Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’extension des activités humaines est responsable du rejet de molécules et de perturbations climatiques pouvant affecter la physiologie des organismes aquatiques. La moule zébrée possède des caractéristiques biologiques faisant d’elle une espèce intéressante en surveillance environnementale. Chez cet organisme, les hémocytes constituent une cible privilégiée pour la mise en place d’une approche multi-biomarqueurs. En effet, ces cellules à fonctionnalités multiples sont impliquées dans les grandes fonctions physiologiques de l’espèce et la régulation de l’homéostasie des individus. L’objectif de ce travail est de développer les outils analytiques permettant d’étudier les réponses hémocytaires de la moule zébrée. Les expérimentations menées ont permis de caractériser la structure des populations hémocytaires ainsi que leurs fonctionnalités propres en lien avec le processus de phagocytose. L’utilisation de ces biomarqueurs dans divers contextes indique une forte adaptabilité de l’espèce aux conditions environnementales. Les résultats montrent l’intérêt d’analyser les activités hémocytaires à l’échelle des sous populations comparativement à l’approche globale ne tenant pas compte de la diversité cellulaire. Il a été observé que certains facteurs comme le statut reproducteur ou l’espèce échantillonnée (D. polymorpha vs D. bugensis) constituent des facteurs de confusion importants. Il ressort également un positionnement fort du test de phagocytose en tant que marqueur de sensibilité aux contaminants. Ce travail constitue un ensemble de données voué à être utilisé dans des contextes multiples aussi bien en écotoxicologie qu’en écophysiologie. / Extension of human activities is responsible of molecule releases and climate changes that may affect physiology of aquatic organisms. The zebra mussel has biological traits making it an interesting species for environmental monitoring. In this organism, hemocyte cells constitute an interesting target to develop a multi-biomarker approach. These cells possess multiple functionalities and are involved in all major physiological functions of the species and in homeostasis regulation. The objective of this work was to develop analytical tools to study hemocyte responses of zebra mussels. Experiments allowed characterizing structure of hemocyte populations and their functionalities linked with phagocytosis process. Use of these biomarkers in various contexts indicated an important adaptation capacity of the species to environmental conditions. Results highlighted interest to analyze hemocyte activities at sub-population scale comparatively to global approach that does not consider hemocyte diversity. It was demonstrated that factor such as reproductive status or sampled species (D. polymorpha vs D. bugensis) constitute important confounding factors. Studies also demonstrated a strong positioning of phagocytosis assay as a sensitive marker to contaminants. This work constitutes a data set destined to be used in multiple contexts such as ecotoxicology or ecophysiology.

La résistance aux antibiotiques est un problème majeur en santé publique qui mène à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques, notamment en ciblant des facteurs de virulence bactériens. MgtC est un facteur de virulence impliqué dans la survie intra-macrophagique chez plusieurs pathogènes intracellulaires. La protéine MgtC est également présente chez le pathogène extracellulaire Pseudomonas aeruginosa. De plus, un peptide MgtR a été identifié comme étant un antagoniste naturel potentiel de MgtC. Pour étudier le rôle de MgtC dans la virulence des mycobactéries, j'ai analysé un mutant mgtC de Mycobacterium marinum dans les modèles d'infection d'embryons de danio et de macrophages en culture. Cela a permis de mettre en évidence un nouveau rôle de MgtC au niveau de l'étape de phagocytose qui est augmentée avec le mutant mgtC. Chez P. aeruginosa, nous avons montré qu'un mutant mgtC est atténué dans l'embryon de danio et présente une sensibilité accrue à l'action bactéricide du macrophage. Par ailleurs, j'ai montré que les gènes mgtC de M. marinum et de P. aeruginosa sont régulés par le magnésium. De plus, l'expression de mgtC de P. aeruginosa est fortement induite dans les macrophages. Enfin, concernant les propriétés antagonistes de MgtR, des souches de Mycobacterium bovis BCG ou de P. aeruginosa exprimants mgtR semblent se comporter de la même manière que les mutants mgtC, suggérant des propriétés anti-virulence prometteuses pour MgtR et confirmant le choix de MgtC en tant que cible dans le cadre d'une stratégie anti-virulence. / Antibiotic resistance is a major problem in public health, which leads to develop new therapeutics strategies, including strategies targeting bacterial virulence factors. MgtC is a virulence factor involved in intramacrophage survival in several intracellular pathogens. MgtC protein is also present in extracellular pathogen Pseudomonas aeruginosa. Moreover, a peptide MgtR has been identified as a potential and natural antagonist of MgtC.To study the role of MgtC in mycobacterial virulence, I have analysed a Mycobacterium marinum mgtC mutant in zebrafish embryo and macrophage infection models. This approach allowed us to uncover a new role of MgtC in phagocytosis, which is increased with mgtC mutant. In P. aeruginosa, we have shown that a mgtC mutant is attenuated in zebrafish embryos. In ex vivo experiments, mgtC mutant is more sensitive to macrophage killing. In parallel, I have shown that M. marinum and P. aeruginosa mgtC genes are regulated by magnesium. In addition, expression of P. aeruginosa mgtC is highly induced in macrophages.Finally, regarding MgtR antagonistic properties, Mycobacterium bovis BCG or P. aeruginosa strains expressing mgtR appear to mimic the behaviour of mgtC mutants, suggesting promising anti-virulence properties for MgtR and supporting the choice of MgtC as a suitable target of an anti-virulence strategy.

La formation des circuits cérébraux, dont l’altération est associée à divers troubles neurologiques et psychiatriques, commence pendant l’embryogenèse. Les microglies sont les macrophages du cerveau et répondent à une inflammation ou une infection par une production de facteurs et une phagocytose active. En plus de leurs fonctions immunitaires, ces cellules ont été récemment impliquées dans l’émergence de troubles associés à des maladies neurodéveloppementales. Elles agissent également sur le remodelage post-natal des circuits neuronaux en phagocytant des synapses et des neurones immatures. Étant donné que les microglies colonisent précocement le cerveau embryonnaire, elles pourraient également participer au développement cérébral précoce. Mes travaux de thèse ont montré que les microglies embryonnaires, par le biais d’une localisation hétérogène, modulent la formation du cerveau antérieur. En effet, l’étude phénotypique comparative in vivo de modèles murins dans lesquels les microglies sont absentes ou leurs fonctions perturbées montrent des défauts de positionnement d’interneurones corticaux et de progression des axones dopaminergiques. De plus, les microglies sont impliquées dans la progression d’un autre faisceau axonal, la capsule externe. Après avoir observé une association très forte entre les microglies et des axones spécifiques, j’ai utilisé deux approches ex vivo et in vivo afin de déterminer si les microglies pourraient agir par phagocytose. Mes résultats montrent que malgré la présence de caractéristiques morphologiques phagocytaires, les microglies ne phagocytent pas les axones de manière intense. Ces travaux suggèrent ainsi que la phagocytose des axones à elle seule ne peut pas expliquer les rôles des microglies sur la croissance axonale. Ce travail, qui montre un rôle anténatal des microglies, révèle une interaction nouvelle entre le développement des systèmes nerveux et immunitaires, et ouvre des perspectives nouvelles pour l’étude sur les mécanismes contrôlant la formation du cerveau en condition physiologique et pathologique. / Brain functioning relies on complex neural circuits that are built during embryogenesis and defects in this process can lead to neurologic or psychiatric disorders. Microglia are the brain resident macrophages, which respond to inflammation and infection by active phagocytosis and secretion of various molecules. In addition to these immune-related functions, microglia were recently involved in the onset of several neuropsychiatric disorders, as well as in postnatal neuronal plasticity, notably through the phagocytosis of developing neurons and synapses. Since microglia colonize the brain during early embryogenesis, they might also participate to the elaboration of neural networks. Here, we reveal that embryonic microglia, via a heterogeneous localization, are modulators of forebrain wiring. Using a cross-comparative analysis of phenotypes induced by either an absence or a perturbation of microglia activity, we showed that microglia directly regulate interneuron positioning as well as dopaminergic axons outgrowth. Moreover, microglia are involved in the formation of another tract, the external capsule. Having observed a strong association between microglia and axons, we combined ex vivo and in vivo approaches in order to decipher whether microglia could act by means of phagocytosis. Despite showing some clear morphological features of intense phagocytosis, our results suggest that microglia do not perform active phagocytosis of axons in vivo. Thus, the phagocytic activity of embryonic microglia by itself is unlikely to explain their role on axonal progression. This study shows for the first time an early prenatal role for microglia and reveal a novel interplay between the central and nervous systems during embryonic development.

Enterococcus faecalis est une bactérie commensale du microbiote intestinal humain. Inoffensive chez l'homme sain, E. faecalis est aussi un pathogène opportuniste. En conditions de dysbiose post-antibiotique, E. faecalis peut devenir une espèce dominante, traverser la barrière intestinale avant de disséminer. E. faecalis se classe désormais comme la troisième cause d'infections nosocomiales dans le monde. La pathogénie de E. faecalis est un processus multifactoriel dont les mécanismes cellulaires de son interaction avec l'hôte sont encore mal compris. À l'aide de modèles cellulaires d'infection et de modèles in vivo, nous avons entrepris de caractériser le rôle du facteur de virulence ElrA pendant l'infection cellulaire.Notre objectif était également de déterminer si FHL2, un partenaire eucaryote de ElrA, était impliqué dans l'infection par E. faecalis et de determiner l'impact de l'interaction ElrA-FHL2. Nous avons démontré que ElrA agit comme une cape d'invisibilité permettant à E. faecalis de ne pas être détecté par des macrophages. Nous avons également montré que FHL2 est impliqué dans la défense de l’hôte contre l'infection par E. faecalis, mais ce rôle implique partiellement ElrA. Parallèlement, nous avons montré pour la première fois que E. faecalis est capable de se multiplier dans les hepatocytes. En conclusion, ce travail apporte de nouvelles perspectives sur les interactions de E. faecalis avec son hôte. / Enterococcus faecalis is a core member of the human gut microbiota. Harmless for healthy humans, it is able to cause disease in susceptible patients under antibiotic-induced microbiota alteration. Nowadays, E. faecalis ranks as the third cause of nosocomial infections worldwide. E. faecalis pathogenicity is a multifactorial process but the cellular mechanisms of its interaction with the host remain poorly understood. Using cellular models of infection and in vivo models, we aimed to characterize the role of the virulence factor ElrA during cellular infection. Our goal was also to determine if FHL2, an ElrA eukaryotic partner, was implicated in E. faecalis infection and the impact of ElrA-FHL2 interaction. We have demonstrated that ElrA acts as an invisibility cloak allowing E. faecalis to avoid macrophage recognition. Also, we have shown that FHL2 is implicated in the defense against E. faecalis infection, involving partially ElrA. In parallel, we showed that intracellular replication of E. faecalis in hepatic cells. Altogether, our work provides new insights in E. faecalis interactions with the host cell.

Le remodelage de la membrane plasmique de la cellule-hôte est une des stratégies d’évasion immunitaire utilisée par le VIH-1 pour persister chez un hôte. Une des protéines accessoires du VIH-1, la protéine virale U (Vpu), joue un rôle important dans ce processus en régulant négativement l’expression de plusieurs protéines de surface. Lors d’une étude de protéomique quantitative du protéome de la membrane plasmique des cellules T exprimant Vpu de manière inductible, nous avons identifié le cluster de différenciation 47 (CD47) comme une protéine potentiellement ciblée et régulée négativement par Vpu. CD47 est une protéine multifonctionnelle exprimée de manière ubiquitaire et impliquée dans plusieurs processus cellulaires, telle que l’inhibition de la phagocytose via son interaction avec la protéine régulatrice SIRPα (« signal-regulatory protein alpha »), un récepteur principalement exprimé par les cellules myéloïdes, telles que les macrophages. CD47 module aussi l’apoptose caspase-indépendante directement via son engagement induit par la thrombospondine 1 (TSP-1) ou des anticorps monoclonaux anti-CD47 spécifiques. Les macrophages sont des cellules cibles importantes du VIH-1 qui sont infectés depuis les phases initiales de l’infection malgré l’absence des virus macrophage (M)-tropiques. Plusieurs études ont suggéré que l’infection des macrophages pourrait être le résultat de la phagocytose des lymphocytes T CD4+ infectés. Dans ce contexte, nous avons examiné si la régulation négative de CD47 par Vpu durant l’infection de cellules T pouvait favoriser la phagocytose par les macrophages et ainsi contribuer à leur infection. Nous avons initialement confirmé que CD47 est régulée négativement par le VIH-1, de manière Vpu-dépendante en utilisant des souches virales de laboratoire ainsi que des souches transmises/fondatrices (T/F). De plus, la coculture des cellules T infectées avec des macrophages dérivés de monocytes (MDMs) a démontré que la régulation négative de CD47 par Vpu provoque la capture et la phagocytose des cellules T infectées par les MDMs. Bien que les MDMs soient peu susceptibles à l’infection par les virus T/F, des expériences de coculture de MDMs avec des cellules T infectées par un virus T/F ont montré l’infection des MDMs et la relâche de particules infectieuses. Sur le plan du mécanistique, nous avons démontré que la déplétion de CD47 médiée par Vpu nécessite le domaine transmembranaire (TMD) de la protéine, ainsi que les motifs double-sérine (DSGNES, qui permet le recrutement du complexe E3 ubiquitine ligase SCFβTrCP1/2) et de trafic (ExxxLV) de Vpu. En effet, Vpu forme un complexe avec CD47 via son TMD et cible CD47 pour la dégradation lysosomale, ce qui est cohérent avec un mode d’action par lequel Vpu perturbe le trafic et/ou le renouvellement de CD47 à la membrane plasmique. Pour mieux définir les implications fonctionnelles de la régulation négative de CD47 par Vpu, nous avons par la suite évalué si celle-ci a un effet sur l’apoptose. Ainsi, nous avons confirmé que l’anticorps monoclonal anti-CD47 (clone CC2C6) permet d’induire l’engagement de CD47 et provoquer l’apoptose de manière CD47-dépendante. De plus, nous avons démontré que Vpu inhibe la réponse de cellules T infectées à l’apoptose suite à l’engagement de CD47 par l’anticorps CC2C6. L’ensemble de nos résultats souligne une nouvelle fonction de Vpu dans l’infection des macrophages en augmentant la phagocytose de cellules T infectées via un processus qui implique la régulation négative de CD47 à la surface des lymphocytes. Cette découverte permettra de mettre en lumière de nouveaux mécanismes régissant la transmission intercellulaire du VIH-1 et l’établissement de l’infection dans les macrophages durant les phases précoces de l’infection, une étape clé favorisant une transmission virale systémique et potentiellement l’établissement de réservoirs viraux persistants. Nos résultats mettent en évidence également un nouveau mécanisme par lequel le VIH-1 module l’apoptose de cellules infectées pour optimiser sa réplication et sa dissémination. Une meilleure connaissance de ces processus est importante pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutique et vaccinale contre l’infection par le VIH-1. / Remodelling of the host cell plasma membrane is one of the strategies used by HIV to evade host immune responses. One of the accessory proteins of HIV-1, the viral protein U (Vpu), plays a key role in this process by downregulating the expression of several cell-surface molecules. In the context of plasma membrane profiling studies of T cells inducibly-expressing HIV-1 Vpu, we identified the cluster of differentiation 47 (CD47) as a putative target downregulated by Vpu. CD47 is a ubiquitously expressed multifunctional protein involved in many cellular processes, such as inhibition of phagocytosis via its interaction with the signal-regulatory protein alpha (SIRPα), a surface receptor mainly expressed by myeloid cells, such as macrophages. In addition, CD47 modulates caspase-independent apoptosis directly through its ligation induced by thrombospondin 1 (TSP-1) or specific anti-CD47 monoclonal antibodies (mAbs). Macrophages are important targets of HIV-1, they are infected at early stages of infection despites the absence of macrophage (M)-tropic viruses, and several studies suggested that the infection of macrophages might result from phagocytosis of HIV-1-infected CD4+ T lymphocytes. In this context, we investigated whether Vpu-mediated CD47 downregulation during infection of T cells promotes the phagocytosis by macrophages and contributes to their infection. We firstly confirmed that surface CD47 is downregulated by HIV-1, in a Vpu-dependent manner by using either laboratory adapted or transmitted/founder (T/F) strains. Furthermore, cocultures of HIV-1-infected T cells with monocyte-derived macrophages (MDMs) revealed that CD47 downregulation by Vpu promotes capture and phagocytosis of infected T cells by MDMs. Importantly, while MDMs were weakly susceptible to infection by cell-free T/F virus, coculture experiments of MDMs with T/F virus-infected T cells led to infection of MDMs and release of infectious particles. Mechanistically, Vpu-mediated depletion of CD47 was found to require the transmembrane domain (TMD), the SCFβTrCP1/2 E3 ubiquitin ligase-interacting diserine motif (DSGNES), as well as the trafficking motif (ExxxLV) of Vpu. Indeed, Vpu can form a physical complex with CD47 through its TMD and target CD47 for lysosomal degradation, consistent with a mechanism whereby Vpu alters the trafficking and/or turnover of CD47 at the plasma membrane. To better define the functional implications of the Vpu-mediated CD47 downregulation, we subsequently evaluated whether this would regulate apoptosis. We confirmed that anti-CD47 mAb CC2C6 was able to induce CD47 ligation and promote apoptosis in a CD47-dependent manner. Furthermore, we showed that Vpu inhibited the response of HIV-1-infected cells to apoptosis following CD47 ligation induced by CC2C6 mAb. Altogether, our results highlight a novel function of Vpu in promoting infection of macrophages by increasing the phagocytosis of HIV-1-infected T cells through a process that involves downregulation of surface CD47. This finding provides new insights into the mechanisms governing the intercellular transmission of HIV-1 and the establishment of infection in macrophages during early stages of infection, a key step for a systematic viral transmission and potentially the establishment of persistent viral reservoirs. Our results also identify a new mechanism by which HIV-1 modulates apoptosis of infected T cells to optimize its replication and dissemination. A better understanding of these processes is important for developing novel therapeutic and vaccine strategies against HIV-1 infection.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Plusieurs protozoaires, des eucaryotes unicellulaires ubiquitaires, sont des prédateurs de bactéries. Cependant, les relations bactéries-protozoaires sont complexes et peuvent donner lieu à des interactions particulières. Certains protozoaires, dont l’amibe sociale Dictyostelium discoideum, peuvent produire des corps multilamellaires (CML) lorsqu’ils digèrent des bactéries. Ces structures avaient initialement été identifiées comme des déchets métaboliques, mais il a été suggéré qu’elles pourraient avoir des rôles supplémentaires. Ce ne sont pas toutes les bactéries qui sont digérées par tous les protozoaires, et certaines bactéries résistantes à la digestion peuvent être enrobées dans les corps fécaux de ces protozoaires. Les corps fécaux partagent des similitudes avec les CML. Ce projet de maîtrise visait à éclairer certains aspects des interactions bactéries protozoaires,en caractérisant la voie phagocytique d’amibes sociales environnementales afin d’examiner leur production potentielle de CML, et en analysant l’impact de différentes caractéristiques bactériennes sur la morphologie de l’enrobage par des ciliés. Ces objectifs furent atteints en cultivant les protozoaires d’intérêt en présence de bactéries digestibles(pour la production de CML) ou non (pour l’enrobage) et en faisant appel à diverses méthodes de microscopie. Nos résultats montrent que les quatre isolats d’amibes sociales environnementales, qui appartiennent tous au genre Dictyostelium, mais qui présentent des caractéristiques différentes, peuvent produire des CML lorsque cultivés sur bactéries digestibles. Pour l’étude de la morphologie de l’enrobage de bactéries, les résultats suggèrent que l’hydrophobicité de surface et la taille de l’espèce bactérienne seraient les caractéristiques ayant le plus fort impact sur la morphologie des corps fécaux. Toutefois, il n’est pas exclu que d’autres facteurs interviennent également, incluant des facteurs qui n’étaient pas à l’étude dans ce projet. Ces résultats approfondissent notre compréhension des relations bactéries-protozoaires, mais de nombreuses autres questions sont toujours sans réponse et le développement de méthodes d’analyse plus raffinées sera primordial pour répondre à ces questions. / Many protozoa, ubiquitous unicellular eukaryotes, are predators of bacteria. However, bacteria-protozoa relationships are complex and can lead to some particular interactions. Some protozoa, including the social amoeba Dictyostelium discoideum, can produce multilamellar bodies (MLBs) upon digesting bacteria. These structures were initially identified as metabolic waste, but it has been suggested that they could have additional roles. Not all bacteria can be digested by all protozoa, and some digestion-resisting bacteria can be packaged into the fecal bodies produced by protozoa. These fecal bodies share similarities with MLBs. This master’s project was meant to shed a light on some aspects of bacteria-protozoa interactions, by characterizing the phagocytic pathway of some environmental social amoebae and by analyzing the impact of bacterial characteristics on the morphology of bacteria packaging. These objectives were met by cultivating the protozoa species of interest with either digestible bacteria (for MLB production) or undigestible bacteria (for packaging) and using diverse microscopy methods. Our results show that the four environmental isolates of social amoebae, belonging to the Dictyostelium genus but presenting distinct characteristics, can produce MLBs upon growth on digestible bacteria. As for the study of bacteria packaging morphology, results suggest that a bacteria’s surface hydrophobicity and cell size are the characteristics impacting packaging morphology the most. However, it is not excluded that other factors may intervene as well, including some not considered in this project. These results bring new understanding to bacteria protozoa relationships, but many questions remain. The development of more refined analysis method will be paramount to answering these.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2005-2006 / Le neutrophile est spécialisé dans la chimiotaxie et la phagocytose. Ces deux phénomènes sont accompagnés d'une accumulation de phosphatidylinositol(3,4,5)triphosphate. Ce dernier est formé par les phosphatidylinositols 3-kinases. Leur activation et la formation de phosphatidylinositol(3,4,5)triphosphate sont bien caractérisés dans le neutrophile. La régulation du niveau de phosphatidylinositol(3,4,5)triphosphate par les lipide phosphatases est peu étudiée. Nous avons examiné le rôle des lipide phosphatases SHIP1 et PTEN suite à la stimulation du CD32a, un FcyR, dans la régulation du niveau de phosphatidylinositol(3,4,5)triphosphate. Ce dernier augmente suite à la stimulation du CD32a. La localisation cellulaire et la phosphorylation de SHIP1, mais pas de PTEN, sont modifiées en réponse à la stimulation du CD32a. Ces événements seraient dépendants des Src kinases. Par contre, ils seraient indépendants de l'activation des phosphatidylinositol 3-kinases. SHIP1, et non PTEN, pourrait donc être impliquée dans la régulation du phosphatidylinositol(3,4,5)triphosphate formé suite à la stimulation du CD32a dans le neutrophile humain.