methods, with average values of 0,235 mg mL -1 for soybean and 0,290 mg mL -1 for chuchu peroxidases, the specific activity of peroxidase was determined with ABTS 1 mM in the presence of H2O2 100 mM in λ= 430nm, obtaining the mean values of 86,06 μmol min -1 mg -1 and 9,04 μmol min -1 mg -1 respectively, in sodium acetate buffer 100mM, pH 4,0. Amination of soluble peroxidases were made in buffer ethylenediamine pH 4,75 and carbodiimide, 10 and 50mM, the functionalization of cellulose and multipoint covalent immobilization were similar to those described for agarose (Guisan). 19 The amino peroxidases 10 and 50 mM were covalently immobilized on activated supports SM-glioxil and CB-glioxil. For discoloration of bromophenol blue 0.01 mM, we used derivatives of stabilized in H2O2 presence in λ= 590nm. The derivatives were reused for five recycling maintaining the catalytic property, suggesting that these products are a low cost alternative, not only for the treatment of wastewater as well as potential uses in other industrial processes / Doutor

>Magister Scientiae - MSc / The negative environmental impact of fossil fuels and growing concerns about petroleum supplies has driven the search for alternative, renewable transportation fuels. An 'ideal' fuel replacement would be a biofuel produced from lignocellulosic biomass. Unfortunately, the presence of lignin in plant cell walls impedes the breakdown of cell wall polysaccharides into simple sugars and the subsequent conversion of these sugars into useable fuels. One of the most common fates of lignin in nature is to be metabolized by lignin peroxidases (LiPs), predominantly of microbial origin. This study aims to isolate and characterise microorganism(s) involved in the degradation of lignocellulose. Thermophilic bacteria were isolated from straw-based compost and screened for lignin peroxidase activity. One isolate, CP11, showed significant lignin peroxidase activity and based on 16S rRNA gene sequence analysis, the isolate was found to be most closely related to Bacillus thermoamylovorans. Morphological, physiological and biochemical characterisation was conducted to determine whether the isolate was a novel species. Morphologically, CP11 was characterised as an endospore-forming, Gram positive rod. In addition, the isolate was found to be a facultative anaerobe, catalase positive and capable of utilising a range of carbon sources including glucose, sucrose and arabinose. Isolate CP11 was moderately thermotolerant and grew between 37°C and 55°C, with an optimum growth temperature of 45°C. Based on its phenotypic characteristics CP11 could be clearly distinguished from its closest phylogenetic neighbours. Preliminary characterisation of the lignin peroxidase was conducted using crude enzyme extract and Azure B dye as the substrate. Activity was detected in the supernatant only and a growth curve was constructed to determine the growth phase of lignin peroxidase production. In order to identify the gene encoding the lignin peroxidase a small insert library was constructed and screened for ligninase activity using Azure B as the substrate. / National Research Foundation

Cytochrome P450 monooxygenases, one of the most important classes of heme-thiolate proteins, have attracted considerable interest in the biochemical community because of its catalytic versatility, substrate diversity and great number in the superfamily. Although P450s are capable of catalyzing numerous difficult oxidation reactions, the relatively low stability, low turnover rates and the need of electron-donating cofactors have limited their practical biotechnological and pharmaceutical applications as isolated enzymes. The goal of this study is to tailor such heme-thiolate proteins into efficient biocatalysts with high specificity and selectivity by protein engineering and to better understand the structure-function relationship in cytochromes P450. In the effort to engineer P450cam, the prototype member of the P450 superfamily, into an efficient peroxygenase that utilizes hydrogen peroxide via the “peroxide-shunt” pathway, site-directed mutagenesis has been used to elucidate the critical roles of hydrophobic residues in the active site. Various biophysical, biochemical and spectroscopic techniques have been utilized to investigate the wild-type and mutant proteins. Three important P450cam variants were obtained showing distinct structural and functional features. In P450camV247H mutant, which exhibited almost identical spectral properties with the wild-type, it is demonstrated that a single amino acid switch turned the monooxygenase into an efficient preoxidase by increasing the peroxidase activity nearly one thousand folds. In order to tune the distal pocket of P450cam with polar residues, Leu 246 was replaced with a basic residue, lysine, resulting in a mutant with spectral features identical to P420, the inactive species of P450. But this inactive-species-like mutant showed catalytic activities without the facilitation of any cofactors. By substituting Gly 248 with a histidine, a novel Cys-Fe-His ligation set was obtained in P450cam which represented the very rare case of His ligation in heme-thiolate proteins. In addition to serving as a convenient model for hemoprotein structural studies, the G248H mutant also provided evidence about the nature of the axial ligand in cytochrome P420 and other engineered hemoproteins with thiolate ligations. Furthermore, attempts have been made to replace the proximal ligand in sperm whale myoglobin to construct a heme-thiolate protein model by mimicking the protein environment of cytochrome P450cam and chloroperoxidase.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-12-07Bitstream added on 2014-06-13T21:05:34Z : No. of bitstreams: 1 gomes_das_dr_arafo.pdf: 1006802 bytes, checksum: 8054c31dbb8f9513add58d4492f5b5dd (MD5) / Mediadores inflamatórios como mieloperoxidase (MPO) e óxido nítrico (NO) participam do processo inflamatório da doença periodontal e na associação ao diabetes. Inibidores da Óxido Nítrico Sintase (NOS), como o L-NAME têm sido administrados na tentativa de minimizar danos teciduais decorrentes da inflamação. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do L-NAME sobre os níveis da isoforma induzível de óxido nítrico (iNOS), sobre a perda óssea alveolar e sobre os níveis de mieloperoxidase (MPO) em ratos diabéticos com periodontite induzida. Foram utilizados 192 ratos divididos em grupos de 24 animais cada: grupo C: Controle com ingestão de água; grupo C-L: Controle com ingestão de LNAME; grupo D: Ratos diabéticos com ingestão de água; grupo D-L: Ratos diabéticos com ingestão de L-NAME; grupo P: Ratos com periodontite experimental e ingestão de água; grupo P-L: Ratos com periodontite experimental e ingestão de L-NAME; grupo DP: Ratos diabéticos com periodontite experimental e ingestão de água; e grupo DP-L: Ratos diabéticos com periodontite experimental e ingestão de L-NAME. O sacrifício dos animais foram realizados aos 3,7,15,e 30 dias após a indução da periodontite experimental. Foram realizadas análises da taxa glicêmica, da perda óssea alveolar, da atividade de mieloperoxidase e da expressão de iNOS. Os grupos com D, P e DP mostraram níveis de iNOS estatisticamente mais altos quando comparados aos grupos D-L, P-L e DP-L que ingeriram L-NAME em todos os períodos. (p < 0.05). Os grupos que ingeriram L-NAME mostraram perda óssea estatisticamente menor quando comparados aos grupos que ingeriram água (p < 0.05). A alta expressão de MPO foi observada nos grupos com periodontite P e DP que ingeriram água. Foi verificado um pico nos níveis de MPO aos 7 dias em todos os grupos experimentais que ingeriram água... / Inflammatory mediators such as myeloperoxidase (MPO) and nitric oxide (NO) play a role in inflammatory processes related to periodontal disease and diabetes. NO-Synthase (NOS) inhibitors as L-NAME have been administered in attempts to reduce tissue damage resulting from such inflammation. The aim of this study was to evaluate the effects of L-NAME on alveolar bone loss, NO and MPO levels in diabetic rats with experimental periodontitis. A hundred ninety-two rats were divided into one of the following groups with 24 animals each: group C-W: control group with water intake; group C-L: control group with L-NAME intake; group D-W: diabetic rats with water intake; group D-L: diabetic rats with LNAME intake; group P-W: chronic periodontitis rats with water intake; group PL: chronic periodontitis rats with L-NAME intake; group DP-W: diabetic chronic periodontitis rats with water intake, and group DP-L: diabetic chronic periodontitis rats with L-NAME intake. The killing was performed at 3, 7, 15 and 30 days after ligature-periodontitis induction to obtain gingival specimens and to evaluate MPO and NO activity and radiographic bone loss. Groups with D-W or P-W and DP-W showed statistically higher iNOS expression compared to LNAME groups in all periods (p < 0.05). L-NAME treatment (L) statistically decreased iNOS expression in all groups with inflammatory pathological conditions, such as D, P and DP. In general, groups with L-NAME intake showed lower bone loss compared to water intake groups. In addition, P-L or DP-L rats demonstrated statistically lower bone loss compared to diabetics and controls at 30 days (p < 0.05). The highest MPO expression was verified in periodontitis groups with water intake (P-W e DP-W). There was a peak in MPO levels at 7 days in all experimental groups with water intake during experimental evolution. The L-NAME statistically decreased MPO levels from all groups... (Complete abstract click electronic access below)

Evidence suggests that root cell walls are a target of low pH stress. Severe low pH stress causes cell death in the root tip. The walls of these cells are highly dynamic. Our hypothesis is that in these cells low pH causes stress in the cell wall due to excessive loosening. Thus, a certain level of turgor pressure should be required to cause cell death. Here, we aimed to investigate the role of the cell wall in low pH stress leading to cell death. We looked for the possible involvement of players such as class III peroxidases and ethylene signaling, which could promote changes in the cell wall and cause differential sensitivity to low pH. Arabidopsis thaliana and mutants in the genetic background of Col-0 were grown in a medium containing agar (0.8%) and half the concentration of Hoagland\'s nutrient medium. Five-day-old seedlings were exposed to low pH in a solution composed of 0.5 mM CaCl2 and 0.6 mM Homopipes buffer. Treatment of roots at pH 4.6 caused death of cells in the transition zone (TZ) and meristematic zone (MZ). However, cell death was negligible when plants were treated at pH 4.6 in an hyperosmotic solution (&Psi;s = -0.37 MPa), thereby decreasing cell wall tension. Also, an hypoosmotic treatment (HO) caused cell death at pH 5.8 in TZ. Cell death was accelerated when HO was performed in a low pH solution. The mutant of a cell wall integrity sensor protein, wak-1, displayed reduced cell death when exposed to low pH. Also, cell death seems to occur through a programmed cell death mechanism. Thus, low-pH induced cell death appears to be triggered by perception of cell wall stress. We examined published data to search for class III peroxidases possibly involved in cell death due to low pH. The gene for AtPrx62 is induced 8.37-fold in low pH exposed roots. The atprx62 KO mutant was less sensitive to low pH than Col-0 roots. The mRNA of AtPRX62 accumulated in the same zone that cell death occurred due to low pH. This strongly suggests that AtPRX62 is positive regulator of low-pH induced cell death. Also, ethylene pretreatment induced subsequent tolerance of roots to low pH and this was dependent of its receptor ETR1. Together we show that a cell wall stress caused by low pH causes cell death. This death was in part due AtPRX62 activity and was also suppressed by ethylene. / Evidencias recentes sugerem que a parede celular é um alvo direto do estresse por baixo pH em raízes. Estresse severo por baixo pH rapidamente causa a morte de células do ápice radicular, onde a parede é altamente dinâmica. Nossa hipótese é de que nessas células, o baixo pH cause mudanças na parede celular, como afrouxamento excessivo. Assim, a pressão de turgor sobre a parede deve ser necessária para causar danos que levam à morte das células. Neste trabalho, nós investigamos o papel da parede celular no estresse por baixo pH e na consequente morte de células radiculares. Além disso, tambem foi investigado o papel de peroxidases de classe III e sinalização por etileno, que promovem mudanças na parede celular as quais podem gerar sensibilidade diferenciada a baixo pH. Plântulas de Arabidopsis thaliana e mutantes no background de Col-0 foram crescidas em meio contendo ágar (0.8%) e metade da concentração dos nutirentes do meio de Hoagland. Plântulas com 5 dias de idade foram expostas a baixo pH em uma solução composta por 0.5 mM de CaCl2 e 0.6 mM de tampão Homopipes. O tratamento de raízes a pH 4.6 causou morte em células da zona de transição (TZ) e zona meristemática (MZ). Entretanto, a morte celular foi negligível quando as plantas foram tratadas a pH 4.6 simultaneamente com a diminuição da tensão na parede celular, através de solução com potencial de - 0.37 MPa. Além disso, um choque repentino na pressão de tugor por intermédio de tratamento hiposmótico (HO) causou morte celular a pH 5.8 na TZ. A morte celular foi acelerada quando HO foi realizado em uma solução a baixo pH. A morte celular foi reduzida no mutante wak-1 exposto a baixo pH. WAK-1 é um receptor de parede que atua no sistema de monitoramento de integridade da parede celular. A morte das células provavelmente ocorreu por meio de morte celular programada. Juntos, esses dados trazem evidências que a parede celular é crucial para percepção do estresse causado por baixo pH e essa percepção possivelmente está envolvida em repostas que causam a morte celular. Nós examinamos dados publicados procurando por peroxidases classe III possivelmente envolvidas com a morte celular devido baixo pH. O gene codante para AtPRX62 foi induzido 8.37 vezes em raízes expostas a baixo pH. O mutante KO atprx62 foi menos sensível a baixo pH que raízes de Col-0. O mRNA de AtPRX62 acumulou-se na mesma zona de morte celular devido baixo pH em raízes de Col-0. Isso sugere que a atividade de AtPRX62 está relacionada com a morte celular devido baixo pH. Além disso, o pré-tratamento com etileno induziu tolerância de raízes à exposição subsequente a baixo pH. Esta indução foi dependente de sinalização via ETR1. No conjunto, nós mostramos que um estresse causado na parede celular pelo baixo pH causa a morte celular. Essa morte é em parte devido a atividade de AtPRX62 mas pode ser aliviada por etileno.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:07:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_jaqueline_tavares_schafer.pdf: 2389820 bytes, checksum: 6ebde337718d550322c67052472113ac (MD5) Previous issue date: 2011-03-03 / The rice crop is subject to the occurrence of various diseases that cause yield losses of crops. Currently is seeking alternative ways to control these diseases, and biocontrol a viable possibility. The aim of this study was to compare the control of brown spot and leaf scald of rice provided by rhizobacteria isolated and combined, their impact on grain production, as well as the involvement of induced resistance associated with the activity of catalases and peroxidases. We used the DFs185 rhizobacteria (Pseudomonas synxantha) DFs223 (P. fluorescens), DFs306 (not identified), and DFs416 DFs418 (Bacillus sp.). And some combinations of these. Rice seeds of El Paso 144L were immersed in suspensions (A540 = 0.5) for each of the bacterial treatments and agitated for 30'/10°C. Seeds immersed in saline and saline plus fungicide were used as control. The experiment was conducted in a greenhouse, with assessment of disease severity in two separate trials. The first was conducted by the production and second, plants were collected at three different times to check the enzyme activity (0 h before inoculation, 24 and 168 h after). The experimental design was completely randomized. In general, the bacterial treatments were able to control both diseases, except DFs306 not provided effective control of brown spot in the first trial. In plants inoculated with Bipolaris oryzae, no treatment was able to increase production of grains or grains with lower intensity of staining. Already in plants inoculated with Gerlachia oryzae, all treatments resulted in increase of at least one variable related to production. In general, it was possible to associate the participation of enzymes evaluated the control provided by some treatments. Thus, it is believed that the bacterial treatments, individual and combined, have the potential to control brown spot and leaf scald and ability to induce resistance by altering the activity of catalases and peroxidases. / A cultura do arroz irrigado está sujeita à ocorrência de várias doenças que provocam perdas na produtividade das lavouras. Atualmente buscam-se alternativas para o controle destas doenças, sendo o biocontrole uma possibilidade viável. O objetivo deste trabalho foi de comparar o controle da mancha parda e da escaldadura do arroz proporcionado por rizobactérias isoladas e em combinações, seu impacto sobre a produção de grãos, bem como o envolvimento da indução de resistência associado à atividade de catalases e peroxidases. Utilizaram-se as rizobactérias DFs185 (Pseudomonas synxantha), DFs223 (P. fluorescens), DFs306 (não identificado), DFs416 e DFs418 (Bacillus sp.), e algumas combinações destas. Sementes de arroz da cultivar El Paso 144L foram imersas nas suspensões (A540=0,5) de cada um dos tratamentos bacterianos e agitados por 30 /10°C. Sementes imersas somente em solução salina e em salina mais fungicida foram usadas como testemunha. O experimento foi conduzido em casa de vegetação, com avaliação da severidade das doenças, em dois ensaios distintos. O primeiro foi conduzido até a produção e o segundo, as plantas foram coletadas em três diferentes tempos para verificar a atividade enzimática (0 h antes da inoculação, 24 e 168 h após). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado. De modo geral, os tratamentos bacterianos foram capazes de controlar ambas as doenças, exceto DFs306 que não proporcionou controle efetivo da mancha parda no primeiro ensaio. Nas plantas inoculadas com Bipolaris oryzae, nenhum tratamento foi capaz de aumentar a produção de grãos ou grãos com menor intensidade de manchas. Já nas plantas inoculadas com Gerlachia oryzae, todos os tratamentos avaliados resultaram em aumento de pelo menos uma variável relacionada à produção. Em geral, foi possível associar a participação das enzimas avaliadas ao controle proporcionado por alguns tratamentos. Assim, acredita-se que os tratamentos bacterianos, individuais e combinados, possuem potencial de controle da mancha parda e da escaldadura e capacidade para induzir resistência pela alteração da atividade de catalases e peroxidases.

O fenômeno da bio- e quimiluminescência tem atraído o interesse da comunidade científica nas últimas décadas não só pelo seu inerente interesse acadêmico, mas também devido as incontáveis aplicações analíticas que dele têm surgido. A maior parte do trabalho acadêmico que tem sido desenvolvido está relacionado ao estudo do mecanismo de geração de estados excitados e a eficiência de desativação radiativa. Por outro lado, do ponto de vista das aplicações tecnológicas, as metodologias para análise de enzimas, drogas e metabólitos, aplicadas à imunologia, microbiologia, medicina forense, etc., que se baseiam em quimiluminescência, estão entre as mais utilizadas em procedimentos de rotina em laboratórios. O desenvolvimento de substratos e, conseqüentemente, novas técnicas quimiluminescentes tem se tornado cada vez mais importante devido a alta sensibilidade desses ensaios, tipicamente equivalente ou melhor do que aqueles que utilizam rótulos radioativos. Esta tese apresenta o desenvolvimento de novas metodologias quimiluminescentes para a determinação de atividade enzimática. O princípio químico é a geração de peróxidos cíclicos instáveis, conhecidos como 1,2-dioxetanos, após a hidrólise de substratos específicos, catalisada pela enzima objeto de estudo. Anéis dioxetânicos são conhecidos pela sua propriedade de gerar produtos em estados eletronicamente excitados quando decompostos. A emissão de luz pode ser relacionada à atividade enzimática. Foi desenvolvido o substrato (fosfato dissódico de 2-metil-1-propenila, NA-MPP) (I)), capaz de produzir o composto 2-metil-1-propen-1-ol quando hidrolisado via a ação catalítica das enzimas fosfatase alcalina (ALP) ou fosfatase ácida (ACP). Este enol é oxidado, sob ação catalítica da enzima peroxidase de raiz forte (HRP), gerando acetona em estado excitado triplete. A emissão de luz direta ou sensibilizada da acetona excitada pode ser correlacionada a atividade enzimatica da ALP ou ACP. A determinação da atividade dessas enzimas livres ou ligadas em anticorpos (conjugados ALP-IgG) tem grande aplicação em tecnologias de diagnóstico, seja como um marcador de diversas doenças, seja como uma sonda em ensaios imuno-enzimáticos (EIA). A sensibilidade alcançada com este substrato foi de 10-15 mols de ALP, 0,0027 unid. de ACP e diluições de até 300.000 de um conjugado (ALP-IgG) por ensaio. Também foi possível correlacionar a atividade de ALP à velocidade de consumo do oxigênio dissolvido no meio de reação, que é uma característica dessa oxidação. Partindo do mesmo princípio delineado no parágrafo anterior, desenvolveu-se um composto para determinação de proteases. Para isso, o composto N-etil-N-(2-metil-1-propenil)benzenamida (II) foi preparado, pois a clivagem de sua ligação amídica geraria uma enamina, que também pode ser oxidada pela ação catalítica da HRP. No entanto, nossos estudos mostraram que este composto não é reconhecido como substrato das proteases. Tomando como base a bem conhecida característica de gerar uma fraca emissão de luz quando derivados indólicos são oxidados por agentes oxidantes clássicos, como KMnO4, K2S2O4, etc., foi estudado o potencial quimiluminescente de alguns derivados indólicos quando submetidos ao sistema HRP/H2O2/O2. Como era esperado, detectou-se quimiluminescência de baixa intensidade para a maioria dos derivados indólicos. Também neste caso a clivagem do anel indólico, via um intermediário dioxetânico, parece ser a responsável pela emissão observada na maioria dos compostos testados. Além disso, a oxidação do composto 2-metilindol (III) mostrou uma eficiência de quimiluminescência com cerca de 3 ordens de grandeza maior que os demais derivados. Verificou-se que o comportamento diferenciado desse composto estava relacionado à exclusiva formação de um composto secundário. A estrutura desse composto foi parcialmente atribuída ao 2,2\'-dimetil-2,2\'-diindoxil. Então, utilizando o 2-metilindol como substrato, desenvolveu-se uma metodologia analítica para determinação de HRP livre ou ligada em anticorpos (conjugados HRP-IgG). Assim como no caso da enzima ALP, conjugados do tipo HRP-IgG são largamente utilizados em EIA. Também com base nas características quimiluminescentes de \'alfa\'-hidroperóxi-cetonas quando submetidas a um forte meio alcalino, desenvolveu-se um potencial substrato para análise de esterases. A hidrólise catalisada por esterase de 2-peracetoxiadamantano-2-carboxialdeído (IV) geraria um \'alfa\'-hidroperóxi-aldeído, que por um ataque nucleofílico intramolecular, levaria a um intermediário dioxetânico. Este composto mostrou-se instável, gerando quimiluminescência mesmo na ausência da enzima. Este fato inviabilizou o seu uso como planejado. / The bio- and chemiluminescent phenomena have attracted the scientists attention in the last decades not only because its inherent academic interests, but also due the uncounted analytical applications that it has originated. Most of the academic work was devoted to the study of the mechanism responsible for the generation of the excited states and the efficiency of radiative deactivation. On the other hand, the technological developments pointed to methodologies for enzyme, drug, and metabolite determination applied to immunological, microbiology, forensic science, etc., based on chemiluminescence, which are already among the most applied techniques in routine laboratory procedures. The development of chemiluminescent substrates has become increasingly important due to their high sensitivity, typically equivalent to or better than assays using radioactive labels. This thesis reports the development of new chemiluminescent methodologies for enzymatic activity determination. The chemical basis is the generation of unstable cyclic peroxides, called 1,2-dioxetanes, upon hydrolysis of specific substrates catalyzed by the target enzyme. Dioxetanes rings are known by their properties to generate electronically excited products upon decomposition. The light emission can be related to enzymatic activity. It was developed a substrate (dissodium 2-methyl-1-propenyl phosphate) (Na-MPP) (I) able to produce 2-methyl-1-propen-1-ol when catalytically hydrolyzed by alkaline (ALP) or acid (ACP) phosphatases enzymes. This enol is oxidized, upon horseradish peroxidase (HRP) action, yielding acetone in triplet excited state. The direct or sensitized light emission of the excited acetone can be correlated to enzymatic activity of ALP or ACP. The activity of this enzyme, free or bound to antibody (ALP conjugates), is widely used in diagnostic technologies, either as a direct marker of several diseases or as an enzymatic probe in enzyme immunoassays (EIA). The sensibility reached with this substrate was 10-15 mols to ALP, 0,0027 u/mL to ACP and dilutions up to 300.000 of ALP-IgG per assay. Since the HRP system consumes dissolved oxygen during the oxidation of the enol, ALP quantification may be performed by following the oxygen uptake rate. By applying the same principle above delineated, it was synthesized a compound for proteases activity determination. Thus, the compound N-ethyl-N-(2-methylpropen-1-yl)benzenamide (II) was prepared, since its hydrolysis would lead to an enamine , which is known to be oxidized via HRP with light emission. However, our studies showed that II is not recognized as a substrate by proteases. Owning to the well known weak emission elicited when indole derivatives are oxidized by classical oxidants like KMnO4, K2S2O4, etc., it was studied the chemiluminescent potential when indoles are submitted to the HRP/H2O2/O2 oxidant system. Indeed, weak chemiluminescence was detected for almost all derivatives. Likewise, the oxidation of 2,3-bond of indoles, through a dioxetane intermediate leading to an open-ring product, seems responsible for this emission. Furthermore, the oxidation of 2-methylindole (III) showed a chemiluminescence efficiency about 3 orders of magnitude higher. It was observed that the high chemiluminescent yield was related to exclusive formation of a secundary product. Its structure was partially attributed to 2,2\'-dimethyl-2,2\'-diindoxil. Thus, using 2-methylindole as substrate was possible to develop an analytical procedure to quantify HRP activity, free or bound to antibodies (conjugates HRP-IgG). In EIA the enzymes HRP and ALP are the most important labels. From the also known chemiluminescent characteristics of \'alpha\'-hidroperoxy-ketones, when submitted to strong alkaline medium, it was developed a potential substrate to esterases. The esterase catalyzed hydrolysis of 2-acetylperoxiadamantane-2-carboxaldeyde (IV) would generate an \'alpha\'-hidroperoxy-aldeyde which, by an intramolecular nucleofilic attack, would lead to a dioxetane intermediate. This compound showed to be unstable and it generated chemiluminescence in the absence of the enzyme. This fact impaired its use as planned.

Thesis (Ph. D.)--Case Western Reserve University, 2006. / [School of Medicine] Department of Physiology and Biophysics. Includes bibliographical references. Available online via OhioLINK's ETD Center.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-03-13Bitstream added on 2014-06-13T19:44:15Z : No. of bitstreams: 1 goncalves_d_dr_arafo.pdf: 899071 bytes, checksum: a457bad7af899a14f12440dc4fc912ff (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Objetivos: Avaliar o efeito do tratamento periodontal não-cirúrgico sobre parâmetros clínicos, microbiota subgengival e a atividade enzimática na saliva e no fluido sulcular gengival em pacientes portadores de diabetes e em indivíduos sistemicamente sadios, ambos com periodontite crônica. Material e método: a amostra populacional foi composta por 40 indivíduos divididos em dois grupos: 20 portadores de Diabetes mellitus tipo 2 com inadequado controle metabólico (grupo DM2) e 20 indivíduos sistemicamente sadios (grupo controle), ambos portadores de periodontite crônica. Clinicamente os indivíduos foram avaliados quanto: ao índice de placa visível (IPV), ao índice de sangramento marginal (ISM), à profundidade de sondagem (PS), ao nível clínico de inserção (NI), à presença de sangramento à sondagem (SS) e à presença de supuração (SUP). Foram realizadas coletas de saliva e de fluido sulcular gengival para determinação da atividade peroxidásica total salivar (PTS) e da mieloperoxidase (MPO), por meio de espectrofotometria. Amostras de placa bacteriana subgengival de 4 sítios rasos e 4 profundos com doença periodontal foram avaliadas pela técnica de Checkerboard DNA-DNA hybridization. Toda a amostra recebeu terapia periodontal não-cirúrgica com posterior fase de acompanhamento para realização de controle de placa profissional a cada quinze dias por um período de três meses. Todas as avaliações foram realizadas no baseline e aos três meses após o término da terapia periodontal. Resultados: No baseline, o grupo DM2 apresentou maior percentual de sítios com IPV e SS (p< 0.01) sem diferença estatisticamente significante entre grupos quanto aos demais parâmetros clínicos. O tratamento periodontal não-cirúrgico resultou em melhora significativa dos parâmetros clínicos avaliados nos 2 grupos. Aos três meses pós-tratamento foram observados maiores... / Objectives: To evaluate the effect of periodontal treatment on clinical parameters as well as on subgingival microbiota and enzimatic activity in the saliva and the gingival crevicular fluid of diabetes patients and systemically healthy individuals with chronic periodontitis. Material and Methods: The sample was constituted by 40 individuals divided in two groups: 20 type 2 diabetes mellitus patients with inadequate metabolic control (DM2 group) and 20 systemically healthy individuals (control group), both groups with chronic periodontitis. Clinical assessments included visible plaque index (VPI), bleeding on probing (BOP), gingival bleeding index (GBI), suppuration (SUP), probing depth (PD) and clinical attachment level (CAL). Saliva and gingival crevicular fluid samples were collected for determination of the total salivary peroxidase (TPS) activity and myeloperoxidase (MPO) activity respectively, by spectrophotometric assays. Subgingival plaque samples from 4 shallow and 4 deep sites with periodontal disease were evaluated by the Checkerboard DNA-DNA hybridization technique. All the patients received non-surgical periodontal therapy followed of the period for accomplishment of professional plaque control performed twice a month during three months. All the evaluations were assessed at baseline and 3 months after periodontal therapy. Results: At baseline, the DM2 group presented a significantly higher percentage of sites with VPI and BOP (p<0.01). No significant differences between groups were observed for the other clinical parameters. Nonsurgical periodontal treatment resulted in a significant improvement of clinical parameters. At 3 months post-treatment, the DM2 group presented significantly higher percentage of sites with VPI, GBI, BOP and mean PD (p<0.05). Regarding the microbiological analysis, at baseline, only C. rectus and S. anginosus were founded significantly higher... (Abstract complete click electronic access below)