L’athérosclérose est une maladie inflammatoire complexe qui résulte dans la formation de plaques d’athérome à risque de rupture. Le concept récent que ce risque soit lié au contenu de la plaque et non à sa taille se traduit par un nouvel impératif dans le domaine de l’imagerie moléculaire et de la thérapie ciblée. Aujourd’hui l’avènement des approches protéomiques et de criblage à haut débit de banques combinatoires permet l’identification à la fois de nouvelles cibles et d’agents bioactifs. Notre objectif consiste à identifier in situ chez des modèles animaux malades, des fragments d’anticorps capables de cibler spécifiquement les plaques vulnérables d’athérome par phage display in vivo. Ces anticorps seront à la base de nouveaux formats moléculaires pour des études de diagnostic et thérapeutique. / Atheroclerosis is a chronic and progressive inflammatory artery disease. These arteries have morphologically raised lesions: the atherosclerotic plaque. The early atherogenesis is characterized by formation of a lipid-rich core constituted by lipid-laden macrophages. These changes can thin the fibrous cap and render the plaque susceptible to rupture and thrombosis, and eventually if the thrombus occludes the vessels to an acute myocardial infarction. So, there still remains a great need to develop novel diagnosis and therapeutic tools to assess these molecular changes. We have applied a novel in vivo selection scheme to select Antibody-ligands that selectively home into atherosclerotic lesions induced in animal models. Such tissue-specific homing ligands may lead to the characterization of new up-regulated lesion-associated markers and open the way to diagnostic and therapeutic strategies based on non-invasive molecular imaging and selective drug delivery for early lesion detection.

In vitro protein selection has had major impacts in the field of protein engineering. Traditional screens assay individual proteins for specific function. Selection, however, analyzes a pool of mutants and yields the best variants. Phage display, a successful selection technique, also provides a reliable link between variant phenotype and genotype. It can also be coupled with high throughput sequencing to map protein mutations; potentially highlighting vital mutations in variants. We propose to apply this technique to cancer therapy. RAF, a serine/threonine kinase, is critical for cell regulation in mammals. RAF can be activated by oncogenic RAS, found in over 30% of cancers, to drive cancer proliferation. Rigosertib, a benzyl styryl sulfone in phase III clinical trials for myelodysplastic syndrome (MDS), is an inhibitor of the RAS binding domain (RBD) in RAF. Phage display can be used to select RAF mutants for RAS binding affinity, in the presence of Rigosertib. High-throughput sequencing of these variants can provide a means of anticipating, and mapping resistance to this anti-cancer drug.

Protein p130Cas is the major tyrosine phosphorylated protein in cells transformed by v-crk and v-src oncogenes. P130Cas plays an important role in invasiveness and metastasis of Src-transformed cells. In breast cancer patients, high p130Cas levels are associated with higher recurrence of disease, poor response to tamoxifen treatment and lower overall survival. In non-transformed cells, after the stimulation of integrins, protein p130Cas is phosphorylated in substrate domain affecting cell migration and cytoskeletal dynamics. For this signalling is the SH3 domain of p130Cas indispensable. In this thesis, was for the first time using the Phage display method analysed and subsequently characterized the binding motif of SH3 domain of p130Cas. Based on this high-affinity motif [AP]-P-[APMS]-K-P-[LPST]-[LR]- [LPST], we predicted new interaction partners of protein p130Cas and subsequently confirmed the interaction with the Ser/Thr kinase PKN3. This kinase colocalizes with p130Cas in the nucleus and perinuclear region and could phosphorylate p130Cas. In this thesis, we also analysed the effect of phosphomimicking mutation of tyrosine from sequence ALYD, which is conserved in the sequence of SH3 domains, on ability of these domains to bind ligands. This mutation reduced binding by about 3 orders of...

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2015-02-27T12:50:00Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Greice Japolla - 2014.pdf: 735093 bytes, checksum: 4795f79b674744556e9029a8e9b99c2f (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-03-04T11:45:39Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Greice Japolla - 2014.pdf: 735093 bytes, checksum: 4795f79b674744556e9029a8e9b99c2f (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-04T11:45:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Greice Japolla - 2014.pdf: 735093 bytes, checksum: 4795f79b674744556e9029a8e9b99c2f (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-02-11 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Bovine herpesvirus type 1 ( BHV - 1 ) is recognized as an important pathogen of economic losses in cattle , these animals causing diseases known as infectious bovine rhinotracheitis ( IBR ) , infectious pustular vulvovaginitis , infectious balanoposthitis and neurological disorders . For effective control of these diseases, the correct diagnosis is necessary, but none of the available tests enables a quick result made the field. Considering this, the aim of this study was to construct a combinatorial antibody library, for it to be used in the future development of new diagnostic approaches . Two breed White Leghorn chickens were immunized with 105.5 TCID50/ml of BoHV - 1, birds were necropsied , their spleens removed for total RNA extraction , cDNA synthesis , amplification of gene fragments encoding the light chain ( VL ) and heavy ( VH ) and production of scFv ( v) fragments. These fragments were cloned into vectors fagomidiais expressed as fusion proteins on filamentous phage and amplified by infection of E. coli. Selection of viral particles ( fused scFv) binding to the BHV -1 ( biopanning ) by six cycles were performed. The affinity of the scFv antibody library BHV -1 observed in ELISA shows that the produced fragments are reactive to HIV, the use of such antibodies in the development of new diagnostic platforms is possible . The sequencing results showed a reduction of variability in comparison to the dot blot previously performed, and a desirable feature of this process , however, it was possible to sequence the clones efficiently, it has been found , therefore, a need to further analyze the shape of results / O herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) é reconhecido como um importante patógeno de perdas econômicas em bovinos, causando nestes animais enfermidades conhecidas como Rinotraqueite Infecciosa Bovina (IBR), vulvovaginite pustular infecciosa, balanopostite infecciosa e desordens neurológicas. Para um efetivo controle destas enfermidades, o diagnóstico correto se faz necessário, porém nenhuma dos testes disponíveis possibilita um resultado rápido feito a campo. Considerando isto, o objetivo deste estudo foi construir uma biblioteca combinatorial de anticorpos, para que esta seja futuramente utilizada no desenvolvimento de novas abordagens diagnósticas. Duas galinhas da raça White Leghorn foram imunizadas com 105,5 DICC50/mL de BoHV-1, as aves foram necropsiadas, seus baços retirados para extração de RNA total, síntese de cDNA, amplificação dos fragmentos gênicos codificantes das cadeias leve (VL) e pesada (VH) e produção de fragmentos scF(v). Estes fragmentos foram clonados em vetores fagomidiais, expressos como proteínas de fusão em bacteriófagos filamentosos e amplificados pela infecção de bactérias E.coli. Foi realizada a seleção de partículas virais (scFv fusionados) ligantes ao BoHV-1 (biopanning) através de seis ciclos. A afinidade da biblioteca de anticorpos scFv ao BoHV-1 observada no teste de ELISA mostra que os fragmentos produzidos são reativos ao vírus, sendo possível a utilização destes anticorpos no desenvolvimento de novas plataformas de diagnóstico. Os resultados de sequenciamento mostraram uma diminuição da variabilidade em comparação ao dot blot realizado anteriormente, sendo uma característica desejável neste processo, porém não foi possível sequenciar os clones de modo eficiente, verificando-se, portanto, a necessidade de analisar de forma mais aprofundada os resultados obtidos .

L'utilisation de virus de bactéries ou bactériophages pourrait être un complément efficace à l’antibiothérapie. Mon travail a porté sur la caractérisation de bactériophages dirigés contre l’espèce Pseudomonas aeruginosa, pathogène opportuniste responsable d'infections des voies respiratoires des patients atteints de mucoviscidose.J'ai tout d'abord déterminé la sensibilité des souches mucoviscidosiques au Pyophage (un cocktail de phages thérapeutiques Géorgien) et identifié six phages lytiques de quatre genres différents. Environ 15% des souches sont résistantes au Pyophage. Ensuite, en utilisant les souches cliniques multi-résistantes aux phages comme bactérie d’enrichissement, 32 phages ont été obtenus à partir des eaux usées de France et Côte d’Ivoire. Tous les phages analysés sont caudés et distribués au sein de dix genres parmi lesquels six exclusivement lytiques. J'ai identifié des souches bactériennes qui demeurent insensibles à tous les phages. J'ai montré que le système CRISPRs-Cas n'est pas associé à la résistance des souches aux phages lytiques. / The use of viruses of bacteria commonly called bacteriophages could constitute an efficient complement to antibiotics. During my PhD, I have characterized phages infecting the opportunistic pathogen Pseudomonas. aeruginosa, responsible for lung infections in cystic fribrosis patients. Firstly, I investigated the efficiency of Pyophage (a cocktail of phages therapeutic Georgian) on clinical P. aeruginosa strains and recovered six lytic phages from four different genus. The Pyophage appears to be unactive on approximately 15% of clinical strains. Secondly, and using multi-phages resistant strains as enrichment bacteria, 32 phages were isolated from waste water of France and Côte d’Ivoire. All phages are tailed and distributed within ten different genus including six exclusively lytic. I identified bacterial strains which remain insensitive to all phages. I also demonstrated that the CRISPRs-cas system plays no role in the resistance of strains to lytic phages.

Les CRISPRs constituent une famille particulière d'éléments génétiques, retrouvés dans de nombreux génomes de procaryotes (la moitié des bactéries et presque toutes les archées). Des études récentes suggèrent que cette structure représente un système de défense contre les ADNs étrangers fonctionnant grâce à un mécanisme d'interférence ARN. Les CRISPRs consistent en la succession de régions très bien conservées (DR) dont la taille varie de 23 à 47 pb, séparées par des séquences uniques d'une taille similaire et ayant en général une origine virale. Le polymorphisme observé entre différentes souches de la même espèce fait du CRISPR un marqueur génétique intéressant pour des analyses comparatives de souches bactériennes très proches et pour des études phylogénétiques. Cette thèse décrira trois outils bioinformatiques accessibles à l'adresse (http://crispr.u-psud.fr) et leurs applications dans l'investigation et le typage des CRISPRs. Le premier outil est CRISPRFinder qui est un programme d'identification des CRISPRs à partir des séquences génomiques. Le deuxième est la base de données CRISPRdb et ses utilitaires qui fournissent un accès aux CRISPRs de tous les génomes procaryotes séquencés. le troisième outil est CRISPRcompar qui sert à identifier et comparer les CRISPRs dans des génomes proches pour faciliter la procédure de typage.

Chez Escherichia coli la terminaison de la transcription peut intervenir selon deux mécanismes distincts : tout d'abord la terminaison intrinsèque qui correspond à une séquence ADN, codant pour une structure en tige boucle riche en GC suivie d'une répétition d'uridine sur l'ARN, induisant le relargage de l'ARN polymérase. Le second mécanisme est gouverné par un facteur de terminaison nommé Rho qui gouverne environ 50 % des événements de terminaison chez E. coli. Au cours de ma thèse, je me suis intéressé à ce deuxième mécanisme, et plus particulièrement à sa régulation in vivo (antiterminaison). Rho, sous la forme d'un anneau héxamèrique, se fixe à l'ARN naissant au niveau d'un site d'entrée (également appelé RUT), puis utilise son activité ATPase pour longer l'ARN et dissocier le complexe ternaire d'élongation stoppé au niveau d'un site de pause. Les terminateurs Rho-dépendants sont assez mal définis et peu d'entre eux on été analysés en détail. Le terminateur du tR1 du phage lambda (λ) est le terminateur Rho-dépendant le plus étudié à la fois in vitro et in vivo. La terminaison Rho-dépendante au niveau de ce terminateur est gouvernée principalement par les séquences localisées en 5', codant deux régions du transcript nommées RUTA et RUTB. Ces deux régions sont séparées par le motif ARN BOXB qui n'est pas indispensable à l'action de Rho mais sert, dans le mécanisme d'antiterminaison, de site de fixation pour la protéine N du paghe λ. Grâce à un système minimal d'étude in vivo, nous avons montré que le motif BOXB possède une fonction double dans les mécanismes de terminaiso/antiterminaison au niveau de λtR1 régulant l'expression temporale du génome du phage λ. Sous la forme d'une tige boucle hautement structurée, BOXB agit comme un lien permettant de placer RUTA et RUTB l'un à côté de l'autre pour une interaction optimale avec Rho et une terminaison efficace. A l'inverse, la fixation de la protéine N sur BOXB induit l'antiterminaison au niveau de λtR1 en empêchant l'accès de Rho à l'ARN. Ce double rôle a été démontré in vivo en substituant au couple N/BOXB la « coat protein » du phage MS2 et son motif cible en tige boucle. En complément de ce travail, j'ai utilisé cette faculté d'un complexe ribonucléoprotéïque de bloquer la terminaison Rho-dépendante, pour développer une nouvelle approche d'étude in vivo, des complexe ARN-protéine.

L'épigénétique est un composant essentiel du fonctionnement des génomes eucaryotes. Les divers phénomènes épigénétiques modifient l'état chromatinien et participent à la plasticité du génome, mais aussi au maintien de son identité fonctionnelle à travers les générations cellulaires. Parmi ces processus, la méthylation de l'ADN joue un rôle fondamental dans la régulation de l'expression des gènes.Chez les mammifères, la méthylation de l'ADN est associée à la répression transcriptionnelle, et elle remplit au moins trois fonctions essentielles. Premièrement, elle permet de réprimer les séquences répétées afin de préserver l'intégrité du génome. Deuxièmement, la méthylation contrôle l'expression des gènes soumis à l'empreinte parentale, qui sont des régulateurs cruciaux du développement et de la vie adulte. Enfin, la méthylation permet de réprimer certains gènes tissu-spécifiques dans les organes où ils doivent être silencieux. En plus de ces rôles physiologiques, la méthylation est liée au cancer. En effet, des patrons de méthylation anormaux sont fréquemment observés dans les cellules tumorales, et ces anomalies participent à la transformation cellulaire par plusieurs mécanismes.La méthylation exerce ces effets par l'intermédiaire de protéines dédiées, qui reconnaissent spécifiquement l'ADN méthylé et contrôlent la transcription en modulant la chromatine. Trois familles de protéines liant l'ADN méthylé sont connues chez les mammifères, et elles totalisent entre elles neuf membres. De nombreux arguments suggèrent que cette liste est encore incomplète, et que des protéines humaines liant l'ADN méthylé restent à découvrir. Dans cette optique, nous avons opté pour deux types d'approches distinctes, une approche basée sur la littérature et une approche génétique. L'étude des protéines candidates ne nous a pas permis d'identifier de nouvelles protéines liant l'ADN méthylé et l'approche génétique par phage display a révélé deux protéines intéressantes, CHD3 et HMGB1 qui doivent désormais être validées par des approches in vivo et in vitro.Par ailleurs, nous avons entrepris l'étude de la régulation des éléments répétés par la protéine Zbtb4 chez la souris. Les expériences préliminaires indiquent une possible régulation des satellites mineurs par Zbtb4. Le rôle de cette régulation sera, par la suite, approfondi.

L'endoribonucléase de restriction RegB est une enzyme produite par le bactériophage T4. Elle est impliquée dans la transition phase précoce-phase moyenne durant le cycle lytique du virus. RegB coupe avec une spécificité quasi absolue la séquence GGAG impliquée notamment dans l'initiation de la traduction chez la bactérie Escherichia coli. Nous avons caractérisé dans cette thèse de façon précise la toxicité de RegB dans la bactérie et nous avons proposé des outils pour contourner cette toxicité tels la manipulation du nombre de copies du vecteur d'expression ou l'atténuation de l'efficacité du site d'initiation de la traduction. Nous avons, par ailleurs, proposé une application de RegB pour la construction d'un vecteur de clonage à sélection positive et à expression duale dans les systèmes procaryotes et eucaryotes. L'étude par RMN du 31P de la cinétique de clivage d'un ARN par RegB a permis de définir RegB comme une "transphosphorylase libérant un phosphodiester 2', 3'-cyclique". Des études de mutagenèses dirigées et aléatoires combinées à l'évolution du gène regB dans un virus apparenté au phage T4 (le virus RB49) ont mis en évidence le rôle des résidus Glutamate 19, Histidine 48, Arginine 52 et Histidine 68 dans l'activité de RegB. Le mutant RegB H48A a été choisi pour construire un modèle structural du site actif de RegB. L'attribution séquentielle de cette protéine par RMN hétéronucléaire 1H/15N/13C a été entreprise avec succès.

<p>It is well established that mast cells (MC) are key players in airway pathologies such as allergic asthma, but they are also known to contribute to host defense and tissue remodeling. MC serine proteases are the major protein components of mast cell granules and accordingly, are most likely involved in many aspects of MC function. Two major groups of MC serine proteases have been described; chymases, which cleave a target preferentially after aromatic amino acids, and tryptases, which cleave preferentially after positively charged residues. Biochemical characterization of these proteases is a first step towards understanding their contribution to MC function. One of the issues addressed in this thesis is the target specificity of two rodent MC chymases, rat mast cell protease (rMCP)-4 and rMCP-5. The substrate specificity was analyzed using a substrate phage display technique, in which a large library of peptide substrates is screened simultaneously in a single reaction. The substrate analysis revealed that rMCP-4 displays very stringent substrate specificity, with striking preference for two subsequent aromatic amino acids N-terminal of the cleavage site. This chymase therefore holds a substrate recognition profile clearly distinct from other chymases. Database searches using the generated peptide sequence identified several interesting potential targets for rMCP-4, such as the FcγRIII and the TGFβ receptor. The phage display technique was also used to analyze the substrate specificity of rMCP-5. rMCP-5 is the rat chymase most closely related in sequence to human chymase. Interestingly, rMCP-5, unlike human chymase, was shown to hydrolyze substrates after small aliphatic amino acids, but not after aromatic residues. rMCP-5 and human chymase might therefore have different biological functions. Thus, studies of cleavage specificity can be a successful approach both to elucidate subtle differences in specificity of closely related proteases, as well as to identify new biological targets for a protease.</p><p>The MC tryptases contribute to the pro-inflammatory activities of the MC. To assess the requirements for activation and stability of a mouse tryptase, mMCP-6, recombinant mMCP-6 protein was produced in mammalian cells. A low pH (<6.5), as well as a negatively charged proteoglycan, e.g. heparin, were shown to be necessary both to obtain and maintain activity. With this in mind, heparin antagonists were studied for their potential to inhibit mMCP-6 and human tryptase. Indeed, the heparin antagonists were shown to be highly efficient tryptase inhibitors. Thus, heparin antagonists might be promising candidates to attenuate inflammatory disorders, such as allergic asthma. </p>