Le développement des organismes multicellulaires, la morphologie de leurs organes, la formation de connections nerveuses ou même la réponse immunitaire conduisent à la formation de cellules dont la mort a été programmée, ces cellules sont en apoptose. Les corps apoptotiques générés sont éliminés par phagocytose, que l'on peut ainsi considérer comme l'étape ultime du programme apoptotique. Cette élimination, assurée soit par des phagocytes professionnels ou des cellules environnantes est très efficace et peu de cellules en apoptose sont observées dans les différents tissus et organes. Deux familles de protéines, ELMO et DOCK, sont connues pour être au centre d'une voie de signalisation impliquée dans l'activation de la petite GTPase Rac et le remodelage du cytosquelette d'actine permettant l'internalisation de corps apoptotiques, mais la manière dont ELMO est activée par la reconnaissance des corps apoptotique reste largement méconnue. Récemment, ELMO a été identifiée comme cible de la kinase hématopoïétique Hck. La phosphorylation d'ELMO constitue un signal d'activation de la voie de phagocytose. Nous avons pu montrer que les domaines N et C-terminaux d'ELMO sont impliqués dans l'interaction avec le domaine SH3 de Hck. Contrairement au SH3 de DOCK, l'interaction du domaine C-terminal avec le SH3 de Hck est strictement dépendante de la présence du polyproline. Les données obtenues sur les cellules transfectées suggère l'interaction in cellulo du motif polyproline avec le domaine SH3 de Hck. La différence dans le comportement du domaine C-terminal d'ELMO avec les deux SH3 nous a mené à identifier un complexe ternaire entre les trois protéines. Le motif polyproline d'ELMO est adjacent à l'une des 5 tyrosines phosphorylées par Hck, la tyrosine 720, nos résultats montrent que la phosphorylation de cette tyrosine défavorise l'interaction entre le domaine C-terminal et le SH3 de Hck. Cette phosphorylation pourrait être à l'origine d'un effet régulateur de Hck sur le complexe ELMO/DOCK. / Multicellular organisms development, tissue organization and morphogenesis, nerve connection network or even immune response lead to programmed cell death or apoptosis. Phagocytosis is the mean for the engulfment of the apoptotic corpses and can thus be considered as the final step of the apoptotic pathway. Both non-professional and professional phagocytic cells are implicated to achieve an efficient clearance of the apoptotic cells and debris, and very little dead cells are actually present in tissues under normal circumstances, preventing secondary necrosis and further inflammation. Two family of proteins, ELMO and DOCK have been identified as major characters in the signaling pathway leading to the activation of the small GTPase Rac, and actin remodeling, that eventually leads to engulfment. Nevertheless, very little is yet known about the upstream events leading to ELMO activation. Recently, ELMO has been characterized as a target for the hematopoietic cell kinase Hck, and consequent phosphorylation participates in ELMO activation. In the course of the present work, we demonstrated that both N- and C-terminal domains of ELMO are binding the SH3 domain of Hck. In contrast with the SH3 domain of DOCK, the SH3 domain of Hck binding to the C-terminal of ELMO is strictly dependent upon the polyproline motif. Our data obtained using transfected cells, further suggest the polyproline dependent interaction also occurs in cells. Taking into account the differential behavior of both SH3 domains from DOCK and Hck we next demonstrated a ternary complex formation between ELMO and both partners in vitro. Finally, we investigated the possible role for the Hck phosphorylation of Y720 located at the edge of the polyproline motif of ELMO and demonstrated that this phosphorylation clearly increases the Kd of ELMO/Hck interaction suggesting this phosphorylation could be part of a regulation loop in Hck dependent ELMO activation.

Les neutrophiles participent à la défense de l'hôte en phagocytant les agents pathogènes et en les détruisant via notamment la production de formes réactives de l'oxygène (FRO). Les FRO sont produites par un complexe multi- protéique :la NADPH oxydase (NOX2). Celle-ci peut s’assembler à la membrane du phagosome lors de la phagocytose mais aussi à la membrane plasmique lors de la stimulation des neutrophiles par des agents bactériens ou des médiateurs de l’inflammation. La NADPH oxydase est une arme à double tranchant; une activation excessive ou inappropriée de la NADPH oxydase génère un stress oxydant, facteur aggravant des nombreuses pathologies. Cette enzyme doit donc être finement régulée. La NADPH oxydase est activée lorsque les sous-unités cytosoliques de NOX2 (p67phox, p47phox, p40phox) et la petite GTPase Rac s’assemblent avec les sous-unités membranaires (p22phox et gp91phox) à la membrane phagosomale ou plasmique. P67phox régule le flux d'électrons qui transite via gp91phox du NADPH à O2.-. Des travaux récents indiquent que les phospholipides anioniques contribueraient à la régulation de la NADPH oxydase. De plus, Les protéines organisatrices p40phox et p47phox possèdent des domaines de liaison à ces phosphoinositides : p40phox peut se lier au phosphatidylinositol 3-phosphate (PI(3)P) et p47phox au phosphatidylinositol 3,4-bisphosphate (PI(3,4)P2). Nous avons donc voulu comprendre le rôle des ces phospholipides dans la régulation de la NADPH oxydase. Dans un premier temps nous nous sommes intéressés au rôle du PI(3)P, présent au phagosome après la fermeture de celui-ci, dans l’activation de la NADPH oxydase. Nos données indiquent que p40phox fonctionne comme un adaptateur, PI(3)P dépendant, permettant de maintenir p67phox dans le complexe de la NADPH oxydase. Le PI(3)P agit comme un « timer » pour l'activation de la NADPH oxydase au phagosome. Nous avons ensuite voulu examiner le rôle du PI(3,4)P2 dans la régulation de la NADPH oxydase à la membrane plasmique. Ce lipide est formé à la membrane plasmique par phosphorylation du PI(4)P par la PI3K de classe I lors de l’activation des neutrophiles. Nous avons montré que, l'activité PI3K de classe I est nécessaire pour maintenir l’activation, intégrine-dépendante, de la NADPH oxydase à la membrane plasmique. / The NADPH oxidase of the professional phagocyte is essential for the immune system. The phagocyte NADPH oxidase, NOX2, catalyze the reduction of molecular oxygen to superoxide. Superoxide is transformed rapidly into other reactive oxygen species (ROS) which play a critical role in the killing of pathogens in host defense. Indeed neutrophils, the first cells that arrive at the site of infections, engulf pathogens in a process called phagocytosis. The production of reactive oxygen species is then triggered by the NADPH oxidase in the phagosome. The importance of ROS production is demonstrated by the recurrent bacterial and fungal infections that face patients who lack functional NADPH oxidase as in the rare genetic disorder known as the chronic granulomatous disease (CGD). Upon stimulation by bacterial peptide or in some pathological conditions, NADPH oxidase can also be activated at the phagocyte plasma membrane producing ROS in the extracellular medium. So, an excessive or inappropriate NADPH oxidase activation generates oxidative stress involve in chronic inflammation, cardiovascular disease and neurodegenerative disease. The NADPH oxidase activity should be tightly regulated. The activity of the enzyme is the result of the assembly of cytosolic subunits (p47phox, p67phox, p40phox and Rac2) with membranous subunits (gp91phox and p22phox). P67phox regulates the electron flow through gp91phox from NADPH to oxygen leading to the formation of superoxide. Recent data indicate that the anionic phospholipids are important for the NADPH oxidase regulation. Moreover, p40phox and p47phox bear a PX domain that binds respectively phosphatidylinositol3-phosphate (PI3P) and phosphatidylinositol (3,4)-bisphosphate(PI(3,4)P2). Our objective was to decipher the importance of these phosphoinositides on the NADPH oxidase activity. We first examined the role of PI3P, which is present on the cytosolic leaflet of phagosome after its sealing, in NADPH oxidase activation. Our data indicate that p40phox works as a late adaptor controlled by PI3P to maintain p67phox in the NADPH oxidase complex. Thus, PI3P acts as a timer for NADPH oxidase assembly. We then examined the role of PI(3,4)P2 in the activation of the NADPH oxidase assembled at the plasma membrane. PI(3,4)P2 and PI(3,4,5)P3 are formed at the plasma membrane, upon neutrophil activation, by phosphorylation by Class I PI3K of respectively PI4P and PI(4,5)P2. We found that class I PI3K activity is required to maintain the integrin-dependent activation of NADPH oxidase at the plasma membrane.

C. glabrata est une levure commensale de l’Homme à l’origine d’infections opportunistes chez les patients immunodéprimés. Les neutrophiles sont les premières cellules recrutées sur le site de l’infection. La production de formes réactives de l’oxygène par ces cellules, initiée dans le phagosome par la NADPH oxydase 2 est un évènement majeur de la maturation du phagosome et fait l’objet de l’étude réalisée. L’objectif de ce travail était de développer des outils expérimentaux permettant l’évaluation du stress oxydant subi par C. glabrata lors de son internalisation par les phagocytes. La levure non pathogène S. cerevisiae, phylogénétiquement plus proche de C. glabrata, a été choisie comme organisme contrôle permettant une étude comparative entre les deux levures. C. glabrata est efficacement internalisée en absence d’opsonisation, par la lignée PLB-985-neutrophile contrairement à S. cerevisiae. L’utilisation de sondes organiques pour la mesure des FRO dans le phagosome est limitée puisque que le marquage des levures par ces sondes n’est pas spécifiquement localisé. Le développement de biosenseurs de FRO à partir de protéines fluorescentes, dont la localisation est maitrisée grâce à un système de marquage, est présenté. Les études réalisées suggèrent cependant que les protéines fluorescentes subissent des modifications dans le phagosome indépendantes de la production de FRO. Des tests de viabilité effectués sur les levures après phagocytose montrent que l’élimination des levures dépend fortement de facteurs indépendants de la production de FRO. Plusieurs méthodes indiquent néanmoins que les phagosomes avec C. glabrata contiennent moins de FRO que les phagosomes avec S. cerevisiae. C. glabrata semble éliminer les FRO plus efficacement que S. cerevisiae. / C. glabrata is a human commensal yeast responsible for opportunistic infections in immunocompromised patients. Neutrophils are the first cells to be recruited to the infection site. Production of reactive oxygen species (ROS) in the phagosome by the phagocyte NADPH oxidase 2 is a major event of the phagosome maturation and is the subject of the study. The aim of this work was to develop experimental tools allowing the evaluation of the oxidative stress endured by C. glabrata during its internalization by phagocytes. The non-pathogenic yeast S. cerevisiae, phylogenetically close to C. glabrata, was chosen as a control organism allowing a comparative study between the two yeasts. Unlike S. cerevisiae, non-opsonized C. glabrata is efficiently internalized by the PLB-985 cell line. The utilization of organic dyes for the detection of ROS in the phagosome lacks precision since the staining of the yeasts by those dyes is not specifically localized. The development of ROS biosensors based on fluorescent proteins, whose localization can be controlled due to a new staining procedure, is presented here. However the results suggest that fluorescent proteins undergo modifications in the phagosome independently from the ROS production. Viability tests performed on the yeasts after phagocytosis showed that yeast removal depends mainly on factors independent from ROS production. Several methods indicate nevertheless that the phagosomes of C. glabrata contain less ROS than the phagosome of S. cerevisiae. C. glabrata appears to suppress ROS more efficiently than S. cerevisiae.

Le neutrophile humain est impliqué dans la première ligne de défense du corps humain. Pour jouer ce rôle le neutrophile doit se rendre au site inflammatoire et phagocyter les agents microbiens. L'objectif de cette étude est d'étudier les mécanismes impliqués lors de la chimiotaxie des neutrophiles et la phagocytose. Les résultats obtenus permettent d'identifier plusieurs voies de signalisation impliquées dans ces deux réponses majeures du neutrophile et décrivent des différences majeures entre les signaux chimiotactiques qui permettent une spécialisation de la réponse.

A ce jour, l’Organisation Mondiale de la Santé estime qu’un tiers de la population mondiale est infectée par Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l’agent étiologique de la tuberculose. De par un taux de mortalité et de morbidité élevé, cette maladie infectieuse constitue un véritable fléau sanitaire au niveau mondial. <p>Mtb est un pathogène intracellulaire qui infecte son hôte par voie aérienne. In vivo, il doit faire face à une série d’environnements (phagosome, granulome) stressants de par leurs activités antimicrobiennes et par leur composition en nutriments relativement pauvre. Pour pouvoir survivre et se multiplier dans ces conditions, Mtb possède un panel de transporteurs spécifiques ainsi que toute une série de mécanismes pour contrer, voire détourner les défenses immunitaires de l’hôte. Malgré cette oppostion, les mycobactéries finissent séquestrées à l’intérieur de granulomes, structure caractéristique de la tuberculose, dans un état de dormance. La mise au point de nouveaux traitements prophylactiques et thérapeutiques nécessite la compréhension des mécanismes mis en œuvre par Mtb pour survivre et se multiplier au sein de son hôte.<p><p>Le présent travail a consisté en l’étude de mécanismes favorisant la dispersion et la survie intracellulaire de Mtb chez son hôte via: <p>1)\ / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le système de l’immunité innée cérébrale (SIIC) est principalement composé des cellules microgliales. En réponse à des stimuli immuns, inflammatoires ou un trauma neurologique, la microglie s’active et produit des facteurs pro et anti-inflammatoires qui d’une part coordonnent la réponse de l’immunité innée cérébrale et d’autre part modulent l’activité neuronale et, in fine, le comportement. Plus récemment, les cellules microgliales se sont révélées jouer un rôle clé dans le développement cérébral. Ainsi, par leurs activités de phagocytose, elles participent à la maturation des réseaux neuronaux. Si l’activation du SIIC permet de défendre le tissu cérébral des agressions, l’activation prolongée des cellules microgliales a aussi des effets délétères. Ainsi, dans le cerveau adulte, la production soutenue de cytokines inflammatoires contribue au développement de pathologies neurodégénératives. Au cours du développement les stimuli inflammatoires, en perturbant l’activité des cellules microgliales conduisent à une dysfonction de circuits neuronaux qui pourrait être impliquée dans des pathologies neuropsychiatriques à composante neurodéveloppementale. La compréhension de la régulation des cellules microgliales et de leur réponse est donc capitale. L’activité microgliale repose sur ses propriétés morphologique, dynamique et sa communication avec les neurones qui impliquent des profils de synthèse de facteurs (cytokines, chemokines, facteurs de croissance, etc..) et de récepteurs particuliers, la polarisation vers un phénotype pro ou anti-inflammatoire et la phagocytose. Peu d’études ont caractérisé l’ensemble des propriétés morphofonctionnelles des cellules microgliales in vivo. Par la combinaison d’approches de FACS, immunohistochimie, microscopie confocale et reconstruction en 3D, microscopie bi-photonique et dosage des facteurs de communication, il est aujourd’hui possible de mieux caractériser ces cellules afin de comprendre leur régulation par l’environnement et l’impact (bénéfique ou délétère) sur les fonctions neuronales. L’objectif général de cette thèse a été d’étudier les propriétés morphofonctionnelles des cellules microgliales in vivo dans deux situations physiopathologiques, une inflammation induite par l’administration périphérique de lipopolysaccharide (LPS) et une déficience alimentaire en acides gras polyinsaturés (AGPI) de type n-3, connus pour leurs propriétés immunomodulatrices. La première étude nous a permis de développer des outils nécessaires à l’étude de la plasticité morphofonctionnelle de la microglie et d’apporter de nouveaux éléments de compréhension de l’impact d’une inflammation périphérique sur l’activité de ces cellules in vivo. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons montré pour la première fois que le statut alimentaire maternel en AGPI n-3 influence les propriétés morphofonctionnelles des cellules microgliales au cours du développement post-natal ainsi que l’activité des réseaux neuronaux. De façon générale, nos résultats apportent des éléments de compréhension des relations entre plasticité morphologique et fonctionnelle des cellules microgliales in vivo. / The brain innate immune system is mainly composed of microglial cells. Microglia are activated in response to an immune or inflammatory stimuli or a trauma, and then produce pro- and anti-inflammatory factors. These factors drive the innate immune response and can modulate neuronal activity and in fine, learning and memory. Recently, microglia have been shown to play a key role during brain development. Via their phagocytic activity, microglial cells can participate to neuronal networks maturation. Although brain innate immune system defends brain tissue from aggression, chronic activation of microglia can also be deleterious. In the adult brain, chronic production of inflammatory cytokines can contribute to the pathogenesis of neurodegenerative diseases. During development, inflammatory stimuli modifying microglia activity and homeostasis could lead to neuropsychiatric diseases with a neurodevelopmental origin. Understanding how microglia are regulated and how they respond to various stimuli is therefore crucial.Microglia activity is characterized by morphological and dynamic properties of microglia,by its communication with neurons by its polarization into a specific phenotype, and by their phagocytic profile. Few studies have characterized all the morphofunctional properties of microglial cells in vivo. Using a combination of approaches including FACS, immunohistochemistry, confocal microscopy, 3D reconstruction, two-photon microscopy and communication factors assays, it is now possible to better characterize these cells in order to understand their regulation by the environment and the resulting impact (beneficial or deleterious) on neuronal functions. The main goal of this thesis was to study the morphofunctional properties of microglial cells in vivo in two pathophysiological states: a peripheral inflammation induced by a peripheral injection of lipopolysaccharide (LPS) and in an n-3 PUFAs nutritional state. In the first study, we developed tools to investigate microglial morphofunctional plasticity and gained a better understanding of the impact of peripheral inflammation on the activity of these cells in vivo. In the second part of this thesis, we showed for the first time that maternal nutritional status in n-3 PUFAs affect the morphofunctional properties of microglial cells and the establishment of neural circuits during the postnatal development of the pups. Overall, our results provide new insights in the relationship between morphological and functional plasticity of microglial cells in vivo.

La phagocytose est un mécanisme cellulaire essentiel de l’organisme. Elle joue un rôle à la fois dans le maintien de l’homéostasie tissulaire mais également dans le système immunitaire. Ce processus, réalisé par des cellules phagocytaires, telles que les cellules dendritiques, les polymorphonucléaires neutrophiles ou les macrophages, permet l’ingestion et l’élimination quotidienne de particules de grandes tailles (>0,5 µm) : bactéries, champignons ou débris cellulaires. Il est induit par de nombreux récepteurs phagocytaires tels que les récepteurs aux fragments cristallisables des immunoglobulines (FcR) et les récepteurs au complément (CR3). Ceux-ci induisent des cascades de signalisation différentes mais aboutissant, toutes deux, à un remodelage du cytosquelette d’actine et de la membrane plasmique. Il y alors formation d’une coupe phagocytaire entourant et enfermant la particule à internaliser dans un compartiment clos appelé phagosome. Alors que de nombreuses études ont permis de disséquer l’organisation des coupes phagocytaires induites par les FcR, le mécanisme de fermeture des phagosomes n’était pas élucidé. Par ailleurs, les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation des phagosomes suite à l’engagement des CR3 sont moins bien décrits. Au cours de ce travail, nous avons analysé le rôle de la dynamine 2, une GTPase impliquée dans les mécanismes de fission des vésicules d’endocytose, au cours de la formation et de la fermeture des phagosomes. Nous avons utilisé un système expérimental original utilisant la microscopie à ondes évanescentes pour montrer, que la dynamine 2 est recrutée avec l’actine dans les coupes phagocytaires en formation et qu’elle s’accumule au site de fermeture des phagosomes dans des macrophages vivants. L’inhibition de son activité GTPase induit une inhibition de l’efficacité de phagocytose et un défaut de la dynamique de l’actine lors de l’extension des coupes phagocytaires. De façon surprenante, la dépolymérisation de l’actine conduit à un défaut de recrutement de la dynamine 2 au site de la phagocytose mettant en évidence une régulation croisée entre la dynamine 2 et l’actine. Enfin cette étude a montré que la dynamine 2 joue un rôle critique dans la scission du phagosome. Dans un second temps, nous avons initié l’étude des mécanismes impliqués dans la régulation de l’activité du récepteur au complément CR3. L’activation de ce récepteur phagocytaire, qui fait partie de la famille des intégrines, requiert un ancrage à l’actine nécessaire à la signalisation vers la polymérisation d’actine et à la formation des coupes phagocytaires. L’ensemble de ces résultats contribue à une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires fins impliqués dans la phagocytose. / Phagocytosis is an important cellular mechanism. It plays a role in both the maintenance of tissue homeostasis and in the immune system. This process, performed by phagocytic cells, including dendritic cells, polymorphonuclear neutrophils or macrophages, enables daily ingestion and elimination of large particles (> 0.5 microns) e.g. bacteria, fungi or cellular debris. It is induced by many phagocytic receptors such as the receptors for crystallizable fragments of immunoglobulins (FcR) and complement receptor (CR3). These receptors induce different signaling cascades but ultimately lead to a remodelling of the actin cytoskeleton and the plasma membrane. Next there is the formation of a phagocytic cup which surrounds and encloses the ingested particle in a closed compartment called the phagosome. While many studies have dissected the phagocytic cup organization induced by the FcR, the mechanism of phagosome closure was not understood. Furthermore, the molecular mechanisms involved in phagosome formation following CR3 engagement are less well described. In this work, we analyzed the role of dynamin 2, a GTPase involved in fission mechanisms of endocytosis vesicles, and in the formation and closure of phagosomes. We used an original experimental system using the total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) to show that dynamin 2 is recruited with actin during phagocytic cup formation and accumulates at the site of phagosome closure in living macrophages. The inhibition of its GTPase activity induced an inhibition of phagocytosis and a defect in actin dynamics during pseudopod extension. Surprisingly, the depolymerization of actin lead to a defective recruitment of dynamin 2 at the phagocytic site showing there is a cross-regulation between dynamin 2 and actin. Finally, this study showed that dynamin 2 plays a critical role in the scission of the phagosome. Secondly, we initiated the study of the mechanisms involved in regulating the activity of the complement receptor CR3. Enabling this phagocytic receptor, part of the integrin family, requires anchoring actin which is necessary for signaling to the actin polymerization and the formation of phagocytic cups. All these results contribute to a better understanding of the molecular mechanisms involved in phagocytosis purposes.