Orientador: Ione Salgado / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campoinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T04:49:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_HalleyCaixetade_D.pdf: 3949471 bytes, checksum: cf24197fabcb7bb0a920baa1ef786e63 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O controle da homeostase do óxido nítrico (NO), determinada pelo balanço entre os processos de síntese e degradação, é essencial para suas funções sinalizadoras. O presente estudo teve como objetivo geral buscar um melhor entendimento da homeostase do NO em plantas, enfocando a importância dessa molécula na bioenergética mitocondrial e na resposta de defesa vegetal ao ataque de patógenos. Inicialmente, foi realizada a caracterização de uma atividade de degradação de NO por mitocôndrias isoladas de tubérculos de batata, observando-se um consumo mitocondrial dependente de sua reação com o ânion superóxido, estimulado na presença de NAD(P)H. Ensaios com diferentes substratos e inibidores respiratórios evidenciaram as NAD(P)H desidrogenases externas, além do complexo III, como os principais sítios de geração de ânion superóxido para o consumo de NO. Por outro lado, numa análise comparativa com mitocôndrias isoladas de fígado de rato, uma atividade NAD(P)H oxidase mitocondrial não associada à cadeia respiratória foi detectada como uma fonte de superóxido, em adição ao vazamento de elétrons nos complexos I e III, para o consumo de NO. Em ambos os casos, a existência de mecanismos mitocondriais de degradação de NO mostrou-se importante para o controle de seus efeitos inibitórios sobre a atividade respiratória. Adicionalmente, a importância da síntese de NO para a defesa vegetal foi analisada utilizando-se como modelo a interação Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae. Trabalhos anteriores já haviam demonstrado que o mutante de A. thaliana duplo-deficiente para a nitrato redutase (nia1 nia2) apresenta reduzida produção de NO e susceptibilidade à P. syringae, o que poderia resultar de sua prejudicada assimilação de nitrogênio. No presente estudo, plantas nia1 nia2 foram cultivadas com glutamina ou arginina para aumentar os níveis foliares de aminoácidos. Entretanto, esse mutante continuou a desenvolver uma baixa emissão de NO e permaneceu susceptível à infecção bacteriana, indicando que a susceptibilidade não resulta do reduzido conteúdo de aminoácidos. Por outro lado, a fumigação com baixas concentrações do gás NO de plantas nia1 nia2 com os níveis de aminoácidos recuperados restabeleceu a resposta de resistência. Coerentemente, uma análise do perfil transcriptômico utilizando microarranjos de DNA mostrou que o tratamento com NO induziu diversos genes relacionados à defesa em folhas nia1 nia2 infectadas, como aqueles relacionados às vias de sinalização do ácido salicílico e do cálcio, as proteínas relacionadas à patogênese, a reorganização da parede celular e a síntese de compostos com atividade antimicrobiana. Ainda, essa análise indicou novos genes como potenciais alvos do NO, sugerindo aspectos até então desconhecidos do papel dessa molécula sinalizadora na interação fitopatogênica e na fisiologia vegetal. Em especial, destacou-se o possível envolvimento do NO na alteração de transcritos relacionados à sinalização hormonal de forma a permitir um controle atenuador de mecanismos da resposta de defesa. / Abstract: The control of nitric oxide (NO) homeostasis, determined by a balance between the rate of synthesis and degradation, is essential for its signaling functions. The present study aimed a better understanding of NO homeostasis in plants, focusing on the importance of this molecule in mitochondrial bioenergetics and in plant defense response to pathogen attack. Initially, we carried out a characterization of an NO degradation activity by mitochondria isolated from potato tubers, observing a superoxide-dependent NO consumption, that was stimulated in the presence of NAD(P)H. Assays with different respiratory substrates and inhibitors evidenced the external NAD(P)H dehydrogenases, in addition to complex III, as the main sites of superoxide anion generation for NO consumption. On the other hand, in a comparative analysis with mitochondria isolated from rat liver, a mitochondrial NAD(P)H oxidase activity, non-associated to the respiratory chain, emerged as a superoxide source, in addition to the electron leakage from complexes I and III, for NO consumption. In both cases, the existence of mitochondrial mechanisms of NO degradation was important for the control of its inhibitory effects on respiratory activity. Additionally, the importance of NO synthesis for plant defense was analyzed using the interaction Arabidopsis thaliana- Pseudomonas syringae as a model. Previous works have shown that the nitrate reductase double-deficient mutant of A. thaliana (nia1 nia2) presents reduced NO production and susceptibility to P. syringae, that could result from its impaired nitrogen assimilation. Here, nia1 nia2 plants were cultivated with glutamine or arginine to increase the leaf amino acid content. Despite this, this mutant continued to develop a low NO emission and remained susceptible to bacterial infection, indicating that the susceptibility does not result from reduced amino acid levels. On the other hand, the fumigation of amino acid-recovered nia1 nia2 plants with low concentrations of NO gas reestablished the resistance response. Accordingly, a transcriptomic analysis using DNA microarrays showed that NO treatment induced diverse defense-related genes in infected nia1 nia2 leaves, as those associated to salicylic acid and calcium signaling pathways, pathogenesis-related proteins, cell wall reorganization and synthesis of antimicrobial compounds. Additionally, this analysis indicated new genes as potential targets of NO action, suggesting previously unknown aspects about the role of this signaling molecule in phytopathogenic interactions. In special, we can highlight the possible involvement of NO in the modulation of transcripts related to hormonal signaling in order to allow an attenuating control of certain mechanisms of the defense response. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

La perception de l’environnement extérieur est importante pour des interactions efficaces entre plantes et champignons. Chez les champignons filamenteux, l’information associée au pH extracellulaire est transmise via une voie de signalisation conservée et impliquant sept protéines. Parmi ces protéines, la protéine transmembranaire PalH est un récepteur présumé initier la réponse aux pH neutre ou alcalin. Le facteur de transcription PacC, présent sous forme inactive dans le cytoplasme de la cellule fongique, est clivé en réponse à l’activation de la voie, et migre dans le noyau où il active la transcription des « gènes alcalins » et réprime la transcription des « gènes acides ». Chez Magnaporthe grisea, un Ascomycète responsable de la principale maladie du riz, le rôle de cette voie dans la physiologie du champignon est encore inconnu. Les deux homologues des gènes PACC et PALH ont été identifiés. Dans le but d’analyser le rôle des deux protéines PacC et PalH chez M. grisea, la délétion de ces gènes a été réalisée. Plusieurs phénotypes ont été analysés chez les deux souches mutantes, notamment la croissance, la sporulation et le pouvoir infectieux. Ceci a permis d’étudier le rôle de la signalisation liée au pH extracellulaire dans le cycle de développement de M. grisea. De plus, une analyse du profil des gènes exprimés chez le mutant ΔpacC a été initiée. Les résultats obtenus indiquent que cette voie est importante pour l’adaptation du champignon à un environnement alcalin et qu’elle joue un rôle dans la pathogénicité du champignon / Perception of external environment is important for successful infection of plants by fungi. In these organisms, the information about extracellular pH is provided to the cell by a conserved signalling pathway that involves seven proteins. Among these proteins, the transmembrane protein PalH is the putative receptor which would initiate the pH response. The transcription factor PacC, existing in an inactive form in the fungus cell cytoplasm, is activated through proteolysis in response to the pathway activation, and migrates into the nucleus where it activates the « alkaline » genes transcription and represses that of the « acidic » genes. In Magnaporthe grisea , an ascomycete responsible for the main rice disease, the role of this pathway is still unknown. In this work, the PACC and PALH genes have been identified. In order to analyse the role of the two corresponding proteins PacC et PalH, the deletion of these two genes has then been performed. Several phenotypes were studied in the two mutant strains, including growth rate, conidiation and ability to infect host plants. This enabled the investigation of the involvement of the pH signalling pathway in the M. grisea development cycle. Furthermore, a gene expression profiling analysis of the ΔpacC mutant has been undertaken and revealed the multiple cellular responses to pH changes. Taken all together, the results collected in this work indicate that the pH signalling pathway is important for M. grisea's adaptation to an alkaline environment and that it plays a significant role in the fungus pathogenicity

Le nématode phytoparasite Radopholus similis est un ravageur majeur des bananiers et plantains dans le monde. Introduit à partir du XVIe siècle en Afrique et Amérique, ce nématode occasionne des pertes importantes dans les bananeraies traditionnelles. La mise au point de nouvelles méthodes culturales a permis de réduire son impact ; mais des connaissances supplémentaires sont requises pour comprendre sa persistance et prévenir sa dispersion. Considérée jusqu'alors comme marginale, la phase sol de R. similis avait été peu étudiée car les populations de R. similis sont faiblement concentrées dans le sol (environ 1/1 000e de celle des racines). Pourtant, le volume du sol exploré par les racines de bananier représente 100 à 300 fois le volume de ces racines ; la phase sol concerne 30 à 50 % des effectifs de R. similis. Après avoir considéré les caractéristiques des sols volcaniques antillais, et notamment les classes de capillaires susceptibles d'héberger R. similis (capillaires de 20 à 300 µm de diamètre), nous avons évalué les différentes méthodes d'extraction des nématodes : filtration Baermann, élutriation, centrifugation-flottaison, aspersion, macération dans l'eau oxygénée. Les rendements à l'extraction de chaque méthode, leurs avantages et inconvénients ont été discutés. Ce travail a été complété par l'évaluation d'une méthode de coloration vitale qui permet de discriminer les nématodes morts et vivants. L'aptitude à la survie de R. similis dans le sol a ensuite été évaluée. Pour cela, nous avons déposé des suspensions de nématodes dans des piluliers remplis de sol de natures et de potentiels matriciels variables, mais toujours sans ressource alimentaire. Ces piluliers ont ensuite été conservés jusqu'à 180 jours dans des conditions de température optimale pour R. similis. Les durées de survie mesurées ont ainsi été légèrement supérieures à celles que l'on trouve habituellement dans la bibliographie : si on exclut les sols saturés en eau, il restait au bout de six mois de 1,7 à 9,3 % de la population apportée dans le nitisol et de 9,5 à 11,9 % dans l'andosol. Pour les adultes, les courbes de décroissances de population de R. similis pouvaient généralement être ajustées à l'aide des modèles de décroissance exponentielle ou de Teissier. Ces courbes dépendaient de la nature du sol, du potentiel hydrique et du sexe. Nous avons ainsi observé que les mâles avaient une capacité de résistance surprenante ; dans le nitisol, les taux de survie ont été en moyenne proches du double de ceux des femelles. Cette capacité de survie des mâles serait liée à une moindre dépense énergétique journalière que chez les femelles : les mâles, dont le système digestif est atrophié, ne chercheraient pas activement leur nourriture et ne perdraient pas de réserves lors du développement des œufs. Par ailleurs, dans les sols stérilisés, la survie était optimale quand les sols étaient proches de la capacité au champ ; dans les sols non perturbés, elle était optimale dans les sols les plus secs. Ces résultats contradictoires pourraient s'expliquer par les interactions avec les autres organismes du sol qui, en diminuant la capacité de survie, pourraient avoir un rôle antagoniste. Une étude complémentaire a été réalisée dans des tubes remplis d'eau ou de solutions de sol, extraites d'un nitisol par centrifugation. Au bout de 35 jours, il restait 7 à 8 % des populations initiales de R. similis, et ce, pour les deux sexes. Cette espèce peut donc subsister assez longtemps dans des eaux qui circulent pour être disséminée par ruissellement. Nous avons donc étudié la dissémination de R. similis par les flux d'eau ; en surface à l'aide de simulateur de pluie, en profondeur à l'aide de cylindres de sol sur lesquels nous avons simulé des pluies allant jusqu'à 3,7 fois le volume poral du cylindre (pluie de 540 mm). Ces études ont été complétées par un dispositif au champ qui a permis de cartographier les recontaminations dans des parcelles isolées ou non hydrologiquement par des fossés. La dissémination passive a été très faible dans le sol et n'a concerné qu'une fraction marginale des populations. Il semble que R. similis ait adapté ses comportements pour résister à l'entraînement par les eaux (plasticité réflexe ?). En surface, les simulations de pluie ont montré que la dissémination par les eaux nécessitait des conditions bien particulières : sols proches de la saturation en eau, racines ou bulbes arrachés à la surface du sol. Néanmoins, la dissémination passive existe, essentiellement en surface ; elle s'apparente à un phénomène restreint aux évènements "catastrophe" à l'échelle du nématode : destruction de son milieu de vie par les intempéries accompagnées d'épisodes de ruissellement important. Elle est suffisante pour entraîner la recontamination d'une parcelle en moins de deux ans. L'ensemble de ces travaux a montré que le comportement de R. similis est un facteur essentiel pour comprendre sa survie et sa dispersion. Sa biologie lui permet de bien s'adapter aux cultures pérennes à multiplication végétative, comme le bananier. Lorsque ces dernières sont cultivées en monoculture, les dégâts peuvent être considérables.

El principal objectiu d'aquest treball ha estat estudiar la producció de metabòlits amb activitat antibiòtica per soques de l'espècie Pseudomonas fluorescens de la col·lecció EPS, i també avaluar la seva potencialitat com a agents de biocontrol. Es va disposar també de diverses soques de P. fluorescens, cedides per altres investigadors, que van utilitzar-se com a referència perquè algunes són actives en control biològic i produeixen metabòlits secundaris d'interès en el biocontrol de malalties de plantes.La present memòria s'estructura en cinc capítols, que són, introducció al control biològic, descripció de l'etapa de selecció de soques i cerca dels metabòlits produïts, estudi de la producció d'HCN per la soca EPS288, estudi de la producció de l'antibiòtic 2,4-diacetilfloroglucinol (DAPG), i finalment, el darrer capítol, on s'ha estudiat la producció de DAPG sobre material vegetal i la capacitat de colonitzar arrels per diverses soques d'interès.En l'etapa de prospecció, va demostrar-se que un 37% del total de les soques de la col·lecció EPS produïen HCN, totes de l'espècie P. fluorescens, i un 90% d'aquestes provenien de les arrels de plantes. Es va confirmar la producció dels metabòlits secundaris 2,4-diacetilfloroglucinol, àcid fenazina-1-carboxílic, i pirrolnitrina, per diverses soques de la col·lecció EPS seleccionades mitjançant tècniques moleculars. Així, de la col·lecció EPS, les soques EPS317 i EPS808 produeixen DAPG, la EPS263 àcid fenazina-1-carboxílic i pirrolnitrina i, EPS894, EPS895, EPS945 produeixen àcid fenazina-1-carboxílic. La producció d'HCN es va estudiar més exhaustivament en la soca EPS288, seleccionada per la seva activitat antifúngica i candidata a agent de biocontrol contra Stemphylium vesicarium, causant de la estemfiliosi de la perera, i contra Penicillium expansum, causant de la podridura blava en conservació de fruita a postcollita. Per aquest estudi, es va dissenyar i validar un sistema per recollir l'HCN a partir de cultius en medi líquid. S'ha demostrat que la temperatura d'incubació, la concentració cel·lular de sembra i la composició del medi de cultiu afectaven a la producció d'HCN. Els medis complexos i la glicina n'afavorien la síntesi i la font de carboni no afectava. La soca EPS288 va produir més HCN que P. fluorescens CHA0, soca de referència productora d'HCN i descrita com a activa en processos de biocontrol de fongs fitopatògens. En l'estudi de la producció de DAPG, les soques de la col·lecció EPS i de referència, es van comparar en diversos medis de cultiu estudiant l'efecte de la complexitat i consistència del medi, i l'addició de ferro o de glucosa. Va demostrar-se que la producció de DAPG depèn principalment de la soca i de les característiques del medi de cultiu. La glucosa estimula la producció, mentre que el ferro pràcticament no afecta, i en general, el medi sòlid i complex estimula la producció de DAPG. Tanmateix, aquests efectes varien en alguna de les soques assajades donant lloc a comportaments singulars. En el seguiment del creixement amb un sistema automàtic es va comprovar que la velocitat específica de creixement i la concentració cel·lular assolida al final del cultiu, estaven condicionades per la composició del medi de cultiu. En les proves d'antagonisme vers fitopatògens que foren seleccionats com a indicadors, va observar-se que tant l'antagonisme in vitro com la inhibició d'infeccions sobre material vegetal estaven parcialment relacionades amb la producció dels metabòlits secundaris estudiats. La promoció del creixement de portaempelts per aquestes soques depenia de la soca i de l'hoste, però no es pogué establir una relació causa-efecte amb el metabòlits produïts. També es va comprovar que algunes de les soques podien sobreviure en ferides de pomes i de peres, on produïren DAPG.Mutants resistents a rifampicina de diverses soques de la col·lecció EPS i de referència es van inocular en llavors de pomera i de tomatera que es van sembrar i incubar en condicions controlades. Es va fer el seguiment de la població bacteriana total i resistent a rifampicina present a les arrels durant 72 dies. Totes les soques van colonitzar les arrels de les plantes, mantenint una elevada població durant 37 dies, cap d'elles va estimular el creixement ni mostrar efectes fitotòxics, no afectant tampoc signicativament a la població bacteriana espontània de les arrels. La soca EPS808, una de les seleccionades pel treball, va aconseguir uns nivells de producció de DAPG, una velocitat de creixement i una supervivència relativa a les arrels similar a altres soques de referència descrites com a bons agents de biocontrol. En conseqüència, se la considera una candidata a agent de biocontrol que hauria de ser objecte de futurs estudis d'eficàcia. / El principal objetivo de este trabajo ha sido estudiar la producción de metabolitos con actividad antibiótica por cepas de la especie Pseudomonas fluorescens de la colección EPS, y también evaluar su potencialidad como agentes de biocontrol. Se dispuso de varias cepas de P. fluorescens, cedidas por otros investigadores, que se utilizaron como referencia ya que algunas de estas son activas en el control biológico, y producen metabolitos secundarios de interés para el biocontrol de enfermedades de plantas.La presente memoria se estructura en cinco capítulos, revisión bibliográfica del control biológico, descripción de la etapa de selección de cepas y de los metabolitos producidos, estudio de la producción de HCN por la cepa EPS288, estudio de la producción de 2,4-diacetilfloroglucinol(DAPG), y finalmente, el último capítulo, donde se ha estudiado la producción de DAPG sobre material vegetal y la capacidad de colonizar las raíces de diversas plantas. En la etapa de prospección se demostró que el 37% del total de las cepas de la colección EPS producían HCN, todas ellas de la especie P. fluorescens, de las cuales el 90% había sido aislada de las raíces de plantas. Se confirmó la producción de los metabolitos secundarios 2,4-diacetilfloroglucinol, ácido fenazina-1-carboxílico y pirrolnitrina, por diversas cepas de la colección EPS seleccionadas mediante técnicas moleculares. De la colección EPS las cepas EPS317 y EPS808 producen DAPG, la EPS263 ácido fenazina-1-carboxílico y pirrolnitrina y las cepas EPS894, EPS895 y EPS945 producen ácido fenazina-1-carboxílico. La producción de HCN se estudió en detalle por la cepa EPS288, esta había sido seleccionada por su actividad antifúngica y es candidata a agente de biocontrol contra Stemphylium vesicarium, causante de la estemfiliosis del peral, y contra Penicillium expansum, causante de la enfermedad del moho azul en la conservación de la fruta en poscosecha. Para este estudio se diseñó y se validó un sistema para la recogida del HCN que se desprende de cultivos en medio líquido. La temperatura de incubación, la concentración en la siembra y la composición del medio de cultivo afectaban a la producción de HCN. Los medios de cultivo complejos y la glicina estimulaban su síntesis, mientras que la fuente de carbono no afectaba. La cepa EPS288 produjo más HCN que la P. fluorescens CHA0, cepa de referencia productora de HCN y descrita como activa en procesos de control biológico de hongos fitopatógenos.En el estudio de la producción de DAPG, las cepas de la colección EPS y de referencia, se compararon en diferentes medios de cultivo estudiando el efecto de la complejidad y la consistencia del medio de cultivo, y de la adición de hierro o de glucosa. Se demostró que la producción de DAPG depende principalmente de la cepa y de la composición del medio de cultivo. La glucosa estimula la producción, mientras que el hierro casi no tiene efecto. Sin embargo, estos efectos varían en alguna de las cepas ensayadas dando lugar a comportamientos singulares.El seguimiento del crecimiento mediante un sistema automático permitió verificar que la velocidad específica de crecimiento y la concentración celular en la fase estacionaria estaban condicionadas por la composición del medio de cultivo. En las pruebas de antagonismo frente a hongos fitopatógenos seleccionados como indicadores, se observó que el antagonismo in vitro y la inhibición de infecciones sobre material vegetal correlacionaban parcialmente con la producción de los metabolitos secundarios estudiados. La promoción del crecimiento de portainjertos con esas cepas era función del huésped y de la cepa. Se comprobó que algunas de las cepas sobrevivían en heridas de manzanas y de peras dónde sintetizaban DAPG. Mutantes resistentes a rifampicina de diversas cepas de la colección EPS y de referencia se inocularon en semillas de manzano y de tomate las cuales se sembraron e incubaron en ambiente controlado. La población bacteriana en las raíces de las plantas se monitorizó durante un periodo de 72 días. Todas las cepas colonizaron las raíces de las plantas manteniendo una elevada población durante, al menos, 37 días. Ninguna de la cepas estimuló el crecimiento ni mostró fitotoxicidad, y no afectaron significativamente a la población bacteriana espontánea de las raíces.La cepa EPS808, una de las seleccionadas para el presente trabajo, demostró una producción de DAPG, velocidad específica de crecimiento y una supervivencia relativa en las raíces, similares a otras cepas de referencia descritas como buenos agentes de biocontrol. Por lo tanto, se considera a esta cepa como una candidata a agente de biocontrol, que tendría que ser objeto de futuros estudios de eficacia. / The main objective of this work is to study the production of biologically active secondary metabolites produced by Pseudomonas fluorescens strains from EPS collection. Moreover, their potential as biocontrol agents was also evaluated. We used P. fluorescens strains, provided by foreign scientists, that were utilised as a reference because these strains are active as biocontrol agents and produce secondary metabolites involved in biological control. The present work is divided into five chapters which deal with an introduction to biological control, the selection of strains, the detection and identification of metabolites produced by these bacteria, the study of HCN production by EPS288 strain, the study of 2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG) production, and finally, the DAPG production based on fruits and plants, and root colonisation by selected strains.It was shown that 37% of isolates in EPS collection produced cyanide, all were P. fluorescens, and 90% of them were isolated at roots of different plants. The secondary metabolites 2,4-diacetilphloroglucinol (DAPG), phenazine-1-carboxilic acid (PCA) and pyrrolnitrin were identified and its production by some EPS collection strains, selected with molecular techniques, was demonstrated. The strains EPS317 and EPS808 produce DAPG, EPS263 produces phenazine-1-carboxilic acid and pyrrolnitrin, and the strains EPS894, EPS895, EPS945 produce phenazine-1-carboxilic acid.The production of cyanide acid by P. fluorescens EPS288 was studied more exhaustively. This strain was selected as a biocontrol agent due to its antifungal activity against Stemphylium vesicarium, that causes brown spot on pear, and Penicillium expansum, that causes the blue mould of fruits during postharvest. A device to collect cyanide produced by bacteria from broth cultures was set up and validated. The incubation temperature, the initial cell density and the composition of growth media clearly affected HCN production by EPS288 strain. Complex media and glycine stimulated HCN production, however, it was not affected by carbon source in defined growth media. The EPS288 strain produced more cyanide in Castric growth media than P. fluorescens CHA0, a reference strain employed in biological control of fungal pathogens. The reference strains and those from EPS collection which produced DAPG were compared considering the factors complexity and consistence of growth media. The effect of iron and glucose addition were also evaluated. The strain and growth media characteristics were the predominant factors in the DAPG production. Glucose increased DAPG production, while iron addition had no considerable effect, and as general rule, solid and complex media stimulated DAPG production. However these effects are variable depending on the strain. The monitoring of bacterial growth and DAPG production with an automated absorbance reader showed that the growth rate and cellular yield were affected by growth media.In antagonism tests against selected fungal pathogens, the in vitro inhibition and inhibition of infections over organic material were, in part, correlated with secondary metabolite production. The rootstock growth promotion caused by some of these strains was dependent on the strain and the host, but a cause-effect relationship with antibiotics produced could not be clearly established. Some strains were able to colonise and produce DAPG in wounds on apples and pears. Rifampicine resistant spontaneous mutants of the reference and of EPS collection strains were isolated and inoculated on apple and tomato seeds, which were sown and grown under a controlled conditions. The evolution of inoculated strains and the whole bacterial population at the roots were monitored during 72 days. All selected strains efficiently colonised plant roots at high levels for at least 37 days, and nor phytotoxic either plant growth promotion was observed by any strain. Moreover, they did not significantly affected the spontaneous bacterial population at roots.The EPS808 strain exhibited a 2,4-diacetilphloroglucinol production level, a specific growth rate and a relative root population as high as the reference strains that are referenced to be good biocontrol agents. Thus we conclude that this strain can be considered as a candidate for biological control agent, but further efficacy studies are required.

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Johana Rincones Peres / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T06:30:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barau_JoanGrande_D.pdf: 15458099 bytes, checksum: 72a1f6ed8ef42544b91f989494fb4ce2 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A introdução da doença vassoura de bruxa do cacaueiro no Sul da Bahia representa um dos maiores exemplos da magnitude de impacto sócio econômico que uma fitopatologia pode aflingir a uma região ou país com um predominante perfil agroexportador. Com a execução do projeto genoma do fungo causador da vassoura de bruxa, o Basidiomiceto Moniliopthora perniciosa, uma série de trabalhos de caracterização morfológica, fisiológica e genética da doença foram inciados. Em um primeiro momento, em paralelo com a caracterização das alterações bioquímicas da doença, buscamos entender as diferenças de expressão gênica através de microarranjos de DNA e bibliotecas ESTs comparando as duas fases morfo-genéticas do fungo reproduzidas in vitro. Apesar de esse esforço pioneiro ter permitido a formação de um modelo panorâmico das alterações genéticas do fungo e fornecido importantes diretrizes para a pesquisa futura, ficou claro a necessidade de se explorar em maior detalhe a interação in vivo. Dentre os aspectos importantes investigados, o estudo do metabolismo do glicerol durante a fase biotrófica da interação através de marcadores de expressão mostrou que essa fonte de carbono em potencial pode ter um papel importante no início da infecção e participar da sinalização de stress através da modulação do shuttle mitocondrial de glicerol 3-fosfato. No entanto, a necessidade de se entender melhor o panorama das fontes de carbono disponíveis no apoplasto, o microambiente ocupado pelo fungo nas fases iniciais da interação, nos motivou a caracterizar as alterações nutricionais desse espaço ao longo da doença. Foi possível demonstrar que a vassoura de bruxa quebra o ciclo de carbono normal do apoplasto e que induz o corte da comunicação vascular com as partes sadias da planta ao final da fase biotrófica. Uma correlação entre a sinalização por carbono e a expressão de genes de patogenicidade secundária foi explorada. Com a expansão dos dados de genoma e transcriptoma utilizando sequenciamento de DNA de terceira geração (Illumina e 454 Life Sciences), dezenas de genes-alvo com potencial participação em vias de patogenicidade e desenvolvimento da doença foram identificados. Nesse contexto, dentre as ferramentas para análises de genômica funcional nesse modelo, a inativação ou nocaute de genes por gene targeting e o estudo da atividade de proteínas através de fusões com genes repórteres são essenciais ao teste das hipóteses geradas como fruto da pesquisa genômica da Vassoura-de-bruxa. Transformantes de M. perniciosa carregando uma cópia do gene marcador de autofagia MpATG8 fusionado ao marcador GFP apresentaram um padrão de fluorescência característico da biologia celular de ATG8, permitindo acompanhar o processo de autofagia sob condições de deprivação de nutrientes, demonstrando a possibilidade da aplicação de fusões com repórteres fluorescentes para experimentos de localização subcelular de proteínas desse fitopatógeno. Por fim, uma estratégia baseada na seleção de recombinantes através da técnica split marker em conjunto com um silenciamento transiente do sistema de reparo NHEJ por RNAi foi traçada e executada de modo a obter o nocaute do gene MpKu70, essencial a essa via de reparo, cuja inativação está associada a um aumento da eficiência de recombinação homóloga e gene targeting / Abstract: Cocoa's Witches Broom Disease (WBD) is caused by the hemibiotrophic interaction between the Basidiomycete fungus Moniliopthora perniciosa and plants of Theobroma cacao. One remarkable feature of WBD is its unusual long biotrophic phase in which the fungal growth is restricted to the apoplastic space of plants. We compared differential gene expression between biotrophic and saprotrophic-like hyphae in vitro and proposed based on microarray and EST results that the maintenance of biotrophic-like cultures of M. perniciosa in vitro is subject to Carbon source regulation, especially regarding the use of glycerol as a preferential carbon source for biotrophy. To further gain insight into the carbon source regulation of WBD biotrophic phase in vivo, we characterized glycerol utilization using fungal expression markers during the initial phases of infection. We also characterized the carbon source fluctuations in the apoplast of healthy and infected cocoa seedlings. We showed that healthy cocoa plants possess a rhythmic carbon cycle in the apoplast that is in fine tune with periodical leaf flushing, expansion and photosynthetic maturation. WBD completely disrupts the carbon cycle in the apoplast of infected plants and also arrests leaf photosynthesis at pre sink-to-source transition levels. It was also possible to distinguish two different phases of carbon availability in the apoplast. The two phases correlated with fungal growth rates, the expression of a characterized necrosis inducing gene and the development of a tumor-like callus at the base of infected stems that completely disrupted normal vascular communication between healthy and diseased parts of the plant. A possible correlation between carbon starvation and phase switch from biotrophic to necrotrophic was explored and the evolution of the vascular-disrupting callus was discussed in the view of the tradeoff between the physiological behavior of infected tissues as sinks and the avoidance of nutrient remobilization during infected tissue senescence. Finally, we focused on the development of functional genomic tools for the study of gene function in this pathogen. As a proof-of-concept, we successfully obtained fungal strains expressing the autophagy related gene MpATG8 fused with GFP reporter, in which was possible to visualize the autophagy process in vivo by fluorescence imaging. In addition we also obtained the first successful gene targeting knockout of MpKu70, an M. perniciosa homologous of a gene essential to NHEJ in Eukaryotes. MpKu70 knockouts strains have reported phenotypes of increased homologous recombination, and the M. perniciosa strain may be an important platform for future functional studies of genes important in witches broom disease pathogenesis / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

This study was conducted in the semiarid region of Alagoas between 2007 and 2010 with the aim of studying the foundations of biotechnology obtain goat's milk and its environment. Were isolated and identified microorganisms from goat milk in two settlements, we studied the chemical characteristics of forage plants local and deepened in the study of Trap (Crataeva tapia L.), identified the prevalence of endoparasites goats in several counties semi-arid Alagoas and tested the Garlic (Allium cepa L) in the alternative control of endoparasites. We also studied the influence of the supply of mineral Selenium mineral salt recommended for goats and interrelation with other minerals, calcium, phosphorus and soluble iron and also, Fat, Lactose, Protein, Somatic Cell Count and Colony Forming Units of Milk goats in the experiment. It was concluded that among the pathogens found in fresh goat milk, the most prevalent was Staphylococcus sp. Forages analyzed compositions presented in nutritive value satisfactory dry matter, crude protein, neutral detergent fiber, acid detergent fiber. All species, the chemical composition, have a potential to be used as fodder, especially Crataeva tapia L. The endoparasites most often found in dairy goats in the study area are Trichostrongyloidea superfamily and members of the genus Eimeria sp, which is also found others as Strongyloides sp, Trichuris sp and Moniezia, these being found with a lower frequency. The use of Allium sativum L. as antiparasitic OPG showed a reduction of 50.38%, 70.22%, 79.38% and 73.28% for treatments with 0 g (control group), 2g, 4g, 6g and 8g of Allium sativum L . respectively, compared to the average OPG treatment T0 (control group). The supply of mineral proved to be essential in the response of essential minerals present in milk of goats, such as soluble Ca and Fe with significant increases, the P did not respond to even increase its value decreasing with increasing selenium. Milk does not transfer directly increased the levels of selenium in animal nutrition studies are suggested dosages of selenium via venal to analyze their transfer. There was a decrease in SCC with increasing dosage of selenium demonstrating their antioxidant activity and an increase in lactose and fat. / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Alagoas / O presente trabalho foi desenvolvido no semi-árido alagoano entre 2007 e 2010 com o objetivo de estudar as bases biotecnológicas de obtenção de leite de cabra e seu meio ambiente. Foram isolados e identificados os microrganismos do leite de cabra em dois assentamentos, estudou-se as características químicas das plantas forrageiras locais e aprofundou-se no estudo do Trapiá (Crataeva tapia L.), identificou-se a prevalência de endoparasitas caprinos em varios municipios do semi-arido alagoano e testou-se o Alho (Allium cepa L) no controle alternativo desses endoparasitas. Também estudou-se a influencia do fornecimento do mineral Selenio no sal mineral recomendado para caprinos e a interrelação com os demais minerais Calcio, Fósforo e Ferro solúvel e também, Gordura, Lactose, Proteína, Contagem de Celulas Somaticas e Unidades Formadoras de Colonias do Leite de cabras em experimento. Concluiu-se que entre os microrganismos patogênicos encontrados no leite de cabra in natura,o mais prevalentefoi o Staphylococcus sp.As espécies forrageiras analisadas, apresentaram composições bromatológicas satisfatórias em teores de matéria seca, proteína bruta, fibra em detergente neutro, fibra em detergente acido. Todas as espécies analisadas, quanto à composição bromatologica, apresentam potencial para serem utilizadas como forrageiras, com destaque paraCrataeva tapia L.Os endoparasitos encontrados com mais freqüência em caprinos leiteiros na área estudada são os da superfamília Trichostrongyloidea e os do gênero Eimeria sp, tendo também encontrado outros como Strongyloides sp, Trichuris, e Moniezia sp, sendo esses encontrados com uma menor freqüência. A utilização de Allium sativum L. como antiparasitário apresentou uma redução de OPG de 50,38%, 70,22%, 79,38% e 73,28%, para os tratamentos; 0 g (grupo controle), 2g, 4g, 6g e 8g de Allium sativum L. respectivamente, em relação à média de OPG do tratamento T0 (grupo controle).O fornecimento de sal mineral mostrou-se imprescindível na resposta de minerais essenciais presentes no leite de cabras, tal como Ca e Fe solúvelcom aumentos significativos, o P não respondeu ao aumento inclusive diminuindo seu valor com o aumento de Selênio.O leite não transfere diretamente as dosagens de selênio aumentadas na alimentação animal, sugerem-se estudos com dosagens de selênio via venal para analisar sua transferência.Houve uma redução na CCS com o aumento da dosagem do selênio demonstrando sua ação antioxidante e um aumento nos teores de lactose e gordura.

Made available in DSpace on 2016-01-26T18:56:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao.pdf: 168225 bytes, checksum: 5446b44c9266240b990e9dcb92f20518 (MD5) Previous issue date: 2009-07-02 / This work aimed to evaluate the use of vinasse as a cultive medium for multiplication of Bacillus subtilis and the effect of your inoculation to control nematodes and growth of sugar cane grown in soil infested with the nematode galls (Meloidogyne spp.). Were developed in laboratory tests to define the best concentration of vinasse on the composition of culture medium to optimize the growth of B. subtilis. For the experiment with plants in the greenhouse soil used was collected in area of cultivation of sugarcane. Were established the following treatments: control, pure vinasse (50 m3 ha-1), Bacillus subtilis in aqueous suspension (50 m3 ha-1); B. subtilis multiplied in vinasse (50 m3 ha-1), multiplied in B. subtilis vinasse (100 m3 ha-1). The multiplication of Bacillus subtilis in the culture-based stillage was considered satisfactory when compared to the culture pattern. The application of B. subtilis without multiplication in vinasse promoted the growth of sugarcane and reduced reproduction of the nematodes in the root during the experiment. The use of B. subtilis, multiplied in vinasse not achieved the benefits found in the application of bacteria in aqueous suspension, with the stimulus to growth and control of nematodes in sugar cane. / Este trabalho objetivou avaliar a utilização de vinhaça como meio de cultura para multiplicação de Bacillus subtilis e o efeito de sua aplicação no solo visando o controle de nematóides e promoção crescimento da cana-deaçúcar cultivada em solo infestado com nematóide de galhas (Meloidogyne spp.). Foram desenvolvidos ensaios em laboratório para definição da melhor concentração de vinhaça na composição do meio de cultura visando otimização do crescimento de B. subtilis. No experimento em casa de vegetação foi utilizado solo coletado em área de cultivo de cana. Foram estabelecidos os seguintes tratamentos: controle; vinhaça pura (50 m3 ha-1); Bacillus subtilis em suspensão aquosa (50 m3 ha-1); B. subtilis multiplicado na vinhaça (50 m3 ha-1); B. subtilis multiplicado na vinhaça (100 m3 ha-1). A multiplicação de Bacillus subtilis em meio de cultura a base de vinhaça foi considerada satisfatória em comparação ao meio de cultura padrão. A aplicação de B. subtilis não multiplicado na vinhaça promoveu o crescimento da cana e redução da reprodução dos nematóides na raiz durante o experimento. A utilização de B. subtilis, multiplicado na vinhaça, não alcança os benefícios encontrados na aplicação apenas da bactéria, com relação ao estímulo ao crescimento e controle de nematóides na cana-de-açúcar.

Made available in DSpace on 2016-07-18T17:51:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao.pdf: 168225 bytes, checksum: 5446b44c9266240b990e9dcb92f20518 (MD5) Previous issue date: 2009-07-02 / This work aimed to evaluate the use of vinasse as a cultive medium for multiplication of Bacillus subtilis and the effect of your inoculation to control nematodes and growth of sugar cane grown in soil infested with the nematode galls (Meloidogyne spp.). Were developed in laboratory tests to define the best concentration of vinasse on the composition of culture medium to optimize the growth of B. subtilis. For the experiment with plants in the greenhouse soil used was collected in area of cultivation of sugarcane. Were established the following treatments: control, pure vinasse (50 m3 ha-1), Bacillus subtilis in aqueous suspension (50 m3 ha-1); B. subtilis multiplied in vinasse (50 m3 ha-1), multiplied in B. subtilis vinasse (100 m3 ha-1). The multiplication of Bacillus subtilis in the culture-based stillage was considered satisfactory when compared to the culture pattern. The application of B. subtilis without multiplication in vinasse promoted the growth of sugarcane and reduced reproduction of the nematodes in the root during the experiment. The use of B. subtilis, multiplied in vinasse not achieved the benefits found in the application of bacteria in aqueous suspension, with the stimulus to growth and control of nematodes in sugar cane. / Este trabalho objetivou avaliar a utilização de vinhaça como meio de cultura para multiplicação de Bacillus subtilis e o efeito de sua aplicação no solo visando o controle de nematóides e promoção crescimento da cana-deaçúcar cultivada em solo infestado com nematóide de galhas (Meloidogyne spp.). Foram desenvolvidos ensaios em laboratório para definição da melhor concentração de vinhaça na composição do meio de cultura visando otimização do crescimento de B. subtilis. No experimento em casa de vegetação foi utilizado solo coletado em área de cultivo de cana. Foram estabelecidos os seguintes tratamentos: controle; vinhaça pura (50 m3 ha-1); Bacillus subtilis em suspensão aquosa (50 m3 ha-1); B. subtilis multiplicado na vinhaça (50 m3 ha-1); B. subtilis multiplicado na vinhaça (100 m3 ha-1). A multiplicação de Bacillus subtilis em meio de cultura a base de vinhaça foi considerada satisfatória em comparação ao meio de cultura padrão. A aplicação de B. subtilis não multiplicado na vinhaça promoveu o crescimento da cana e redução da reprodução dos nematóides na raiz durante o experimento. A utilização de B. subtilis, multiplicado na vinhaça, não alcança os benefícios encontrados na aplicação apenas da bactéria, com relação ao estímulo ao crescimento e controle de nematóides na cana-de-açúcar.

A leprose é uma das principais doenças na citricultura brasileira devido à sua ocorrência difundida nos pomares e aos altos custos para o controle químico do ácaro vetor. A doença compromete a produção da planta e sua vida útil, manifestando-se através de lesões locais cloróticas ou necróticas em folhas, ramos e frutos, levando à queda prematura destes órgãos e à seca de ramos. O patógeno, Citrus leprosis virus C (CiLV-C), recentemente classificado como espécie tipo de um novo gênero de vírus de planta, Cilevirus, é transmitido pelo ácaro Brevipalpus phoenicis (Geijskes). Apesar de haver consenso de que a doença tem etiologia viral, ainda existem muitas questões pendentes sobre as interações vírus-planta-vetor, cujas soluções contribuirão para o controle integrado da doença. O presente trabalho teve como objetivo obter informações sobre a interação do vírus com células hospedeiras através de ensaios de imunolocalização das proteínas MP (putativa proteína de movimento), helicase (associada à replicação) e p29 (putativa proteína capsidial) do CiLV-C. Para tal, as sequências codificadoras das ORFs mp e hel foram amplificadas via RT-PCR e clonadas em vetor de expressão. Em seguida, promoveu-se a expressão in vitro das respectivas proteínas em células de E. coli e purificação por cromatografia de afinidade e troca iônica. A proteína MP pura foi utilizada para produção de antissoro policlonal específico que foi testado quanto à especificidade por métodos sorológicos. Os resultados do ELISA mostraram que o antissoro apresentou reação positiva com extratos foliares de lesões lepróticas em todos os estágios de desenvolvimento da doença, quando utilizado em altas concentrações. Além disso, lesões maduras reagiram mais intensamente que lesões mais novas. Por Western Blot, detectou-se somente a proteína pura, não sendo possível obter reação positiva em extrato de lesões foliares. Também não foi possível detectar a MP por imunolocalização in situ. Os resultados em conjunto sugerem que ocorre baixo nível de expressão da MP nos tecidos do hospedeiro. Empregando-se anticorpo policlonal contra proteína p29 do CiLV-C, foi possível detectar o CiLV-C em extratos de lesões foliares de leprose por ambos os métodos sorológicos testados e também por Tissue Blotting. Ensaios de imunolocalização in situ permitiram confirmar que as partículas baciliformes presentes em cisternas do retículo endoplasmático de tecidos de lesões lepróticas em plantas representam de fato vírions do CiLV-C. Além disso, também demonstrou-se que o viroplasma que ocorre no citoplasma representa o sítio de acúmulo da proteína p29. Este mesmo ensaio revelou que partículas baciliformes que ocorrem entre membranas de células adjacentes (intestino médio, glândulas prosomais, músculos e epiderme) de B. phoenicis virulíferos são de fato do CiLV-C. A ausência de viroplasma no ácaro sugere que a relação vírus/vetor seria do tipo circulativo, sem replicação. Baseado neste fato discutem-se alternativas para explicar como o vírus trafegaria do lúmen do intestino até o duto salivar para causar infecção numa planta sadia. / Citrus leprosis is one of the most important diseases in the Brazilian citrus production due to the wide occurrence in orchards and also to the high costs involved in the chemical control of the mite vector. The disease affects the plant production and longevity and it is characterized by localized chlorotic and/or necrotic spots on the leaves, stems and fruits. Affected leaves and fruits may drop prematurely and dieback can be observed in stems. The pathogen, Citrus leprosis virus C (CiLV-C), recently considered as the type member of a new genus, Cilevirus, is transmitted by the mite Brevipalpus phoenicis Geijskes. Despite the consensus that citrus leprosis has viral etiology, there are many pending questions regarding the viral interactions with the infected plant and the viruliferous mites. The solution of these questions may contribute to a better disease integrated management. This work aimed to obtain a better understanding about the virus-plant-vector relationship with the host cell by immunolocalization assays of the putative movement protein (MP), helicase (protein involved in the viral replication) and p29 (putative coat protein) of the CiLV-C. ORFs coding sequences of mp and hel was amplified by RT-PCR and cloned in the expression vector. Afterwards, in vitro expression of these proteins in E. coli and its purification by affinity chromatography were realized. The purified MP was used to produce specific polyclonal antibody that was tested for specificity by serological methods. The ELISA results showed that high concentration antibody reacted with the leaves extracts from lesions in all the disease stage of development. Furthermore, the old lesions reacted more intensely than the younger. Western blot (which detected only the pure protein) and in situ immunolocalization assays failed to detect the native MP in lesioned leave extracts. The results as a hole suggest the occurrence of low expression of MP in host tissue. The polyclonal antibody against p29 was able to detect the virus in lesioned plant extracts by PTA-ELISA, Western Blot, and Tissue Blotting. The viral nature of the putative viral particles, present within endoplasmic reticulum cisternae of infected leaf tissue, was confirmed by immunogold label. The labeling also occurred intensely in the viroplasmas, indicating that these structures represent p29 protein accumulation site. Putative virus particles, visualized in viruliferous B. phoenicis, between membranes of adjacent cells (midgut, prosomal glands, epidermis, muscles), was also immunogold labeled indicating that they represent CiLV-C. The absence of viroplasma in the mite tissues suggests that CiLV-C / B. phoenicis relationship is of the circulative type, without replication. Based on this finding, we search for possible alternatives for the viral circulation in the mite body from the midgut lumen to the salivary duct for the infection of a healthy plant to occur.

Nous avons exploré la diversité génétique du complexe d'espèces Ralstonia solanacearum (ceRs) pour caractériser et comprendre les graves épidémies de flétrissement bactérien qui sévissent à Madagascar. Une large collection de souches (n=1224; 75 sites) est constituée. Les souches sont assignées aux phylotypes I, III, et la grande majorité associée à l'épidémie appartiennent au groupe IIB-1 (‘Brown rot’ des anglo-saxons) signalé pour la première fois à Madagascar. L'approche MLVA (RS2-MLVA9) a révélé leur apparenté aux souches IIB-1 distribuées mondialement, suggérant ainsi une introduction malheureuse à Madagascar. Trois populations clonales se propagent par des tubercules infectées. Le génotypage des souches du phylotype III, avec le schéma hautement résolutif RS3-MLVA16 que nous avons développé, a révélé une forte diversité génétique structurée géographiquement en onze populations clonales bien différenciées. Cette structure reflète un caractère endémique des populations suggérant l'absence de transmission par tubercules. Les souches malgaches sont différentes de celles d'Afrique continentale. Les souches IIB-1 et III présentent deux modèles épidémiologiques différents. Les variétés de pomme de terre cultivées à Madagascar n'ont montré aucune résistance génétique vis-à-vis du panel de souches malgaches. Cependant, dans nos conditions expérimentales les accessions 720118 et 800934 sont résistantes aux souches I-31 non détectées pour l'instant à Madagascar, mais prévalentes dans l'océan Indien. Nous disposons ainsi d'un outil robuste pouvant être appliqué à l'étude du phylotype III, d'une vue globale de la structure des populations et d'épidémiologie du ceRs. / This thesis is exploring genetic diversity, population structure and molecular epidemiology of the Ralstonia solanacearum species complex (Rssc) causing potato bacterial wilt outbreaks in Madagascar. We characterized a large collection of strains (n=1224; 75 sites) collected from potato production areas. Surprisingly, the large outbreaks were associated with IIB-1 strains (Brown rot) while a few were associated with phylotypes I and III. This is the first report of phylotype IIB-1 in Madagascar. The IIB-1 strains were genotyped based on MLVA (RS2-MLVA9). And Malagasy phylotype IIB-1 clustered with worldwide distributed strains. Fine scale genetic investigation suggested three clonal populations that were introduced and spread through latently infected tuber-seeds. Phylotype III strains were genotyped with the highly discriminatory RS3-MLVA16 scheme we developed. Genetic population analyses revealed a high genetic diversity within phylotype III strains that geographically structured into 11 clonal populations. This support the endemic character of the phylotype III population in Madagascar and suggests no transmission with potato tubers. Malagasy strains were distinct from continental African strains. A clear-cut epidemiological profile is shown between IIB-1 and III strains. Genetically, no bacterial wilt resistance properties were shown for the most popular Malagasy potato cultivars, except two cultivars: 720118 and 800934 that showed strong resistance to phylotype I-31 strain that are predominantly distributed in the Indian Ocean. This study offered tool to genotype phylotype III strains and gives an insights into population structure and epidemiology of the Rssc.